Krooninen sairaus

tiivistelmä

Gynura procumbens

(Lour.) Merr. kuuluu Asteraceae perhe. Laitos on tunnettu perinteinen yrtti Kaakkois-Aasiassa ja sitä käytetään laajalti tulehduksen hoitoon, munuaisten epämukavuutta, korkea kolesteroli, diabetes, syöpä ja korkea verenpaine. Meidän aikaisempi tutkimus osoitti sisältää arvokkaita kasvi puolustus proteiineja, kuten peroksidaasi, taumatiini kaltaisten proteiinien ja mirakuliini in lehtiä

G. procumbens

. Kuitenkin vaikutukset näiden puolustus proteiinien syöpiin ole koskaan määritetty aiemmin. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet bioaktiivisuutta geelisuodatuksen fraktioitiin proteiineja

G. procumbens

lehtiuutteen. Aktiivisen proteiinin fraktio, SN-F11 /12, havaittiin inhiboivan kasvua rintasyövän solulinjan MDA-MB-231, on EC50-arvo 3,8 ug /ml. MRNA ilmauksia leviämisen markkereita, Ki67 ja PCNA, vähenivät merkittävästi MDA-MB-23-solut käsiteltiin SN-F11 /12. Ilmaisu hyökkäyksen markkerin, CCL2, todettiin myös vähentää käsitellyn MDA-MB-231-soluja. Kaikki nämä havainnot korostavat sitä, syövän ominaisuus SN-F11 /12, siis, proteiinit tässä fraktiossa voi olla mahdollinen kemoterapeuttinen aine rintasyövän hoitoon.

Citation: Hew CS, Khoo BY, Gam LH (2013) Anti-Cancer Property of Proteins Ote

Gynura procumbens

(Lour.) Merr. PLoS ONE 8 (7): e68524. doi: 10,1371 /journal.pone.0068524

Editor: Natarajan Aravindan, University of Oklahoma Health Sciences Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 29 toukokuu 2013; Julkaistu: 11 heinäkuu 2013

Copyright: © 2013 Hew et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat RU avustusta Universiti Sains Malaysia (Projektin numero: 1001 /PFARMASI /815034). Kirjoittajat myös kiittää Institute for Graduate Studies of Universiti Sains Malaysia tarjota stipendin Veistä Chaw-Sen. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Monet tällä hetkellä saatavilla lääkkeet ovat kasvipohjaisia, ja kasvien peptidit ja proteiinit ovat osoittautuneet kriittinen lähde biologisten yhdisteiden, joissa havaittiin bioaktiivisuuksiin joita voidaan hyödyntää huumeiden. Joukossa toiminta havaituista olivat antituumorivaikutuksen peptidien uutetaan

Hypericum perforatum, Chelidonium majus L

.,

Inula helenium L

.,

Equiseteum arvense L

. ja

pakurikääpä

[1]; HIV-ominaisuus makrosyklisten peptidi uutetaan

Palicourea

lauhteen [2]; antimikrobiaalista aktiivisuutta taumatiini kaltaisten proteiinien uutettu mallasohran [3] ja eri kasvi- ”proteiineista [4]. Kasvi-pohjaisia ​​tuotteita, kuten proteiineja ja pieniä mole- yhdisteitä on ehdotettu suotuisa lääkkeitä syövän hoitoon ottaen huomioon monia haitallisia vaikutuksia kohdistama nykyisten syövän hoitomuotoja, eli kemoterapiaa ja sädehoitoa. Lisäksi, nämä hoidot ovat kalliita, joka voi olla taakka potilaille. Kasvit sisältävät erilaisia ​​aktiivisia aineosia, joita voidaan käyttää lääke tautien hoito, kuten rintasyövän [5]. Rintasyöpä on yleisin kuolinsyy johtuu syövästä naisten keskuudessa kaikkialla maailmassa [6]. Vaikka sädehoito ja kemoterapia ovat säännöllisiä hoitoihin annettiin syöpäpotilaille, tehokas hoito rintasyöpään jäävän vähäisiksi. Tämän valossa, merkittäviä ponnisteluja pyrkiä tehokkaita aineita kasvin tulisi ottaa tunnistamiseksi enemmän uusia aineita sekä ehkäisyyn ja hoitoon ihmisen syöpien.

