Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

androgeenireseptorin (AR) on keskeisessä asemassa leviämisen eturauhasen syöpäsoluja. Kuitenkin sen vaikutusmekanismi in leviämisen ei tunneta. Ymmärtäminen mekanismin AR toiminnan leviämisen voi johtaa kehitystä tehokkaiden strategioiden eturauhassyövän hoitoon.

Menetelmät /Principal Havainnot

Tässä tutkimuksessa raportoivat, että pulssi hoito synkronoitu LNCaP solujen Casodex, AR-antagonisti, 4 tuntia puolivälissä G

1 vaihe oli riittävä estämään solujen pääsyn S-vaiheessa. Koska kokoonpano valmiiksi replikaatiokompleksin (pre-RC) G

1 vaaditaan etenemisen solujen G

1 S-vaiheeseen, vaikutus Casodex aikana puolivälissä G

1 ehdotti, että roolia AR leviämisen ehkä säännellä kokoonpanoon pre-RC. Tämän mahdollisuuden testaamiseksi, tutkimme vuorovaikutus AR ja Cdc6, olennainen osa ennalta RC LNCaP-soluissa. AR co-lokalisoitu ja yhteistyötä immunosaostettiin Cdc6, ja Casodex käsittely häiriintyy tämän vuorovaikutuksen. AR-Immunopresipitaattia (AR-IP) sisälsi myös sykliini E ja sykliini A, joka on kriittinen rooli valmiiksi RC kokoonpano ja solusyklin S-vaiheeseen siirtymistä, ja DNA-polymeraasi-α, PCNA, ja ribonukleotidireduktaasia, jotka ovat välttämättömiä aloittamista DNA-synteesin. Lisäksi soluja S-vaiheessa, AR co-sedimentoidaan komponenttien DNA-replikaation koneita solujen joka tuli S-vaiheessa.

Johtopäätökset /merkitys

Yhdessä nämä havainnot viittaavat uusi rooli AR osana ennalta RC valvominen etenemistä LNCaP G

1 S faasin mekanismin, joka on riippumaton sen roolista transkriptiotekijän.

Citation: Murthy S, Wu M, Bai VU, Hou Z, Menon M, Barrack ER, et al. (2013) Rooli androgeenireseptorin vuonna eteneminen LNCaP syöpäsolujen G

1 S vaihe. PLoS ONE 8 (2): e56692. doi: 10,1371 /journal.pone.0056692

Editor: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia

vastaanotettu: 16 elokuu 2012; Hyväksytty: 14 tammikuu 2013; Julkaistu: 20 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Murthy et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain apurahan W81XWH-05-1-0071 Department of Defense GPR. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on useimmin diagnosoitu ei-ihosyöpä ja toiseksi suurin syy syöpäkuolemista American men [1]. Androgeenin, aktivoimalla androgeenireseptorin (AR), on tärkeä rooli sekä kehittymistä ja etenemistä eturauhassyöpää. Siksi androgeeniablaatio farmakologisin tai kirurgisen kastraation [2] pysyy etulinjan hoito hoitoon paikallisesti edenneen tai levittää eturauhassyövän. Vaikka sairauden alkuvaiheessa taantuu vastauksena androgeeniablaatio, se lopulta pahenemisvai- tulla kastraatio vastustuskykyisiä [3], [4]. Yllättävää kuitenkin, vaikka jatkuva käyttö tämä hoito strategiaa jo yli 70 vuotta, hyvin vähän tiedetään mekanismia, jolla AR säätelee eturauhassyövän proliferaatiota. Ymmärrystä mekanismin AR toiminnan leviämisen voi johtaa kehittämiseen tehokkaampia strategioita eturauhassyövän hoitoon.

kastraatio kestävä kasvu eturauhasen syöpä liittyy usein lisääntynyt ekspressio AR: [5] [6], [7]. AR edelleen välttämätön leviämisen eturauhassyövän solut, jotka ovat tulleet kastraatiotason kestävä; AR-spesifinen shRNA tai siRNA estää leviämisen androgen-herkkien sekä kastraatio kestävä AR-positiivisten syöpäsolujen [8], [9], [10], [11], [12]. Lisäksi, mikroinjektio AR-spesifisen vasta-aineen tumaan tai solujen käsittely AR-mRNA hammerhead-ribotsyymi estää proliferaatiota ja AR-positiivinen, mutta ei AR-negatiivinen, eturauhasen syöpäsolujen [13], mikä osoittaa kriittisen roolin AR proliferaation AR-ilmentävien syöpäsolujen. Mielenkiintoista on, että rooli AR leviämisen eturauhasen syöpäsolujen näyttää olevan riippumaton sen funktio, kuten transkriptiotekijän, ainakin kastraatiotason kestävä CWR22R3 ihmisen eturauhasen syöpäsolujen (johdettu CWR22 ksenografteista), jossa AR-riippuvaisen proliferaation on ligandi itsenäinen mutta AR transkriptioaktiviteettia pysyy ligandista riippuvan [11]. Yhdessä nämä havainnot vedota siihen, että sen lisäksi sen rooli transkriptiotekijän, AR voi olla suora rooli solusyklin sääntelyn tapahtumia tarvitaan leviämisen eturauhasen syöpäsoluja. Suora rooli AR säätelyssä leviämisen vastakohtana käsite välillinen rooli, jossa AR transkriptioaktiviteettia säätelee ilmentymistä tekijöitä vaaditaan solusyklin etenemisen.

