Krooninen sairaus

tiivistelmä

Enhancer of zeste homologin 2 (EZH2), his- metyylitransferaasin on Polycomb- Sortavat monimutkainen 2 katalysoiva histoni H3 lysiinin 27 tri-metylaatio (H3K27me3), on usein säädelty ihmisen syövissä. Tässä tutkimuksessa olemme tunnistaneet tuumorisuppressori Poistetut maksasyöpää 1 (DLC1) tavoitteeksi asetettiin tukahduttamisen EZH2 välittämän H3K27me3. DLC1 on GTPaasia aktivoivan proteiinin Rho proteiinit. Inaktivointi DLC1 johtaa hyper-aktivoitu Rho /ROCK signalointi ja on sekaantunut aktiinisytoskeletonin uudelleenjärjestely edistää syövän etäpesäkkeiden. By Kromatiini immuunisaostustesti, olemme osoittaneet, että H3K27me3 merkittävästi rikastettu DLC1 promoottorialueen, joka DLC1-nonexpressing HCC-solulinjassa, MHCC97L. Köyhtyminen EZH2 in MHCC97L by shRNA alennettu H3K27me3 tasolla DLC1 promoottori ja aiheuttama DLC1 geeni uudelleen ilme. Kääntäen, ohimenevä yli-ilmentyminen GFP-EZH2 in DLC1 ilmentäviä Huh7 solujen pienentää DLC1 mRNA tason kanssa samanaikaisesti rikastaminen EZH2 on DLC1 promoottori. Käänteinen suhde EZH2 ja DLC1 ekspressiota havaittiin maksassa, keuhko-, rinta-, eturauhas-, ja munasarjasyöpä kudoksiin. Syövän solut EZH2 pieni molekyyli inhibiittoria, 3-Deazaneplanocin A (DZNep), kunnostettu DLC1 sen erilaisissa syöpäsolulinjoissa, mikä osoittaa, että EZH2-välitteinen H3K27me3 epigeneettisellä sääntely DLC1 oli yhteinen mekanismi ihmisen syövissä. Mikä tärkeintä, olemme huomanneet, että DZNep hoito esti HCC solujen vaeltamiseen läpi häiritsevät aktiinisytoskeletonin verkkoon, mikä viittaa terapeuttista potentiaalia DZNep kohdentamisessa syövän etäpesäkkeiden. Yhdessä tutkimuksemme on vuodattanut mekanistinen käsityksen EZH2-H3K27me3 epigeneettisellä tukahduttaminen DLC1 ja kannatti merkittävä pro-metastasoitunut rooli EZH2 kautta tukahduttaa kasvaimen ja etäpesäkkeiden vaimentimet.

Citation: Au SL-K, Wong CC- L, Lee JM-F, Wong CM, Ng IO-L (2013) EZH2 välittämää H3K27me3 osallistuu Epigeneettiset tukahduttaminen Poistettu in Maksasyöpä 1 ihmisen syövissä. PLoS ONE 8 (6): e68226. doi: 10,1371 /journal.pone.0068226

Editor: William B. Coleman, University of North Carolina School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 05 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 28 toukokuu 2013; Julkaistu: 27 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Au et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukivat yliopisto Hong Kong SeedFunding ohjelma perustutkimus (200811159061 ja 201011159045 sen jäteperäisiä), Hong Kong Research Grants neuvosto General Research Fund (HKU 782411M on CMW) ja Hong Kong Research Grants neuvosto Collaborative Research Fund (HKU 1 /06C ja HKU 7 /CRG /09 IN). IN on Loke Yew professori Pathology. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ilmoittavat, että toinen kirjoittaja Chun-Ming Wong on PLoS One Editorial Board jäsen ja tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja. Kaikki muut Kirjoittajat julistaa ole kilpailevia taloudellisia etuja.

Johdanto

vapautuminen ylävirran epigenetic säätelevien proteiinien edistää epigeneettisellä muutoksia ja osaltaan poikkeava vaiennettu tuumorisuppressorigeeneille ihmisen syövissä [1]. Enhancer of zeste homologin 2 (EZH2), katalyyttinen alayksikkö Polycomb- Sortavat Complex 2 (PRC2), on yksi yleisimmin säädelty epigeneettiset sääntelyviranomaisten eri ihmisen syövissä [2-5]. EZH2 on histoni metyylitransferaasin joka nimenomaan katalysoi histoni H3 lysiinin 27 tri-metylaatio (H3K27me3), joka puolestaan ​​toimii tukahduttavan histonimodifikaation on epigeneettiseltä ohjaamaan geenin transkriptiota [6,7]. Up-regulation EZH2 keskeinen rooli pahanlaatuinen etenemiseen ja oli mukana syövän etäpesäkkeiden [2]. EZH2 toimii onkogeenin eri ihmisen syövissä pääasiassa epigeneettisellä vaiennettu kasvain ja etäpesäke synnyssä, kuten E-kadheriinin [8], RUNX3 [9], SLIT2 [10], DAB2IP [11], ja KLF2 [12]. Viime aikoina olemme myös raportoitu, että EZH2 epigeneettiseltä inaktivoi ilmauksia useita kasvainten ja etäpesäkkeiden vaimennin MikroRNA (miRNA), kuten miR-125b ja miR-139 ihmisen maksasolusyövän (HCC), mikä edistää HCC tuumorigeenisyyteen ja etäpesäkkeiden [13]. Identifioida uusia tavoitteita, vaiennetaan EZH2 paremmin paljastaa molekyyli- roolit EZH2 syövän etäpesäkkeiden joka hyödyttää kehitystä chemotherapies kohdistaminen EZH2.

