Krooninen sairaus

tiivistelmä

erilaistuminen syövän kantasoluja (CSCS) otetaan syöpäsoluja aiheuttaa lisääntynyt herkkyys kemoterapia-aineiden. Vaikka esto nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR) johtaa CSC eloonjäämisen, vaikutus haaraketjuisia aminohappoja (BCAAs), joka on mTOR kompleksi 1 (mTORC1) aktivaattori on edelleen tuntematon. Tässä tutkimuksessa selvitimme vaikutuksia bcaa on maksasolusyövän (HCC), jotka ilmentävät maksan CSC merkki, EpCAM. Olemme tutkineet vaikutuksia bcaa ja /tai 5-fluorourasiilin (FU) ekspressiosta EpCAM ja muiden CSC liittyviä markkereita, sekä soluproliferaation HCC-soluissa ja ksenografti hiirimallissa. Olemme myös tunnettu CSC liittyviä ja mTOR signaali sukuinen molekyyli ilmaisun ja tuumorigeenisyystesti HCC solujen knockdovvn Rictor tai Raptor tai yliekspressio konstitutiivisesti aktiivisen rheb (caRheb). mTOR signaali sukuinen molekyyli ilmentymistä tutkittiin myös BCAA saaneilla HCC-soluissa.

In-vitro

BCAA vähentää taajuuden EpCAM-positiivisten solujen ja parannettu herkkyys anti-proliferatiivista vaikutusta 5-FU. Yhdistettyä 5-FU ja BCAA oli parempi tuumorin vastaista tehokkuutta kuin 5-FU yksin ksenograftimallissa. Stimulaatio suurilla BCAA aktivoitu mTORC1. Pudotus ja yli-ilmentyminen kokeet paljastivat, että mTOR kompleksin 2 (mTORC2) tai aktivoitumista mTORC1 vähensivät EpCAM ilmaisun ja vähän tai ei lainkaan kasvainten muodostumiseen. BCAA voi parantaa herkkyyttä kemoterapiaa vähentämällä väestö cscs kautta mTOR-reitin. Tämä tulos viittaa siihen hyödyllisyyttä bcaa maksan syövän hoidossa.

Citation: Nishitani S, Horie M, Ishizaki S, Yano H (2013) haaraketjuaminohapot Acid vaimentaa Hepatosellulaarinen Cancer Kantasolut kautta aktivointi Nisäkkäiden rapamysiinin kohde. PLoS ONE 8 (11): e82346. doi: 10,1371 /journal.pone.0082346

Editor: Diego Calvisi, Institut für Pathologie, Greifswaldin, Saksa, Saksa

vastaanotettu: 28 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 31 lokakuu 2013; Julkaistu: 27 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Nishitani et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole rahoitusta tai tukea raportti.

Kilpailevat edut: Tämä tutkimus kuuluu Ajinomoto Pharmaceutical Company. Kirjoittajat ilmoittavat, että ne ovat hakeneet patenttia liittyvät BCAA käytettiin tässä tutkimuksessa (Patent nimi: Agent tehostamiseksi antituumorivaikutuksen kemoterapeuttisten lääkkeen, patenttihakemus nro: WO2012 /111790). SN, MH ja SI työskentelevät Ajinomoto Pharmaceuticals, Co, Ltd. Tämä tutkimus suoritetaan eläinmalleissa eikä sillä ole suoria vaikutuksia ihmisillä. Kuitenkin työ Tutkimuksen käännetään ihmisen aiheita tulevissa tutkimuksissa ja siten tämän julkaisun voi lisätä jonkin verran hyötyä Ajinomoto Pharmaceuticals, Co, Ltd. ei ole muita patentteja, tuotteiden kehittämiseen julistaa. Seostussuhde bcaa käytettiin tässä tutkimuksessa on sama kuin seostusuhteissa BCAA rakeita, joita myydään Ajinomoto Pharmaceuticals Co. Ltd Japanissa nimellä LIVACT ® Rakeet. Yhtiö kuitenkin ei tehdä suoraa kaupallista hyötyä tässä tutkimuksessa, koska se ei ole suoritettu ihmisillä. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Termi ”syöpä kantasolujen” (CSC) tarkoittaa syöpäsolu kanssa ominaisuudet kantasolun. Kantasolut kuljettaa potentiaalia itse uudistaa ja erilaistua muut solutyypit, ja voivat näin ollen palauttaa solujen apoptoosin. Oletetaan, että karsinoomien kehittää kantasoluista läpi epäsymmetrisen jako. CSCS alun perin tunnistettiin akuutti myelooinen leukemia [1], ja on sittemmin löydetty muissa syövissä. Haaste syntyi, kun luultiin, että CSCS olivat resistenttejä. Monet kemoterapeuttiset aineet kohdistuvat aktiivista jakautuvat solut ja ei voi olla tehokas solujen käynnissä rajoitettu lisääntymistä. Elossa syöpäsolut määritettiin olevan tekijällä uudelleen puhkeaminen tai etäpesäkkeiden muihin kudoksiin [2,3]. Tutkimuksissa on havaittu monia CSC markkereita eri syövissä. Maksasolukarsinoomassa (HCC), CD133 ja EpCAM on tunnistettu CSC markkereita [4]. Lisäksi CSCS ilmaista ABC kuljettajat kun aktiivisesti alttiina kemoterapia-aineiden, edistää terapeuttisia vastus [5]. Yhdistelmä tutkimus, jossa arvioitiin näiden hoidolle huonosti CSCS todettu, että nykyiset syöpäsolujen voitaisiin täysin kitkettävä [6].