solusyklin etenemisen G

1 S-vaiheeseen on olennaista lisääntymistä. Me raportoitu aikaisemmin, että Casodex (bikalutamidi), erityinen estäjä AR, estää kyky G

1 vaihe AR-positiivisten LNCaP eturauhasen syöpäsolujen syöttää S-vaiheeseen [14], [15], mikä osoittaa roolin AR solusyklin etenemisen G

1 S-vaiheeseen. Etenemistä solujen G

1 S vaihe edellyttää asteittaisia ​​peräkkäisten tapahtumien G

1 vaihe, jotka edistävät kokoonpanoon DNA-replikaation koneita soluissa, jotka tulevat S-vaiheessa. Näitä tapahtumia ovat a) lastaus Cdc6, replikointi lisensointi tekijä RLF-B /Cdt1, ja mini-kromosomin huolto (Mcm) proteiinien päälle alkuperän tunnustamista kompleksi (ORC) muodostamaan ennalta replikaatiokompleksin (pre-RC), ja b) purkaminen DNA helikaasin (Cdc45) liittyy ennalta RC, ja kokoonpano entsyymien DNA-synteesin muodostamaan mega-komplekseja tarvitaan aloittamista DNA-synteesiin on alkuperä DNA: n replikaation (katso Reddy et al [16] tarkistamaan ).

tässä tutkimuksessa tutkimme onko AR vuorovaikutuksessa komponenttien ennalta RC ja DNA: n replikaatiota koneita. Meidän tutkimukset osoittavat ensimmäistä kertaa, että AR tarvitaan puolivälissä G

1 vaihe, silloin, kun ennalta RC kokoonpano tiedetään aloittaa, jotta LNCaP syöttää S-vaiheeseen, ja että AR liittyy solusyklin sääntelyn proteiinit ja entsyymit DNA-synteesin on monen entsyymin kompleksi eristää S-vaiheessa olevien solujen. Nämä havainnot viittaavat siihen, AR osallistumista leviämisen kautta vuorovaikutuksessa solusykliä sääteleviä proteiineja ja entsyymejä DNA-synteesin tarvitaan puhkeamista DNA-synteesin ja etenemisen LNCaP G

1 S-vaiheeseen.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

LNCaP-soluja ylläpidettiin RPMI (Gibco BRL, Rockville, MD), joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia (FCS), 2,5 mM glutamiinia, 100 ug /ml streptomysiiniä , ja 100 U /ml penisilliiniä (täydellinen väliaine) kostutetussa inkubaattorissa 5% CO

2 ja 95% ilmaa, 37 ° C: ssa.

RNA: n eristäminen, RT-PCR, ja reaaliaikainen RT -PCR (qRT-PCR) B

RNA eristettiin ohjaus ja Casodex käsiteltyjen solujen ja alistettiin RT-PCR: llä sen määrittämiseksi, PSA: n ja GAPDH ilmaisun kuten aiemmin on kuvattu [14]. Alukesekvenssejä käytettävä PSA ovat: 5′-gcacccggagagctgtgt (eteenpäin) ja 5-gatcacgcttttgttcctgat (reverse) alukkeet, ja GAPDH ovat 5′-gagatccctccaaaatcaagtg (eteenpäin) ja 5′-ccttccacgataccaaagttgt (käänteinen). GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. Densitometrisesti RT-PCR-bändejä suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [14]. qRT-PCR suoritettiin Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) käyttäen Taqman-geenin ilmentymisen määrityksissä (PSA-määritys Id: Hs02576345_m1) ja 18S RNA: n (määritys Id: Hs03928985_g1), kuten on kuvattu aiemmin [17]. Suhteellinen taso PSA ilmentymisen kvantifioitiin käyttämällä vertailevia ΔΔC

t 18S RNA sisäisen valvonnan.

Synkronointi LNCaP-solujen Isoleucine Deprivation

Isoleucine puutteen suoritettiin meidän aikaisemmin julkaistu menetelmä [15]. Soluja kasvatettiin 60%: sta 70% konfluenssiin ja sitten elatusaine korvattiin isoleusiini-RPMI 1640 (Life Technologies, Carlsbad, CA), johon oli lisätty 6%: lla dialysoitua FCS: ää (Life Technologies, Carlsbad, CA), 2,5 mM glutamiinia, 100 ug /ml streptomysiiniä ja 100 yksikköä /ml penisilliiniä. Soluja ylläpidettiin isoleusiini-väliaineessa 36 tunnin ajan inkubaattorissa, kuten edellä. Solut vapautettiin isoleusiini-lohkon korvaamalla väliaineen kanssa täydellistä alustaa, joka sisälsi 10% FCS: ää ja käsiteltiin Casodex (bikalutamidi, lahja Astra Zeneca, England, UK), kuten.

