Krooninen sairaus

tiivistelmä

KIF14

(kinesiiniin perheenjäsen 14) on mitoosi kinesiinin ja tärkeä onkogeeni useissa syövissä. Kasvain

KIF14

ekspressiotasot ovat itsenäisesti ennustavia huonosta tuloksesta, ja syöpäsoluissa KIF14 voi moduloida metastaattinen käytös ylläpitämällä sopivilla tasoilla soluadheesion ja muuttoliike proteiineja solukalvon. Näin KIF14 on jännittävä potentiaalia terapeuttinen kohde. Ymmärtäminen KIF14 asetus syöpäsoluissa on tärkeää kehittää tehokkaita ja selektiivisiä hoitoja estää sen tuumorigeenisia toiminto (s). Olemme aikaisemmin todenneet, että lähes 30% vakavien munasarjojen syöpiä (OvCa kasvaimet) osoittavat matalan tason genomista vahvistus, joka osoittaa yksi mekanismi

KIF14

yli-ilmentymisen kasvaimia. Nyt raportoivat transkription ja epigeneettiset sääntelyn

KIF14

. Kautta promoottori poisto analyysien tunnistimme yksi

cis

sääntelyvälineitä sisältävän alueen sitoutumiskohtia SP1 HSF1 ja YY1. siRNA-välitteisen knockdovvn Näiden transkriptiotekijöiden osoittaneet endogeenistä sääntely

KIF14

yliekspressio by

SP1

ja

YY1

, mutta ei

HSF1

. ChIP vahvistivat, rikastuminen sekä SP1 ja YY1 sitoutuminen endogeeniseen KIF14 promoottori OvCa solulinjoissa korkea

KIF14

ilme. Vahva korrelaatio nähtiin ensisijaisen serous OvCa kasvainten välillä

SP1

,

YY1

ja

KIF14

ilme, lisänäyttöä siitä, että nämä transkriptiotekijät ovat tärkeitä toimijoita

KIF14

yli-ilmentymisen. Hypometylaatio kuvioita havaittiin ensisijaisen vakavien OvCa kasvaimia, mikä viittaa vähäinen rooli promoottori metylaation valvonnassa

KIF14

geeniekspressiota. miRNA ilmentymisanalyysit todennut miR-93, miR-144 ja miR-382 oli huomattavasti pienempi ilmentymistasoissa ensisijaisen serous OvCa kasvaimia kuin normaaleissa kudoksissa; hoitoa varten OvCa solulinjan miRNA matkii ja inhibiittorit nimenomaan moduloitu

KIF14

mRNA-tasoja, osoittaen potentiaalisia uusia mekanismeja

KIF14

yli-ilmentymisen primaarikasvaimia. Meidän havainnot paljastavat useita mekanismeja KIF14 säätelyyn ylöspäin syöpäsoluissa, jotka tarjoavat uudet tavoitteet hoitotoimenpiteiden vähentämiseksi KIF14 kasvaimissa, parantamiseen tähtääviä ennustetta.

Citation: Thériault BL, Basavarajappa HD, Lim H, Pajovic S, Gallie BL, Corson TW (2014) Transkription ja Epigeneettiset asetukseen

KIF14

yliekspressio munasarjasyövässä. PLoS ONE 9 (3): e91540. doi: 10,1371 /journal.pone.0091540

Editor: Jean-Marc Vanacker, Institut de Génomique Fonctionnelle de Lyon, Ranska

vastaanotettu: 21 kesäkuu 2013 Hyväksytty: 13 helmikuu 2014; Julkaistu: 13 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Thériault et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat Yhdysvaltojen puolustusministeriön urakehityssuunnitelmaan Award; myöntävät # OC080083 ja Marsha Rivkin Munasarjojen Cancer Center Scientific Scholar Award. Tätä työtä tuki myös osittain Indiana Clinical ja Translational Sciences Institute rahoitetaan, osittain Yhdysvaltain National Institutes of Health, National Center for edistäminen Translational Sciences, Clinical and Translational Sciences Award (TR000163, TWC). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

KIF14

tunnistettiin ensin onkogeeni ja edistäjänä pahanlaatuisen muutoksen lapsuuden syöpä retinoblastooma [1]. Sijaitsee kromosomissa 1q32.1, genomista voitto

KIF14

esiintyy jopa 50% retinoblastoomia [1] – [3]. Ryhmämme ja muut ovat aiemmin osoittaneet, että KIF14 proteiini ja mRNA yli-ilmentyy useita syöpiä, kuten munasarjan syövät (OvCa kasvaimet) [4] – [10]. Olemme kertoi myös, että lopputuloksesta vakavien OvCa potilaita voidaan ennustaa perustuen

KIF14

mRNA ekspressiotasot niiden ensisijainen kasvaimia. Lisätutkimukset paljastivat näiden näytteiden osoittivat, että ilmentyminen

KIF14

mRNA ja proteiini ylitä tasoja odotettavissa perustuu kopiomäärä voitto yksin, mikä viittaa ajan sääntelyn transkriptionaalisen säätelyn syöpäsoluissa verrattuna niiden normaali kollegansa.