Gynura procumbens

(Lour.) Merr . on tunnettu perinteinen yrtti Kaakkois-Aasiassa. Tehdas kuuluu Asteraceae perhe. Tämä kasvi on noin 10-25 cm korkea ja se esitetään meheviä, elliptinen ja kiiltävä violetin lehdet [7]. Lehdet

G. procumbens

on toiminut elintarvikkeiden vuosikymmeniä Malesiassa, missä se on yleensä kulutetaan raaka salaattia. Lisäksi kasvi on laajalti käytetty tulehduksen hoitoon, munuaisten epämukavuutta, korkea kolesteroli, diabetes, syöpä ja korkea verenpaine [7], [8]. Todellakin,

G. procumbens

käytetään perinteisesti Kaakkois-Aasiassa sen arvokasta lääkkeiden omaisuutta. Pieni molekyylipaino yhdisteitä uutettu

G. procumbens

on raportoitu näyttää syövän [9], antioksidantti [10], anti-inflammatoriset [11], anti-hyperglykeeminen ja anti-hyperlipideemisiin [12] toimintaa. Lisäksi olemme havainneet sisältää arvokkaita kasvi puolustus proteiineja, kuten peroksidaasi, taumatiini kaltaisten proteiinien ja mirakuliini päässä lehdestä

G. procumbens

[13], [14]. Kuitenkin vaikutukset proteiinin uutteen syöpiin ole koskaan määritetty. Siksi pyrimme analysoimaan sytotoksista aktiivisuutta proteiinien uutetaan lehdistä

G. procumbens

käyttämällä laktaattidehydrogenaasin (LDH) sytotoksisuusanalyysin ja sen jälkeen määrittää reitin sytotoksisuuden mekanismin kautta ilmaus leviämisen ja invaasion markkereita käsitellyssä MDA-MB-231-solujen avulla puolikvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (PCR). Lisäksi aktiiviset proteiinit tunnistettiin käyttämällä massaspektrometrianalyysi. Toivomme, että saadut tiedot ovat hyödyllisiä tulevaisuudessa intervention proteiiniperustaisista lääke syövän hoidossa.

Materiaalit ja menetelmät

Plant Materials

lehdet

G. procumbens

kerättiin Penang, Malesia. Ei erityisiä oikeuksia tarvittiin kokoelma lehtien ja tehdas ei ole suojattu kasvilajeja. Tosite määrä malleja (11209) talletettiin kasvimuseossa School of Biological Sciences, Universiti Sains Malaysia. Tuoreet lehdet pestiin kahdesti vesijohtovedellä ja lopuksi huuhdellaan tislatulla vedellä.

Protein Pura ja puhdistus

Proteiini uutettiin menetelmällä Kiba

et al.

(2003) [15] kanssa pienin muutoksin. Tuore lehdet

G

.

procumbens

(1 kg) jauhettiin hienoksi jauheeksi nestemäisessä typessä käyttäen sekoitin ja sekoitetaan 3 l uuttopuskuria [10 mM NaH

2PO

4, 15 mM Na

2HPO

4, 100 mM kaliumkloridia, 2 mM etyleenidiamiinitetraetikkahappoa, 2 mM tioureaa, 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride ja 1,5% (w /v) polyvinyylipolypyrrolidonin]. Seosta homogenoitiin 20 min välein 2 h ja niitä inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli. Homogenaattia sentrifugoitiin 15 000 rpm, 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Raaka uute pidettiin -20 ° C: ssa. Kaksi vaihetta ammoniumsulfaattisaostus käytettiin, jossa kiinteää ammoniumsulfaattia lisättiin raakaa uutetta

G. procumbens

4 ° C: ssa, kunnes 30% kyllästyminen saavutettiin. Sakka poistettiin sentrifugoimalla 30 minuuttia 13 000 rpm. Sen jälkeen, kiinteää ammoniumsulfaattia lisättiin uudelleen jäljellä supernatantin saavuttaa 70% kylläisyys, ja liuosta sentrifugoitiin 30 minuutin ajan 13 000 rpm: ssä ja pelletti otettiin talteen. Pelletti suspendoitiin sitten uudelleen deionisoidussa vedessä, kunnes täysin liuennut. Raaka saostaa ammoniumsulfaatilla proteiineja ladattiin geelisuodatuspylvästä, HiPrep ™ 16/60 Sephacryl ™ S-100 High Resolution (GE Healthcare) käyttäen ÄKTAprime plus-proteiinin puhdistus järjestelmä. Proteiinit eluoitiin 50 mM natriumfosfaattia, pH 7,2, virtausnopeudella 0,5 ml /min: n kokonaistilavuudessa 180 ml eluointipuskuria, eluaatti kerättiin fraktioita kukin 5 ml. Pitoisuus proteiinin määritettiin käyttämällä RC /DC ™ Protein Assay Kit (Bio-Rad Laboratories).

SDS-PAGE

natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) on käytetty erottaa kerätty proteiineja. Kukin fraktio sekoitettiin ei-vähentää näytepuskuriin [0,5 M Tris-HCl (pH 6,8), 10% (v /v) glyserolia, 0,02% (w /v) SDS: ää ja 0,1% (w /v) bromifenolisinistä]. Elektroforeesi prosessi ajettiin vakiojännitteellä 200V. Geeli värjättiin Coomassie Blue.