Koska solunjakautumisen S vaihe on merkitty puhkeamista DNA-synteesin, etenemisen synkronoitu solujen G

1 S-vaiheessa seurattiin määrittämällä solujen kyky sisällyttää

3H-tymidiiniä DNA: han, kuten aiemmin on kuvattu [14], [ ,,,0],15]. Säännöllisin väliajoin vapautumisen jälkeen isoleusiini-block, soluja pulssi-leimattu 2 uCi /ml

3H-tymidiiniä (ICN Biomedicals, Inc., Costa Mesa, CA) 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa. Radioaktiivisuus sisällytetty happo-saostuva aines määritettiin sitten, kuten on kuvattu [15].

solu-uutteiden ja immunosaostus

Eksponentiaalisesti kasvavat LNCaP-solut kerättiin raaputtamalla fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS) pelletoitiin sentrifugoimalla 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa 2000 rpm Sorvall RT7-sentrifugissa ja suspendoitiin uudelleen immunosaostuksella (IP) puskurissa (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,1% Triton X-100, 5 mM EDTA, 250 mM NaCl, 2 mM CaCl

2, 50 mM NaF, ja 0,1 mM Na-

3Vo

4), johon oli lisätty proteaasi-inhibiittoriseosta (P-8340, Sigma Chemical Co., St Louis, MO) tiheydellä noin 1 x 10

7 solua /ml. Solususpensio saatettiin sitten kahdesti 30 pulssin sonication käyttäen Branson Sonifier 250 (Branson Sonic Power Co, Danbury, CT), asetettu lähdön valvonta 2 ja käyttömäärä on 20, vaihtelevalla jäähdytys jäissä. Sonikoitu solu-uute kirkastettiin sentrifugoimalla Eppendorf-sentrifugi 5415R 6000 rpm 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Proteiinikonsentraatio selvitetty uutteissa määritettiin käyttäen BioRad Protein Assay-reagenssia (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

immunosaostus, solu-uutteet laimennettiin 5-kertaisesti IP-puskuriin, johon oli lisätty proteaasi-inhibiittoriseosta ja inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli 4 ug /ml anti-AR-vasta-aineet (AR-N20 tai AR-441) tai anti-Cdc6-vasta-aineita (H-304) (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA). Immuuni- komplekseja sitten adsorboitiin Pierce Protein A /G-agaroosi-helmiä (Thermo Scientific, Philadelphia, PA), 2 tunnin ajan 4 ° C: ssa varovasti sekoittaen. Adsorboitunut kompleksit pestiin kolme kertaa IP-puskurissa sentrifugoimalla Eppendorf-sentrifugi 5415R 6000 rpm 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja sitten eluoitiin PAGE latauspuskuria (Bio-Rad, Richmond, CA). Ohjaus immunopresipitaatit valmistettiin käyttämällä 4 ug /ml puhdistettua hiiren tai kaniinin IgG (Antibodies Incorporated, Davis, CA) sijasta anti-AR tai anti-Cdc6-vasta-aineita.

DNA: n eristäminen replikaatiokompleksin jae Nuclear Lysate

synkronoitu LNCaP-solujen G

1 vaihe (1 tunti vapautumisen jälkeen isoleusiini-lohko) tai S-vaiheessa (24 tuntia vapautumisen jälkeen isoleusiini-lohko) otettiin talteen ja ydinvoiman lysaatti valmistettiin muuttamalla hieman menetelmää Subramanyam et ai [18]. Kerätyt solut pelletoitiin sentrifugoimalla 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa 2000 rpm Sorvall RT7-sentrifugissa ja suspendoitiin uudelleen puskuri A: [0,16 M sakkaroosi, 50 mM Tris-HCI (pH 7,6), 25 mM KCI, 10 mM MgCI

2, 70 mM HEPES (pH 7,6), 0,025 mM CaCl

2, 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF), 2 mM DTT, 1 mM EDTA], jonka tiheys on 2 x 10

