Krooninen sairaus

tiivistelmä

Sovelluksen doksorubisiinia (Dox) varten syövän hoitoon on rajoitettua, koska sen vakavia sivuvaikutuksia. Käytimme yhdistelmä strategiaa yhdistämällä doksorubisiinin (Dox) kanssa withaferin A (WFA) minimoida huonosti vaikutukset Dox. Hoito eri epiteelin munasarjasyövän solulinjoissa (A2780, A2780 /CP70 ja CaOV3) yhdistelmällä WFA ja Dox (WFA /DOX) osoitti ajasta ja annoksesta riippuvaa synergiavaikutusta soluproliferaation inhibointi ja solukuoleman induktioon, mikä vähentää annostusta vaatimus Dox. Yhdistelmähoito johti paranevat merkittävästi ROS tuotannon seurauksena valtava DNA-vaurioita, induktio autophagy analysoitiin läpäisevällä elektronimikroskoopilla ja kasvu ilmaus autophagy merkki LC3B, ja huipentui solukuoleman analysoitiin pilkotun kaspaasi 3. Meillä validoitu yhdistelmähoito kasvaimen kasvu käyttämällä in vitro 3Dimension (3D) kasvainmuoto ja enemmän klassinen

in vivo

ksenograftimallia munasarjasyöpä. Molemmat kasvainmuodoista osoittivat 70-80% vähennys kasvaimen kasvua verrattuna kontrolliin tai käsitellyillä eläimillä WFA tai Dox yksin. Immunohistokemiallinen analyysi kasvaimen kudokset eläimistä hoidettiin WFA /Dox yhdistelmä osoitti merkittävää vähenemistä solujen lisääntymisen ja mikrosuonten muodostumisen mukana kasvoi LC3B tasolla, halkaistut kaspaasi 3, ja DNA-vaurioita. Yhdessä meidän tiedot viittaavat siihen, että yhdistämällä WFA kanssa Dox vähentää annostusta vaatimus Dox siis minimoi /poistaa vakavia sivuvaikutuksia suurilla DOX, mikä viittaa soveltaminen tämän yhdistelmän strategian munasarjojen ja muiden syöpien kanssa no tai vähintään sivuvaikutuksia.

Citation: Fong MY, Jin S, Rane M, Singh RK, Gupta R, Kakar SS (2012) Withaferin synergizes terapeuttinen vaikutus Doksorubisiini kautta ROS-välitteisen Autophagy munasarjasyövässä . PLoS ONE 7 (7): e42265. doi: 10,1371 /journal.pone.0042265

Editor: Yunli Zhou, Harvard Medical School, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 22, 2012; Hyväksytty: 02 heinäkuu 2012; Julkaistu: 30 heinäkuu 2012

Copyright: © Fong et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Rahoitus tuli National Institutes of Health /National Cancer Institute CA124630. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Raj K Singh työskentelee Vivo Biosciences Inc. Ei ole patentteja, tuotteita kehittäminen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Munasarjasyöpä on kaikkein vaarallisin maligniteetti naisen lisääntymiselimiin [1]. Puutteen vuoksi oireita varhaisessa vaiheessa tauti, viiden vuoden eloonjäämisaste on vain 27,2% [1]. Kaukoliikenteen munasarjasyövän hoitoon on sytoreduktiivisen leikkaus seurasi platinapohjaisen kemoterapian [2]. Aluksi, munasarjasyöpä vastaa myönteisesti 70-80%: ssa tapauksista [3]. Kuitenkin 18 ja 24 kuukauden kuluttua hoidon aloittamisesta, kasvain uusiutuu, joka (noin 70% potilaista) on johtuu karsinoomien oli tullut platina kestävät [3] Tämä huono eloonjäämisaste naisten platina kestävät munasarjakarsinoomissa pistettä että pikaisesti käyttöön vaihtoehtoinen strategia.

Doksorubisiini (Dox) on laajakirjoinen anthracylin eristetty

Streptomyces peucetius

jota on käytetty hoitoon useita syöpiä, kuten munasarjan, rinta, ja eturauhasen [4]. Itse asiassa, anthracylins ovat yleisimmin käytetty FDA hyväksyi syöpälääke [5]. Dox: n tehokkuuden on katsottu johtuvan sen kyvystä interkalatoi välillä DNA-säikeet toimia topoisomeraasi II: n inhibiittori ja /tai sitoa kovalenttisesti proteiineja, jotka liittyvät DNA: n replikaatioon ja transkriptioon [5]. Käyttö Dox rajoittaa vakava annoksesta riippuvaisia ​​sivuvaikutuksia mukaan lukien akuutti pahoinvointi ja oksentelu, stomatiitti, neurologisia häiriöitä, sydänlihaksen myrkyllisyys, alopesia ja luuytimen aplasia [5]. Vaihtoehtoisesti pegyloitu liposomaalinen doksorubisiini (PLD) (DOXIL) pidetään yhtenä standardin hoitovaihtoehtojen toistuvien munasarjasyöpiä (ROC) [6]. Huolimatta suhteellisesti alhaisemmat haittavaikutuksia Doxil on hyvin alhainen vastausprosentti ( 20%) [6].

