Krooninen sairaus

tiivistelmä

kohdentaminen onkogeenisten ”kuljettajan kinaasien kanssa pienmolekyylisalpaajien on osoittautunut erittäin tehokas terapeuttinen strategia valituissa ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) potilailla. Kuitenkin kehittynyt resistenssi kohdennettuja hoitomuotojen poikkeuksetta herää ja on merkittävä rajoitus potilaan hoitoon. ROS1 fuusioproteiinit ovat äskettäin kuvattu luokan onkogeenisten kuljettaja, ja NSCLC potilaat, jotka ilmaisevat nämä fuusiot yleensä reagoi hyvin ROS1-täsmähoitoihin. Tässä tutkimuksessa olemme pyrkineet määrittämään mekanismeja kehittynyt resistenssi ROS1 esto. Tämän saavuttamiseksi, olemme analysoineet kasvaimen näytteitä potilas, joka alun perin vastasivat ROS1 estäjä crizotinib mutta lopulta kehittyi hankittu resistenssi. Lisäksi meillä tuotti ROS1 esto-fenikoliresistenttiin alunperin herkkien NSCLC solulinjan HCC78. Aiemmin kuvattu mekanismeja kehittynyt resistenssi tyrosiinikinaasiestäjiksi tavoitepäivämäärineen kinaasi-domain mutaatio, tavoite kopiomäärä voitto, epiteelin-mesenkymaalitransitioon, ja muuntaminen pienisoluinen keuhkosyöpä histologia todettiin ei taustalla vastarintaa potilaan näytteessä tai resistentti solulinja. Emme kuitenkaan tarkkailla kytkimen valvonnassa kasvun ja eloonjäämisen signalointireittejä välillä ROS1 EGFR että resistenttien solulinjassa. Seurauksena tämän kytkimen, ROS1 esto-resistenttejä HCC78 solujen tuli herkkiä EGFR inhibition, vaikutus, joka on parantunut samanaikainen käsittelemällä ROS1 estäjä. Tuloksemme viittaavat siihen, että co-esto ROS1 ja EGFR saattaa olla tehokas strategia torjua resistenssiä täsmähoitoihin joissakin ROS1 fuusio-positiivisten pienisoluista keuhkosyöpää.

Citation: Davies KD, Mahale S, Astling DP, Aisner DL Le AT, Hinz TK, et ai. (2013) Kestävyys ROS1 välittämää estoa EGFR Pathway Aktivointi ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 8 (12): e82236. doi: 10,1371 /journal.pone.0082236

Editor: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 17 kesäkuu 2013; Hyväksytty 22 lokakuuta 2013 Julkaistu: 13 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Davies et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat tutkimusrahoitusta Cancer League of Colorado KD Davies Boettcher Foundation Webb-Waring Biomedical Research -palkinto R.C. Doebele, ja University of Colorado keuhkosyöpään SPORE avustus (P50CA058187) ja M. Varella-Garcia ja R.C. Doebele. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu tai analysointi päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: D. L. Aisner on saanut palkkioita Abbott Molecular. P.A. Bunn Jr. on saanut konsulttipalkkiot Pfizer, Novartis, Genentech /Roche, AstraZeneca, Boehringer Ingelheim, Astellas, ja GlaxoSmithKline. DR. Camidge on saanut neuvottelukunta maksamalla Pfizer. R.C. Doebele on saanut tutkimusrahoitusta, konsulttipalkkiot, ja neuvottelukunta palkkioita Pfizer, palkkiot Abbott Molecular, konsulttipalkkiot ja neuvottelukunta palkkioita Boehringer Ingelheim, tutkimusrahoituksen ImClone, ja tutkimusrahoitus Eli Lilly. Ei ole olemassa patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Keuhkosyöpä, josta noin 80-85% voidaan luokitella ei-pieni keuhkosyöpä (NSCLC), on johtava syy syövän liittyvän kuolleisuuden maailmassa [1]. Viime aikoina on tullut selväksi, että NSCLC on heterogeeninen sairaus, joka voidaan suurelta osin jakaa perustuu geneettisiin muutoksiin, jotka luovat hallitseva kuljettaja onkogeenien [2]. NSCLC tuumorisolut ovat usein ”koukussa” näihin aktivoitu onkogeenien, niin että esto toimintaansa lohkojen proliferatiivinen ja pro-selviytymisen solun signalointi, lopulta johtaa kasvun pysähtymisen ja /tai solukuolemaan. Tärkeää on, monet onkogeenisten kuljettajien tähän mennessä on löydetty aktivoidaan kinaasit, jotka voidaan kohdistaa pienimolekyylisiä estäjiä. Gefitinibi ja erlotinibi hoitoon NSCLC potilaiden kätkeminen

EGFR

aktivoivia mutaatioita ja crizotinib hoito NSCLC potilaiden kätkeminen aktivoimalla