7 solua /ml. Solususpensio homogenisoitiin sitten moottorikäyttöinen Wheaton-homogenisaattorissa (Wheaton Co., Wheaton, IL), kunnes ~90% soluista värjättiin trypaanisinivärin (yleensä kolme lyöntiä kierrosluvulla asetus 3). Sytosolin supernatantti erotettiin sitten ydin- pelletti sentrifugoimalla Eppendorf-sentrifugi 5415R 6000 rpm 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Ydin- suspendoitiin tilavuuteen puskuria A sama kuin käytettävien homogenointi ja alistettiin kahdesti 30 pulssin sonication Branson Sonifier 250 (Branson Co., Danbury, CT) asetettu lähdön valvonta 2 ja pulssisuhde 20, jäähdyttäen ajoittain jäiden päällä. Sonikoitu Tumauute kirkastettiin sentrifugoimalla Eppendorf-sentrifugi 5415R 6000 rpm 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa. DNA-replikaatio kompleksi fraktio eristettiin sitten alistamalla ydin- lysaatti sakkaroosia heysgradienttisentrifugoinnilla oleellisesti, kuten ovat kuvanneet Reddy ja Pardee [19]. Nuclear lysaattia (0,5 ml) laitettiin kerrokseksi 4,8 ml: n lineaarisella gradientilla 20-40% (paino /tilavuus) sakkaroosia puskurissa A, joka puolestaan ​​oli kerrokseksi 66% sakkaroosia pad (0,5 ml), ja sentrifugoitiin Beckman SW 50,1-roottorilla 4 ° C: ssa 16 tunnin ajan 35000 rpm. Gradientti sitten erotettiin 0,5 ml: n fraktioita ja nopeasti sedimentoimalla osa, joka sisälsi DNA-polymeraasin aktiivisuus on kutsutaan replitase kompleksin osa, kuten ovat kuvanneet Murthy ja Reddy [20]. Monimutkainen fraktio G

1 tai S-vaiheessa olevien solujen saatettiin sitten Western blot-analyysi arvioida läsnä entsyymit DNA-synteesiä ja solusyklin säätelyproteiineja.

Western blot -analyysi

näytteet liuotettiin PAGE latauspuskuria (Bio-Rad, Richmond, CA) ja suoritettiin denaturoivissa 10% polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE) ja sitten siirrettiin nitroselluloosamembraaneille. Yksittäiset kalvot tutkittiin vasta-aineita AR (AR-N20 tai AR-441), Cdc6 (H-304), eturauhasen spesifisen antigeenin (PSA, C-19), Lamin B, DNA-polymeraasi-α (STK1), PCNA (PC10 ), ribonukleotidireduktaasi (R2, E-16), sykliini A (H-432), sykliini E (C-19) (kaikki Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA), p27

Kip-1, sykliini B (BD transduktio Lab, San Jose, CA), kaspaasi 3 (Cell Signalling, Danvers, MA), tai GAPDH (Chemicon, Temecula, CA). Immunoreaktiivisia bändejä kehitettiin käyttämällä piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-aineita ja SuperSignal WestPico kemiluminesenssisubstraatilla (Pierce, Rockfold, IL) ja visualisoitiin käyttämällä röntgenfilmiä.

immunofluoresenssivärjäyksellä ja konfokaalimikroskopialla

LNCaP Lasilevyillä kasvatetut pestiin kerran PBS: llä, jota seurasi kiinnitys on 3,7% (tilavuus /tilavuus) formaldehydiä 20 minuutin ajan 22 ° C: ssa. Solut tehtiin läpäiseviksi 0,5% (tilavuus /tilavuus) Triton X-100: ssa 15 minuuttia ja blokattiin 1 tunnin ajan 2% (paino /tilavuus) BSA: ta 22 ° C: ssa. Leikkeitä inkuboitiin sitten 1 tunnin ajan 22 ° C: ssa vasta-aineita AR (AR-N20 tai AR-441) ja Cdc6 tai DNA-polymeraasi-α seuraa sekä vuohen anti-hiiri-fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) – ja vuohen-anti -rabbit-tetra- B-isotiosyanaatti (TRITC) -leimattua sekundaarisia vasta-aineita (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Neljän pesun jälkeen PBS: llä, Levyjä asennettu Aqua-Poly /Mount (Polysciences Inc., Warrington, PA). CLSM tehtiin Zeiss LSM 410 pystyasennossa konfokaalimikroskoopilla. Kuvat käsiteltiin, ja rinnakkaispaikantumisen analyysi (Väriltään keltainen) suoritettiin Zeiss LSM 410 Meta magnetointilaitteisto keräämiseen 488 ja 543 nm. Intensiteetti Korrelaatio osamäärä (ICQ) analyysi määrällisesti AR rinnakkaispaikantumisen kanssa Cdc6 tai DNA-polymeraasi-α suoritettiin käyttäen ImageJ ohjelmisto (NIH, Bethesda, MD).

Immunofluoresoivat Detection of bromideoksiuridiinin (BrdU) Sisällytetty DNA

LNCaP-soluja kasvatetaan lasilevyillä leimattiin 10 uM BrdU (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 30 minuutin ajan, pestiin kerran PBS: llä ja kiinnitettiin 3,7% formaldehydillä 20 minuutin ajan 22 ° C: ssa. Solut tehtiin läpäiseviksi 0,5% (v /v) Triton X-100: ssa 15 minuuttia ja blokattiin 1 tunnin ajan 2% (w /v) naudan seerumin albumiinia 22 ° C: ssa. Sitten solut värjättiin hiiren monoklonaalisella vasta-aineita BrdU (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), jota seurasi vuohen anti-hiiri-FITC-leimattua sekundaarista vasta-ainetta. Objektilasit asennettu Vectashield Mounting Medium sisältävä DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA) ja mikrovalokuvausta suoritettiin Zeiss Axiofot mikroskooppi varustettu epifluoresenssiin.