Äskettäin yhdistelmähoito Dox on kerännyt enemmän huomiota. Yhdistämällä Dox sildenafiilin kanssa johti parannettu solukuoleman kautta alas sääntelyn Bcl-2 liittyy lisääntyneeseen kaspaasi 3 tehostamalla Dox aiheuttaman reaktiivisten happiradikaalien (ROS) ja vaimentaa Dox aiheuttamien sydämen vajaatoiminta [7]. Dox on myös yhdistetty HO-3867, synteettinen curcumin analoginen, saavuttaa parannettu solukuoleman ja vähentää sydänlihaksen myrkyllisyys käyttämällä pienempiä annoksia Dox [8]. Siksi yhdistelmähoito on osoittautunut hyödylliseksi, jolla vähennetään liittyvät sivuvaikutukset Dox säilyttäen silti sen terapeuttinen funktio.

Withaferin A (WFA) on bioaktiivinen, solun läpäisevä steroideihin laktoni ottaa withanolide luuston sen perus rakenne. WFA eristetään kasvi

Withania somniferia

, joka on ollut osa Intian Ayurvedic lääketieteen vuosisatoja ja on nyt saatavilla over-the-counter ravintolisä Yhdysvalloissa Sitä on käytetty hoitamaan erilaisia ehtoja koska sen tulehdusta ja antibakteerisia ominaisuuksia. Viime aikoina on ehdotettu, kuten syöpää torjuvia yhdisteen on osoitettu estävän tuumorin kasvua, angiogeneesin, ja etäpesäkkeiden [9], [10]. Useat biologiset toiminnot ovat vaikuttaneet WFA lukien apoptoosin induktion avulla inaktivaation Akt ja NF-KB [11] sekä lasku pro-eloonjäämisen proteiini Bcl-2 [12], [13], induktio Par-4 [14 ] esto Hsp90 ja Notch-1 [15], G2 /M solukierron pysähtymisen [16], FOXO3a ja Bim asetuksen [9], sukupolvi ROS [17], [18] ja alas säätely ilmentymisen HPV E6 ja E7 onkoproteiineja [19].

edellinen tutkimus on osoittanut, että WFA parantaa sytotoksista vaikutusta Dox osteogeeninen sarkooma (U2OS) ja rintasyövän solulinjan (MCF-7) käyttäen soluproliferaation määritys [20] . Kuitenkin yhdistetty vaikutus Dox ja WFA ei ole tutkittu munasarjasyöpä, vaikutusmekanismia määritelty, tai yhdistelmähoito testattu

in vivo

tukahduttamista kasvaimen kasvua. Olemme ehdottaneet, että WFA yhdistettynä Dox tulee saada synergistinen vaikutus tukahduttaminen munasarjojen kasvaimen kasvua. Testata hypoteesia, tutkimme yhdistetty vaikutus Dox ja WFA sisplatiinilla herkkä munasarjojen epiteelin syövän A2780, sisplatiini kestävä munasarjojen epiteelin A2780 /CP70, ja p53 mutantti munasarjojen epiteelisolujen linja CaOV3. Ensimmäistä kertaa osoitimme, että solukuolema indusoitiin ROS tuotanto ja DNA-vaurioita, jotka johtavat induktion autophagy ja huipentui solukuolemaan kaspaasi 3 riippuvaisella tavalla. Osoitimme myös, että vaikutus Dox ja WFA

in vitro

3D kasvaimet syntyvät A2780 solujen ihmisen soluväliaineen. Lisäksi tutkimme vaikutus yhdistelmähoidon

in vivo

syöpäkasvainten kasvuun, leviäminen, angiogeneesi, autophagy, solukuolemaa, ja DNA-vaurioita käyttäen ksenograftikasvaimissa tuottama ruiskuttamalla A2780 solut nude-hiirissä.

Materiaalit ja menetelmät

Eettinen linjaus

Eläimet työtä raportoitu käsikirjoitus tehtiin hyväksymisen jälkeen protokollan yliopiston Louisville Animal Care Käytä komitea (IACUC).

Cell Culture

Ihmisen munasarjan epiteelin kasvain sisplatiini-herkän (A2780) solulinja saatiin lahjana tri Denise Connolly (Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, PA). Solulinja on alun perin tuotettu ihmisen munasarjasyöpä potilaan ennen hoitoa [21]. Sisplatiini kestävä (A2780 /CP70) solulinja saatiin lahjana tri Christopher States (University of Louisville, Louisville, KY). Tämä solulinja oli peräisin A2780 hoidon jälkeen sisplatiinin [22]. CaOV3 solulinja hankittiin American Type Culture Collection (ATCC). A2780 ja A2780 /CP70-soluja viljeltiin RPMI-väliaineessa, joka sisälsi 10% FBS: ää, 1% penisilliini /streptomysiiniä ja 0,05% (v /v) Insuliini (Sigma). Caov3-soluja viljeltiin DMEM-alustassa, joka sisälsi 10% FBS: ää ja 1% penisilliiniä /streptomysiiniä. Vasta-aineita fosfo-BAD Pa

136, Bcl-x L, pilkottiin kaspaasi 3, ja GAPDH ostettiin Cell Signaling Technology. Ki67 vasta-aine hankittiin Santa Cruz Biotechnology, CD31 ja LC3B alkaen Abcam. Doksorubisiini, withaferin A, N-asetyyli-L-kysteiini, superoksididismutaasi, katalaasi, ja DMSO hankittiin Sigmalta.