Tällä hetkellä 45 ihmisen kinesiinien luokiteltiin 14 erillistä perhettä. Ihmisillä

KIF14

on mitoottisen kinesiinin, joka kuuluu N-3-perheen. Vaikka sen solujen toimintaa ei ole vielä täysin selvitetty,

KIF14

on tärkeä rooli toteutettaessa sytokineesi, ja ne voivat myös toimia ensisijaisen cilium [11]. Se on vuorovaikutuksessa proteiini-säätelijä sytokineesin 1 (PRC1) ja sitronikinaasigeenin läpi tiettyjä verkkotunnuksia tukea asianmukaisen solunjakautumisen [12], [13]. Hiljentäminen

KIF14

käyttämällä siRNA indusoi sytokineesiin epäonnistuminen johtaa monitumaisia ​​soluissa, aneuploidian, ja apoptoosin [12]. Tilapäinen kertymistä KIF14 proteiinia havaitaan mitoosi soluissa, johdonmukainen sen toiminta [12]. Olemme viime aikoina osoittaneet rintasyövän solujen linjat, suora vuorovaikutus KIF14 kanssa Radil, keskeinen välittäjäaine Rap1a välittämää integriini nurinpäin signalointi, ohjaten Radil-Rap1a aktiivisuutta solukalvon ja edistävät solujen tarttumista ja muuttoliike [14].

katsoo rakennetta ja toimintaa muiden kinesiinien ymmärretään melko hyvin, paljon vähemmän tiedetään niiden sääntelyä DNA-tasolla. Eräässä tutkimuksessa kuvataan roolit transkriptiofaktoreiden SP1 ja E2F1 vuonna vastaavasti aktivoimalla ja tukahduttaa transkriptio ihmisen mitoosi centromere liittyvän kinesiiniin (MCAK) promoottori [15]. Tutkimuksia ei ole vielä raportoitu

KIF14

. Ymmärtäminen mekanismi sen geenin sääntely on ratkaisevan tärkeää, koska

KIF14

nousseet tärkeiksi tavoite syövän hoidossa.

Nyt raportoivat tunnistaminen oletetun

cis

sääntelyvälineitä alue

KIF14

promoottori kätkeminen sitoutumiskohtia transkriptiotekijät

SP1

,

YY1

ja

HSF1

. Kautta siRNA pudotus ja ChIP määritykset, osoitamme, että Sp1 ja YY1, mutta ei HSF1 sitoutua suoraan

KIF14

promoottorin ja hallita endogeenisen

KIF14

tasoilla OvCa solulinjoissa. Lisäksi sekä

SP1

ja

YY1

ekspressiotasoja korreloivat

KIF14

mRNA ilmaisun ensisijainen vakavien OvCa kasvaimia, jotka osoittavat niiden mahdollinen rooli ylläpitää korkeita KIF14 tasoja OvCa kasvainsoluissa . Metylointi analyysi paljasti, että ihmisen

KIF14

promoottori on suurelta osin hypometyloidut on OvCa primaaristen kasvainten, normaali munasarja kudoksissa, ja solulinjat, mikä osoittaa, että metylaatio on todennäköisesti säädellä

KIF14

yliekspressio sisällä OvCa kasvaimia. Kuitenkin ero metylaatiokuvion voi esiintyä OvCa ilmentävien kasvainten erittäin korkea KIF14.

miRNA ilmentymisen analyysi ensisijainen OvCa kasvaimia ja solulinjoissa paljasti kolmen oletetun sääntelyviranomaisten (miR-93, miR-144 ja miR-382) ja

KIF14

lauseke, joka on dokumentoitu rooli kasvainten synnyssä syöpäsoluissa. Olemme todenneet, että nämä ehdokas miRNA voi suoraan moduloida

KIF14

mRNA ilmaisu, joka osoittaa niiden merkitys ylläpidetään korkeaa KIF14 kasvain tasoilla. Tuloksemme paljastaa monimutkaisuus sääntelymekanismeja ajo

KIF14

yli-ilmentymisen OvCa kasvaimissa, sekä korostettaisiin ymmärryksen

KIF14

asetusta lopulta kohdistaa tämä geeni terapeuttista hyötyä.