Tulokset

käyttö Casodex merkityksen määrittämiseksi AR solusyklin synkronoitu LNCaP

AR knockdown strategioita on käytetty osoittamaan, että AR tarvitaan leviämisen eturauhasen syöpäsolujen [8], [9], [10], [11], [12]. Kuitenkin AR pudotus siRNA tai shRNA vaatii hoitoa eturauhassyöpäsolujen aikana useita päiviä. Näin ollen tämä lähestymistapa ei voi käyttää tunnistamaan, kun solusyklin (eli G

1, S tai G

2 /M vaihetta) AR tarvitaan proliferaation LNCaP-solujen, koska kukin vaihe solusyklin kestää korkeintaan muutaman tunnin. Siksi käytimme steroideihin kuulumattomien antiandrogeeni Casodex (bikalutamidi) selektiivisesti ja akuutisti estävät AR, jotta voidaan määrittää roolin AR etenemisessä synkronoitu LNCaP kautta G

1 ja S vaiheissa.

Casodex käytetään yleensä 10- 20 uM estämään androgeenin indusoimaa AR transkriptionaalisen aktiivisuuden; mutta näissä kokeissa solut ovat hiilellä erotettua seerumia (CSS) sisältävä väliaine [21], [22]. Kuitenkin synkronoitu soluja vapautuu CSS sisältävä väliaine ei etene solusyklin läpi. Vertasimme tehokkuutta Casodex ilmenemistä eturauhasen spesifisen antigeenin (PSA), erityinen AR-kohdegeenin [23], LNCaP-solujen FCS- vs. CSS- väliaineessa. Androgeenipuutteen solujen CSS-väliaineessa laski PSA ilmaus -50% tästä hallinnassa solujen FCS-väliaineessa ja Casodex aiheutti edelleen vähennys (kuviot. 1A ja 1B). Casodex on 75-100 uM FCS-väliaineessa oli sama vaikutus PSA ilmaisun kuin 25-50 uM Casodex CSS-väliaineessa (kuviot. 1A ja 1B). Erityisesti kun annoksesta riippuvainen vaste Casodex on piirretty suhteessa oma kontrollinsa (FCS vs. CSS), käyrät ovat päällekkäisiä, mikä osoittaa, että IC

50 estävän AR toiminta on ≈50 uM Casodex joko FCS tai CSS (Fig. 1 C). Soluja käsiteltiin 100 uM Casodex FCS-väliaineessa olivat morfologisesti samanlaisia ​​kuin käsitellään 20 uM Casodex CSS-väliaineessa, ja 100 uM Casodex FCS-väliaineessa ei aiheuttanut havaittavaa solukuolemaa, määritettynä trypaanisiniekskluusiolla menetelmällä (data ei esitetty). Siksi käytimme 100pM Casodex, maksimaalisen tehokas konsentraatio estämään AR aktiivisuutta, määrittää roolin AR nopeaan lisääntymiseen LNCaP FCS-väliaineessa. Tämä pitoisuus on samanlainen kuin käytetään estämään PSA ekspression tai kasvun LNCaP-solujen läsnä ollessa FCS [24], [25], [26].

Eksponentiaalisesti kasvavat LNCaP-solut pestiin kahdesti serum- ja hormonien elatusaineella ja siirrettiin RPMI, joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia (FCS) tai 6% hiilellä erotettua seerumia (CSS). 24 tunnin kuluttua, Casodex lisättiin ja soluja inkuboitiin vielä 24 tuntia. RNA eristettiin ohjaus ja Casodex käsiteltyjä soluja altistettiin RT-PCR ja qRT-PCR-analyysi PSA, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. (A) RT-PCR-tuotteiden PSA: n ja GAPDH erotettiin 1% agaroosigeelillä. Suhde kaistan tiheys PSA /GAPDH (P /G-suhde) solujen FCS ilman Casodex asetettiin 1,0 ja P /G suhde muun hoidon edellytyksistä ilmaistu suhteessa tämän valvonnan. (B) Suhteellinen PSA-tasot määritettynä qRT-PCR: llä, ovat funktiona bikalutamidin pitoisuus. Ja (C) Suhteellinen PSA-tasot on esitetty. 1B piirretään prosentteina kontrollista ilman Casodex lasketaan erikseen FCS- ja CSS- välineellä. Suljettu ympyrä, FCS-väliaineessa; ja avoimet ympyrät, CSS-väliaine. Aineisto edustaa kahta toisistaan ​​riippumatonta koetta.