LDH Sytotoksisuusmääritys

MDA-MB-231 (HTB-26 ™) solulinjassa oli ystävällinen lahjoitus John Hopkins tutkimuskeskuksen, joka ostettiin American Type Culture Collection (ATCC). Soluja viljeltiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM) (Gibco BRL), jota oli täydennetty 10% (v /v) naudan sikiön seerumia (FBS) (Gibco BRL), 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 mg /ml streptomysiiniä (Gibco BRL ). Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% (v /v), CO

2. Sytotoksinen aktiivisuus suoritettiin käyttäen laktaattidehydrogenaasin (LDH) sytotoksisuuskokeeseen kit (BioVision, USA), LDH on soluliman entsyymi, läsnä kaikissa soluissa, joten se vapautuu elatusaineeseen, kun vahinkoa solun solukalvon tapahtuu. LDH-aktiivisuus määritettiin kytketyssä entsymaattisessa reaktiossa, jossa LDH hapetetaan laktaatin pyruvaatti, pyruvaatin muodostettu sitten reagoimaan tetratsoliumsuolan INT muodostamiseksi farmazan. Kasvu formatsaanituotteen määrän korreloi suoraan kasvu määrän lyysatuista soluista. Formatsaanipitoisuus väriaine voimakkuus mitattiin ELISA-lukijalla. Yhteensä 1,0 x 10

5 solua /ml MDA-MB-231-solut ympättiin 24-kuoppaiselle viljelylevylle, joka inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka koostuu 5% (v /v), CO

2, kunnes solukasvu saavutti noin 70% konfluenssiin. Keskipitkän kustakin kuopasta heitettiin pois, solut pestiin varovasti PBS: llä ja 2% kasvualustaa (DMEM, jota oli täydennetty 2% (v /v) FBS: ää, 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 mg /ml streptomysiiniä) lisättiin. Soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla uute (kolmena kappaleena). Sata pl viljelyalustaa poistettiin ja LDH sytotoksisuusmääritys suoritettiin manuaalinen säädetty. Sata ui elatusainetta siirrettiin immuniteettia levyn ja 100 ui reaktioseosta (seos katalyytin ja väriaineen liuosta) lisättiin kuhunkin kuoppaan. Levyä inkuboitiin 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa pimeässä. Absorbanssi kaikkien näytteiden mitattiin 490 nm: ssä ja viite aallonpituus oli 680 nm. Prosenttiosuus sytotoksisuus laskettiin [(testinäyte – low ohjaus) /(korkea ohjaus – low ohjaus)] x100, jossa alhainen ohjaus on absorbanssi viljelyalustan lisäämättä mitään uutetta ja korkea valvonta on absorbanssi viljelyväliainetta, jossa solut käsiteltiin 1% (v /v) Triton X-100 vapauttaa 100% LDH.

Polymerase Chain Reaction (PCR) analyysi

Kokonais-RNA uutettiin soluista käyttämällä RNeasy Mini Kits (Qiagen, USA). Kokonais-RNA uutettiin oli käänteistranskriptio cDNA: ksi käyttäen RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific). Ilmaisut Kahden proliferatiivisen markkereita, Ki-67 ja PCNA, ja kaksi invaasio markkereita, CCL2 ja IL6, tutkittiin käsiteltiin ja un-käsitellyn MDA-MB-231-solujen avulla PCR ja geeliä tiheysmittaus. Tasot mRNA ilmaistiin kaistan intensiteetti markkereita PCR-tuotteiden suhteessa kontrolliin beta aktiini-PCR-tuote. Alukkeet, joita käytetään PCR-reaktiot olivat seuraavat: antigeeni Ki-67, Forward: 5′-AACTATCCTCGTCTGTCCCAACAC-3 ’, Reverse: 5′-CGGCCATTGGAAAGACAGAT-3′; proliferoivan solun tuma-antigeeni (PCNA), Forward: 5’-AGAAGGTGTTGGAGGCACTCA-3 ’, Reverse: 5′-GGTTTACACCGCTGGAGCTAA-3′; kemokiini (c-c-motiivi) ligandia 2 (CCL2), Forward: 5’-GCTGTGATCTTCAAGACCATTGTG-3 ’, Reverse: 5′-AGTGAGTGTTCAAGTCTTCGGAGTT-3′; interleukiini 6 (IL6), Forward: 5’-CCAGTACCCCCAGGAGAAGATT-3 ’, Reverse: 5′-CCGTCGAGGATGTACCGAAT-3′; beta aktiini, Forward: 5’-CATTGCCGACAGGATGCA-3 ’, Reverse: 5′-CCGATCCACACGGAGTACTTG-3’. PCR-reaktiot koostuivat 5 ui cDNA: ta (5 ng), 12,5 ui Master Mix, 1 ui kutakin 20 pmol eteenpäin ja reverse-alukkeita ja DNaasi /RNaasi-vapaata vettä lopputilavuuteen 25 ui. Reaktiot asetettiin 30 sykliä seuraavissa olosuhteissa; pre-vahvistus: 94 ° C: ssa 10 min, denaturaatio: 94 ° C 20 s, pariutuminen 55 ° C: ssa 20 s, pidennys 72 ° C: ssa 30 s, päättyminen: 72 ° C: ssa 10 minuuttia. Kukin PCR-reaktio suoritettiin kolmena kappaleena ja PCR-tuotteet elektroforesoitiin 2% (paino /tilavuus) agaroosigeelillä, joka sisälsi 0,1 ug /ml EtBr. Bändit PCR-tuotteen geelillä otettiin käyttäen Gene Genius Image Analyser ja bändi intensiteetti analysoitiin käyttämällä Määrä Yksi ohjelmisto (Bio-Rad, USA).