Kaksi lähestymistapoja syöpähoidon on ehdotettu: Herää hoito ja Sleep hoito. Herää hoito parantaa herkkyys kemoterapia-aineiden aiheuttamalla erilaistumista CSCS syöpäsoluihin. Onkostatiini M, sytokiini on IL-6-perheen, on tunnettu erilaistumisen indusoinnissa. Yhdistelmä tämän sytokiinin kanssa kemoterapeuttisen aineen parantunut antituumorivaikutuksen tehosta käytettäessä HCC ksenograftimallia [7]. Kuitenkin onkostatiini M ei ole kliinisesti testattu. Tehohoitoon kuulemma ylläpitää alhainen leviämisen CSCS, mutta patofysiologiassa tämän ilmiön jää epäselväksi. Tutkimukset ovat lähinnä hematopoieettisten solujen nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR) liittyvien signaalien erilaistumista [8,9]. On hyvin tunnettua, että haaraketjuisia aminohappoja (BCAAs), erityisesti leusiinin, aktivoi mTORC1 [10,11]. BCAAta tarvitaan ammoniumnitraatin aineenvaihduntaa lihaksia, kun maksassa ei kykene suorittamaan tätä toimintoa. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että BCAA aktivoi albumiini synteesin rotan maksasoluissa [12] ja kirroosipotilailla rotan maksan [13] kautta mTOR signalointi, keskeinen säätelijä proteiinisynteesiä, havaitsemalla ravitsemukselliset olosuhteissa [14]. Japanissa farmakologinen lisäravinteen BCAA rakeita hoidetaan hypoalbuminemia potilailla, joilla on maksan kirroosi (LC) [15]. BCAA rakeita, määrätty kolme kertaa päivässä aterioiden jälkeen antamaan yhteensä päivittäinen annos 12 g BCAA, on 2: 1: 1.2 painosuhde leusiinin isoleusiinin valimiin. BCAA tukahduttaa esiintyminen HCC eläinmalleissa [16,17] ja LC potilailla [18]. Keskityimme asiakkuutta CSC erilaistumista, erityisesti tehostamaan kemoterapeuttisen herkkyys. CSC erilaistumista arvioitiin aktivoimalla mTORC1 kanssa BCAA, ja anti-kasvain vaikutus yhdistelmän BCAA ja kemoterapeuttisen aineen tutkittiin

in vitro

ja

vivo

. Tuloksemme on suuri merkitys ymmärrystä kliinisen tehon maksan kohdunkaulan potilaille, joilla LC.

Materiaalit ja menetelmät

Kaikki eläin työ tehtiin noudattaen niitä kansallisia ja kansainvälisiä ohjeita.

Soluviljely ja reagenssit

Kaksi HCC solulinjat, HAK1-B [19] ja Huh7, pidettiin RPMI1640 (Nacalai Tesque, Japani) ja DMEM (Nacalai Tesque, Japani) vastaavasti tai LC väliaine, joka on väliaineessa, jossa on alhainen Fischer-suhde (suhde BCAA pitoisuudesta aromaattisen hapon konsentraatio) [20], joka sisälsi 1% penisilliini /streptomysiiniä ja 10% naudan sikiön seerumia (FBS). Käytettävien reagenssien mukana anti-EpCAM FITC konjugoitua vasta-ainetta (Abcam, USA), Hoechst 33342-liuosta (Dojindo, Tokio, Japani) ja tumavärjäystä ja solujen määrä laskentaa array skannausjärjestelmä (Thermo Fischer teknologia, USA); 5-fluorourasiili (5-FU) saatiin Kyowa Kirin, Japani.

Plasmidi rakentaminen Rheb konstitutiivisen aktiivisessa muodossa

Flag-caRheb plasmidi saatiin Dr. Tomohiko Maehama (Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science, Tokio, Japani).

shRNA plasmideja

Pieni hiusneula-RNA (shRNA) plasmidit saatiin iGENE terapeuttiset (USA).

shRNA lipofektamiini- suunniteltiin mukaan valmistajan ohjeiden. Tavoitteena sekvenssit shRNA olivat seuraavat: sh-Raptor: 5′-GCGGAAAGGATTATGGGT-3 ’; sh-Rictor: 5’-GTAGAAAGTTCAACGAGCT-3 ’; ja U6RepT7STOP (sh-RNA kontrollivektori): 5’-CACCTTTTTTTAAAAAAATCCT-3 ’.