LNCaP Cell S-vaiheeseen siirtymistä edellyttää toimivia AR aikana Mid-G

1 Vaihe

Olemme osoittaneet aiemmin, että isoleusiinia puute aiheuttaa LNCaP pidättämään G

0 /G

1 vaihe [15], [27]. Vapautuessaan isoleusiini-lohko, eli siirtyvät täydellistä alustaa, joka sisälsi FCS (FCS-väliaineessa), nämä solut etenevät G

1 ja anna S-vaiheessa 12 tunnin kuluttua levittämisestä, ja saavuttavat huippunsa S faasin 10-12 tuntia sen jälkeen [15]. Olemme myös osoittaneet, että Casodex hoitoa 24 tuntia alkaen, kun tuote lähtee isoleusiini-lohkon kumoaa solujen kyky syöttää S-vaiheeseen [14], [15]. Vaikka tämä ehdotti roolia AR solusyklin, että kokeellinen suunnittelu voi erottaa roolin AR G

1 vs. S-vaiheen. Näin ollen, jotta voidaan erottaa toisistaan ​​estävää vaikutusta bikalutamidin G

1 vs. S-vaiheessa, käsittelimme synkronoitu LNCaP-solujen Casodex alkaen 0, 4, 8, 12, tai 16 tunnin kuluessa vapautumisen isoleusiini-lohkon , ja määritetään kyky solujen sisällyttää

3H-tymidiiniä (

3H-TdR) 20 tunnin kuluttua release, aika, jolloin ohjaus solut ovat S-vaiheessa (katso kaavio kuvassa. 2A). Kuten on esitetty kuviossa. 2A, Casodex maksimaalisesti estivät

3H-TdR jos lisätty tahansa G

1 vaihe (eli 0, 4 tai 8 tuntia julkaisun jälkeen), mikä osoittaa roolin AR G

1. Sitä vastoin Casodex vaikutus oli pyöristettyjä jos hoito viivästyi vasta 12-16 tunnin kuluttua vapautumisen isoleusiini-lohko, jolloin solut ovat jo sitoutuneet syöttää S-vaiheeseen. Casodex hoitoon soluja, jotka oli jo tullut S-vaiheessa (16 tunnin kuluessa vapautumisen isoleusiini-lohko) oli hyvin vähän vaikutusta

3H-TdR (Fig. 2A). Siten estävää vaikutusta bikalutamidin esiintyy G

1 vaihe, jolloin solut valmistautuu tulemaan S-vaiheeseen, eikä S-vaiheen. Siksi AR tarvitaan G

1 soluille tulla S-vaiheeseen.

LNCaP-solut synkronoidaan isoleusiini-puutteen ja vapautuu täydellistä alustaa. A) Casodex lisättiin ilmoitettuun aikaan vapautumisen jälkeen isoleusiini-lohkon ja säilytetään keskipitkällä kunnes

3H-TdR määritettiin 20 tunnin kuluttua vapautumisen isoleusiini-lohkon. Tulokset ilmaistaan ​​prosentteina

3H-TdR hallinnassa soluissa, jotka päästettiin täydellistä alustaa ilman Casodex. A) Casodex lisättiin 4 tunnin aikana, kuten on esitetty yläpaneelissa, ja

3H-tymidiiniä (

3H-TdR) yhdistyminen DNA: han määritettiin 4 tunnin välein vapautumisen jälkeen isoleusiini-lohkon ja poiston jälkeen bikalutamidin. Kukin tietopiste on keskiarvo kolmesta näytteestä 10% vaihtelu; Esitetyt tiedot edustavat kahta toisistaan ​​riippumatonta koetta.

määritetään sitten, kun G

1 vaihe Casodex on tehokkain tukahduttamaan solujen S-vaiheeseen siirtymistä. Me pulssi käsitelty synkronoitu LNCaP kanssa Casodex ensimmäisen, toisen tai kolmannen 4 tunnin välein vapautumisen jälkeen isoleusiini-lohko, joka vastaa varhaisen G

1, mid-G

1, tai myöhään G

1, tässä järjestyksessä, ja määritetään nopeus

3H-TdR DNA: han 4 tunnin välein 24 tunnin ajan (katso kaavio kuvassa. 2B). Olemme osoittaneet aiemmin, että

3H-TdR tarjoaa luotettavan ja toistettava menetelmä seurata etenemistä synkronoitu solujen G

1 S-vaiheeseen ja tukee virtaussytometrialla analyysi sekä ilmaus S vaihe- erityisiä sykliinit ja aktivointi sykliiniriippuvaisten kinaasien [14], [15]. Kuten on esitetty kuviossa. 2B, hoito Casodex aikana puolivälissä G

1 (4-8 tuntia vapautumisen jälkeen isoleusiini-lohko) oli tehokkaampi estäminen S-vaiheeseen siirtymistä kuin oli hoidon aikana varhaisen G