DLC1 tunnistettiin

bona fide

tuumorisuppressorigeeniä on toistuvasti poistettava geenivirhe kromosomissa 8p21 HCC [14]. DLC1 on Rho GTPaasia aktivoiva proteiini (RhoGAP) paikallistaa paikallisiin tarttumisiin [15,16], ja se on spesifinen ohjaamiseksi aktiivisuuden RhoA, B, C ja Cdc42 [17,18]. RhoGAP aktiivisuus DLC1 säätelee negatiivisesti nämä Rho proteiinien stimuloimalla niiden luontainen GTP hydrolyyttistä aktiivisuutta, mikä muuntaa ne aktiivisen GTP-sidottu tilasta aktiivinen BKT sitoutuneena. Rho signalointiryöpyn mahdollistaa asianmukaisen hallinnan monia biologisia prosesseja, kuten solujen proliferaatio [19] ja solujen liikkumisen [20] normaaleissa soluissa. Aikana maligniteetti kehitys, DLC1 /Rho reitti on erityisen tärkeä, koska sen asetuksen aktiinisytoskeletonin liittyvät syöpäsolujen leviämiseen. Olemme osoittaneet, että menetys DLC1 HCC aktivoitu RhoA, joka myöhemmin aktivoidaan sen alavirtavaikuttajainhibiittorit Rho-kinaasia (ROCK) uudistaa aktiinitukirankaan verkon solun kulkua ja invaasiota [21,22]. Muut erilaiset tuumoria tukahduttavan roolit DLC1 kuuluu sovittelu kaspaasi-3-riippuvaista apoptoosia HCC malli [23], VEGF-riippuvaisten angiogeneesin eturauhassyövän malli [24], ja tukahduttaminen kyky muodostaa klooneja on useita erilaisia ​​syöpiä [25]. Down-regulation DLC1 on yleisesti esitetty monenlaisia ​​ihmisen maligniteettien [26] ja sen menetys ilmentyminen klassisesti liittyy kromosomi poistetaan tai promoottori DNA hypermetylaation (Yuan ym 1998; Ng et al 2000; Wong et al 2003; Kim et al 2003). Tässä esillä olevassa tutkimuksessa olemme toimittanut ensimmäiset todisteet että DLC1 on uusi tavoite tukahduttamisen EZH2 välittämän H3K27me3. Olemme edelleen osoitti inaktivointi EZH2 3-Deazaneplanocin A (DZNep) että uudelleen ilmaisi DLC1 ja huomattavan lakkautetaan solun tukirangan uudelleenjärjestelyjä ja esti soluvaelluksen syöpäsoluja. Yhdessä meidän havainnot viittaavat siihen, että epigeneettisellä vaiennettu DLC1 on mukana pro-metastasoitunut toiminta EZH2 ihmisen syövissä.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

SMMC-7721 solulinja (Shanghai Institute of Cell Biology) ja Huh 7 solulinja (japanilainen Cancer Research Bank) ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM) -korkea glukoosia. MHCC97L solulinja (lahja prof Z.Y. Tang Fudanin yliopiston, Shanghai) [27] ja Miha solulinja (Shanghai Institute of Cell Biology) ylläpidettiin DMEM-korkean glukoosin täydennetty natriumpyruvaattia. HeLa-solulinja (American Type Culture Collection), pidettiin DMEM-alhainen glukoosi. CNE2 (American Type Culture Collection) ja HCT116 (lahja prof B. Vogelstein, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD) [28] solulinjoja ylläpidettiin Roswell Park Memorial Institute 1640-väliaine. Kaikki alustaan ​​lisättiin 10% naudan sikiön seerumia ja 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja streptomysiiniä.

bisulfiittimodifikaatio ja metylointianalyysi

bisulfiittimodifikaatio genomi-DNA uutettiin solulinjoista tehtiin käyttäen EZ DNA metylointi-Direct Kit (ZYMO Research, Orange, CA, USA) valmistajan ohjeiden. Käytetyt alukkeet monistamiseen DLC1 promoottorin jälkeen bisulfiittimodifikaatio ovat: 5′-GTTTTTAGTTAGGATATGGT-3 ’(eteenpäin) ja 5′-ACTTCTTTCTACACATCAAACAC-3′ (taaksepäin) ja BS-1 alueella; ja 5’-TAGAGTTATTAAGAAAAAGAAGGGA-3 ’(eteenpäin) ja 5′-AAAACTAAAATATTTCCCCCAC-3’ (reverse) BS-2 alue. PCR-tuote kloonattiin TOPO TA Cloning vektoriin (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja sekvensointi Yksittäisten kloonien suoritettiin Sangerin sekvensoinnilla.