Quantitative reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (Q-PCR) B

Q-PCR: ää käytettiin havaitsemaan mRNA tasot CYP3A4, Bmi1, EpCAM, FOXO3a, Raptor, ja Rictor. Yhteensä 1 x 10

5 HAK-1B-soluja siirrostettiin RPMI1640, joka sisälsi 10% FBS: ää 24 tuntia ennen kokeita. BCAA (4 mM) lisättiin väliaineeseen ja pidettiin 72 tuntia. RNA eristettiin käyttäen TriPure eristäminen reagenssia (Roche Applied Science) ja komplementaarinen DNA (cDNA) syntetisoitiin käyttäen High Capacity cDNA käänteistranskriptiolle Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). Reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (PCR) suoritettiin käyttäen 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) ja Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems), joka sisältää spesifisiä alukkeita, mukaan valmistajan ohjeiden. Kukin näyte normalisoitiin GAPDH ilmentymisen.

Alukesekvenssit PCR olivat seuraavat: CYP3A4: eteenpäin 5′-TTGGAAGTGGACCCAGAAAC-3 ’, käänteinen 5′-CTGGTGTTCTCAGGCACAGA-3′; Bmi1: eteenpäin 5’-CCAGGGCTTTCAAAAATGA-3 ’, käänteinen 5′-GCATCACAGTCATTGCTGCT-3′; EpCAM: eteenpäin 5’-GCTGGTGTGTGAACACTGCT-3 ’, käänteinen 5′-ACGCGTTGTGATCTCCTTCT-3’;

FOXO3a: välittämään 5′-TGCTGTATGCAAGAACTTTCCAGTAGCAG-3 ’, käänteinen 5′-ACTCTAGCCCCCATGCTACTAGTG-3’; Raptor: eteenpäin

5′-CCCTGCTACTCGCTTT-3 ’, käänteinen 5′-GTGAGGTGTTTCCCCT-3’;

Rictor: eteenpäin 5′- GGAAGCCTGTTGATGG-3 ’, käänteinen 5’-GGCAGCCTGTTTTATG-3 ”

Cell count ja EpCAM-positiivinen solu detektiomäärityksen

Soluja viljeltiin, kun läsnä tai poissa ollessa bcaa 72 tuntia, sitten kiinteä käyttäen 4% paraformaldehydillä ja värjättiin Hoechst 33342 (10 mg /ml, Dojindo, Tokio, Japani) 1 min. Solulaskennat tehtiin käyttämällä kohde aktivointi protokolla ja joukko skannausjärjestelmä. EpCAM-positiivisia soluja havaittiin värjäämällä kiinnitetyt solut, joissa EpCAM-konjugoidulla FITC-vasta-ainetta 1 tunnin ajan, ja määrä EpCAM-positiivisia soluja per 5000-soluja havaittiin tarkistuksen järjestelmän

apoptoosimäärityksessä

Soluja viljeltiin 5-FU: ta (0, 1, 2 ug /ml) läsnä tai poissa ollessa 2 mM bcaa 72 h 96-kuoppaisille levyille (BD Biosciences). Anneksiini V: n sitoutumisen solun kalvot visualisoitiin anneksiini V-FITC havaitseminen kit (TAKARA BIO INC, Tokio, Japani) ja Hoechst 33342 ratkaisu array skannaus.

Western blotting

Yhteensä 1 x 10

5 Huh7-soluja ympättiin DMEM 24 h ennen tutkimuksen kokeita. Väliaine vaihdettiin LC väliaineessa 3 päivää tai DMEM erilaisia ​​hoitoja: pudotus ja 5 päivää, yli-ilmentyminen ja 1 päivä, ja BCAA hoito 30 min tai 3 päivää. Western-blottaus suoritettiin tavanomaisella tavalla. Solut pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja lyysattiin RIPA-puskuriin, joka sisälsi täydellistä proteaasi ja fosfataasinestäjällä cocktail (Roche Applied Science, Indianapolis, INC). Kalvot blokattiin estäminen One-P (Nacalai Tesque, Japani). Vasta-aineet sisältyvät kanin anti-Rictor (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), kanin anti-raptor (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX), kanin anti-p-70S6 kinaasi, anti-kokonais-p-70S6 kinaasi, kanin anti-p -4EBP1 (T37 /46), kanin anti-p-Akt (T308 tai S473), kanin anti-p-GSK3p (S9), kanin anti-β-kateniinin (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), ja hiiren anti- a-tubuliini (Sigma-Aldrich, St Louis, MO). Densitometria tehtiin suoraan blotatun kalvosta käyttämällä CCD-kenno kamerajärjestelmän (LAS-4000 Mini, Fujifilm, Tokio, Japani).