1 (0-4 tuntia vapautumisen jälkeen isoleusiini-lohko) tai myöhään-G

1 vaihe (8-12 tuntia vapautumisen jälkeen isoleusiini-lohko). Tämä viittaa siihen, AR osallisuudesta solusyklin sääntelyn tapahtumia puolivälissä G

1 vaihe, jotka ovat kriittisiä LNCaP edetä G

1 S.

AR vuorovaikutuksessa Cdc6, kriittinen osa pre-RC Tarvitaan yleiskokouksen Replication Machinery S Phase LNCaP

Koska Casodex hoidon puolivälissä G

1 estetty kyky synkronoitu LNCaP syöttää S-vaiheeseen (Fig. 2), me testattiin, AR vuorovaikutuksessa solusykliä sääteleviä proteiineja mukana kokoonpanoon pre-RC, koska kokoonpano valmiiksi RC puolivälissä myöhään-G1 tarvitaan solujen tulla S-vaiheeseen ja aloittaa DNA-synteesin. Cdc6 sitoutuminen alkuperän tunnustamista kompleksi (ORC) on ensimmäinen askel prosessissa ennalta RC kokoonpano [16]. Havaitsimme, että immuunisaostumassa valmistettu käyttäen Cdc6 vasta-aineita (Cdc6-IP) sisälsi AR, mikä viittaa siihen, AR vuorovaikutusta Cdc6 (Fig. 3A). Tämä vuorovaikutus on spesifistä, koska yksi ekspressoidaan runsaasti proteiineja, prostataspesifinen antigeeni (PSA), LNCaP-soluissa ei ollut yhteydessä Cdc6-IP (Fig. 3A). Olemme osoittaneet aikaisemmin, että vuorovaikutus solusykliä sääteleviä proteiineja ja entsyymejä DNA-synteesin eri solujen johtaa kokoonpano, jossa on monen entsyymin monimutkainen kutsutaan replitase tai DNA: n replikaatio koneiden [28], [29], [30]. Nämä kompleksit ovat helposti havaittavissa soluissa, jotka ovat S-vaiheessa, mutta ei missään vaiheessa G1 vaiheessa [29], [30]. Sen vuoksi testasimme, onko AR-Cdc6 vuorovaikutus on solusyklin riippuvainen ilmiö. Kuten on esitetty kuviossa. 3B, vaikka Cdc6 oli läsnä alhaisella tasolla G

1 vaihe soluja, sen yhdessä AR-IP nähtiin synkronoitu LNCaP, jotka olivat S-vaiheessa, mutta ei niitä, jotka olivat G

1 vaihe. Vertailun vuoksi lamiinivektori B, tumaproteiini, osoitti hyvin pieni ero sen yhdessä AR-IP G

1 vs. S vaiheessa olevien solujen (Fig. 3B). Siten AR osoittaa solusyklin-riippuvainen vuorovaikutus Cdc6.

A) Cdc6-IP valmistettiin eksponentiaalisesti kasvavia LNCaP-solujen ja tehtiin Western blot -analyysi. B) AR-IP valmistettiin synkronoitu G

1 vaihe (1 tunti vapautumisen jälkeen isoleusiini-lohko) tai S-vaiheessa (20 tuntia vapautumisen jälkeen isoleusiini-lohko) LNCaP ja alistettiin Western blot-analyysi. IgG raskaan ketjun AR-IP ja IgG-IP on merkitty nuolella.

Casodex häiritsee AR-Cdc6 Vuorovaikutus

Koska AR on sekaantunut olevan rooli säätelyssä Cdc6 ilmaisun [14], [31], testasimme Casodex aiheuttama saarto tulo LNCaP solujen S-vaiheeseen johtuu lasku Cdc6 proteiinin tasot. Itse asiassa, koeolosuhteissa käytetään esillä olevassa tutkimuksessa, Casodex ei ollut havaittavaa vaikutusta joko Cdc6: n tai AR-proteiinin tasot eksponentiaalisesti kasvavissa LNCaP-solut (Fig. 4A, Input). Kuitenkin Casodex häiritsi AR vuorovaikutusta Cdc6 kuten läsnäolo Cdc6 AR-IP valvonta soluissa, mutta ei että bikalutamidin käsiteltyjen solujen (Fig. 4A, AR-IP). Tämä Casodex aiheuttama häiriö AR yhdessä Cdc6 tuki lisäksi konfokaalimikroskopiaa (Fig. 4B); havaitsimme huomattava väheneminen rinnakkaispaikantumisen AR kanssa Cdc6 ytimet Casodex käsiteltyjen solujen (ICQ = 0,059 ± 0.022 SD) verrattuna ohjaamaan soluihin (ICQ = 0,152 ± 0,047 SD). Siten Casodex aiheuttama suppressio pääsyn LNCaP-solujen S-vaiheeseen liittyy häiriöitä AR-Cdc6 vuorovaikutusta.

