Krooninen sairaus

tiivistelmä

korkea sairastuvuus ja kuolleisuus potilaiden ruokatorven (E) ja maha-ruokatorven risteyksessä (GEJ) syövät, optio uudet esikliiniset malleja huumetestit. Hyödyllisyys ensisijainen tuumoriksenograftien (PTXGs) edeltäväksi kliinisissä malleissa arvioitiin. Kliinis, immunohistokemiallinen markkereita (p53, p16, Ki-67, Her-2 /

neu

ja EGFR), ja globaalin mRNA runsaasti profiilit arvioitiin sen määrittämiseksi, valinta harhat näytteiden implantoitu tai Siirto tehty, verrattuna perusjoukosta . Yhdeksän ensisijainen E /GEJ adenokarsinooman ksenografti linjat edelleen tunnettu varten taajuuksien ja vakauden geenin /proteiinin ilmentymistä kohtia. Seitsemän ensisijainen ruokatorven adenokarsinooma ksenografti linjat hoidettiin yksittäisten tai yhdistelmä kemoterapiaa. Kasvaimet, jotka istutettiin (n = 55) NOD /SCID hiirillä oli piirteitä viittaavia aggressiivisempi biologian kuin kasvaimia, joita ei koskaan istutettiin (n = 32). Näiden istutetaan, 21/55 Siirto tehty; engraftmentti liittyi huonosti eriytetty kasvaimet (p = 0,04) ja iäkkäät potilaat (p = 0,01). Expression Immunohistokemiallisen merkkiaineiden oli samanlainen potilaan näytteen ja vastaavan ksenograftin. mRNA havaitut erot potilaiden kasvaimia ja ensimmäisen kanavan ksenografteissa olivat paljolti menetyksestä Ihmisen strooman in ksenografteissa. mRNA malleja varhaisen vs. myöhään kulkua ksenografteissa ja pienten vs suuria kasvaimia saman käytävän olivat samanlaiset. Täydellinen vastus oli läsnä 2/7 ksenografteissa loput kasvaimia osoitti eriasteinen herkkyys, joka pysyi tasaisena kohtia. Koska niiden kyky kerrata primaarikasvaimen ominaisuudet aikana siirteen ja poikki sarja johtamisella, PTXGs voi olla hyödyllinen kliininen järjestelmiä arvioitaessa lääkeaineen herkkyys ihmisen E /GEJ syöpiä.

Citation: Dodbiba L, Teichman J, Fleet , Thai H, Starmans MHW, Navab R, et al. (2015) asianmukaista käyttää potilaasta peräisin ksenograftimalleja varten Farmakologiset Uusien hoitomuotojen arviointi for Ruokatorven /gastroesofageaalinen Junction Syövät. PLoS ONE 10 (3): e0121872. doi: 10,1371 /journal.pone.0121872

Academic Editor: Wayne A. Phillips, Peter MacCallum Cancer Centre, AUSTRALIASSA

vastaanotettu: 13 heinäkuu 2014; Hyväksytty: 17 helmikuu 2015; Julkaistu: 31 maaliskuu 2015

Copyright: © 2015 Dodbiba et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: Kaikki mRNA ilmaisun tiedostot ovat saatavilla GEO tietokannasta (hakunumero: GSE58870).

Rahoitus: GL tukivat Alan B. Brown Chair in Molecular Genomics, Posluns Family Fund ja CCO professuurin Experimental Therapeutics ja Population Studies. Tämä tutkimus suoritettiin tuella Ontario Institute for Cancer Research PCB myönnettyihin hallituksen Ontario. LEA tukivat Ontario Institute for Cancer Research New tutkija Award. PCB tukivat Terry Fox tutkimuslaitos New tutkija Award. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

viime vuosikymmeninä ruokatorven (E) ja maha-ruokatorven risteyksessä (GEJ) syöpä on nähnyt dramaattinen nousu esiintyvyys kehittyneissä maissa, kun taas viiden vuoden eloonjääminen on edelleen alhainen 19% [1]. Tunnistaminen menetelmiä valita sopiva lääkehoitojen vuoksi perusteltua. Perinteisesti solulinja paneelit on käytetty nopeasti testata syöpälääkkeet [2,3]. Lisäksi injektioita solulinjojen osaksi immuunipuolustus hiiret ovat yhteisiä