pudotus Kokeet

Huh-7-solut transfektoitiin negatiivisen kontrollin (NC) tai kohde (mTORC1 tai mTOR2 sääntelyyn liittyvä proteiini Raptor ja Rictor) pieni hiusneula-RNA (shRNA) käyttäen Lipofectamine ™ LTX reagenssia (Invitrogen Technology, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Stabiilit transfektantit valittiin, kuten aiemmin on kuvattu [21], joka on vastustuskykyinen puromysiini 2 päivää ja sen jälkeen DMEM: ssä, joka sisälsi 10% FBS: ää 2 päivää. Q-PCR ja western blotting vahvisti knockdown tehoa.

Eläinkokeet

Eläimet.

Seuraavat kokeelliset protokollaa tarkasteli ja hyväksynyt Animal Care komitean Ajinomoto Co., Inc. BALB /c nude-hiirissä tai NOD /SCID iässä 6 viikkoa saatiin Charles River Japan (Yokohama, Japani). Ne pidettiin yksittäisissä häkeissä puhtaassa ja ilmastoidussa huoneessa (24 ± 1 ° C), jossa on 12 h-12 h valo-pimeä sykli (valot 0700-1900). Eläimiä ruokittiin varastossa steriili jauhe ruokavalio (CRF-1, Oriental Yeast, Tokio, Japani).

Kemoterapia.

Miljoona HAK-1B solut suspendoitiin 100 ui RPMI 1640 kanssa FBS, ja ihonalaisen injektion suoritettiin. Ilmaantuvuus ja koko ihonalaisen kasvainten kirjattiin kun keskimääräinen tilavuus oli saavuttanut 100 mm

3 kuten aiemmin on kuvattu [7]. Kasvaimen injektiota 50 ui 10% DMSO /PBS: llä (kontrolli) tai 5-FU (250 ug /kasvain) annettiin kahdesti viikossa ja 3% BCAA-täydennetty tai 3% kaseiinia täydennetty ruokavalio annettiin päivittäin 2 viikkoa alkaen 7 päivän kuluttua kasvainsolujen injektiosta. Kasvaintilavuudet arvioitiin käyttäen paksuuden mittauksia ja lasketaan kaavalla V = 1/2 x

2 x

b

jossa

on lyhyt akseli ja

b

on pitkä akseli kasvain. On 14

päivänä kaikki hiiret tapettiin anestesiassa, eristetty kasvaimet punnittiin, niiden määrät lasketaan, ja kudos analysoitiin mRNA: n ilmentymisen.

kasvaimien syntyyn.

Miljoona Huh7 solua transfektoitu lipofectal hiukkasia, jotka sisältävät NC, Raptor tai Rictor shRNA, ohjaus plasmidi-cDNA (pcDNA), tai Flag caRheb plasmidi otettiin talteen ja injektoitiin subkutaanisesti NOD /SCID-hiirten (n = 5 kussakin ryhmässä). Kasvaintilavuudet arvioitiin kuten aiemmin. Hiirillä NC, pudotus (KD), tai yli ilme ksenograftit tapettiin 4 viikon kuluttua.

Tilastolliset menetelmät.

Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SE. Merkitys määritettiin EXSUS versio 7.7.1 (CAC Corporation, Tokio, Japani) suorittamalla Dunnettin testi, Tukeyn testi ja Opiskelijan

t

-testi, ja erot katsottiin merkitsevä P arvoihin 0.05.

Tulokset

Vaikutus BCAA on EpCAM-positiivisuuden HAK-1B solujen

HAK-1B solut olivat noin 10% EpCAM-positiivisia (kuva S1); tämä laski merkittävästi annoksesta riippuvalla tavalla, kun läsnä oli 1-4 mM bcaa (kuvio 1A). 4 mM BCAA johti ekspression lisääntymisen CYP3A4 mRNA: n, joka on eriytetty markkeri, ja sen sijaan 1-4mM bcaa taipumus vähentyä ilmaus Bmi1 mRNA, erilaistumaton markkeri (kuvio 1 B). Nämä tulokset viittaavat siihen, BCAA vähensi EpCAM-positiivisuus kautta erilaistumista. Siksi arvioimme kemoterapeuttiset herkkyys HAK-1B sisältäviä EpCAM-positiivisia soluja. Anneksiini V: ilmaisu, jota käytetään havaitsemaan ensisijainen apoptoosi tapauksessa lisääntynyt kasvavia annoksia 5-FU; Tämä kasvu oli suurempi soluissa käsitelty yhdistelmällä BCAA ja 5-FU (kuvio 1 C). Lisäksi, HAK-1B proliferaation voimakkaammin inhiboivat yhdistelmä BCAA ja 5-FU kuin 5-FU yksinään (kuvio 1 D).