In-geeli Digestion

geelillä digestio suoritettiin käyttämällä menetelmää, jonka [16]. Proteiinivyöhykkeet leikattiin irti SDS-PAGE. Geelipalat pestiin 100 mM ammoniumbikarbonaattia ja 10 min, ja sitten asetonitriilillä (ACN) 5 min. Tämä vaihe toistettiin kahdesti. Geelipalat kuivattiin sitten nopeus-vakuumisentrifugissa. Kuivattu geeli palaset lisättiin 10 mM DTT: 100 mM ammoniumbikarbonaattia ja inkuboitiin 1 tunnin ajan 56 ° C: ssa. Liiallinen liuos poistettiin. Geelipalat inkuboitiin sitten 55 mM jodietikkahappoa 100 mM ammoniumbikarbonaattia pimeässä 45 minuuttia huoneenlämpötilassa. Geelipalat pestiin 100 mM ammoniumbikarbonaattia ja 10 min, ja sitten asetonitriilillä (ACN) 5 min kahdesti. Geelipalat käsiteltiin 15 ng /gl trypsiiniä digestointipuskuriin [50 mM ammoniumbikarbonaattia, 5 mM CaCI

2] ja inkuboitiin 37 ° C: ssa yön yli. Supernatantissa tryptinen digestio kerättiin ja loput peptidit uutettiin 3 kertaa 5% (v /v) muurahaishappoa 30:70 ja ddH 2O: lla: ACN. Supernatantit yhdistettiin ja puhaltaa kuivattiin käyttäen typpikaasua.

Käänteisfaasikromatografia Capillary Chromatography ja massaspektrometria

Käänteisfaasi kapillaari-kromatografia (Waters ACQUITY Ultra Performance Liquid Chromatography [UPLC]) kytkettiin kvadrupoli aika- of-lennon tandem-massaspektrometrialla (Waters, Milford, MA, USA) yhdistetty LockSpary tarkka massa kalibraattori. Ionisointilähteeseen käytettiin ESI (sähkösumutus pehmeä ionisaatiota). Näyte ruiskutettiin järjestelmään kautta autosamplerista. Näytteet injektoitiin Trizaic UPLC nanoTile (Waters, Milford, MA, USA) koostui sieppaavaa sarake ja kapillaarikolonni. Proteiini sulattaa oli ennalta keskittynyt ja suolanpoisto ansastusta pylväs patruuna pakattu 1,8 um High Strength piidioksidi (HSS) partikkeli virtausnopeudella 8

μ

l /min 99% A: 3 minuuttia. Peptidit eluoitiin sitten käänteisfaasi-kapillaarikolonnia (1,8 um HSS hiukkanen, 85 um x 100 mm) gradientilla tilassa 3% B 40% B 30 minuutin ajan virtausnopeudella 0,45 ul /min. Liuotin A koostui vettä, jossa on 0,1% muurahaishappoa, ja liuotin B koostui asetonitriili, jossa oli 0,1% (v /v) muurahaishappoa. Eluaatti MS järjestelmään. Kaikki massaspektrit hankittiin käyttäen Q-TOF massaspektrometrillä. Q-TOF parametrit asetettiin seuraavasti: positiivinen toiminto; kapillaari, 3,2 kV; näytteenotto kartio, 28,0; louhinta kartio, 2,0; lähteen lämpötila, 70 ° C; desolvaatiolämpötila, 200 ° C; kartio kaasun virtaus, 40,0 l /h; desolvation kaasun virtaus, 600,0 L /h; scan aika, 0,2 s. Spektrit rekisteröitiin

m /z

2 1200. Ulkoinen kalibrointi sovellettiin kaikkiin dataa [Glu1] -Fibrinopeptide B standardi (Waters). Kysely scan hankinta tehtiin linjassa kapillaari kromatografinen erottaminen; aluksi TOF-MS scan hankittiin yli massa alueella 2-1200 m /z sekunnissa, kytkentäkorvakkeella kriteerit MS MS /MS että mukana ioni intensiteetti (100 pulssia /s) ja varaustila (+2). MS /MS lähtöaineiden ioni valitaan ostettiin yli massa alueella 50-1600 m /z. Törmäys energia oli 6 eV.