ALK

uudelleenjärjestelyt ovat onnistuneita esimerkkejä tästä strategiasta [3], [4]. Hoito näillä estäjä lääkkeet johtaa parempaan tehoon ja on enemmän siedettävä sivuvaikutuksia verrattuna tavanomaisiin chemotherapies potilailla, jotka ovat ennalta seulotaan aktivoimiseksi geneettiset muutokset [5], [6], [7].

huolimatta alkuperäisen tehoa gefitinibi, erlotinibi ja crizotinib valituilla pienisoluista keuhkosyöpää, hankittu resistenssi poikkeuksetta syntyy tyypillisesti alle vuoden. Solutasolla, tämä vastus tapahtuu useilla mekanismeilla. Ensimmäinen näistä on mutaation kohde-kinaasidomeenin, joka vähentää kykyä lääkkeen inhiboida kinaasia. Esimerkiksi T790M mutaatio, jota kutsutaan ”portinvartija” mutaatio, vähentää kykyä EGFR-inhibiittoreiden outcompete ATP: n sitoutuminen EGFR [8]. Tämä mutaatio (yhdessä muiden huomattavasti harvemmin resistenssiin liittyviä mutaatioita) löytyy solulinjassa malleja vastarinnan ja noin 50%: lla potilaista, jotka kehittävät kehittynyt resistenssi EGFR estäjähoidosta [9], [10], [11]. Analogisen portinvartija kanta ALK, L1196, on samoin todettu olevan mutatoitunut ALK fuusio-positiivisia keuhkosyöpä aikaan resistenssin crizotinib ja kestävä solulinjassa malleja, kuten myös useita muita aminohappoja, joiden mutaatio vähentää myös kykyä lääke estää kinaasin [12], [13], [14], [15], [16]. Toinen mekanismi resistenssiä vahvistus kohde kinaasi. Teoriassa kasvu määrä kinaasia, joka ilmaistaan ​​solu voi heikentää lääkkeen kyllästää kohde. Monistaminen

ALK

fuusiot on osoitettu resistenttien solujen ja potilailla, joille on kehittynyt vastustuskyky [13], [14], [16]. Lisäksi, monistus

EGFR

on korreloitu vastus

EGFR

mutantti keuhkosyöpä, vaikka useimmissa tapauksissa monistetun alleelin suhtautuu T790M-mutaatio [17], [18]. Toinen merkittävä mekanismi resistenssiä aktivointi vaihtoehtoisten signalointi komponenttien. Tällöin proteiineja, jotka ovat alavirtaan tai työskentelevät rinnakkain kohde kinaasi aktivoituvat ja horjuttaa riippuvuus kohde kinaasia yksinomaan stimuloida proliferatiivisia ja pro-eloonjäämisen signalointi. MET, PI3K, BRAF, IGF-1 R, FGFR1, MEK, ja ERK1 /2 aktivointi kaikilla havaittu EGFR estäjä kestävä

EGFR

mutantti sairaus ja /tai solulinjan mallit [18], [19] , [20], [21], [22], [23], [24]. Aktivointi tai monistuminen EGFR, KRAS, ja KIT on vastaavasti havaittu crizotinib kestävä

ALK

jäsensi potilaiden ja solulinjoissa [14], [15], [16], [25]. Lisäksi tuoreessa tutkimuksessa osoitti, että altistuminen yhteinen kasvutekijöitä on riittävä indusoimaan vastustuskykyä kohdennettuja hoitomuotojen syöpäsolulinjoissa useista geneettisten taustoja, ja tämä vaikutus korreloi pelastus lääkkeen aiheuttama AKT ja ERK inaktivaation [26]. Lopuksi, histologisia ja morfologiset muutokset on osoitettu korreloivan vastus. Erityisesti muuntaminen pienisoluinen keuhkosyöpä histologia ja epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) on havaittu

EGFR

mutantti potilaiden ja solulinjat vastustuskykyinen EGFR: n estäjien [11], [18]. Mekanistinen emäkset takana näitä muutoksia ei täysin ymmärretä.

ROS1

on reseptori tyrosiinikinaasin joka liittyy läheisesti

ALK

, ja, kuten

ALK

, se läpikäy genomista uudelleenjärjestely, joka luo fuusioproteiinit NSCLC ja muiden syöpien [27]. Se on vakiintunut, että nämä fuusioproteiinit toimivat kasvaimia synnyttävän kuljettajat ja että ROS1 esto on antiproliferatiivisia soluissa, jotka ilmentävät ROS1 fuusiot [28]. Lisäksi crizotinib, joka tehoaa ROS1, on osoittaa, teho

ROS1

fuusio-positiivisten pienisoluista keuhkosyöpää faasin I tutkimuksessa [29]. Siten otetaan huomioon menestys crizotinib in