in vivo

malleissa lääkkeen tehosta [4,5]. Vaikka solulinjan lähestymistavat ovat suuresti vaikuttaneet lääkekehityksen ja syöpäbiologian, ne ovat epätäydellisiä malleja huumetestejä [6]. Lisäksi kolme laajalti käytetty E /GEJ syöpäsolulinjoja äskettäin todettu ovat saastuneet muiden solulinjojen aikaisin viljelmässä [7]. Siten idetifying asianmukaisten prekliinisten päihdetestien malleja tämä syöpä on haaste.

Ensisijainen tuumoriksenografteja (PTXGs) lupaavia vaihtoehtoisena prekliinisen malleja huumeiden herkkyyden testaus. PTXGs luodaan istuttamalla pala kasvain suoraan potilaasta immuunipuolustus hiirillä ja käyttäen tuloksena ksenograftissa kokeiluihin. Primaarikasvaimen ksenograftimalleja keuhkojen [8], rintojen [9], paksusuolen [10], pään ja kaulan [11] ja E /GEJ syöpiä [12], on osoitettu kerrata potilaan kasvainhistologiaa ja solujen morfologia vaihtelevassa määrin. Fysiologiset olosuhteet, kuten lämpötila, happipitoisuus, ravinnepitoisuus

jne

. lähemmin muistuttavissa läsnä syöpäpotilailla [6]. Lisäksi PTXGs ei ole tehty valintaa paineet ja merkittäviä molekyylitason muutoksia mukana solulinjassa perustaminen ja pitkän aikavälin kasvun [6], [13,14]. Siten PTXGs ehkä todennäköisemmin ennustaa lääkevasteita kuin solulinjoja kasvatetaan joko

in vitro

tai

in vivo

. Vaikka PTXGs on osoitettu matkia alkuperäisen kasvaimen hoitovasteen melko tarkasti [15-17], ne ovat edelleen alttiina valinnan voimia, jotka liittyvät erot ihmisen ja hiiren mikroympäristöihin [18]. Siksi on tärkeää arvioida, missä määrin PTXGs poikkeavat ensisijaisen potilaan kasvaimia genomisen ja proteiinin taso ennen ryhtymistä laajoja huumeiden tutkimuksiin.

Olemme aiemmin kuvattu PTXG mallin kehittämiseen [12]. Seuraava looginen askel on se päällimmäinen tavoite Tämän tutkimuksen: arvioidaan hyödyllisyys ja rajoituksista on PTXG malleja huumetestit. Erityisesti missä määrin ovat E /GEJ kasvaimet edustaja potilaan kasvainten yhteydessä farmakologisen arviointi? Omaa testejä useissa syöpätyyppejä ovat havainneet yhteisiä PTXG kysymyksiin, kuten: (i) puute siirteen monien kasvainten; (Ii) odottamattomat hiiri kuolemantapausta, mikä johtaa tarpeeseen muuttaa ja kokeiluja eri kohtia; (Iii) tekniset syyt, kuten tarve laajentaa ksenografteissa osaksi suuret ikäluokat ja jäädyttää alas aikaisemmin kohtia saavutettavuuden varmistamiseksi tulevien tutkimusten tuloksena tarvitse käyttää myöhemmin kohtia huumeiden kokeilut; ja (iv) satunnaisesti kyvyttömyys tunnistaa erityisiä PTXG mallien kanssa samat molekyylitason ominaisuudet havaittiin potilaassa.