Kromatiini immunosaostuksella (ChIP) määritys

ChIP määritys suoritettiin käyttäen EZ ChIP kit (Millipore, Billerica, MA, USA), kuten aiemmin on kuvattu [13]. ChIP-luokan vasta-ainetta vastaan ​​H3K9me3 (ab8898; Abcam, Cambridge, MA, USA), H3K27me3 (07-449; Millipore, Billerica, MA, USA) ja EZH2 (# 3147; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) käytettiin määrityksessä. Kani-IgG (Millipore, Billerica, MA, USA) tai hiiren IgG: tä (Millipore, Bedford, MA, USA) käytettiin negatiivisena kontrollina määrityksessä. Alukkeet kattavat -394nt on -325nt ylävirtaan DLC1 transkription aloituskohdasta käytettiin: 5′-CACCTC CGCCAAGTAAATGC-3 ’(eteenpäin) ja 5′-CCGAAAAGTCGCCAACTATTG-3’ (taaksepäin). Kvantitointi vasta-sitoutuneen alueella tehtiin qPCR suoritettiin ABI Prism 7700 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA).

In vitro

epigeneettisiä lääkkeiden hoito

DZNep (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA) liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA). 5-atsa-dC (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) liuotettiin 50% etikkahappoa. TSA (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) liuotettiin etanoliin. Liuotin kemikaalien käytettiin mock vastaavan hoidossa. Sillä DZNep hoitoon, DZNep (1 uM tai 10 uM) lisättiin elatusaineeseen 48 tai 72 tuntia. 5-atsa-dC hoitoon, 5-atsa-dC (10 uM) täytetään päivittäin 72 tunnin ajan. TSA hoito, TSA (0,25 ug /ml) vasta lisättiin soluille viimeisen 24 tunnin kokeen.

Cell migraatiokokeessa

Ennen solujen migraatiokokeessa, 2×10

5 MHCC97L soluja käsiteltiin 1 uM DZNep 48 tuntia. Mock ja DZNep käsiteltyjä soluja (1×10

5) soluja ympättiin ylemmässä kammiossa 8 um-huokoskoko TranswellTM aseta (Millipore, Billerica, MA, USA). Alempi kammio sisälsi väliaine kerättiin käsittelemättömien MHCC97L solujen houkuttelemiseksi solumigraatiota 18 tuntia. Siirtyneet solut kiinnitettiin metanolilla ja värjättiin kristallivioletilla. Kolme riippumatonta näkymät Transwell kalvon valokuvattiin ja kuinka monen solujen laskettiin.

Immunofluoresenssitesti (IF) mikroskopia ja pyyhkäisyelektronimikrosko- (SEM) B

Ennen IF kuvantamisen, 2×10

5 MHCC97L soluja käsiteltiin 1 uM DZNep 48 tuntia. Käsittelyn jälkeen, mock ja DZNep-käsiteltyjä soluja (1×10

5) solut trypsinoitiin ja ympättiin peitelaseilla DZNep viljelyalusta 24 tuntia. Solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä PBS: ssä ja tehtiin läpäiseviksi 0,2% Triton-X-100. Paikallisessa tarttumisessa värjättiin anti-paksilliini-vasta-aine (05-417; Millipore, Billerica, MA, USA). F-aktiini visualisoitiin värjäämällä FITC-konjugoitua phalloidin (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA). Tumat vastavärjättiin DAPI: lla (Calbiochem, San Diego, CA, USA). IF kuvia näytettiin ja siepattiin käyttäen Leica Q550CW fluoresenssimikroskooppia (Leica, Wetzler, Saksa). SEM, mock ja DZNep-käsitellyt solut fiksoitiin 1% osmiumtetroksidilla ja 2,5% glutaldehyde, jonka jälkeen vaiheittain etanolia nestehukka. Kun vaihe kriittisen pisteen kuiva, dioja asennettiin hopea tahna. Kuvat skannattiin ja jää alle × 2000 suurennus käyttäen Hitachi S-4800 FEG Pyyhkäisyelektronimikroskooppi.