ALK

fuusio-positiivisia NSCLC, näyttää siltä, ​​että ROS1 täsmähoitoihin todennäköisesti pian standardin hoidon tässä potilasryhmässä. Kuitenkin perustuu kokemuksia muiden kinaasin estäjien keuhkosyöpää, se on täysin odotettavissa, että kehittynyt resistenssi ROS1 esto tapahtuu, ja tämä lopulta rajoittaa hoitovaihtoehtoja näille potilaille. Tämän tueksi, tuore tutkimus raportoitu kliininen kyseessä on

ROS1

uudelleenjärjestely-positiivisten potilaiden jotka kehittäneet vastustuskyvyn crizotinib jälkeen ensimmäinen vastaus [30]. Potilas todettiin tehty mutaatio

ROS1

kinaasialue joka haittasi huumeiden sitovia [30]. Tässä tutkimuksessa olemme pyrkineet määrittämään resistenssimekanismeihin ROS1 esto. Tämä suoritettiin käyttäen kliiniset näytteet potilaasta, joka tuli vastustuskykyisiä crizotinib ja ROS1 esto-fenikoliresistenttiin

ROS1

jäsensi NSCLC solulinjassa HCC78.

Tulokset

aiemmin raportoitu tunnistaminen on NSCLC potilas ilmaisi

SDC4-ROS1

fuusio ja onnistuneen hoidon tämän potilaan kanssa crizotinib [28]. Potilas koki 57% kasvain kutistuminen kahden 28 päivän hoitojaksoa. Huolimatta jatkuva hoito, sairauden todetaan etenevän havaittiin noin 18 viikon kuluttua hoidon aloittamisesta. Tällä hetkellä, joka on excisional biopsia etenee kasvain otettiin. Kohdennettu sekvensointi tämän resistenttien biopsianäytteen paljasti, että samanlainen esikäsittely biopsia, koko

ROS1

kinaasidomeeni oli villityypin (WT), siten, että

ROS1

kinaasidomeenin mutaatio oli ei resistenssimekanismi (taulukko 1). Lyhyt analyysi osoitti myös WT tilan yleisesti muuntunut jäämien useissa muissa tunnetuissa onkogeenien (mukaan lukien

EGFR

,

KRAS

, ja

BRAF

) sekä esikäsittelyn ja post -resistance näytteitä (taulukko 1). Sitten tutkittiin kopiomäärä vahvistus

ROS1

-fuusiogeenin mahdollisena resistenssimekanismi. Tämä saatiin aikaan käyttämällä fluoresenssia

in situ

-hybridisaatio (FISH) koettimilla sekä 5 ’ja 3’-alueille geenin. Keskimääräinen single 3 ’signaali (edustaja fuusio geenin) määrä per kasvainsolu oli 1,7 esikäsittelyssä näyte ja 1,82 jälkeisessä vastus näyte, joka ei ole merkittävää eroa (kuvio 1A). Tämä havainto viittasi siihen, että kopiomäärä voitto ei ollut resistenssimekanismi tämän potilaan kasvain. Jälkeinen kestävyys näyte teki paljastaa menetys yhden 5-signaali; mutta tämä ei odoteta olevan toiminnallisesti merkittäviä (kuvio 1A). Olemme varmistaneet, että fuusio-geeni ilmaistaan ​​aikaan vastuksen, ja että suhde pitkä (

SDC4

eksoni 2 fuusioitu

ROS1

eksonin 32 (SD2, R32)) lyhyen (

SDC4

eksoni 2 fuusioitu

ROS1

eksonissa 34 (SD2, R34)) variantit oli samanlainen kuin esikäsittely- näyte (kuvio 1 B). Morfologinen tarkastelu näyte otettu vastustuskyky osoitti pullea epithelioid solut suuri ydinvoiman sytoplasman suhde, näkyvä nucleoli, ja eosinofiilinen sytoplasma, samanlainen esikäsittely koepala (kuvio 1 C). Nämä havainnot ehdottivat, että pienet solutransformaatiota ei ollut tapahtunut. Lopuksi mitään morfologisia todisteita EMT, kuten solujen kuikelo, havaittiin, ja koepala otettu vastus osoitetut kielteiset immunohistokemiallisella värjäyksellä vimentiinista, EMT merkki (kuva S1). Ei ole todisteita, että nämä yhteiset resistenssimekanismien oli viittaavia säätelyä alterative signalointi kuin taustalla resistenssimekanismi crizotinib tässä potilasryhmässä.