Cell Proliferation (MTT) -määritykset

A2780, A2780 /CP70, ja Caov3 kasvavien solujen kasvuvaiheessa trypsinoitiin ja ympättiin 96-kuoppaisille levyille. 24 tunnin kuluttua pinnoitus, soluja käsiteltiin kolmena rinnakkaisena eri annoksilla Dox ja WFA molemmat yksin tai yhdistelmänä WFA /Dox 24, 48, ja 72 h. Sen jälkeen, kun tietyn ajan, 20 ui MTT reagenssin solulisäkasvumääritykselle Kit (Promega) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin noin 1 tunti. Värin kehittyminen arvioitiin ELISA-lukijalla 492 nm: ssä, kuten aiemmin on kuvattu [23]. Dox liuotettiin veteen ja WFA liuotettiin DMSO. DMSO: ssa (0,1% v /v) käytettiin ajoneuvon ohjaus.

Isobologrammi Analyysi

A2780 ja A2780 /CP70-soluja käsiteltiin kolmena rinnakkaisena 48 h käyttäen 7 pitoisuuksia Dox ja WFA sekä yksin tai yhdistelmänä WFA /Dox tasaisella nopeudella, kuten edellä on kuvattu. Elävät solut kvantitoitiin MTT määrityksissä kuten edellä on kuvattu, ja fraktion laskettiin estoprosentti. Fraktion käytettiin sitten CalcuSyn- ohjelmisto tuottaa annos-vaste-käyrä ja isobologram-.

solukuoleman määritykset käyttämällä virtaussytometria anneksiini V

A2780 hoidettiin Dox ja WFA molemmat yksin tai yhdistelmänä of WFA /Dox kuin edellä 24 tuntia. Solut liukenevat verseeniä (Invitrogen), pestiin PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen anneksiini V: n sitoutumisen puskuriin pitoisuuteen 1 x 10

6 solua /ml. Anneksiini V-FITC: tä (2 ui, BD Biosciences) inkuboitiin 15 minuutin ajan pimeässä 100 ui solususpensiota. Neljäsataa ui anneksiini V: n sitoutumisen puskuria lisättiin suspensioon. Kaksi ui propedium jodidia (PI) on, joka on lisätty liuokseen ja käytettiin välittömästi on FACSCaliber (BD Biosciences), kuten ovat kuvanneet Betts et al [24]. Anneksiini V: ja PI-värjätyt solut analysoitiin käyttäen FlowJo ohjelmistoa.

reaktiivisen hapen (ROS) määritykset

A2780-soluja siirrostettiin lasipohja 35 mm

2 maljaa yön yli, jota seuraa käsittely Dox ja WFA kuten edellä on kuvattu 24 tunnin ajan. Sitten soluja inkuboitiin 2 uM H

2DCFDA (Invitrogen) kasvatusväliaineessa 30 min 37 ° C: ssa, kuten ovat kuvanneet Das et al [7]. Solut pestiin PBS: llä, tarkasteltiin konfokaalimikroskoopilla ja valokuvattiin.

DNA-vaurio Analyysi käyttämällä TUNEL määritykset

A2780-soluja ympättiin kammion dioja ja käsiteltiin Dox ja WFA kuten edellä on kuvattu. Sitten solut analysoitiin DNA-vauriota käyttämällä DeadEnd fluorometrinen TUNEL iinianalyysikitissä (Promega) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Solut tutkittiin konfokaalimikroskoopilla ja valokuvataan.

TUNEL määrityksissä kudosleikkeiden suoritettiin käyttäen ApopTag Plus Peroxidase Apoptosis Detection Kit (Millipore, Billerica, MA) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Protein eristäminen ja Western blot -analyysi

A2780-soluja ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja käsiteltiin Dox ja WFA molemmat yksin tai yhdistelmänä WFA /Dox kuten edellä on kuvattu 24 tunnin ajan. Solulysaatit valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu [25]. Proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosamembraanille (GE Healthcare). Ensisijainen vasta-aineet laimennettiin kuten valmistajan ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa. Vasta-aineen sitoutuminen paljastettiin peroksidaasilla leimattuja sekundaarisia vasta-aineita visualisoidaan parannettu chemioluminescence (GE Healthcare), kuten aiemmin on kuvattu [26]. Sitten blotit uudelleen koetettiin GAPDH normalisoida eroja lastaus.