Dunnettin testi, * p 0,05, ** p 0,01 n = 6, keskiarvo ± SE.

prosenttiosuus anneksiini V-positiivisten solujen (C) ja suhteellinen elinkelpoisten solujen määrä (D) array skannaavat HAK-1B soluja viljeltiin RPMI1640, joka sisälsi 10% FBS: ää tai ilman 2 mM BCAA läsnäollessa (1 tai 2 ug /ml) tai poissa 5-FU 72 h käyttämällä kohde aktivointi protokollaa array skannaus. Student

t

-testi, * p 0,05, ** p 0,01, n = 7, keskiarvo ± SE.

Samat tulokset saatiin Huh7 soluja ja ne osoittivat kuvassa S2 AB.

Kemoterapia herkkyys

in vivo

Sen hypoteesin testaamiseksi, että EpCAM positiivisuus kasvattaa kemoterapeuttisen herkkyyttä läsnäollessa bcaa käytimme yhdistetty BCAA ja 5-FU-käsittely BALB /c-nude-hiirimallissa istutetaan ihon alle HAK-1B.

Kasvaintenvastainen teho oli merkittävää 5-FU yksin, ja vielä vahvempi antituumorivaikutus saavutettiin yhdistelmällä BCAA ja 5-FU hoidossa. Kuitenkin antituumorivaikutus BCAA yksinään ei ollut merkittävä (kuvio 2A, B, kuva S3). EpCAM mRNA ilmentyminen oli merkittävästi vähentynyt BCAA saaneilla hiiren kasvaimia (kuvio 2C). FOXO mRNA: ta (kuvio 2D), on raportoitu ekspressoituvan CSCS [22], on merkittävästi vähentynyt samalla tavalla.

suhteellinen mRNA: n eri molekyylit kunkin kasvaimen liittyi CSC ominaisuudet (C, D). Ohjaus: 10% DMSO /suolaliuos /kasvaimen injektio + 3% kaseiinia sisältävät ruokavalio, 5-FU: 250 ug /kasvaimen injektio + 3% kaseiinia sisältävät ruokavalio, BCAA ruokavalio: 10% DMSO /suolaliuos /kasvaimen injektio + 3% BCAA sisältävät, 5-FU + BCAA ruokavalio: 250 ug /kasvaimen injektio + 3% bcaa sisältävät ruokavaliota 14 päivää. Tukeyn testi: * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 vs. kontrolli, #p 0.05 vs. 5-FU, $$ p 0,01 vs. BCAA, n = 6, keskiarvo ± SE.

Mechanism BCAA vaikutuksia EpCAM-positiivisten Huh7 solujen

Koska kokeellinen transfektiotehokkuus Huh7 soluja, käytimme niitä arvioida mekanismi bcaa, olettaen, että 40% Huh7 oli EpCAM-positiivisia, kuten aiemmin on raportoitu [7]. Kuten HAK-1B, EpCAM-positiivisten solujen Huh7 merkittävästi vähentää BCAA; Lisäksi mTORC1 aktivoitiin upon BCAA hoitoa ja esti rapamysiinillä (kuvio 3A, kuvio S4A). Lasku EpCAM-positiivisten solujen takia BCAA oli kumosi kokonaan esikäsittelemällä rapamysiini, estäjä mTORC1 (kuvio 3A, kuvio S4A). Lisäksi LC välineellä alhainen Fischer suhde välineellä esti mTORC1 aktiivisuus ja lisääntynyt määrä CSCS (kuvio 3B). mTORC1 aktivoituminen tukahdutettiin LC keskipitkän (kuvio 3B, kuvio S4b).

nopeus muutos EpCAM-positiivisten solujen 5000 solua yliekspressioon caRheb tai valvonnan plasmidin cDNA (pc DNA) valvonta (DMEM, joka sisälsi 10% FBS) kanssa ja ilman 4 mM BCAA stimulaatio 24 h Huh7 (C).

havaitseminen P70S6 kinaasin fosforylaation, jäsen alavirran mTOR signaloinnin läsnäollessa DMEM, BCAA hoito esikäsittely rapamysiinin ja BCAA hoitoa, tai LC stimulaatio 72 h Huh7 ( A, B).

Tukeyn testi ** p 0,01 vs. kontrolli, $$$ p 0,001 vs. BCAA, n = 8, keskiarvo ± SE (A).

Studentin t-testi * p 0,05, **** p 0,0001, n = 8, keskiarvo ± SE (B, C).