(A) Esikäsittely ja post-resistenssi potilaiden näytteistä analysoidaan BREAK- lisäksi FISH määritys

ROS1

. Punainen koettimet ovat 5′-alueen ROS1 ja vihreä koettimen 3′-alue. Arvot edustavat keskiarvoa signaalien lukumäärä solua kohti. Yksittäinen 3 ’signaali (arvot alleviivattu) on osoitus

ROS1

fuusio geenin kopioluku. (B) RT-PCR: llä käyttämällä alukkeita

SDC4

ja

ROS1

jotka kattavat fuusio vaiheessa suoritettiin esikäsittely ja post-vastus kasvainnäytteestä. SD2, R32 on ”pitkä” variantti (fuusio

SDC4

eksoni 2

ROS1

eksoni 32) ja SD2, R34 on ”lyhyt” variantti (fuusio

SDC4

eksoni 2

ROS1

eksoni 34). (C) hematoksyliinillä ja eosiinivärjäykset esikäsittelyn ja post-resistenssi potilaiden näytteistä.

luomiseksi solulinjassa malli vastustuskyvyn ROS1 esto, me kroonisesti kohdella

SLC34A2-ROS1

ilmentävät NSCLC solulinja HCC78 kasvavien pitoisuuksien kanssa ja ROS1 inhibiittorin TAE684. Tätä menetelmää on käytetty aikaisemmin luoda kestävä malleja sekä EGFR-estäjien

EGFR

mutanttisoluihin ja crizotinib in

ALK

jäsensi soluja, ja mekanismit havaittu näissä malleissa ovat korreloi mitä havaitaan potilailla [13], [15], [19]. Päätimme käyttää TAE684 (ei-kliininen yhdiste) yli crizotinib (lääke kliinisiä tehoaa ROS1) koska crizotinib on suhteellisen korkea IC

50 HCC78 soluissa ja vain hyvin kapea ikkuna poistuu välillä IC

50 ja off-tavoite toimia lääkeaineen [28], [31]. Toisin sanoen, käyttämällä TAE684 tehdä resistenttejä soluja ROS1 eston sijaan crizotinib, pystyimme varmistamaan täydellisempi esto ROS1 fuusioproteiinin annoksilla, jotka eivät osoittaneet off-kohde antiproliferatiivisia vaikutuksia. Sen jälkeen noin 4 kuukautta kulttuurin kasvavien pitoisuuksien, resistentit johdannainen HCC78 linja, jota kutsutaan HCC78-TR, pystyi lisääntymään normaalisti 500 nM TAE684. Ensimmäiset yritykset nostaa annosta kulttuurin lisäksi olivat tuloksettomia, joten 500 nM pidettiin suurin ja soluja jatkuvasti viljeltiin tämän lääkkeen pitoisuus. Kun herkkyys näiden solujen TAE684 analysoitiin lisääntymismäärityksissä, se määritettiin, että IC

50 TAE684 oli suurempi kuin 1 uM (kuvio 2A). Tämä on samanlainen kuin muut NSCLC solulinjoja, jotka eivät sisällä ALK tai ROS1 fuusioiden (H322 ja HCC4006), mikä viittaa siihen, että antiproliferatiivisia vaikutuksia tällä alueella ovat todennäköisesti johtuu off-tavoite toimintaa. HCC78-TR-solut olivat myös vähemmän herkkiä crizotinib, ja taas, herkkyystaso oli samanlainen kuin solut, jotka eivät ekspressoi ALK tai ROS1 fuusiot (kuvio 2B). Kuitenkin siedätyshoito oli nimenomaan ROS1 esto, koska HCC78-TR-solut säilyttivät herkkyyden pemetreksedille, FDA-hyväksytty kemoterapiaa ei-levyepiteelikarsinooma keuhkosyöpä (kuvio 2C). Vastus ROS1 esto ei ole riippuvainen jatkuvasta viljely, kun läsnä on 500 nM TAE684, koska solut, jotka oli otettu pois lääkkeen pysyi kestävät jopa 6 kuukautta ja 47 kohdat (kuvio S2).

Solut käsiteltiin TAE684 (A), crizotinib (B), tai pemetreksedin (C), kuten single-aineina 3 päivää ja sitten analysoitiin MTS-määrityksellä. Arvot edustavat keskiarvoa ± SEM (n = 3-7). Laskettu IC

50-arvot TAE684: vanhempien HCC78 = 0,14 uM, HCC78-TR = 1,09 uM, H322 = 1,42 uM, ja HCC4006 = 1,15 uM. Laskettu IC

50-arvot crizotinib: vanhempien HCC78 = 0,79 uM, HCC78-TR = 1,95 uM, H322 = 4,13 uM, ja HCC4006 = 3.03 uM. Laskettu IC

50-arvot pemetreksedi: vanhempien HCC78 = 11 nM ja HCC78-TR = 14 nM. HCC78-TR solut olivat merkittävästi vähemmän herkkiä kuin vanhempien HCC78 solut TAE684 (p 0,000005) ja crizotinib (p 0,05), mutta ei pemetreksediin (p 0,05) määritettynä opiskelijan pariksi t-testiä.

sekvensointi vanhempien HCC78 ja HCC78-TR-solut osoittivat, että kinaasidomeenia

ROS1

oli WT molemmat linjat, viittaa siihen, että

ROS1

mutaatiota ei ole vastuussa vastus ROS1 inhibition (Pöytä 1).