Kolmiulotteinen (3D) Tumor Growth Analyysit

A2780-soluja (15000 /helmi) sekoitettiin Hubiogel® suhteessa 01:04 ja annosteltiin 10 ui helmien ja annettiin polymeroitua ennen väliaikaisesti lämpimään kasvualustaan ​​muodostamiseksi pallomaisia ​​kasvaimia. Jokainen pallomainen kasvain (1 mm

3) siirrettiin 96-kuoppalevylle (yksi kasvain /kuoppa) ja käsiteltiin Dox (0,2, 2 uM), WFA (0,5, 2 uM), tai yhdistelmä WFA /Dox (0.5 uM /0,2pM tai 2,0 uM /0,2 uM). Medium korvattiin (kahdesti /viikko) sisältävällä liuoksella tuoretta ainetta. Kasvaimen kasvu suoritettiin päivänä 1, 3 ja 7 käyttäen MTT-määrityksiä yllä kuvatulla tavalla. Kasvaimet käsittelyn jälkeen inkuboitiin kalseiini AM (Invitrogen) 30 minuutin ajan ja tutkittiin käyttäen Nikon B-2EIC fluoresenssimikroskooppiin käyttäen FITC suodatinta lohko Ex

465-495 nm ja Em

515-555 nm) ja valokuvattiin.

Vieraslajisiirteen kasvaimen muodostumisen ja hoito Dox, WFA tai WFA /DOX

A2780 solut sekoitettiin matrigeelin (BD Biosciences) klo 01:01 suhteessa. -Soluja (2 x 10

6) molemminpuolisesti injektoitiin ihonalaisesti ventraalisen kylkeen 5-6 viikkoa vanhojen nu /nu-hiiriä (Charles River) ja kasvainten annettiin kasvaa 20 päivää, kunnes ne saavuttivat 100 mm

3 koko kuten aiemmin on kuvattu [27]. Sitten hiiret satunnaistettiin 6 ryhmään ja injektoitiin: 1) PBS: ssä, 2) 10% DMSO: ta + 90% glyseryylimonostearaattia trioktanoaatti (ajoneuvo), 3) Dox 9 mg /kg, 4) Dox 1 mg /kg, 5) WFA 2 mg /kg, tai 6) Dox 1 mg /kg + WFA 2 mg /kg. Hiiriä käsiteltiin joka toinen päivä i.p. käyttäen 100 ui ja kasvaimet mitattiin digitaalinen työntömitta ennen hoidon. Dox liuotettiin suolaliuokseen taas WFA liuotettiin DMSO: hon ja glyseryyli trioktanoaatti (10:90 v /v). Hiiret tapettiin 12 päivää hoidon aloittamisen. Kaikki käsittelyt hyväksynyt IACUC, University of Louisville.

immunohistokemiallinen analyysi kasvainkudosnäytteet

ksenograftikasvaimissa kiinnitettiin 10% formaliinilla ja upotettiin parafiiniin leikkeiden. Objektilasit poistettiin parafiini ksyleenillä ja rehydratoitiin luokiteltujen sarjojen etanolia. Antigeeni haku suoritettiin inkuboimalla kalvoja 10 mM natriumsitraatti, pH 6,0 20 minuutin ajan 95 ° C: ssa, minkä jälkeen käsitellään 0,3% H

2O

2 metanolissa 20 min ajan [28]. Objektilasit käsiteltiin käyttämällä Vectastain ABC Elite Anti-Rabbit Kit (Vector Labs). Leikkeitä inkuboitiin ensisijaisen vasta-aineiden Ki67 (laimennettu 1:50, Santa Cruz Biotechnology), CD31 (01:50, Abcam), LC3B (1:500, Abcam), ja pilkotaan kaspaasi 3 (1:200, Cell Signaling) osoitteessa 4 ° C: ssa yön yli. Objektilasit huuhdeltiin PBS: llä ja inkuboitiin sekundäärisen vasta-aineen mukaan toimittajien ohjeita. Väri kehitettiin käyttämällä DAB (Vector Labs) ja vasta- värjättiin hematoksyliinillä QS (Vector Labs) värjäämään ytimien kuten aiemmin on kuvattu [28].

Tilastollinen analyysi

Arvot ilmaistiin keskiarvona ± SD. P-arvot määritettiin ANOVA seurasi Student-Newman-Keuls testin monimuuttujille.

Tulokset

WFA synergizes Antituumorivaikutus doksorubisiinin

Dox käytetään tyypillisesti 5 uM matkia havaittu konsentraatio plasmassa olevia potilaita Dox hoito [29]. Kuitenkin tällä annoksella, potilailla esiintyy vakavia haittavaikutuksia, sillä pitoisuudella 1 uM ylläpitäminen vaatii erilaisia ​​mekanismeja toimien Dox [29]. Minimoimiseksi tai poistamiseksi näistä haittavaikutuksista, selvitimme mahdollisuutta käyttää Dox /WFA yhdistelmähoito. Munasarjasyövän solulinjoissa A2780 ja Caov3 ja sisplatiinin kestävä A2780 /CP70 käsiteltiin eri pitoisuuksilla Dox ja WFA sekä yksin että yhdistelmänä. Dox /WFA yhdistelmä inhiboi soluproliferaatiota kaikkien kolmen solulinjojen annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla. Kun Dox ja WFA käytetään yksin, IC