Lopuksi EpCAM-positiiviset solut olivat merkittävästi vähentää mTORC1 aktivointi yliekspressio caRheb, aktivoiva tekijä mTORC1 ilman BCAA stimulaatiota ( kuvio 3C). Näin ollen, vaikutusta bcaa on EpCAM-positiivisiin soluihin riippui mTORC1 aktivointia.

välinen yhteys mTOR signaalin ja EpCAM-positiivisuus

mTOR signaalit sisältävät kaksi alatyyppiä: mTORC1 ja mTORC2 [23]. Erityisesti mTORC1 on Raptor, sääntelyn proteiini mTORC1 monimutkainen, ja on kannustanut BCAA, erityisesti leusiini. Sen sijaan mTORC2 on Rictor, sääntely proteiinia mTORC2 monimutkaisia, joka viestittää Akt alavirtaan.

Rapamysiini inhiboi mTORC1 ja mTORC2 riippuen stimulaation kestoa [24,25]. Näin ollen voimme määrittää vaikutukset estämällä mTORC1 yksin tai kahden inhibitio mTORC1 /2 EpCAM-positiivisten solujen esikäsittely rapamysiiniä 1 h tai 24 h, vastaavasti. Huomasimme, että EpCAM-positiivisten solujen lisääntyi merkitsevästi estoon mTORC1. Sen sijaan, EpCAM-positiivisten solujen vähentynyt dual inhibition mTORC1 /2, erityisesti mTORC2 inhibitio, esikäsittely 72 tuntia (kuvio 4A).

Dunnettin testi, * p 0,05, *** p 0,001 vs. kontrolli, n = 6, keskiarvo ± SE.

Suhteellinen ilmauksia EpCAM, c-myc, ja FOXO3a mRNA päälle Raptor ja Rictor taintumisen (BD).

Dunnettin testillä, ** p 0,01, *** p 0,001 vs. kontrolli n = 8, keskiarvo ± SE.

Nämä havainnot viittaavat siihen, että läsnä tai poissa EpCAM-positiivisten solujen riippuu mTORC1 tai mTORC2, vastaavasti. Sitten tutkittiin ekspressiota EpCAM-mRNA: n läsnä ollessa mTORC1 tai mTORC2 menetys toiminnon knockdovvn Raptor tai Rictor, vastaavasti. Menetys mTORC1 toiminto aiheutti EpCAM mRNA: n ilmentymisen lisäämiseksi samalla mTORC1 inhibition esikäsittelemällä rapamysiini 1 h. Kuitenkin menetys mTORC2 toiminta aiheutti EpCAM mRNA ilmaisun laskevan merkittävästi. Lisäksi c-myc ja FOXO3a mRNA: n ilmentymisen annettiin reagoida samalla tavalla kuin EpCAM mRNA: n ilmentymisen (kuvio 4B-D).

Rictor, Raptor, ja β-kateniinin myös liittyy mTOR ja Wnt /β-kateniinin signaalit (kuvio 5A). Kun mTORC1 estyi Raptor knockdovvn, fosforylaatio p70S6 kinaasin, loppupään signaali mTORC1, laski, ja fosforylaatiota Akt (Ser473) lisääntynyt. Tämä viittaa siihen, että inhibitio mTORC2 fosforylaation P70S6kinase kumottiin Raptor pudotus. Sen sijaan, kun mTORC2 estyi Rictor pudotus, fosforylaatio p70S6 kinaasin lisääntynyt, ja fosforylaatiota Akt vähentynyt.

Rictor tai Raptor pudotus verrattuna negatiiviseen kontrolliin (NC), caRheb verrattuna kontrolliin plasmidin cDNA (pc DNA), BCAA hoitoon verrattuna DMEM (FBS 10%) vain (Ctrl) (A). Keskimääräinen kasvainten ja kasvaimen kehittymisen suhde on 4

th viikolla ksenograftimallia kanssa siirrettyjen solujen kanssa negatiivisen kontrollin, knockdovvn Raptor, Rictor varten 5 päivää, tai yliekspressio valvonnan plasmidi-DNA, caRheb ja 1 päivä (C), ja kasvaimen kehittymisen rate (B).

Dunnettin testi, * p 0,05, *** p 0,001 vs. N.C. n = 5, keskiarvo ± SE.

Kun mTORC1 aktivoitiin caRheb yli-ilmentyminen tai 4 mM bcaa hoitoa, fosforylaatiota p70S6 kinaasin lisääntynyt ja fosforylaation Akt vähentynyt. Lisäksi β-kateniinin proteiinin väheni estämällä fosforylaation GSK3p kautta mTORC1 aktivointi.

Lisäksi GSK3p fosforyloitiin Akt (Ser473) vastauksena Raptor knockdown; kuitenkin, fosforylaatio GSK3p: n ja β-kateniinin proteiinia ei vaikuta Rictor pudotus.

tumorigeneesin mTOR-Knockdown ja mTORC1-aktivoitujen solujen

aktivoituminen mTORC1 tai esto mTORC2 hypoteesi tukahduttamiseksi EpCAM-positiivisia soluja. Kasvaimia kyky CSCS tutkittiin käyttäen ksenograftimallia ihonalaisesti istutettu Raptor tai Rictor pudotus, ohjaus plasmidin cDNA tai caRheb yli-ilmentää Huh7-soluja hiirissä 4 viikkoa (kuvio 5B ja 5C).