Proteiinitunnistus

Tietokantahaku suoritettiin MS /MS-tiedot on luotu käyttäen koko taksonomian järjestys

Viridiplantae

alle SwissProt tietokantaan. Peptidi toleranssi ja fragmentti massan toleranssi oli asetettu 0,1 BDA ja 2 Da, vastaavasti, ja vain yksi jäi pilkkominen on sallittua. Carbamidomethylated kysteiiniä asetettiin vahvistettu muutos, kun taas hapettunut metioniini asetettiin muuttuja muutos.

Tilastollinen analyysi

Tulokset esitetään keskiarvona ± keskivirhe (SE) kolmen indepent kokeiluja ja tilastollinen analyysi oli tehdään käyttäen Studentin t-testiä. Arvo p 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä.

Tulokset

Lievä fosfaattipuskuria käytetään erottamaan proteiinien lehtiä

G. procumbens

estämiseksi denaturaatio proteiinien.

In vitro

bioaktiivisuus tutkimus osoitti, että pakastekuivattu raakaa lehtien uute

G. procumbens

hallussaan anti-proliferaatioaktiivisuuden vastaan ​​rintasyöpä MDA-MB-231. Näin ollen fraktiointi proteiinin uute tehtiin, jotta proteiinin eristämiseen (t) kohteisiin. Ammoniumsulfaattisaostus käytettiin ensimmäisenä vaiheena puhdistuksessa proteiinien menetelmä on ei-denaturoivalla proteiineihin, tämä suolasaostus Menetelmän tarkoituksena poistaa pieni molekyylipaino yhdisteitä uutteesta [17]. Saostunut suola proteiinit alistettiin sitten geelisuodatus, jossa edelleen proteiinien erottamiseen koon mukaan suoritettiin. Eluaatin geelisuodatuskromatografialla kerättiin fraktioita 5 ml: n tilavuuteen kukin. Kaikki fraktiot testattiin anti-leviämisen tehoaa rintasyövän solulinjaa, MDA-MB-231

in vitro

. Voimakas anti-leviämisen aktiivisuutta havaittiin fraktioissa 11 ja 12, jossa osa 11 koostui 51

st 55

th ml eluaattia kun jae 12 kerättiin 56

th 60

th ml eluaattia (kuvio 1) ja yhteensä 180 ml: lla eluutiopuskuria käyttää. Kuvio 2 esittää SDS-PAGE-analyysi fraktioista 9 14.

geelisuodatuksella erottaminen suoritettiin käyttäen HiPrep 16/60 Sephacryl S-100 HR pylvääseen. Proteiini fraktiot eluoitiin 50 mM natriumfosfaattia, pH 7,2, ja virtausnopeus 0,5 ml /min. Aktiiviset proteiinifraktiot 11 ja 12 eluoitiin ulos 50 ml 60 ml: aan eluointipuskuria.

Alustavien analyysissä havaittiin, että jakeet 11 ja 12 hallussaan anti-leviämisen aktiivisuutta MDA-MB-231. Sekä jakeet 11 ja 12 osoittivat identtiset proteiiniprofiileja.

Fraktiot 11 ja 12 yhdistettiin ja kutsutaan SN-F11 /12. LDH sytotoksisuusmääritys suoritettiin MDA-MB-231-solulinja, jossa solu käsiteltiin SN-F11 /12. Kuvio 3a esittää prosenttiosuutta LDH vapautuu elatusaineet, jotka käsiteltiin eri pitoisuuksilla (5-25 ug /ml), SN-F11 /12, hoidot suoritettiin 24, 30, 36, 42 ja 48 tuntia ja jokaisen hoitojakson jälkeen LDH prosenttiosuus vapautuu medioissa mitattiin. Tehokas konsentraatio (EY

50)-arvo määritellään konsentraationa, joka ilmaistaan ​​mikrogrammoina /ml proteiinien uutteen, joka inhiboi 50% solujen kasvun. EY

50-arvot eri hoitojaksojen määritettiin ja on esitetty kuviossa 3b, josta jatkuva EY

50-arvo SN-F11 /12: n havaittiin olevan 3,8 ug /ml proteiineja.

Jokainen käyrä% LDH: n vapautuminen piirrettiin kunkin hoidon ajankohtana. B. EC50-arvo piirrettiin kunkin käsittelyaika pisteen määrittämiseksi jatkuvan EC50-arvo. Jatkuva EC 50-arvon SN-F11 /12 MDA-MB-231 oli 3,8 ug /ml.