50-arvot A2780 soluissa, sen jälkeen 48 h hoidon olivat 0,8 uM ja 4,1 uM (Fig. 1A-B). Kun soluja yhdessä käsiteltiin yhdistelmä Dox 1,5 uM WFA, IC

50-arvo Dox laski 0,16 uM (Fig. 1A). Vastaavasti kun 200 nM Dox yhdistettiin WFA, IC

50 vastinetta WFA laski 1,5 uM (Fig. 1 B). Solut kun samanaikaisesti käsitellään 200 nM Dox ja 2,0 uM WFA johti 90 95% solukuolema (Fig. 1 B), kun taas solujen käsittely Dox yksinään (200 nM) ja WFA yksinään (2,0 uM) aiheutti 9 % ja 20%: n inhibition vastaavasti. Sillä A2780 /CP70 soluja, IC

50-arvot Dox ja WFA olivat 0,65 uM ja 6 uM. Yhdistämällä Dox 1,5 uM WFA vähensivät IC

50 arvo Dox 0,18 uM, ja yhdistämällä WFA 200 nM Dox vähensivät IC

50-arvo 1,2 uM (Fig. 1 C-D). Caov3-soluja herkempiä hoidon Dox ja WFA yksinään tai yhdistelmänä Dox /WFA (tuloksia ei esitetty). IC

50-arvot on esitetty yhteenvetona taulukossa 1. Nämä tulokset viittaavat siihen, että Dox /WFA yhdistelmä työskentelee synerginen tavalla välittäjänä antituumorivaikutus. Soluproliferaation tietoja 24 h ja 72 h hoito on esitetty kuviossa. S1 ja S2.

A2780 ja A2780 /CP-soluja maljattiin 96-kuoppaisille levyille. 24 tunnin kuluttua pinnoitus, soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla Dox ja WFA, molemmat yksin tai yhdessä. 48 tunnin kuluttua hoidon, solujen elinkelpoisuus määritettiin käyttäen MTT-määrityksissä. Esitetyt arvot ovat keskiarvoja ± SD neljästä itsenäisestä kokeesta. * P 0,05 verrattuna kontrolliin, # p 0,05 verrattuna Dox tai WFA yksin. (E) Isobologrammi analyysi A2780-soluja (n = 4) ja (F) A2780 /CP70 (n = 4) käyttäen 7 annoksia Dox ja WFA pidetään vakiona suhteessa ja solukuolemaa määritettiin MTT-määrityksissä. Tulokset analysoitiin CalcuSyn- ohjelmisto.

Vahvista, että vaikutus yhdistelmän WFA kanssa Dox oli synergistinen, suoritimme isobologram- analyysi. Sekä A2780 ja A2780 /CP70-soluja käsiteltiin 7 pitoisuudet Dox ja WFA jatkuvassa suhteessa 48 tuntia, ja solujen lisääntyminen analysoitiin MTT määrityksissä. CalcuSyn ohjelmistoa käytetään tuottamaan isobologrammit, joka osoittaa, että Dox ja WFA toimivat synergistisesti (Fig. 1 E-F) sekä solulinjoissa.

onko apoptoosin oli syynä solukuoleman, teimme anneksiini V -FITC virtaussytometria A2780 soluissa, joita käsiteltiin Dox ja WFA sekä yksin tai yhdistelmänä. Analyysi Dox, WFA, ja Dox kanssa WFA käsiteltyjen näytteiden osoittivat ei-kasvavat merkittävästi ohjaus anneksiini V (Kuva. S3). Jotta voitaisiin vahvistaa myös tekniikka, positiivinen kontrolli näytteet tuotettiin käyttämällä UV-altistuksen 30 sekuntia ja analysoimalla solut 4 h, 6 h, ja 24 h altistuksen jälkeen tehokkuuden varmistamiseksi värjäytymistä (kuvio. S4). Lisäksi olemme tutkineet luontainen apoptoottisten proteiinien fosfo- BAD

136 (pBAD

136) ja Bcl-xL. Emme ei havaittu huomattavia muutoksia pBAD

136 tai Bcl-x (Fig. S5), mikä osoittaa, että vaihtoehtoisen reitin luontaisten apoptoosin käytetään aiheuttamaan solukuoleman.

Dox ja WFA Tuota ROS aiheuttavan Cell Death

Dox tiedetään tuottavan ROS osana sen mekanismien [4], [5]. Lisäksi on lukuisia raportteja WFA tuottavan ROS tuotanto on yksi osa sen apoptoottisten mekanismien eri syöpätyyppejä [12], [17], [18], [30]. Siksi kysyimme WFA voisivat voimistaa alhaisen pitoisuuden Dox 24 tunnin kuluttua hoidon, käytimme H