EGFR

,

KRAS

, ja

BRAF

todettiin myös olevan WT molemmissa solulinjoissa (taulukko 1). FISH-analyysi osoitti, että HCC78-TR menetettyjen solujen 1 kopion

ROS1

-fuusiogeenin verrattuna vanhempien rivi (1 kappale vs. 2 kappaletta, vastaavasti), mikä viittaa siihen, että kopiomäärä voitto fuusio geeni ei resistenssimekanismi (kuvio 3A). Seurauksena genomisen menetys 1 kopion fuusiogeenin, vähemmän

SLC34A2-ROS1

mRNA ilmentyy HCC78-TR-solut (kuvio S3). Vaikka merkitys alennetun fuusio geenin ilmentyminen on epäselvä, pakko ilmentyminen aktivoidun ROS1 fuusioproteiinia (SDC4-ROS1) on HCC78-TR-solut eivät uudelleen herkistää ne TAE684 (kuva S4). Noin 40% HCC78-TR soluilla kasvua määrän kopioita 5′-alue

ROS1

(2 kappaletta 4 kappaletta), vaikka tätä ei odoteta olevan toiminnallisesti merkittävä kuin 5′-alue ei esiinny kinaasiaktiivisuutta (kuvio 3A). Lisäksi, morfologia HCC78-TR-solut eivät visuaalisesti erilainen kuin vanhempien HCC78 linja, viittaa siihen, että konversio on pieni keuhkosyöpä morfologia ei tapahtunut (kuvio 3B). MRNA määritysrajan,

CDH1

tasot olivat samankaltaisia ​​kahdessa solulinjassa ja

VIM

tasot laskivat 3-kertaiseksi HCC78-TR linjan (kuva S5). Nämä tulokset viittaavat siihen, että EMT ei ollut resistenssimekanismi. Lopuksi, emme tarkkailla merkitsevä mRNA ilmaus tahansa ATP-sitova kasetti kuljettaja perheen geenien HCC78-TR soluissa, mikä viittaa siihen, että tehostettu lääkevuoto- todennäköisimmin ei selittämään resistenssiä ROS1 esto (taulukko S1).

(A) Vanhempien HCC78 ja HCC78-TR-solut analysoitiin break-erilleen FISH määrityksessä

ROS1

. Punainen koettimet ovat 5′-alueen ROS1 ja vihreä koettimen 3′-alue. Arvot edustavat useita signaaleja solua kohti. Yksittäinen 3 ’signaali (arvot alleviivattu) on osoitus

ROS1

fuusio geenin kopioluku. Vuonna HCC78-TR linja, kahden populaation olemassa, jotka poikkeavat toisistaan ​​lukumäärän perusteella 5 ’signaaleja havaita. (B) edustaja Kirkas kuvia vanhempien HCC78 ja HCC78-TR soluissa.

Sitten kysytään vastustuskykyä ROS1 esto voi johtua muutoksista alavirran solusignaloinnissa. Vanhempien HCC78 ja HCC78-TR-soluja käsiteltiin annos-alueella TAE684 4 tunnin ajan, ja sitten solujen lysaatit analysoitiin Western-blotilla. Samanlainen kuin mitä olemme aiemmin raportoitu, TAE684 vähensi ROS1 autofosforylaation ja aktivoimalla fosforylaation SHP-2, AKT, ja ERK1 /2, vanhempien HCC78 soluja (kuvio 4A) [28]. Kuten on ennustettu genomisesta kopioluvun menetys

ROS1

fuusiogeeni ja vähentää mRNA: n ilmaisu, HCC78-TR-solut ilmaistu vähemmän fuusioproteiinin kuin vanhempien linjan ja ROS1 autofosforylaation ei voitu havaita. Alentamista määrän ROS1 fuusioproteiinia korreloi vähentää pohjapinta fosforylaation SHP-2. Huolimatta fuusioproteiini menetys, pohjapinta tasot fosforyloitua ERK1 /2 olivat samanlaisia ​​kuin vanhempien linjan ja pohjapinta tasoilla fosforyloidun AKT oli suurempi kuin vanhempien linjaa. Tärkeää on, TAE684 hoito ei johtanut de-fosforylaation AKT tai ERK1 /2 on resistenttejä soluja. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin crizotinib hoitoon (kuvio 4B).