Nämä tekniset asiat esiin neljä tärkeää malli liittyviin kysymyksiin, joita voidaan totesi kokeellisia hypoteeseja: (a) PTXG mallit edustavat taustalla väestöstä gastroesofageaalinen syöpiä (eli arvioidaan toimivasti siirtyviin bias), ja jos ei kokonaan edustavia, voimme kuvailla mikä harhat ovat läsnä ja miten ne voivat vaikuttaa päätelmiin; (B) PTXG mallit ovat käyttökelpoisia yleensä edes myöhemmin kohdat, koska niiden geeni /proteiini ilmentymismalleja pysyy vakaana; Tämän hypoteesin mittaa aste sekoittavia valitsemalla paineet siirtojen aikana; (C) PTXGs voi kerrata laaja molekyyli- ominaisuudet edustajan niiden taustalla primäärisyövästä; Tämän käsitteleekin ei löytää välisten kasvain heterogeenisuus tarpeen kehittää henkilökohtaisen lääketieteen lähestymistapoja terapia; ja (d) PTXGs vastata farmakologisen hoidon vakaasti useille kohtia. Siten arvioimme potentiaalin E /GEJ PTXGs jäljitellä mitä löytyy kliinisesti ihmisen E /GEJ kasvaimia, ja olosuhteita, joissa nämä PTXGs ovat aiheellista käyttää prekliiniset huumetestauksen malleja.

Materiaalit ja menetelmät

kliiniset ja patologiset Potilastiedot

Kaikki potilaat rekrytoitiin kirjallista suostumusta. Potilaan tiedot, mukaan lukien käsittely ja lopputulos (

i

.

e

. Eloonjäämiseen) saatiin läpi sähköisen potilaskertomuksen järjestelmä yliopiston Health Network (UHN), Toronto, Canada, maha -intestinal onkologit. UHN tutkimuseettiseltä (REB #: 06-0982-CE) hyväksyi tutkimuksen.

Eläimet ja Kudoskäsittely

Ei-liikalihava Diabeettinen-Severe Combined immuunipuutteisten (NOD /SCID) hiiriä kasvatetaan sisäisesti Ontario Cancer Institute (OCI) Animal Care laitokseen. Kaikki eläimet pidettiin taudinaiheuttaja ympäristössä tavallisella 12h päivän /12h yön ajan ja ruokittiin standardin steriloitu pellettiruokaa ja vesi

halun

. Eläimet lopetettiin käyttämällä hiilidioksidi, jonka jälkeen niskanmurrolla. Kaikki toimenpiteet hyväksynyt eettinen ohjeisto on OCI Animal Care Committee (eläin protokolla #: 1293,16).

Ihmisen E /GEJ syöpäkudokset saatiin potilailta, joille suoritetaan kirurginen resektio at UHN, Toronto, Ontario ja käsiteltiin kuten aiemmin on kuvattu [12]. Yhteenvetona, tuoreesta kudoksesta säilytettiin RPMI 1640-alustassa (ei FBS lisätty), kunnes se leikattiin paloiksi noin 5mm mitat ja istutettiin ihonalaisesti kylkeen NOD /SCID-hiirten (24 tunnin sisällä resektion, mutta syöpä kudokset pantiin soluviljelyelatusaineella kuluessa mediaani 45 minuutin kuluttua resektion, ja pidetään tiedotusvälineet asti istutusta). Kaksi edustavaa kappaletta tallennettuja Optimal Cutting Lämpötila (MMA) yhdiste (jäädytettiin -80 ° C: ssa molekyyli työ) ja formaliinilla parafiiniin upotetut (FFPE) lohkoissa molekyyli- ja patologisen analyysin vastaavasti.

hoito

kohortit 10 istutettiin hiirtä per hoitoryhmään seurattiin kasvaimen kasvua. Kun näkyvä, kasvaimet mitattiin metrinen jarrusatulat (Scienceware, kissa: 134160001) kahdesti viikossa. Hiiret tapettiin, kun kasvaimet saavuttivat 15-20 mm: n pisin mitta, pitää inhimillinen päätepisteen, jonka Animal Care komitea. Kun kasvaimet olivat saavuttaneet noin 300-750 mm