materiaalit ja menetelmät

rakentaminen Luciferase Reporter Plasmidit

kuusitoista eri pituudet

KIF14

promoottori (548 bp, 966 bp, 1514 bp, 1666 bp, 1787 bp, 1898 bp, 2032 bp, 2150 bp, 2245 bp, 2327 bp, 2366 bp, 2401 bp, 2466 bp, 2536 bp, 2898 bp, 4555 bp) kaikista yhteisiä sekvenssejä niiden proksimaaliseen päähän monistettiin polymeraasiketjureaktiolla (PCR) kohteesta genomi-DNA terveen verkkokalvon käyttäen KOD Hot Start DNA-polymeraasia (Novagen) (taulukko S1). Promoottori fragmentit alikloonattiin StrataClone ™ Blunt PCR Kloonaus Vector PSC-B (Stratagene) ja todentaa ainoastaan ​​oikein päin ja suunnan restriktiodigestiotuotteista. PCR-tuote leikattiin käyttäen Kpn1 /Sma1 restriktiokohdat ja insertoitiin pGL3-Basic-vektoriin (Promega) on täydentäviä kohtia ylävirtaan lusiferaasigeenin tuottaa toimittaja rakentaa pGL3-548, pGL3-966, pGL3-1514, pGL3-1666, pGL3 -1787, pGL3-1898, pGL3-2032, pGL3-2150, pGL3-2245, pGL3-2327, pGL3-2366, pGL3-2401, pGL3-2466, pGL3-2536, pGL3-2898, ja pGL3-4555. Sekvenssit kaikki 16 konstruktioita linjassa viitaten sekvenssit NCBI verkkosivuilla. PRSV-lusiferaasireportteriplasmidin luovutti ystävällisesti Dr. A. Schimmer, Ontario Cancer Institute.

Cell Culture

SKOV3 (ystävällinen lahja Dr. Mark Nachtigal, University of Manitoba) [ ,,,0],16] ja HeLa-solut (ATCC) viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-kasvualustassa (DMEM), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja penisilliini /streptomysiini /L-glutamiinia (P /S /G) (Invitrogen). OvCa 429-solut (Dr. Mark Nachtigal) [16], viljeltiin a-MEM: ssä, joka sisälsi 10% FBS: ää ja P /S /G. WERI-Rb1 retinoblastooma-soluissa (positiivisena kontrollina SP1 sitova) viljeltiin Iscoven modifioidussa Dulbeccon alustassa (IMDM), joka sisälsi 10% FBS: ää (PAA laboratoriot), P /S /G, 10 ug /ml insuliinia, ja 55 uM β-merkaptoetanolia. Soluviljelmät pidettiin 5% CO

2 kosteus on 37 ° C inkubaattorissa. Solulinja identiteetti varmistettiin lyhyellä tandem repeat profilointia.

transfektio reportterirakenteet ja siRNA

trypsinisoitiin soluja ympättiin tiheydellä 5 x 10

4 solua /ml. 24 tuntia ymppäyksen jälkeen, yhtä suurina määrinä (0,5 ug) sekä toimittaja ja sytomegalovirus-β-galaktosidaasi (pCMV-β-gal, Promega) konstruktioita kotransfektoitiin kolmena 12-kuoppalevyillä käyttäen Gene Juice (Novagen). Arvioida endogeeninen vaikutus transkriptiotekijän Knockdown on

KIF14

tasoja, joukko 3 siRNA: iden (Sigma Aldrich) ja

HSF1

,

SP1

, ja

YY1

transfektoitiin määränä 0,5 nmol osaksi 60 mm ruokia. Kohdesekvenssejä kunkin siRNA on lueteltu taulukossa S2. Transfektiot suoritettiin kolmena kappaleena mukaan valmistajan ohjeiden ja toistettiin ainakin kolme kertaa.

Luciferase ja β-galaktosidaasin määritys

Solut, jotka transfektoitiin yhdessä reportteri ja pCMV-β-gal-konstrukteja kerättiin 24 tuntia transfektion jälkeen. Solulysaatit valmistettiin ja lusiferaasiaktiivisuus käyttäen lusiferaasimäärityssysteamiä (Promega) mukaisesti sen protokollaa. Lusiferaasiaktiivisuus normalisoitiin P-galaktosidaasin aktiivisuuden (mitattuna hydrolyysi kolorimetristä substraattia ONPG [

O

nitrofenyyli β-d-galaktopyranosidi], Sigma), ja ilmaistaan ​​suhteellisena prosenttiosuutena pRSV-Luc ohjaus.