Soluja käsiteltiin TAE684 (A) tai crizotinib (B) 4 tuntia. Lysaatit soluista analysoitiin sitten Western blot käyttäen mainituilla vasta-aineilla.

määrän vähentäminen on ilmaistu ROS1 fuusioproteiinin, pysyvyys pohjapinta AKT ja ERK1 /2 aktivointi, ja puute esto AKT ja ERK1 /2, jonka ROS1 inhibiittorit ehdotti, että vaihtoehtoisen signalointireitille oltiin aktivoitu HCC78-TR soluissa. Yritetään tunnistaa ilmen- tymisen lisääntymisen reaktiotien komponentit, suoritimme kahden fosfo-proteiinijärjestelmän kokeet: yksi, joka tutki reseptorityrosiinikinaasit (RTK: t), ja yksi, joka analysoitiin alavirtaan kinaasit (muiden proteiinien). Kuten olemme havainneet aikaisemmin, vanhempien HCC78 rivi ilmaistaan ​​fosforyloidun EGFR ja MET kun tutkittiin fosfo-RTK array (kuva 5A) [28]. HCC78-TR line riitti fosforyloitu EGFR, mutta fosfori-MET väheni merkittävästi (kuvio 5A). Mikään muu merkittävästi fosforyloituu reseptorityrosiinikinaaseja havaittiin. Kuten ennustettu western blot-analyysi, AKT fosfo-S473 on lisääntynyt HCC78-TR-solut verrattuna emo-soluja, samoin kuin useat fosforylaatiokohdat p53 (kuvio 5A). Nämä olivat ainoat erot havaitsemat fosfo-proteiini array.

(A) Phospho-RTK (ylhäällä) ja fosfo-kinaasi (alhaalla) array analyysit suoritettiin käsittelemättömien vanhempien HCC78 ja HCC78-TR soluissa. Kiinnostavia proteiineja leimataan. Tunnisteeton täplät kulmissa molemmat paneelit ovat positiivisen kontrollin. (B) Vanhempien HCC78 ja HCC78-TR-soluja käsiteltiin TAE684, gefitinibi, tai molempia 4 tuntia. Lysaatit soluista analysoitiin sitten Western blot käyttäen mainituilla vasta-aineilla. (C) Vanhempien HCC78 (P) ja HCC78-TR (T) solut jätettiin käsittelemättä, käsiteltiin 1 uM gefitinibin 4 tuntia, tai niitä käsiteltiin 100 ng /ml EGF: ää 10 minuutin ajan. Lysaatit soluista analysoitiin sitten Western blot käyttäen mainituilla vasta-aineilla.

Olemme aiemmin osoittaneet, että EGFR signalointi on osittain aktiivinen vanhempien HCC78 linja, koska voimakas anti-proliferatiivista vaikutusta TAE684 voisi saavutetaan vain yhdessä hoito EGFR estäjän gefitinibin [28]. Johtuen havaintojen EGFR oli ainoa merkitsevästi fosforyloituu RTK vuonna HCC78-TR linja, ja että AKT, joka on yleisesti käytössä myötävirtaan EGFR oli raskaammin fosforyloitu vuonna HCC78-TR, meidän hypoteesi, että kenties EGFR signalointi oli edelleen harjoittaa resistentit solut. Tämän hypoteesin testaamiseksi käsittelimme vanhempien HCC78 ja HCC78-TR-solut 200 nM TAE684, 1 uM gefitinibi, tai molempia 4 tuntia. Jälleen fosfo-AKT ja fosfo-ERK1 /2 olivat herkkiä TAE684 kohtelun emolinjan mutta ei HCC78-TR line (kuvio 5B). Tilanne oli päinvastainen, kun nämä rivit hoidettiin gefitinibin, jossa alavirran signalointia on herkkä HCC78-TR linja muttei vanhempien rivi (kuvio 5B). Samanlaisia ​​vaikutuksia havaittiin kanssa kemiallisesti erillisen EGFR: n estäjien erlotinibin, lapatinibi, ja afatinib, mikä viittaa siihen, että vaikutukset johtuivat paikan kohde EGFR esto (kuva S6). Siten WT EGFR oli tullut hallitseva kasvun nopeuttamiseksi ja eloonjäämisen signalointireittejä vuonna HCC78-TR soluissa. Tämä muutos solusignalointi korreloi lievän nousun yhteensä EGFR tasot HCC78-TR soluja verrattuna vanhempien HCC78 soluja (kuvio 5C). Autofosforyloinnin EGFR, määritettynä western blot käyttämällä cocktail fosforylaatiokohdan-spesifisten vasta-aineiden, oli suhteellisen matala molemmissa solulinjoissa. Kuitenkin stimuloitaessa EGFR ligandin EGF, autofosforylaatio kasvoi ja oli suurempi HCC78-TR-solut (kuvio 5C). mRNA kvantitointi osoittaa, että useimmat EGFR ligandit eivät merkittävästi enemmän ilmaistu HCC78-TR-solut, lukuun ottamatta NRG1 joka näytetään 4-kertainen nousu mRNA-tasot (kuvio S7).