Tilastollinen

Ei-parametriset data ja jatkuva parametritietoja analysoitiin Mann Whiteney U testi ja

t

testi, vastaavasti käyttäen GraphPad Prism versio 5.00 (GraphPad Software, San Diego Kalifornia USA). Testit pidettiin merkittävinä, kun

P

arvo oli alle 0,05.

Tulokset

H3K27me3 taso differentiaalidekoodataan rikastuu DLC1 promoottori kuolemattomaksi normaalissa maksasolujen ja HCC solulinjat

roolin ymmärtämiseksi epigeneettiset sääntelyn purkamisen ja DLC1 inaktivaatio HCC aloitimme analysoimalla DLC1 promoottorin metylaation tilan bisulfide sekvensoimalla on kuolemattomaksi normaalissa hepatosyyttisolulinjasta Miha ja kaksi HCC solulinjoista SMMC-7721 ja MHCC97L. DLC1 promoottori oli täysin metyloitumaton vuonna Miha, heterogeenisesti ja osittain metyloitu MHCC97L, ja täysin metyloitu SMMC-7721 (kuvio 1A). Metylaatiostatuksen DLC1 vuonna Miha ja SMMC-7721 korreloivat hyvin niiden DLC1 transkription tasoa. Mutta MHCC97L, jonka DLC1 promoottori vain osittain metyloitu, täydellinen hiljentämisen DLC1 ehdotti, että muut epigeneettisiä määräykset voivat olla mukana (kuvio 1 B). Siksi arveltu, että poikkeava histoni metylaatio saattaa myötävaikuttaa DLC1 hiljentämisen MHCC97L. Kromatiinin immunosaostus (chip) analyysi suoritettiin arvioimaan rikastumista transkription tukahduttavia histonimodifikaation, H3K9me3 ja H3K27me3, on DLC1 promoottori (kuvio 1 C). Osoitimme, että H3K9me3 ja H3K27me3 eivät olleet havaittavissa Miha ja tämä oli sopusoinnussa kopioinnin suhteen aktiivisia tilan DLC1 geenin tässä solulinjassa. Sen sijaan, rikastaminen sekä transkriptio- tukahduttavia H3K27me3 ja H3K9me3 havaittiin klo DLC1 edistäjä SMMC-7721 ja MHCC97L soluja. Mielenkiintoista, H3K27me3 oli runsaammin rikastunut MHCC97L verrattuna SMMC-7721. Tämä havainto osoittaa, että sen lisäksi, että osittaisen DNA: n metylaatio, H3K27me3 osallistui myös epigeneettisenä hiljentäminen täysin transkriptionaalisesti inaktivoimiseksi DLC1 geenin MHCC97L.

Promoottori DNA: n metylaation ja histoni muuttaminen DLC1 HCC solulinjoissa.

(A) kaaviokuva osoittaa CpG saari sijaitsee DLC1 lokuksessa. DNA: n metylaatio tilan 45 CpG dinukleotidien (BS-1 alue sisältyy 35 CpG dinulceotides ja BS-2 alue oli 10 CpG dinukleotideissä) sovellettiin bisulfiittia Sekvensointianalyysin. Miha osoitti täydellisen unmethylation, MHCC97L osoitti osittaista metylaatio ja SMMC-7721 osoitti täydellisen metyloinnin. Avoin ympyrä edustaa metyloimattoman CpG dinukleotidejä ja ympyrä edustaa metyloitu CpG dinukleotideissä. Kukin pylväs edustaa yksittäinen klooni sekvensoitiin. (B) RT-PCR: llä (ylempi paneeli) ja qRT-PCR: llä (alapaneeli) esittää havaittavissa DLC1 mRNA: n ekspression Miha, mutta ei MHCC97L ja SMMC-7721-soluja. (C) Kromatiini immunosaostuksella (chip) määritys yhdistettynä qPCR (qChIP) analyysi paljasti suhteellinen rikastuminen H3K9me3 ja H3K27me3 päälle DLC1 promoottorialueen Miha, MHCC97L ja SMMC-7721-soluissa. Kertainen rikastaminen sirujen määritys laskettuna IgG ohjaus jälkeen normalisoidaan tulo DNA. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta.

tukahduttaminen EZH2 aiheuttama DLC1 reexpression eri ihmisen syövän solulinjoissa