Lisäksi arvioinnin anti-leviämisen mekanismi näytteillä SN-F11 /12 MDA-MB -231 suoritettiin käyttäen PCR-tekniikkaa, jossa määritetään vakio EC50-arvo oli käytetty hoitoon MDA-MB-231-soluihin ja sen jälkeen ilmentyminen kaksi proliferatiivisen markkereita, Ki67 ja PCNA, tutkittiin. Beeta-aktiini käytettiin lastaus ohjaus. Ekspression Ki-67 ja PCNA havaittiin alassäädetty verrattuna soluihin, joita kasvatetaan ilman hoitoa (kuvio 4a). Ki-67 ilmentyminen väheni merkittävästi MDA-MB-23 solujen jälkeen 36 ja 48 tuntia hoidon SN-F11 /12 verrattuna YK-käsitellyt solut. Ilmaus PCNA välillä käsiteltyjen ja un-käsiteltyjen solujen ei ollut merkitsevästi erilainen, vaikka SN-F11 /12 käsitellyt solut ilmaistu alemmilla PCNA (kuvio 4b).

Kuvioissa normalisoitu mRNA: n ilmentymisen (A) Ki67 ja (B) PCNA käsitellyissä MDA-MB-231-soluja. Kohdegeenin mRNA: n ekspressio oli normalisoitu mRNA: n ilmentymisen beeta-aktiini. Kukin data edustaa keskiarvo ± SE kolmesta itsenäisestä kokeesta. Tilastollinen analyysi määritettiin käyttämällä Studentin

t

testi *

p

0,05 tilastollista merkittävyyttä, verrattuna ei-käsitellyt solut kussakin aikapisteessä.

lisäksi proliferatiivisen markkereita, ilmaisu kahden hyökkäyksen markkereita, CCL-2 ja IL-6 tutkittiin myös käyttäen PCR-tekniikkaa. Ilmaisu CCL2 MDA-MB-231 kennoa alassäädetty jälkeen SN-F11 /12 kohtelun kuin YK-käsitellyn solu (kuva 5a). Sitä vastoin, IL-6, joka on yleensä mukana edistämässä soluinvaasion, havaittiin säädelty seuraavat SN-F11 /12 hoitoa (kuvio 5b).

Kuvioissa normalisoitu mRNA ilmentymistä (A) CCL2 ja (B) IL6 käsitellyissä MDA-MB-231-soluja. Kohdegeenin mRNA: n ekspressio oli normalisoitu mRNA: n ilmentymisen beeta-aktiini. Kukin data edustaa keskiarvo ± SE kolmesta itsenäisestä kokeesta. Tilastollinen analyysi määritettiin käyttämällä Studentin

t

testi *

p

0,05 tilastollista merkittävyyttä, verrattuna ei-käsitellyt solut kussakin aikapisteessä.

SDS-PAGE-proteiinin profiloinnin SN-F11 /12 osoitti, että läsnä on 15-proteiinin bändejä, jokainen juova leikattiin in-geeli-hydrolyysillä, ja tryptisen-pilkottu peptidit analysoitiin käyttäen LC /Q-TOF. Kuvio 6 esittää SDS-PAGE-profiili aktiivisen fraktion SN-F11 /12 ja proteiini tunnistettiin on lueteltu taulukossa 1, 13 Proteiinivyöhykkeet onnistuneesti tunnistettu, kun taas 2-proteiinin bändejä ei havaittu proteiinin osumia.

tunnistettu proteiini vyöhykkeet numeroidaan osoitettu oikealla. Analyysissä tunnistettiin 15 proteiinia bändejä geelillä.

Keskustelu

Aiemmin pieni molekyylipaino yhdisteitä lehtiä Etanolisuodos otteen ja lehtien vesiuute

G. procumbens

oli osoitettu estävän kasvua rintasyövän T47D [9] ja ihmisen mesangiosyyttien proliferaatiota [18], vastaavasti. Tähän mennessä ei ole tietoa bioaktiivisuus proteiinin ote lehdestä

G. procumbens

. Tämä on ensimmäinen raportti paljastaa sytotoksisen omaisuutta lehtiä proteiinien

G. procumbens

. Tässä tutkimuksessa lehtiä teiiniuutteissa

G. procumbens

tehtiin muutamia puhdistusvaiheessa ennen kuin niitä käytetään testaukseen. Uutteet Ensimmäinen tehtiin suola sademäärä poistaa molekyylipainoltaan pienten yhdisteiden kun proteiinit suolattu ulos kuin pelletti. Pelletti on osoitettu olevan sytotoksista aktiivisuutta on MDA-MB-231 rintasyövän solulinja tarkasteltiin käännettyä mikroskooppia. Sen jälkeen pelletti joka puhdistettiin geelisuodatuksella poistamiseksi suolaa ja myös muita proteiinien erottamiseen koon mukaan [17]. Tämän jälkeen aktiivista proteiinia fraktiot 11 ja 12 olevan samanlainen proteiinin profiilit ja ne yhdistettiin, koska SN-F11 /12 osa. SN-F11 /12 havaittiin olevan voimakas sytotoksinen aktiivisuus MDA-MB-23 rintasyöpäsolulinja arvioimana LDH sytotoksisuusanalyysin.