Koska kytkin ohjaus kasvua ja selviytymistä signalointireittejä välillä ROS1 EGFR on HCC78-TR-solut, me arveltu, että näiden solujen olisivat herkkiä EGFR inhibition. Tämän hypoteesin testaamiseksi, käsittelimme sekä vanhempien HCC78 ja HCC78-TR solujen gefitinibin yhtenä-aine lisääntymismäärityksissä. Kuten olemme aiemmin raportoitu, gefitinibi pitoisuuksina jopa 5 uM ei vaikuttanut leviämisen vanhempien HCC78 soluja (kuva 6A) [28]. Kuitenkin lääke vaatimattomasti inhiboivat HCC78-TR-solut (kuvio 6A). Samanlaisia ​​vaikutuksia havaittiin erlotinibin (tuloksia ei ole esitetty). Sitten arveltu, että koska HCC78-TR-solut vielä ilmaisi, joskin rajoitettu tasot ROS1 fuusioproteiinin, täydellinen anti-proliferatiivisen vaikutuksen aiheuttama gefitinibin vaatisi co-inhibition ROS1. Tämän hypoteesin testaamiseksi, käsittelimme HCC78-TR solut annosalueella gefitinibin yhdistettynä 500 nM TAE684 (lääkkeen konsentraatio, että nämä solut olivat jatkuvasti viljeltiin). Lisäämällä 500 nM TAE684 ollut antiproliferatiivinen vaikutus omasta; kuitenkin edelleen herkistyneet solut gefitinibin hoitoon (kuvio 6B). Näissä olosuhteissa HCC78-TR-solut eivät olleet niin herkkiä kuin HCC827 NSCLC solulinja, joka ohjaa E746_A750del EGFR. Tämän odotetaan koska aktivoivia mutaatioita EGFR parantaa sen affiniteetti EGFR estäjät [32]. Kuitenkin HCC78-TR-solut olivat tai herkempi kuin WT EGFR ilmentävien NSCLC linjat H358 ja H322, vastaavasti (kuvio 6B). Nämä kaksi solulinjaa on raportoitu olevan erittäin herkkiä gefitinibin verrattuna muihin WT EGFR ilmentävien NSCLC linjat [33]. Tärkeää on, että HCC78-TR solujen merkittävää antiproliferatiivista aktiivisuutta havaittiin kliinisesti asianmukaisilla annoksilla gefitinibin (~ 1 uM) yhdistettynä ROS1 esto [34].

(A) Vanhempien HCC78 ja HCC78- TR-soluja käsiteltiin gefitinibin yhtenä-aine 3 päivää ja sitten analysoitiin MTS-määrityksellä. (B) Vanhempien HCC78 ja HCC78-TR solut ko-käsiteltiin 500 nM TAE684: n ja gefitinibin, ja HCC827, H322, ja H358-soluja käsiteltiin yhden aineen gefitinibin 3 päivää ja sitten analysoitiin MTS-määrityksellä. Laskettu IC

50-arvot: vanhempien HCC78 (alle 50% yhden-aine TAE684), HCC78-TR = 0,86 uM, HCC827 = 0,04 uM, H322 = 5 uM, ja H358 = 1,0 uM. Kaikki arvot edustavat keskiarvoa ± SEM (n = 4).

Koska proof-of-concept joka EGFR aktivointi voidaan de-herkistää ROS1 fuusio-ajettu solujen ROS1 esto, tutkimme vaikutus ligandin indusoiman reseptorin aktivoitumisen herkkyydestä. Tämän saavuttamiseksi, teimme lisääntymismäärityksissä tutkitaan herkkyys TAE684 puuttuessa tai läsnä ollessa EGFR ligandin EGF. Olemme havainneet, että lisäämällä EGF alussa määrityksen merkittävästi flegmatoituja vanhempien HCC78 solujen inhibitio ROS1 (kuvio 7A). Sen sijaan, EGF ei ollut vaikutusta herkkyyteen HCC78-TR soluihin, jonka odotettiin johtuu jo maksimaalisen epäherkkyys tämän linjan (

cf

kuvio 2A). Mekanistisesti flegmatoimiseen että vanhempien HCC78 solut korreloivat pelastus EGF päässä TAE684 aiheuttama de-fosforylaatiota AKT ja ERK1 /2 (kuvio 7B).