3, hiiret satunnaistettiin ohjaus ja kemoterapia aseita. Yhden Hoitokokeissa hiiren ryhminä injisoitiin kerran intraperitoneaalisesti 6 mg /kg sisplatiinia (1 mg /ml, Hospira, DIN: 02126613), 9 mg /kg paklitakselia (2 mg /ml, Hospira, DIN: 02296624) tai 100 mg /kg 5-fluorourasiilin (15 mg /ml, Hospira, DIN: 021827420), kun taas kontrolliryhmä injektoitiin suolaliuoksella. Yhdistettyjen hoito kokeissa kemoterapiaa ryhmä käsiteltiin kerran 5.4mg /kg sisplatiinia (1 mg /ml, Hospira, DIN: 02126613) ja 9 mg /kg paklitakselia (2 mg /ml, Hospira, DIN: 02296624), joka perustuu hiiri myrkyllisyys kokeiluja. Hiiret tapettiin 24 tunnin kuluttua hoidon aloittamisesta (merkitty pienet kasvaimet) ja lopussa kokeen (suuria kasvaimia). Mediaani kaksi hiirtä (1-3) kohti varren tapettiin vertailuja. Kasvaimet kerättiin ja tallennettu lokakuu ja FFPE lohkojen molekyylien /patologisten luonnehdintaan.

immunohistokemia molekyylimarkkereiden

arvioi paneeli molekyylimarkkereiden immunohistokemiallisesti (IHC) tutkia niiden vakautta kussakin ksenograftin. Markkereita valittiin perustuen niiden merkitys E /GEJ syöpä. FFPE kudoksen leikkeet värjättiin vasta-aineita p53 (klooni DO-7, Vector Laboratories, Burlington, Kanada, laimennus: 1: 250), p16

INK4a (MTM laboratoriot AG, Heidelberg, Saksa; not- laimennettu), Ki 67 (klooni SP6, Neomarkers, Rockford, USA, laimennus: 1: 500), EGFR (klooni 31G7, Zymed, San Francisco, USA, laimennus: 1: 100), Her-2 /

neu

(klooni A0485, Dako, Burlington, Kanada, laimennus: 1: 25), HIF-1α (klooni 54, BD Biosciences, Franklin Lakes, USA, laimennus: 1: 50) ja CD31 (klooni PECAM1, Santa Cruz, USA, laimennus: 1 : 1000). Värjäys indeksiä käytettiin arvioimaan CD31 ja HIF-1α ilmaisun käyttäen Aperio ImageScope katsojalle. Kaikki muut molekyylimarkkerit arvioitiin sokkona joukkue patologian. Yhdistelmä osuus pisteet ja intensiteetti pisteet käytettiin. Osuus pisteet (osuus positiivisia kasvainsoluja) on: 0: ei mitään, 1: 1-24%, 2: 25-49%, 3: 50-74, 4: ≥75%. Intensiteetti pisteet (värjäytymisen intensiteetti kasvaimen solut) oli: 0: ei mitään, 1: heikko, 2: kohtalainen, 3: voimakas. Kaikkiaan pisteet saatiin yhdistämällä tulokset. Lyhyesti, p53 ja p16 pidettiin positiivisena, jos värjäytyminen ilmestyi taas Ki-67 arvioitiin perustuen prosenttiosuus positiivisia kasvainsoluja. EGFR kalvo ekspressio määritettiin EGFR-positiivisuus. Her-2 /

neu

standardia pisteytys käytettiin; näytteet katsotaan olevan samanlaisia ​​ilmaisun jos ne eroavat vähemmän kuin yksi tahra intensiteetti pisteet (esim. 2+ vs 3+). Kaksipuolinen t-testejä käytettiin arvioimaan eroja ilmaisun näitä parametreja.

RNA

RNA eristettiin lokakuu upotettu ksenografti ja ihmiskudoksen (kymmenen x 10 pm paksu kryostaatti viipaleet) käyttäen RNeasy Mini-sarjat (Qiagen, 74104). RNA eheys arvioitiin käyttäen Agilent-2100-Bioanalyzer ja RNA Nano-6000-sarja (Agilent Technologies, 5067-1511) ja kvantitoitiin käyttäen Nanodrop-ND-1000 Spektrofotometri (Thermo-Scientific). RNA eheys numerot (RIN) 7 + tai 8+ olivat laatu cutoffs potilaan ja PTXG näytteitä, vastaavasti.

nimeäminen ja Hybridisaatio

Näytteet mukaiset merkinnät GeneChip WT Terminal nimeäminen ja Hybridisaatio käsikirja, hybridisoitiin Human Gene-1,1-ST paneelit (Affymetrix) ja skannattu GeneChip- Scanner 3000-7G (Affymetrix). Kaikki paneelit läpäissyt laadunvalvontakriteerit (Expression Console -ohjelmaa Affymetrix).