2DCFDA määrittää sukupolven ROS. H

2DCFDA on stabiili ei-polaarinen yhdiste, joka on helposti diffundoituu soluihin. Tämä yhdiste hydrolysoidaan sitten solunsisäisten esteraasien muodostamiseksi DCFH, joka puolestaan ​​hapetetaan vetyperoksidilla, jolloin saadaan erittäin fluoresoiva yhdiste 2’7′-dikloori-(DCF). 6 h kuluttua hoidon WFA 1,5 uM merkittävästi lisääntynyt ROS-positiivisia soluja 2%: sta 17% kontrolliin verrattuna soluihin (tuloksia ei esitetty). 24 tunnin kuluttua hoidon, Dox 200 nM oli pieni määrä ROS-positiivisten solujen, 18% (Fig. 2A-B). Vaikka WFA 0,5pM (23%) ei ollut merkittävästi erilainen kuin Dox, yhdistelmästä Dox 200 nM WFA 0,5pM johti merkittävään kasvuun 37%. Tämä vaikutus on suuresti parannettu yhdistelmä Dox 200 nM WFA 1,5 uM, kasvaa 90%: iin ROS positiivisia soluja (kuvio. 2A-B). Käsittely WFA 2 uM vaurioituneet solut liian vakavasti tuottaa ROS, mikä osoittaa, että vaikutus WFA on ROS tuotanto on annoksesta riippuvainen ja siitä yhdistettynä Dox saa aikaan synergistisen vaikutuksen.

Varmista, että ROS ovat vastuussa meidän havaittu solukuolema, teemme yhteistyötä käsiteltyjen A2780 solujen ROS scavenger N-asetyyli-L-kysteiini (NAC, 5 mM) tai entsymaattisella antioksidantit (SOD) ja katalaasi yhdessä Dox ja WFA hoitoja 24 ja 48 tuntia kuten edellä on kuvattu. Vaikka NAC oli tehoton estämään solukuolema, jota Dox 24 h, se antoi kohtalainen suoja 48 tunnin kuluttua hoidon (Fig. 3A) määritettiin MTT-määrityksissä. NAC oli erittäin tehokas estämään solukuolema, jota WFA 24 tunnin jälkeen ja jatkoi suojaa jälkeen 48 tunnin inkuboinnin (Fig. 3C). NAC oli tehokas myös estää Dox /WFA yhdistelmähoidon (Fig. 3B-D). Erottamaan tärkeä muoto ROS tuottaman Dox ja WFA hoito, käsittelimme solut entsymaattiseen antioksidantteja katalaasi 500 U /ml tai SOD 100 U /ml. On raportoitu, että katalaasi on usein käytetty solut hajottamaan vetyperoksidin [31], kun taas SOD erityisesti katalysoi superoksidianionien [32]. 48 tunnin kuluttua hoidon, SOD merkittävästi estetty indusoimaa solukuolemaa Dox ja WFA yksin ja yhdistelmänä (Fig. 4). Samanlainen SOD, katalaasi osoitti suojaa solukuolemaa Dox ja WFA molemmat yksin tai yhdistelmänä WFA /Dox (tuloksia ei ole esitetty), mikä osoittaa, että superoksidianionien ovat suuria ROS tuotettuja lajeja Dox ja WFA.

A2780 solut maljattiin lasipohja ruokia. 24 tunnin kuluttua pinnoitus, soluja käsiteltiin Dox ja WFA, molemmat yksin tai yhdistelmänä WFA /DOX, kuten on kuvattu kuviossa 1. 24 tunnin kuluttua hoidon alusta korvattiin tuoreella alustalla, joka sisälsi H

2DCFDA ja inkuboitiin 30 min. Solut huuhdeltiin PBS: lla ja tutkitaan konfokaalisella mikroskoopilla. (A) ROS positiiviset solut (vihreä väri) laskettiin perustuen 3 pienitehoisia kenttiä. Keskiarvo ± SD. P-arvot määritettiin ANOVA seurasi Student-Newman-Keuls testi monivertailuja. * P 0,05 kontrollista, $ P 0,05 verrattuna Dox, P 0,05 verrattuna WFA. (B) Konfokaalimikroskopia analyysi soluista osoittaa sukupolven ROS (vihreä).

A2780-soluja yhteistyötä käsiteltiin NAC ja Dox, WFA tai yhdistelmä WFA /WFA 48 tuntia. Solujen proliferaatio määritettiin käyttäen MTT-määrityksissä. Esitetyt arvot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. P 0,05 verrattuna kontrolliin, # P 0,05 verrattuna ei NAC ja NAC.

Solujen proliferaatio määritettiin käyttäen MTT määrityksiä. Esitetyt arvot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05 verrattuna kontrolliin, # P 0,05 verrattuna ei SOD ja SOD.

Koska ROS aiheuttaa DNA-vaurioita, suoritimme TUNEL määritys visualisoida laajuuden DNA-vaurioita, kun heitä hoidetaan Dox ja WFA yksin tai yhdistelmänä. 24 tunnin kuluttua hoidon Dox 200 nM DNA-vaurioita muutaman solun taas WFA 1,5 uM yksin hieman lisääntynyt määrä vaurioituneiden solujen (Fig. 5). Kuitenkin hoito Dox 200 nM ja WFA 1,5 uM yhdistelmä johti tehostetun vaikutuksen aiheuttavan DNA-vaurioita. Lähes jokainen solu osoitti DNA-vaurioita (Fig. 5).