(A) Vanhempien HCC78 ja HCC78-TR-solut hoidettiin TAE684 ja 3 päivää tai ilman lisäämällä 100 ng /ml EGF: ää ja sitten analysoitiin MTS-määrityksellä. Arvot edustavat keskiarvoa ± SEM (n = 3). Laskettu IC

50-arvot TAE684: vanhempien + ajoneuvo = 0,18 uM, vanhempien + EGF = 0,57 uM, HCC78-TR + ajoneuvo = 1,39 uM, ja HCC78-TR + EGF = 1,45 uM. EGF merkittävästi Flegmatoidut vanhempien HCC78 muttei HCC78-TR solujen TAE684 määritettynä opiskelijan pariksi t-testiä (p 0,05). (B) Vanhempien HCC78 soluja käsiteltiin TAE684 4 tuntia, EGF 10 minuutin ajan, tai molempien yhdistelmä. Lysaatit soluista analysoitiin sitten Western blot käyttäen mainituilla vasta-aineilla. (C) CUTO-2-soluja käsiteltiin TAE684 4 päivän ajan tai ilman lisäämällä 100 ng /ml EGF: ää ja sitten analysoitiin MTS-määrityksellä. Arvot edustavat keskiarvoa ± SEM (n = 3). Laskettu IC

50-arvot TAE684: + ajoneuvo = 0,2pM ja + EGF = 0,81 uM. EGF merkittävästi Flegmatoidut CUTO-2 solujen TAE684 määritettynä opiskelijan pariksi t-testiä (p 0,01). (D) CUTO-2-soluja käsiteltiin TAE684 4 tuntia, EGF 10 minuutin ajan, tai molempien yhdistelmä. Lysaatit soluista analysoitiin sitten Western blot käyttäen mainituilla vasta-aineilla. Fosforyloituu ROS1 bändit olivat alle määritysrajan, joten niistä ei sisälly.

solulinja oli peräisin koepala, joka on otettu potilaan vastustuskykyinen kasvain. Perustaminen Tämän solulinjan, jota olemme kutsutaan Colorado University rintakehä Oncology-2 (CUTO-2), kesti noin vuoden kulttuuriin ja suoritettiin puuttuessa ROS1 estäjä. Kun solut saavuttivat riittävä jakolukuun ( 35 kohtia) sekä riittävä kasvunopeus kokeellinen analyysi, tutkimme ROS1 -fuusiogeenin tila, ROS1 fuusioproteiinin ilmentymisen, ja herkkyys ROS1 esto. CUTO-2-soluissa varmistettiin vielä näytteille uudelleenjärjestely

ROS1

geenin ja ilmentävät ROS1 fuusioproteiinia (kuvio S8A, B). Proliferaation määrityksissä CUTO-2-solut osoittivat samanlaista herkkyyttä TAE684 ja hieman lisääntynyt herkkyys crizotinib verrattuna emo-HCC78 soluja (kuvio 7C ja kuvio S8C). Mielenkiintoista, kuten vanhempien HCC78 solujen herkkyyttä ROS1 esto voitaisiin vähentää EGR-hakemusta ja tämän siedätyshoito korreloivat pelastus TAE684 aiheuttama väheneminen fosforyloidun AKT ja ERK1 /2 (Kuva 7 C ja D).

keskustelu

kehittynyt resistenssi kohdennettuja hoitomuotojen on merkittävä rajoitus hoitoon keuhkosyöpäpotilaiden. Kuitenkin järkevä lähestymistavat torjua vastus voidaan kehittää, kun molekyyli- ja solutason mekanismeja, jotka taustalla se tunnistetaan. Tässä tutkimuksessa selvitimme resistenssimekanismeihin ROS1 inhibition NSCLC. Tämä suoritettiin käyttäen kasvainnäytteestä peräisin NSCLC potilas tuli vastustuskykyisiä crizotinib ja NSCLC solulinja, että teimme vastustuskykyinen ROS1 esto jatkuvalla kulttuurin ROS1 estäjä TAE684. Ihannetapauksessa tutkimukset sitoutunut tarkastelemaan resistenssimekanismeja mukana näytepankkien useista potilaista ja useita eri solulinjoissa. Kuitenkin, kuten

ROS1

uudelleenjärjestelyt ovat läsnä vain 1-2% pienisoluista keuhkosyöpää, meillä oli vain saada yksi potilas, joka tuli vastaa hoitoon. Lisäksi ennen meidän johtaminen CUTO-2 line, HCC78 oli ainoa julkaistu NSCLC solulinjan tiedetään ilmentämään ROS1 fuusioproteiinia. Näistä rajoituksista huolimatta havainnot tästä tutkimuksesta on suuri vaikutus

ROS1

uudelleenjärjestely-positiiviset potilaat, jotka tulevat vastustuskykyisiksi crizotinib hoitoon. Ennen Tutkimuksessamme ainoa julkaistu raportti oli tunnistanut resistenssimekanismi ROS1 esto. Tutkimuksessa, jonka Awad et al.,

ROS1

uudelleenjärjestely-positiivinen potilas, joka aiemmin vastanneet crizotinib mutta tuli vastustuskykyisiä todettiin hankkinut kodonissa 2032

ROS1

-fuusiogeenin (

CD74-ROS1

). Tämä mutaatio osoitettu häiritsevän crizotinib sitoutumisen ROS1 ATP-sitoutumiskohdan [30].