kerätyt tiedot LDH sytotoksisuuden määritys osoitti, että SN-F11 /12 näkyviin voimakas estävä ominaisuus kasvuun MDA-MB-231-solujen vakio EC 50-arvon 3,8 ug /ml. Anti-proliferatiivista vaikutusta SN-F11 /12 paljasti tukahduttaminen mRNA: iden kahden proliferaation markkerit, eli Ki67 ja PCNA, jotka ovat välttämättömiä DNA: n replikaatiota [20]. Molemmat markkerit ovat solusyklin liittyvät geenit, joita käytetään yleisesti arvioinnissa

in vitro

anti-proliferatiivista lääkkeiden [19]. Ki67 on tuma-antigeeni ilmaistu G1, G2 ja M vaiheissa [20], kun PCNA ilmaistaan ​​G1, G2 ja S vaiheet [21] solusykliä. Tuloksemme osoittivat ero ilmentymistä näiden kahden merkkiaineiden SN-F11 /12-käsiteltyjen ja un-käsitellyn MDA-MB-231-solujen, joissa ilmentyminen Ki67 mRNA oli merkittävästi (p 0,05) alassäädetty jälkimmäisessä taas vähentäminen PCNA mRNA ilmaisun ei näyttänyt eroavan merkittävästi. Ki67 ja PCNA on erityispiirteitä ja puoliintumisaika [22]. Yleensä ilmaus Ki67 on ainoastaan ​​osoittaa solujen lisääntymistä, kun taas PCNA ilmaisun lisäksi solujen lisääntymistä, osoittaa myös DNA: n korjaukseen tai solukuolemaan. Havainto eri tasojen Ki67 mRNA ja PCNA mRNA voitaisiin katsoa johtuvan puoliintumisaika PCNA, joka on 20 kertaa pidempi kuin Ki67. Lisäksi PCNA proteiini löytyy postitse solusyklin ja solukuolemaa. Havaitseminen PCNA jälkeen solukuoleman voivat olla syynä merkityksetön ero PCNA ilmentymisen välillä SN-F11 /12-käsiteltyjen ja un-käsitellyn MDA-MB-231-soluja. Siksi antiproliferatiivista vaikutusta SN-F11 /12 MDA-MB-231-solujen on todennäköisesti korreloi Ki67 ja PCNA, yleisesti käytetty proliferatiivisia indeksit

in vitro

tutkimuksessa.

CCL2 ja IL6 ovat mukana syöpäsoluinvaasiota. Tässä prosessissa syövän kehityksen CCL2 yhdessä makrofagien kasvutekijä (M-CSF) ja endoteelikasvutekijä (VEGF) on aktiivinen rooli rekrytoida kiertävän verimonosyyteissä kasvainkohtaan, jossa palvelukseen monosyytit erotellaan kasvaimeen liittyvä makrofagit (TAM) ja luoda symbioosissa syöpäsoluja. Sen jälkeen, TAM erittävät kasvutekijöitä, kuten EGF, TGF, FGF, VEGF, IL1, TNF: n ja IL6, jotka edistävät kasvainsolun proliferaatiota, invaasio ja metastaasi [23]. MRNA ilmaisuja kahden hyökkäyksen markkereita, CCL2 ja IL6, olivat käänteisesti toisiinsa. CCL2-mRNA alassäädetty kun IL6 mRNA ilmaisu oli säädellään ylöspäin SN-F11 /12-käsiteltyjen MDA-MB-231-soluja. CCL2 on yksi kemokiinien välttämätöntä rintasyövän kehittymistä ja etenemistä [24]. Yliekspressio CCL2 edistää rintasyövän metastaasi [25]. Päinvastoin, inhibition CCL2 ja sen reseptori-signalointireitin vähentää etäpesäkkeiden

in vivo

ja pidentää selviytymisen kasvaimen kantavien hiirten [26]. IL6 on interleukiini joka on avainasemassa patofysiologiassa useiden syöpien ja eri tulehdussairauksiin immuunijärjestelmän [27]. IL6 yli-ilmentyminen on osallisena tuumorigeneesiä multippelin myelooman, munasarja-, munuaissolukarsinooma, eturauhassyöpä, kohdunkaulan ja rintasyövät [28], [29], [30], [31]. Aikaisemmassa tutkimuksessa, CCL2 ilmoitettiin edistää keuhkofibroosin vähentämällä IL6 tasot [32]. Tässä tutkimuksessa hoitoa MDA-MB-231-solujen kanssa SN-F11 /12 vähentynyt ilmentyminen CCL2 mRNA soluissa. Päinvastoin, ilmaus IL6 mRNA SN-F11 /12-käsiteltyjen MDA-MB-231-soluissa oli säädelty verrattuna YK-käsitellyt solut. Kuten IL6 oli osoitettu olevan pleiotrooppinen sytokiini, sekä kasvaimen edistävää ja estävä aktiivisuus [33], ylös-ekspression säätelyn IL6 mRNA: n SN-F11 /12-käsiteltyjen MDA-MB-231-solut voivat aiheuttaa estävä vaikutus kasvuun rintasyövän solulinjassa.