A2780-soluja käsiteltiin Dox, WFA molemmat yksin tai yhdistelmänä WFA /Dox. 24 tunnin kuluttua hoidon, DNA-vaurioita analysoitiin TUNNEL määrityksiä. Kuvat saatiin käyttäen konfokaalimikroskopialla on 20X suurennoksella.

yhdistelmä Dox ja WFA aiheuttama Cell Death Autophagy

Various syöpälääkkeiden kemoterapian lukien Dox on osoitettu aiheuttavan autophagy, joka toimii yhdessä apoptoosin indusoimiseksi solukuolemaa [33] – [38] keinona poistaa vaurioitunut organelleja, jotka voivat tuottaa korkean tason ROS ja siten rajoittaa kromosomaalisen epävakautta [39]. Siksi tutkii rooli kemoterapia agentti Dox yhdistettynä WFA in autophagy on Avenue kohteisiin. Elektronimikroskoopilla analyysi ohjaus käsiteltyjen solujen DMSO osoitti, että läsnä mitokondrioiden ja ehjän ydinvoiman kääriä (Fig. 6). Vaikka WFA 0,5pM yksin oli vähän tai ei lainkaan vaikutusta, WFA 1,5 ja 2 uM osoitti muutaman autophagosomes indikaattorina autophagy, mutta jätti mitokondriot ehjä, mahdollisesti mukauttaminen mekanismi. Solut hoidetuilla Dox 200 nM yksin osoitti muodostumista autophagosomes sisältävien soluliman ja hävittäminen mitokondrioita. Solujen käsittely Dox /WFA yhdistelmä johti tehostetun vaikutuksen annoksesta riippuvaisella tavalla. Dox 200 nM plus WFA 2 uM osoitti voimakasta autophagic vacuoles yhdessä romahtaminen ydinaseiden kääriä, kalvo hajoaminen, ja puuttuminen mitokondrioiden (Fig. 6), mikä osoittaa voimakasta soluvaurioita kun käsittelemällä Dox /WFA yhdistelmä.

A2780-soluja käsiteltiin Dox ja WFA, molemmat yksin tai yhdistelmänä WFA /Dox. 24 tunnin kuluttua hoidon, solut huuhdeltiin PBS: llä, kiinteä ja käsiteltiin TEM-analyysi. Elektronimikroskoopilla kuvia 5,600X suurennos on näytetty.

Vahvista induktion autophagy kun solujen käsittely Dox /WFA yhdistelmä, määritimme ilmentymisen kanonisen markkerin autophagosome muodostumista, mikrotubuluksiin liittyvä proteiini-1 kevytketjun 3B (LC3B) [38]. Western blot analyysi solujen havaittiin kaksi spesifistä vyöhykettä: ylemmän kaistan (18 kDa), joka edustaa LC3B-I ja alemman nauhan (16 kDa), joka vastaa LC3B-II (Fig. 7). Soluliman LC3B-I muutetaan LC3B-II kautta lipidaatio ja mahdollistaa LC3B-II tulla liittyy autophagic rakkulat. Hoidon Dox indusoiman LC3B-II (Fig. 7), kun taas WFA yksin stimuloiman pre-osoitin LC3B-I sekä LC3B-II (Fig. 7). Yhdistelmähoito parantaa LC3B-II annoksesta riippuvaisella tavalla Dox 200 nM WFA 2 uM, jolla on suurin ilmentyminen (Fig. 7). Sen määrittämiseksi, onko autophagy oli sopeutuminen vaste tai mekanismi solukuoleman, tutkimme pilkottu kaspaasi 3 markkerina solukuoleman. Western blot-analyysi osoitti lievän nousun käsitelty solu Dox 200 nM. Sen sijaan, WFA 0,5 uM ei osoittanut solukuoleman, kun taas WFA 1,5 ja 2 uM kasvoi tason katkaistun kaspaasi 3. Solujen käsittely Dox /WFA yhdistelmä osoitti edistää edelleen solukuoleman annoksesta riippuvaisella tavalla (Fig. 7), mikä osoittaa, että autophagy edistää solukuolemaa sijaan indusoimaan mukauttamista mekanismi edistää solujen eloonjäämistä, joilla Dox /WFA yhdistelmähoitoon.