BCAA aktivoitu mTORC1; kuitenkin, BCAA on kaksi vaikutuksia mTORC1. Stimulaatio suurilla bcaa laski EpCAM-positiivisten solujen aktivaation kautta mTORC1, kun taas stimulaatio pienillä annoksilla lisääntynyt EpCAM-positiivisten solujen eston kautta mTORC1 (kuvio 3A ja 3B). Korkean annoksen BCAA ei ylläpidettävä kasvaimen istutuksen, ja kasvaimen kehittymisen ei ole perustettu, kun solut on käsitelty suurella annoksella BCAA implantoitiin ihon alle. Sen sijaan käytimme caRheb yli-ilmentäviä soluja mTORC1 aktivoivan soluja varten tuumorigeneesin tutkimuksessa, joka voisi säilyttää mTORC1 aktivointia vähintään yhden viikon ajan.

Vaikka tuumorin koko oli pienempi ryhmässä, istutettiin Raptor pudotus soluissa kuin negatiiviseen kontrolliryhmään (kuvio 5C), tuumorigeneesin säilyi kaikissa 5 hiirtä, samanlainen negatiiviseen kontrolli- transfektio solu istutettiin ryhmä (kuvio 5B). Kuitenkin kaksi ryhmistä Rictor pudotus solujen ja caRheb yli-ilmentävät solut oli 0/5 hiiriä tai vain 1/5 hiiret säilyttävät tuumorigeneesiin potentiaalia, vastaavasti. Lisäksi kasvaimen koon caRheb yli-ilmentyminen ryhmässä oli pienempi kuin kontrolliryhmässä plasmidissa cDNA ryhmä.

Keskustelu

Yksi romaanin maksujen Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli havainto, että syöpäsolut kokenut lisääntynyt herkkyys solunsalpaajiin jälkeen EpCAM-positiivisten solujen eriytetty BCAA hoidon kautta mTORC1 aktivaation (kuvio 1). Lisäksi alhainen BCAA stimulaatio LC väliaineen, jolla on alhainen Fischer-suhde (suhde BCAA pitoisuudesta aromaattisen hapon pitoisuus), johti tukahdutetaan mTORC1 aktivointia, mikä lisää EpCAM-positiivisia soluja (kuvio 3B). Potilailla, joilla on krooninen hepatiitti tai kirroosi, hypoalbuminemia ja plasman arvot Fischer suhde BCAA aromaattisiin happoja havaitaan yleisesti [26]. Nämä potilaat voivat kehittyä HCC tai on uusiutumisen HCC. BCAA täydentäminen on tunnettua parantaa Fischer suhde maksakirroosi [27]. Siksi korkeamman Fischer suhde voi estää maksan syövän synnyn tai uusiutumisen takia CSCS. Japanissa BCAA rakeet tarkoitettu dekompensoitunut maksakirroosi, potilailla, joilla on hypoalbuminemia huolimatta riittävä ravinnon saanti, ja suun kautta bcaa rakeiden nostaa pitoisuuksia plasmassa bcaa noin 1 mM [20]. Sen jälkeen, kun suun kautta bcaa rotilla, plasman bcaa in porttilaskimon oli useita kertoja korkeampi kuin pitoisuus bcaa perifeerisen veren (tuloksia ei ole esitetty). Siksi katsoimme, että pitoisuus bcaa käyttää

in vitro

(2

~ 4 mM) ei ollut merkittävästi erilainen kuin pitoisuus bcaa

in vivo

.

Havaitsimme myös, että mTORC1 aktivaatio bcaa hoito tukahdutti EpCAM-positiivisiin soluihin ja parantaa herkkyyttä kemoterapeuttisten aineiden HCC kasvain (kuvio 2). Tutkimme EpCAM mRNA maksassa antamisen jälkeen bcaa normaaleissa hiirissä tutkimaan, onko mitään vaikutusta maksaan. Tämän seurauksena, BCAA ei ole mitään vaikutusta ekspression EpCAM maksassa (tuloksia ei ole esitetty).

mekanismi vaikutusten bcaa hoidon EpCAM-positiivisiin soluihin arvioitiin kiihtyi eriyttäminen syöpään soluja aktivoimalla mTORC1. Fosforylaatio GSK3p estyi aktivoimalla mTORC1 ja alavirran Wnt /β-kateniinin signaalin, kun taas fosforylaatiota β-kateniinin säilyi, jolloin β-kateniinin hajoamiseen. Se päätteli, että tämä esti tumaansiirtymiseen of β-kateniinin, ja myöhemmin esti transkriptiota, c-myc, EpCAM, ja Bmi1. Lisäksi alavirran signaalit EpCAM määritettiin olevan c-myc transkription signaalin [28], joka korreloi ilmentymistä EpCAM ja c-myc. Nämä ehdotti, että EpCAM, c-myc ekspressiota väheni ja mTORC1 aktivointi kasvoi herkkyys kemoterapia (kuvio 2).