SN-F11 /12 on osoittanut lupaavia tuloksia anti-leviämisen ja anti-invaasion MDA-MB-231-solut, proteiini fraktio arvioitiin edelleen SDS-PAGE: lla ja massaspektrometrialla analyysi. Kahdestatoista proteiinien tunnistettu SN-F11 /12, kaksi proteiinia, nimittäin superoksididismutaasi cooper sinkki (Cu, Zn-SOD) ja Toll interleukiini 1 -reseptorin-Nucleotide Binding Site-Leu-Rich Toista (TIR-NBS-LRR) luokka taudinkestävyys proteiini kuului kasvin puolustukseen proteiinien luokka. Nämä kasvien puolustus proteiinien on myös havaittu

Corydalis cava

mukuloita poimimaan joissa niiden todettiin estävän kasvua HeLa solulinjan [34]. Superoksididismutaasi (SOD), on antioksidantti, joka katalysoi jakaantumisen superoksidi anionisen radikaalit vetyperoksidin ja hapen [35]. Proteiini kuuluu metalloenzyme ryhmään, jossa toiminta perustuu metalli-ionin muodossa Cu, Zn-SOD: n, Mn-SOD: n ja Fe-SOD [36]. Zhang

et al

. (2002) [37], on raportoitu, että yliekspressio Cu, Zn-SOD estää kasvua ihmisen kasvainsoluissa. Kuitenkin, Cu, Zn-SOD uutetaan valkosipuli näytetään antagonisti vaikutus doksorubisiini, yksi yleisimmin käytetty syöpälääkkeiden, lievittää syöpälääke kasvainsolusytotoksisuuden solulinjoissa [38], [39]. Meidän olevassa tutkimuksessa, Cu, Zn-SOD havaittiin neljässä eri proteiinia bändejä SN-F11 /12. Kuitenkin, onko Cu, Zn-SOD on proteiini, joka edistää syövän ominaisuuden aktiivisen proteiinin osa SN-F11 /12 vaatii tarkempaa arviointia.

TIR-NBS-LRR-luokan tautiresistenssin ( R) proteiineja on raportoitu keskeinen merkitys ohjelmoidun solukuoleman osana laitoksen immuunijärjestelmä [40]. NBS domains osoittavat ATPaasiaktiivisuus kun LRR verkkotunnuksen tiedetään välittävän proteiini-proteiini ja proteiini-ligandi vuorovaikutusten. TIR-NBS-LRR luokan taudinkestävyys (R) proteiinit on mukana erityinen tunnustamista patogeeniperäinen elisiittorin [41]. Vuonna kasvikunnan, TIR verkkotunnus, on läsnä N-päässä R-proteiinien kuljettaa NBS ja LRR, samalla välttämätön solukuolemaan signalointi [42].

Askorbaattioksidaasitesti peroksidaasi (APX) on kasvi puolustus proteiini, joka havaittiin myös SN-F11 /12. APX yhdessä glutationiperoksidaasi ja katalaasi, muodostavat antioksidantti entsyymejä, jotka osallistuvat vieroitus vetyperoksidia (H

2O

2). Sen jälkeen, kun vetyperoksidin muodostumisen kautta entsymaattisen reaktion SOD, vieroitus vetyperoksidia suoritetaan näiden antioksidantti entsyymejä, jotka katalysoivat vetyperoksidin vettä [43]. Tasapaino suhde SOD antioksidantti entsyymejä on tarpeen asianmukaisen toiminta solun, jossa korkea SOD suhteessa antioksidanttientsyymejä johtaa kertyminen superoksidiradikaalien jotka ovat myrkyllisiä makromolekyylien taas alhainen SOD suhteellisen antioksidantti entsyymien johtaa kasvuun vetyperoksidin pitoisuus, joka myöhemmin muunnetaan hydroksidin radikaali (OH), joka on hyvin reaktiivinen laji, joka on vastuussa hapettumista solun [37].

malaattidehydrogenaasi oli runsain proteiini havaitaan aktiivisen proteiinin osa SN-F11 /12, koska se havaittiin seitsemän SDS-PAGE-proteiinijuovat. Malaattidehydrogenaasin katalysoi palautuvan NAD

+ – riippuvaista-dehydrogenaasin reaktio TCA cycle [44]. Kim

et. al

(2008) [45] paljasti, että aktiivisuus malaattidehydrogenaasi antagonisoi aktiivisuus glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasin, että dehydroepiandrosterone (DHEA) käsiteltiin maksasolusyövän rotilla.