Tuottaa enemmän todisteita siitä, että EZH2 välittämä H3K27me3 suoraan säätelee DLC1, me tutkimme, DLC1 ilmaisua voitaisiin palauttaa kun knockdovvn EZH2. HCC solulinjat ilmensivät stabiilisti muiden kuin kohde-ohjaus (NTC) tai EZH2 kohdistaminen shRNA (shEZH2) perustettiin edellisessä tutkimuksessa [13]. Kun vakaa knockdovvn EZH2, DLC1 oli transkriptionaalisesti aiheutettiin MHCC97L (kuvio 2A). Menetys H3K27me3 on DLC1 promoottorin havaittiin MHCC97L shEZH2 soluissa (kuvio 2B), mikä osoittaa, että EZH2-välitteinen H3K27me3 edistää tukahduttaminen DLC1 in MHCC97L. In DLC1 ilmentävien Huh7-solut, ohimenevä yliekspressio GFP-EZH2 transkriptionaalisesti tukahdutettu DLC1 ja samanaikaisesti rikastaminen EZH2 havaittiin on DLC1 promoottorin (kuvio 2C ja D Täydentävä kuvio S1). Mukaisesti EZH2 pudotus mallia, me osoitti lisäksi, että käsittely 3-Deazaneplanocin A (DZNep), pieni molekyyli EZH2 estäjä [29,30], vähensi merkitsevästi EZH2-proteiinin tason ja H3K27me3 tasolla ja indusoitiin DLC1 uudelleen ilmentymisen MHCC97L solut (kuvio 2E). Vielä tärkeämpää on, olemme huomanneet, että EZH2-välitteinen DLC1 epigeneettisiä hiljentäminen ei rajoitu HCC. Re-ilmentyminen DLC1 upon DZNep hoidon havaittiin myös eri syövän solulinjoissa mukaan lukien nenänielun karsinooma solulinjaa CNE2, kolorektaalikarsinoomasolulinjaa HCT116 ja kohdunkaulan adenokarsinoomasolulinja HeLa (kuvio 2F). Edellä esitetyt havainnot osoittivat, että epigeneettisellä vaiennettu DLC1 by EZH2 välittämä H3K27me3 on yhteinen mekanismi jaettu eri ihmisen syövistä.

EZH2 välittämää H3K27me3 oli mukana epigeneettisellä tukahduttamisen DLC1 HCC ja useita muita ihmisen syövissä.

(A) DLC1 oli kopiointia indusoituu vakaa knockdovvn EZH2 in MHCC97L soluissa. (B) qChIP analyysi vahvisti ehtyminen H3K27me3 rikastaminen on DLC1 promoottori kun EZH2 Knockdown sisään MHCC97L soluissa. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. (C) DLC1 oli kopioinnin suhteen tukahdutettu Huh7 soluissa jälkeen ohimenevä yli-ilmentymisen GFP-EZH2. (D) qChIP analyysi paljasti samanaikainen rikastamisen EZH2 at DLC1 n promoottori lokuksen upon GFP-EZH2 yliekspressio Huh7 soluissa. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. (E) EZH2 ja H3K27me3 ilmentyminen väheni, kun 1 uM DZNep hoito 48 tunnin MHCC97L soluissa (vasen paneeli). DMSO käytettiin mock hoitoon. Pan H3 ja α-tubuliinin asettaisit valvonta immunoblot. DZNep hoito kopiointia aiheuttama DLC1 ilmaisun MHCC97L kuten osoitetaan qPCR analyysi (oikea paneeli). (F) eri ihmisen syöpäsoluja, mukaan lukien nenänielun karsinooma solulinja CNE2, The kolorektaalikarsinoomasolulinjaa HCT116 ja kohdunkaulan adenokarsinoomasolulinja HeLa tutkittiin DLC1 uudelleen ilmentymisen yhteydessä DZNep hoitoon. Solujen käsittely 10 uM DZNep uudelleen DLC1 ilmaisua.

P

-arvot saadaan

t

-testissä.

EZH2 ja DLC1 ekspressiotasot ne ovat käänteisesti verrannollisia ihmisen syövän kudoksissa

Tuottaa kliinistä merkitystä meidän

in vitro

havaintoja, tutkimme DLC1 mRNA: n ekspression 25-pariksi ensisijainen HCC näytteitä ja korreloi ilmaisun tasolla edellisessä EZH2 mRNA ilmaisun data [31]. Tässä kohortissa näytteitä, EZH2 oli merkittävästi voimistunut, kun DLC1 oli merkittävästi vaimentua siinä syöpäkudoksissa kuin ei-tuumori- kudoksiin (kuvio 3A). Mielenkiintoista on, että merkittävä käänteinen korrelaatio EZH2 ja DLC1 havaittiin osajoukko HCC näytteitä, joissa DLC1 promoottori ei vaiennetaan DNA: n metylaatio [17] (kuvio 3B). Olemme myös laajentaneet analyysi muihin ihmisen syövissä hakemalla microarray geenien ilmentyminen tietojen keuhkojen [32], rintojen [33], eturauhas- [34], ja munasarjojen [35] syöpiä peräisin Oncomine (www.oncomine.org) (kuvio 3C ). Yhdenmukainen havaintojen ihmisen HCC, samanaikainen DLC1 alassäätöä ja EZH2 ylössäätöä oli näillä syöpäsairauksia, mikä viittaa vaikutuksia EZH2 ylössäätöä äänenvaimennusjärjestelmissä DLC1 sen erilaisissa ihmisen syövissä.

käänteinen korrelaatio EZH2 ja DLC1 ilmaisuja ihmisen syövissä.