A) Eksponentiaalisesti kasvavat LNCaP-soluja käsiteltiin Casodex tai kantajaa (kontrolli) 24 tunnin ajan ja AR-IP valmistetut käsiteltyjen ja kontrolli solut altistettiin Western blot-analyysi havaitsemiseksi AR ja Cdc6. B) LNCaP-soluja kasvatetaan objektilasit synkronoitu isoleusiini-puutteen ja vapautuu täysin väliaineessa ajoneuvon (kontrolli) tai Casodex. 24 tunnin kuluttua vapautumisen isoleusiini-lohkon (jos kontrolli solut odotetaan tulevan S-vaiheessa), solut kiinnitettiin ja käsitellään immunoflourescent värjäystä käyttäen anti-AR (AR-441) hiiren monoklonaalinen anti-Cdc6 (H-304) kanin polyklonaalisia vasta-aineita.

AR vuorovaikutuksessa S Phase Sykliinit

lisäksi Cdc6, jotkut solusyklin säätelyproteiineja, kuten sykliineiksi E ja A, on myös tärkeä rooli kokoonpano pre-RC G

1 [16]. Siksi testasimme AR vuorovaikutuksessa tahansa Sykliinien, joiden tiedetään olevan mukana etenemistä solujen G

1 S-vaiheeseen (nim. Sykliinejä E ja A) ja G

2 /M ( nim. sykliini B) vaiheiden LNCaP. Havaitsimme, että sykliini E ja sykliini A, mutta ei mitoosi sykliini, sykliini B, liittyi AR-IP valmistetut eksponentiaalisesti kasvavia LNCaP-soluja (Fig. 5). Vertailun vuoksi GAPDH, sytosolinen markkeri, ei liittynyt AR-IP. Siten AR on spesifinen vuorovaikutus solusyklin säätelyproteiineja, jotka osallistuvat säätelyyn solujen pääsyä S-vaiheeseen.

AR-IP valmistetut eksponentiaalisesti kasvavia LNCaP tehtiin Western blot -analyysi.

AR vuorovaikutuksessa entsyymit DNA Synthesis

koska CDC-6-riippuvaista kokoaminen valmiiksi RC johtaa rekrytointiin entsyymien DNA-synteesin sivustoille DNA: n replikaation [16], ja sen jälkeen AR vuorovaikutuksessa Cdc6 (Fig. 3), testasimme myös AR-IP sisältää myös entsyymejä, DNA-synteesin. Kuten on esitetty kuviossa. 6, havaitsimme, että AR-IP valmistettu käyttäen kahta erilaista AR vasta (AR-N20 ja AR-441) sisälsivät DNA-polymeraasi-α, on keskeinen entsyymi osallistuu aloittamista DNA-synteesin (Fig. 6A). AR vuorovaikutusta DNA polymeraasi-α Lukua tukevat immunoflourescent konfokaalimikroskopialla (Fig. 6B); havaitsimme vahvaa rinnakkaispaikantumisen AR DNA-polymeraasi-α (ICQ = 0,45 ± 0,016 SD) ytimet LNCaP. Lisäksi DNA-polymeraasi-α, AR-IP valmistetaan käyttämällä AR-441 ja AR-N20 sisältämät vasta lisääntyvien solun tuma-antigeenin (PCNA), ylimääräinen proteiini DNA-polymeraasin, ja katalyyttinen alayksikkö ribonukleotidireduktaasia (RNR2), joka muuntaa ribonukleotideja deoksiribonukleotideiksi tarvitaan DNA-synteesiin (Fig. 6C). Sen lisäksi sen rooli leviämisen [8], [9], [10], [11], [12], AR on myös raportoitu olevan keskeinen rooli selviytymisen LNCaP, koska AR knockdown johtaa apoptoottisen solukuoleman [32]. Siksi testasimme, onko roolin AR apoptoosin säätelyyn liittyy myös sen vuorovaikutusta apoptoottisia proteiineja. Kuten on esitetty kuviossa. 6A, kaspaasi-3, apoptoottinen entsyymi, ei ole havaittu AR-IP. Siten AR osoittaa selektiivinen vuorovaikutus entsyymit DNA-synteesin tarvitaan leviämisen LNCaP-soluissa.

AR-IP sisältää DNA-polymeraasi-α. AR-IP valmistetut eksponentiaalisesti kasvavista LNCaP-soluissa käyttäen anti-AR hiiren monoklonaalinen (441) tai kaniinin polyklonaalista (N-20) vasta-aineet tehtiin Western blot-analyysi. B) AR on colocalized DNA-polymeraasi-α LNCaP-soluissa. Eksponentiaalisesti kasvavat LNCaP solujen Leikkeitä kiinnitettiin ja värjättiin anti-AR (N-20), kanin polyklonaalista anti-DNA-polymeraasi-α (STK1) hiiren monoklonaaliset vasta-aineet ja konfokaalimikroskopialla tehtiin. C) AR-IP sisältää PCNA ja ribonukleotidireduktaasiin.