Tilastollinen analyysi

kemosensitiivisyys analyysin viive aika kasvaimen kaksinkertaistuvan tilavuuteen verrattiin välillä käsiteltiin linjojen ja niiden vastaava käsittelemättömiä kontrolleja. Aikaviiveet määritettiin piirtämällä kasvaintilavuudet logaritmisella y-asteikko ja piirtämällä vaakasuora viiva kaksinkertaistaminen taltio, siepata ja kontrolliryhmiin kasvukäyrät. Aikaviive määritettiin aikaero kahden siepataan ja se kutsutaan kaksinkertaistaa viivettä. Keskimääräinen kaksinkertaistuminen aikaviive kestävä vs. herkkä linjat on laskettu yhdistämällä kaikkien kontrollihiiret ja vertaamalla niitä yhdistettyjen arvojen käsiteltyjen hiirten.

Muita tilastollisia analyysejä suoritettiin kliinis tekijöihin liittyviä ennakkoluuloja tutkimuksessa näytteessä , ja määrittää liittyvät tekijät siirteen. Kaksipuolinen t-testejä sovelletaan kaikissa tapauksissa. Tulokset pidettiin merkittävinä, kun

p

-arvo 0,05. Tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen SAS.v.9.2 (Cary, NC).

Gene Profilointi Analysis

Sekä ensisijainen potilaan kasvain ja Hyväksytty ksenografti näytteitä käytettiin transcriptome analyyseihin (yhteensä 51 näytettä analysoitiin mRNA runsaus). Kaksikymmentäyksi adenokarsinooma kasvaimia profiloitu (12 Siirto tehty /9 ei Siirto tehty). Kahdeksan Siirto tehty ensisijainen adenokarsinoomat, käytävä yksi (P1) -ksenografti näyte profiloitu. Lisäksi analyysi suoritettiin 21. myöhemmin passage ksenografteja (P3 kautta P12), joista yhdeksän oli pienistä (aikaisin kasvukäyrän) kasvaimet ja 12 olivat suuria kasvaimia.

arvioitiin eroja mRNA profiileja välillä (a) potilaan kasvaimia, jotka Siirto tehty

vs

, jotka eivät, (b) P1-ksenografteja

vs

P0 (ensisijainen) kasvaimet, (c) myöhemmin kanavan ksenografteja

vs.

P1, ja (d) suuret

vs

pieni ksenograftikasvaimissa samassa kulkua. Kunkin Vertailun geeni-viisasta lineaarinen malli oli kunnossa vertailla kahta ehdot, oikaistuna array erän ja tarvittaessa käytävien. Väärä-löytö korjausta suoritettiin tiliin useita testaus [19].

Kaikki analyysit suoritettiin käyttäen R (v2.15.3). Paketit ristikko (v0.20-15) ja latticeExtra (v0.6-24) käytettiin graafista esitystä. Data esikäsittely- suoritettiin käyttäen RMA-algoritmia [20] (Affymetrix paketti, v1.36.0) yhdistettynä päivitetty ProbeSet merkintöjä (hugene11stv1hsentrezgcdf paketti, v15.0.0) [21]. Ilmaus suodatinta käytettiin poistamaan kokeellista kohinaa. Matalan intensiteetin kynnys asetettiin perustuu kromosomissa-Y-geenin intensiteetin viiden naispotilas näytettä kuten aiemmin on kuvattu [22]. Koettimet, joiden log-keskiarvo

2-transformoituja ekspressioarvo alle viisi poistettiin. Yhteensä ~ 15500 koettimia säilytettiin.

vallan analyysi suoritettiin power.t.test toiminto (tilastot paketti v.2.15.3) arvioida todennäköisyys, että erot ekspressiotasoja voitiin tunnistaa välillä ryhmiä. Koska ekspressiotietojen oli log

2-tila, eroa keskimääräisessä ilmaisun vastasi loki

2-transformoidut kertamuutosta. Havaintojen määrä per ryhmä asetettiin 10 ja merkityksen asetettiin arvoon 0,05 /15500 = 3×10

-6 (

i

.

e

., Bonferronin korjattu). Virta laskettiin erilaisia ​​taitettavan muutokset (