(A) Kaksikymmentäviisi-pariksi HCC näytteitä tutkittiin EZH2 ja DLC1 mRNA ilmentyminen qPCR. EZH2 oli merkitsevästi säädellään ylöspäin HCC tumorous (T) kudoksiin kuin ei-tuumori- (NT) kudokset (vasen paneeli). Samassa näytteestä kohortin DLC1 oli merkitsevästi säädellä vähentävästi HCC verrattuna NT kudoksiin (oikea paneeli).

P

arvot Wilcoxonin sovitettu pari testiä. (B) Käänteinen korrelaatiota ei havaittu EZH2 ja DLC1 ilmentymisen osajoukko HCC näytteitä ilman DLC1 promoottorin metylaation. Ilmentymistaso EZH2 ja DLC1 pariksi-HCC näytteet edustivat ΔΔCt (T

(HPRT Ct -Gene kohteisiin Ct) -NT

(HPRT Ct – geeni Ct)). Lineaarinen regressioanalyysi suoritettiin käyttämällä GraphPad Prism5 (La Jolla, CA, USA). (C) EZH2 säätelyä (vasen paneeli) ja samanaikainen DLC1 downregulation (oikea paneeli) havaittiin yhdenmukaisesti tuumoritransformaatiossa kudoksissa eri syöpiä, kuten keuhko- [32], rintojen [33], eturauhas- [34] ja munasarjojen [35] syöpiä. Expression data ja

P

arvoja DLC1 ja EZH2 useita syöpätyyppejä saatiin Oncomine microarray tietokannasta. Kelluva tangot osoitettiin havainnollistamiseksi minimi, mediaani ja maksimi normalisoitu ilmentämisyksiköissä ei-tuumori- (NT) ja tumorous (T) kudoksiin.

DLC1 on synergistisesti vaiennetaan H3K27me3 vain silloin, kun sen promoottori DNA on osittain metyloitu

Koska useita epigeneettisellä tukahduttavia koneistoja liittyvät läheisesti luoda vähemmän salliva kromatiinin ympäristö tukahduttaa geenin transkription [36,37], pyrimme osoittamaan monimuotoiset vaikutus eri epigeneettiset koneiden valvontaan DLC1 ilme. MHCC97L ja SMMC-7721-soluja käsiteltiin DZNep yhdessä 5-atsa-2’deoxycytidine (5-atsa-dC) ja trikostatiini A (TSA), jotka ovat hyvin karakterisoitu DNA: n metylaation ja histoni asetylaatio estäjien, vastaavasti. Vaikka hoito DZNep, 5-atsa-dC ja TSA erikseen kohonnut ilmentyminen DLC1, yhdistetty hoito kolmen lääkeaineen synergistisesti palautettu DLC1 ilmentymisen MHCC97L soluissa (kuvio 4A). Kuitenkin co-hoidon SMMC-7721 solut eivät näytä lisääntyvän edelleen DLC1 ilmentymisen verrattuna 5-atsa-dC yksinään (kuvio 4B), mikä tarkoittaa, että DNA: n metylaatio oli hallitseva epigeneettiset mekanismi hiljentäminen DLC1 tässä solulinjassa.

DLC1 ilmentyminen synergistisesti palautettu upon DZNep, 5-atsa-dC ja TSA hoitoa MHCC97L muttei SMMC-7721-soluissa.

(A) Combinational epigeneettiset huumehoidon MHCC97L soluissa 10pM 5-atsa-dC, 0,25 ug /ml TSA ja 10 uM DZNep indusoi vahvimmista DLC1 uudelleen ilme kuin mikään yhden tai kahden epigenetic huumeita hoitoon. DZNep ja 5-atsa-dC käsittely suoritettiin 72 tuntia. TSA oli joko lisättiin soluihin yksin tai yhdessä muiden lääkkeiden viimeisten 24 tunnin hoidon. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. (B) lisääminen DZNep in SMMC-7721 solut eivät vielä indusoi DLC1 uudelleen ilmentymisen verrattuna 5-atsa-dC ja TSA dual hoitoa. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta.