24 tunnin kuluttua hoidon, solut pestiin PBS: llä ja hajotettiin. Western blot-analyysi suoritettiin LC3B, kaspaasi 3 ja GAPDH-proteiineja.

vaikutus Dox ja WFA 3D kasvaimia in vitro

Lisäksi määrittämällä tuumorin solujen kasvua, me arvioidaan vaikutukset Dox ja WFA molemmat yksin tai WFA /Dox yhdistelmä niiden antituumoriteholla käyttämällä 3D mini-kasvain malli emuloi

in vivo

-kuten monisoluisten kasvaimen kasvua ja biologia. Elinkelpoinen mini-kasvainten (1 mm

3 koko) on A2780 munasarjasyövän soluja tuotetaan käyttämällä 3D ihmisen biogeelillä kulttuuri järjestelmä (HuBiogel®, Vivo Biosciences Inc.). Hubiogel® on osoitettu edustavat ihmisen matriisin tarkemmin kuin Matrigel, jotta voidaan ennustaa prekliinisiä päätepisteet [40]. Mini-kasvaimia käsiteltiin 1) Dox 0,2pM, 2) Dox 2,0 uM, 3) WFA 0,5pM, 4) WFA 2,0 uM, 5) Dox 0,2pM kanssa WFA 0,5pM, ja 6) Dox 0,2pM kanssa WFA 2 uM . Mittaukset kasvaimen kasvun tehtiin päivänä 1, 3 ja 7 käyttäen MTT-määrityksiä ja fluoresenssimikroskopia. Medium ja DMSO käsitelty kasvaimet jatkoivat kasvuaan koko hoidon, kun taas Dox 0,2pM olivat niiden kasvu pysähtyi päivänä 7 (Fig. 8A). Dox 2,0 uM yksin ja WFA 2,0 uM yksin käsitellyt tuumorit osoittivat kasvun hidastumista ja tämä estävä vaikutus tehostui käsittelemällä Dox 0,2pM plus WFA 2,0 uM (Fig. 8A). Yhdistelmä Dox 0,2pM kanssa WFA 0,5pM saavuttanut merkittävästi parannettu vaikutus verrattuna joko pelkän yhdisteen (Fig. 8A). Mikroskopia analyysi kasvainten jälkeen päivänä 3 ja 7 on esitetty kuviossa. 8B ja 8C, osoittaen, synerginen vaikutus Dox ja WFA yhdistelmä kasvaimen kasvun estoa.

(A) A2780 Solut yhdistettiin Hubiogel® on 1:04 suhde, ja kasvatettiin 10 ui helmiä. Kasvaimet käsiteltiin Dox ja WFA, molemmat yksin tai yhdistelmänä WFA /Dox. Kasvaimia käsiteltiin kahdesti /viikko korvaamalla liuoksella, joka sisälsi tuoretta ainetta. Kasvaimen kasvu mitattiin MTT-määrityksiä jälkeen päivänä 3 tai 7 hoidon. (B-C) Kasvaimet käsittelyn jälkeen inkuboitiin kalseiini AM 30 min ajan, ja kuvat otettiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia jälkeen 3 päivää hoidon jälkeen (B) tai 7 päivää hoidon (C).

vaikutus Dox ja WFA on Vieraslajisiirteen Tumor Growth

vaikutuksen tutkimiseksi Dox ja WFA yksin tai yhdessä kasvaimen kasvuun

in vivo

, hiiren tuumoriksenografteja kehitettiin ruiskuttamalla A2780-soluja (2 × 10

6) ihon alle bilateraalisesti vatsanpuoleisissa kylkeen 5-6 viikkoa vanhojen nu /nu hiirille. Kasvainten annettiin kasvaa, kunnes ne saavuttivat 100 mm

3 koko. Päivänä 20 jälkeisen solun injektio, hiiret jaettiin satunnaisesti 6 5 hiiren ryhmiä jokaisen ja käsiteltiin erilaisilla aineilla: 1) negatiivinen kontrolli (PBS), 2) ajoneuvon ohjaus (10% DMSO ja 90% glyseryyli trioktanoaatti), 3) Dox 9 mg /kg, 4) Dox 1 mg /kg, 5) WFA 2 mg /kg, ja 6) Dox 1 mg /kg kanssa WFA 2 mg /kg, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Kasvaimet mitattiin joka toinen päivä, ja hiirille annettiin 100 ui i.p. volyymi 12 päivän ssa yhteensä 32 päivää. Hiiret, jotka saivat Dox 9 mg /kg näytti olevan hyvin sairaana ruokahaluttomuus johtaa laihtumiseen ensimmäisen hoitokerran jälkeen ja myöhemmin kuoli 4 hoitoa. Hiiret muissa ryhmissä näyttivät olevan terveitä ilman ruokahaluttomuus tai painon koko hoitojakson ajan. Tuumorin tilavuus ei ollut merkitsevää eroa ajoneuvon Dox 1 mg /kg ja WFA 2 mg /kg ryhmille. Kuitenkin hiiret, jotka saivat Dox 1 mg /kg WFA 2 mg /kg (ryhmä 6), oli erittäin merkittävä (70-80%) vähennys kasvaimen kasvua (Fig. 9A). Samoin kasvaimen paino mitattiin päivänä 32 kerättyjen aikaan uhraamalla eläimiä, osoitti jyrkän laskun Dox 1 mg /kg kanssa WFA 2 mg /kg ryhmässä (kuvio. 9B) verrattuna muihin ryhmiin osoittaa, että yhdistelmä WFA kanssa Dox saa aikaan synergistinen vaikutus kasvaimen kasvaimen kasvun estoa

in vivo

.

(A) kasvaimet kasvua mitattiin päivä 20-32 (post-solujen injektion) ja käsitellään joka toinen päivä * P 0,05.