Lisäksi olemme havainneet, että mTORC1 aktivaatio väheni proteiinin ilmentymistä Rictor kautta yliekspressio caRheb (kuvio 5A). Tutkimukset ovat aiemmin raportoitu, että aktivointi p70S6 kinaasin palautteen estyy Rictor fosforylaation, mikä tukahduttaminen Rictor toiminto [29]. Kuitenkin meidän tiedot osoittivat, että proteiini ilmentymistä Rictor vähentynyt. Mekanismi, jolla mTORC1 aktivaatio väheni proteiinin ilmentyminen Rictor jää epäselväksi, ja on potentiaalinen tulevaisuuden tutkimuksen suuntaan.

inhibitio mTORC2 toiminnon Rictor pudotus johti aktivaatioon p70S6 kinaasin, signaali mTORC1, vähentynyt EpCAM, c-myc, ja FOXO3a ilmaisun, ja fosforylaatio Akt, mutta sillä ei ollut vaikutusta GSK3p: n ja -proteiinin ilmentyminen β-kateniinin. Se ei ole selvää, onko p70S6 kinaasi aktivoituu suoraan Rictor pudotus, vaikka on mahdollista, että mTORC1 aktivaatio ja inhibitio Akt signaalit vähensivät EpCAM ilmentymistä. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että esto mTORC2, eikä mTORC1, tukahduttaa syövän syntymistä [19,30]. Muissa raporteissa, fosforylaatiota Akt (Ser473) korreloi merkittävästi syöpään stemness [31,32]. Kliininen tutkimus on raportoitu, että potilailla, joilla on korkea Rictor tai EpCAM mRNA ilmaisun eristetyissä maksasyövän oli korkeampi uusiutumisen [33,34].

Tässä tutkimuksessa havaintomme viittaavat siihen, että CSC potentiaali liittyy vahvasti mTORC signaaleja. Lisäksi mTORC2 on rooli ylläpitää kantasolujen potentiaali taas mTORC1 tukahduttaa tätä potentiaalia (kuva 6).

Aliravitsemus tai matala Fischer suhde tukahdutetaan mTORC1 aktivointi mikä lisäsi syöpään stemness. Sen sijaan mTORC2 ylläpitää syöpä stemness. Kuitenkin mTORC1 estää mTORC2. BCAA estää syövän stemness aktivoimalla mTORC1, ja parantaa antituumorivaikutukset kemoterapia tekijöille.

On mahdollista, että aktivointi yksin mTORC1 mukaan bcaa hoidon vähensivät Rictor proteiinin ekspression, joka oli samanlainen kuin Rictor pudotus, estäen siten mTORC2 ja aktivoimalla mTORC1. Nämä havainnot viittaavat siihen, että mTORC2 voi olla totta syöpä terapeuttinen kohde, erityisesti syövän synnyssä liittyvät CSC ja aktivointi mTORC1 yksinään johtaa pienenee EpCAM ja c-myc ilme. Niinpä suosittelemme, että uusi syöpähoidon strategioilla pyritään estämään mTORC2 ja aktivoi mTORC1 samanaikaisesti.

tukeminen Information

Kuva S1.

edustaja Kuva EpCAM positiivinen solu, joka värjättiin menetelmänä on kuvattu materiaaleissa Menetelmät.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0082346.s001

(TIF) B Kuva S2.

prosenttiosuus anneksiini V-positiivisten solujen (A) ja suhteellinen elinkelpoisten solujen määrä (B) joukko skannata Huh7-soluja viljeltiin DMEM: ssä, joka sisälsi 10% FBS: ää tai ilman sitä 4 mM bcaa läsnäollessa (1 tai 2 ug /ml) tai puuttuminen 5-FU 72 h käyttämällä kohde aktivointi protokollaa array skannaus. Student

t

-testi, * p 0,05, ** p 0,01, n = 7, keskiarvo ± SE.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0082346.s002

(TIF) B Kuva S3.

Kasvaimen tilavuus HAK-1B ksenografti hiirimallissa 14. päivänä antamisen jälkeen BCAA ja 5-FU injektio. Tukeyn testi: * p 0,05, ** p 0,01 vs. kontrolli, $$ p 0,01 vs. BCAA, n = 6, keskiarvo ± SE.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0082346.s003

(TIF) B Kuva S4.

havaitseminen koko-p-70S6 kinaasin läsnä ollessa DMEM, BCAA hoito, esikäsittely rapamysiini (A) ja BCAA hoitoa, tai LC stimulaatio (B) 72 h Huh7.

doi: 10,1371 /journal.pone.0082346.s004

(TIF) B