DZNep hoito häiritsee aktiinisytoskeletonin estävän HCC solujen vaeltamiseen

DLC1 /Rho /ROCK reitti on ratkaisevan tärkeää säännellä asianmukaisen solun tukirangan remodeling ja solun liikkuvuus. Meidän menettely havainnot viittaavat siihen, että EZH2 on mukana tukahduttaa DLC1, siksi edelleen testata, onko DZNep hoito voisi estää

in vitro

HCC muuttoliikettä. DZNep käsittely 1 uM: ssa 48 tuntia, mikä osoitti minimaalista sytotoksinen vaikutus (Täydennyskuvio S2), tehokkaasti inhiboi solumigraatiota in MHCC97L soluissa osoittaa Transwell migraatiokokeessa (kuvio 5A). DZNep käsitellyt solut osoittivat myös poistaminen asianmukaisen aktiinisytoskeletonin verkkoon, kun tutkitaan pyyhkäisyelektronimikroskoopilla (kuvio 5B) ja immunofluoresenssivärjäyksen (kuvio 5C). Nämä solu morfologisten muutosten aiheuttama käsittelemällä DZNep erittäin muistuttivat of DLC1 aiheuttaman solun tukirangan romahtaa ja solujen kutistuminen [21], mikä tarkoittaa, että DZNep voivat estää solujen vaeltamiseen kautta häiritsee DLC1 /ROCK polku ja aiheutti huomattavaa aktiinisytoskeletonin epäjärjestystä.

hoito DZNep esti HCC solujen migraation kautta häiriöitä aktiinisytoskeletonin.

(A) DZNep hoito tehokkaasti lakkautetaan MHCC97L solun leviämiskyky. Ennen solujen migraatiomääritys, soluja käsiteltiin 1 uM DZNep 48 tuntia. Mock ja DZNep käsiteltyjä soluja asetettaisiin tämän jälkeen solujen migraatiokokeessa käyttämällä Transwell laitetta. Edustavat kuvat kolmen erillisen kokeen näytettiin.

P

-arvot saadaan

t

-testi. (B) DZNep hoito tukahdutti muodostumista filopodia (punaiset nuolet) ja lamellipodioihin (sininen nuolet), kuten on esitetty pyyhkäisyelektronimikroskoopilla. Kuvat (2000x suurennos) otettiin käyttäen Hitachi S-4800 FEG Pyyhkäisyelektronimikroskooppi. (C) DZNep käsittely alentunut aktiinisytoskeletonin ja aiheutti solujen kutistumista MHCC97L soluissa. Stressi kuitu värjättiin FITC-konjugoidulla phalloidin ja paikallisia tarttumista värjättiin anti-paksilliini vasta-aine. Tumat vastavärjättiin DAPI. Mock-käsitellyt solut osoittivat järjestäytyneen nippua stressiä kuituja ja hyvin kiinni paksilliini. DZNep käsiteltyjä soluja kutistui ja hävisi asianmukainen aktiinisytoskeletonin verkkoon. Kuvat (100x suurennos) on vangiksi Leica Q550CW fluoresenssimikroskooppia (Leica, Wetzler, Saksa).

Keskustelu

Yksi tärkeä pro-metastasoitunut roolia EZH2 syövässä on kautta epigeneettiset hiljentäminen kasvain ja etäpesäke synnyssä [8-12]. H3K27me3 on paras tunnettu EZH2 välittämää histonimodifikaation nisäkkäiden epigeneettiset järjestelmään. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme todisteita siitä, että EZH2-välitteinen H3K27me3 on mukana epigeneettinen tukahduttaminen DLC1 aikana HCC kehitystä. Mielenkiintoista, useista julkaistu genominlaajuisten tiedot Polycomb- (PCG) kohdegeenin kartoitus ihmisen alkion kantasoluja (HES) soluja, me myös huomannut, että DLC1 on ehdokkaana PCG-säännelty geenin alussa kehitysvaiheessa (Täydennyskuvio S3). In HES soluissa DLC1 promoottori on käytössä SUZ12, joka liittyy EZH2 muodostamiseksi PRC2 välittäjänä H3K27me3 ja transkription repression [38]. Lisäksi DLC1 promoottori on myös merkitty H3K27me3 [39] ja H3K4me3 [40], jotka muodostavat kahdenarvoisen kromatiinin allekirjoitus PcG tavoitteet [41]. Tämä kahdenarvoisen chromatin allekirjoitus, johon H3K27me3-hiljentäminen ja H3K4me3 aktivoiva histonimodifikaation, sallii geenien kehitys- merkitys ja geenien tarvitaan stemness kunnossapidon valmis ready-to-transcribe tilassa, kunnes erilaistuminen [41,42]. DLC1 on välttämätöntä alkionkehityksen [43] ja mahdollisesti on rooli sukujuuret selityksessä [44]. DLC1 hiirten on alkion tappava [43]. Kuitenkin DLC1 kaikkialla läsnä transkriboidaan aikuisen kudoksissa [14], mikä tarkoittaa, että PcG Äänenvaimennussuhde on helpottunut eriytetty somaattisten solujen. Kun oncogenesis, on mahdollista, että DLC1 saa takaisin alkion PcG merkinnän seurauksena EZH2 säätelyä ylöspäin. Molekyylitasolla, osoitimme, että DLC1 oli mukana säätelee EZH2 välittämän H3K27me3, DNA: n metylaation ja histonien deasetylaatiolla HCC-soluissa. Kuitenkin myötäsääntelyn näiden kolmen epigeneettiset mekanismien DLC1 havaittiin vain, kun sen promoottorin osittain metyloitu (kuten MHCC97L soluissa). Kun DLC1 promoottori tiheään metyloitu (kuten SMMC-7721-soluissa), H3K27me3 oli poissa ja DNA: n metylaatio oli avain tukahduttava mekanismi vaatimaton osallistuminen histoni deasetylaatiolla. Tämä havainto saattaa heijastaa ylikuulumisen on EZH2 hiljentämisen ja DNA: n metylaation aikaisemmassa vaiheessa epigeneettiset tukahduttaminen tuumorisuppressorigeeneille ennen korvaamista lopullisesti H3K27me3 hiljentäminen vakaalla DNA metylaatio koneet [45,46]. Todellakin, meidän havainnot että DLC1 on PCG-säännelty tavoite ja sen myöhempien epigeneettiset hiljentäminen aikana pahanlaatuisen etenemistä ovat myös linjassa äskettäin ehdotetun mallin PcG merkintää geenien ES-soluissa ovat alttiita

de novo

syöpä erityisiä DNA: n metylaatio [45,46].

Farmakologiset kohdentaminen vapautetuilla epigenetic proteiinien esiin houkuttelevana lähestymistapa syövän hoidossa [47,48]. DZNep on osoitettu poistamaan kasvaimen aloittamista HCC-solut nude-hiirissä implantoitu HCC [49], apoptoosin rintasyöpäsoluissa [29] ja kohdistaa ihmisen akuutti myelooinen leukemia hiirillä, kun niitä käytetään yhdessä panobinostat [50]. Kuitenkin etäpesäkkeitä estävä vaikutus on DZNep ei ole koskaan tutkittu. Tuloksemme osoittavat, että DZNep estävät EZH2 ilmaisun ja voi lisäksi toimivat voimakas etäpesäke estäjä läpi häiritsevät aktiinisytoskeletonin organisaatio. Yksityiskohtainen luonnehdinta DZNep tukahduttaa HCC kasvaimen kasvua ja etenemistä in vivo pysyvyyden tutkimiseksi terapeuttista potentiaalia DZNep kuten syövän hoito-ohjelma.

Olemme aiemmin osoittaneet, että EHZ2 edistää HCC etäpesäke osittain läpi epigeneettiset tukahduttaminen useiden Rho /ROCK signalointi kohdistamisen miRNA [13]. Esimerkiksi miR-139, joka on kohdistettu ROCK2 [22] oli usein alassäädetty ihmisen HCC by EZH2 välittämä H3K27me3 [13]. Tässä tutkimuksessa olemme lisäksi osoittaneet, että DLC1, avain alkupään säätelijänä Rho /ROCK reitin, myös vaiennetaan EZH2. Kaikkiaan meidän havainnot purkaa tiukka ja monikerroksinen sääntely DLC1 /Rho /ROCK opastinjärjestelmillä EZH2, joka voi tukea kriittisen epigeneettiset ajettu tapahtuma edistämisessä syövän etäpesäkkeiden.

tukeminen Information

Kuva S1.

ohimenevä yli-ilmentymisen GFP-EZH2, mikä on vahvistettu immunoblottauksella (vasen panal) ja qPCR (oikea panal), täydensi EZH2 ja H3K27me3 tasoilla Huh-7-soluissa. Anti-EZH2-vasta-ainetta (# 3147, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) havaittiin sekä sisäsyntyinen ja GFP-EZH2 fuusioproteiinin immunoblot. Proteiini ja RNA kerättiin kuuden päivän transfektion jälkeen.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0068226.s001

(TIF) B Kuva S2.

MHCC97L solut, joita käsiteltiin 1 uM DZNep 48 tuntia tutkittiin niiden elinkelpoisuuden trypan blue -värjäyksellä ennen solujen migraatiomääritys. Mock ja DZNep käsitellyt solut olivat yhtä elinkelpoisia.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0068226.s002

(TIF) B Kuva S3.

Julkisesti saatavilla chip sekvensointi ja Chip-on-chip tietokanta analysoitiin antaa vihjeitä of DLC1 kromatiinin tilaansa ihmisalkion kantasolujen. DLC1 lokuksen havaittiin leimaa H3K27me3 (Zhao et al., 2007) ja H3K4me3 (Pan et al., 2007) itsenäisissä tutkimuksissa. Lisäksi DLC1 promoottorin havaittiin myös sitoutua SUZ12 (Lee et al., 2006), joka on keskeinen osa Polycomb Tukahduttamistoimet Complex 2.

doi: 10,1371 /journal.pone.0068226.s003

(TIF) B