Kliiniset näytteet

Kaksikymmentäkuusi tuore OvCa kasvainnäytteet, kymmenen tuore normaalien ei-neoplastisten munasarjat potilailta, joille suoritetaan ooforektomia ei-syöpäsairauksien olosuhteissa ja neljä normaalia munanjohtimien epiteelin kudokset saatiin University Health Network (UHN) Biopankkiverkosto. UHN tutkimuseettiseltä hyväksyi tutkimuksen kudosnäytteiden ja niihin liittyvien kliinisten tietojen (# 08-0884-TE), ja kaikki kudokset kallisteta kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen. Kliiniset tiedot liittyvät UHN Biopankkiverkosto näytteet tarkistaa gynekologisen onkologi ja gynecologic patologi varmistaa tietojen eheys ja laatu, ja kaikki UHN Biopankkiverkosto kudokset (viereinen H 80 % kasvainsoluja.

Reaaliaikainen PCR

Seitsemänkymmentäkaksi tuntia transfektion jälkeen siRNA, solulinjojen otettiin talteen ja kokonais-RNA eristettiin TRIzol-reagenssia (Invitrogen) valmistajan ohjeiden mukaisesti. OvCa kasvain ja normaali munasarja ja munanjohtimien epiteelin RNA: t eristettiin myös TRIzol reagenssilla, kuten aiemmin on kuvattu [8]. Ensimmäisen juosteen cDNA valmistettiin 1 ug solun kokonais-RNA: ta 100 uM satunnaisia ​​heksameerialukkeita, 20 U RiboLock RNase Inhibitor (Fermentas), ja 200 U Superscript II käänteiskopioijaentsyymiä (Invitrogen) lopullisessa tilavuudessa 20 ui. 1 ui syntetisoitu cDNA lisättiin 1X TaqMan PCR Master Mix (ABI), ja 1X TaqMan Gene Expression Assay aluke-koetin miksaus

KIF14

(Hs00978216_m1),

SP1

(Hs00916521_m1),

YY1

(Hs00231533_m1), ja

HSF1

(Hs01027608_g1). Tarkoittaa ilmentyminen kolme siivous geenejä käytettiin endogeenisen ohjaus:

TBP

(Tata- sitovan proteiinin, Hs_99999910_m1),

HPRT

(hypoksantiinifosforibosyylitransferaasi, Hs99999909_m1) ja

GAPDH

(glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi, Hs99999905_m1). Kolme rinnakkaista reaktiot suoritettiin kullekin geenille, ja kunkin näytteen, ja PCR suoritettiin käyttämällä SDS-7900HT järjestelmän (ABI), kuten on kuvattu [8]. SDS 2.1 -ohjelmisto (ABI) käytettiin laskettaessa ΔΔCt suhteellinen ilmaisu arvot normalisoituivat endogeenisen kontrolligeenin ja suhteessa joko vektorisäätö (solulinjan siRNA transfektioiden) tai ilmentyminen normaalien munasarjan ja munanjohtimen epiteelin kudosnäytteistä (kudoksen mittaukset).

Western blot -analyysi

Seitsemänkymmentä kaksi tuntia sen jälkeen transfektoidaan siRNA, solut kerättiin ja lyysattiin puskurissa, joka sisälsi 20 mM Tris-HCI, pH 7,6, 150 mM NaCl, 1 mM etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA), 1% Triton X-100, ja proteaasi-inhibiittorit aprotiniini, leupeptiini, ja phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF). Solun kokonaisproteiinia kvantifioitiin Bradfordin menetelmällä (BioRad). 30 ug ladattiin 4-12% gradientti SDS-PAGE-betonielementtien geeli (Lonza) ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi (PVDF) kalvo ja blokattiin 5% BLOTTO: lla (BioRad) Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa, 0,05% Tween-20 ( TBST). Ensisijainen vasta-aineita KIF14 (Bethyl), SP1, YY1 ja HSF1 (Abcam) ja β-tubuliinin (Sigma) käytettiin havaitsemaan endogeenisen proteiinin ilmentyminen. Piparjuuriperoksidaasileimattua sekundaarisia vasta-aineita (Chemicon) havaittiin käyttäen kemiluminesenssi-reagenssia (Denville) ja inkuboitiin valokuvausfilmikasetti (Denville). Signaalin voimakkuuden mittaukset laskettiin Photoshop CS3.

Kromatiini Immunosaostaminen (chip) määritys

ChIP testit suoritettiin kanssa Imprint® Kromatiini Immunosaostaminen Kit (Sigma) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, 1 x 10

5-soluja viljeltiin, ja proteiini-DNA-kompleksit silloitettu 1% formaldehydiä (lopullinen konsentraatio), jonka jälkeen ydin- fraktiointi ja DNA leikkaus kautta sonikoimalla. Immunosaostukset suoritettiin 90 minuutin ajan RT: ssä vasta-aineita SP1, YY1, HSF1 (Abcam), RNA-polymeraasi II (positiivinen kontrolli) ja IgG (negatiivinen kontrolli). Rajat linkit olivat päinvastaiset, DNA uutettiin ja käytettiin sekä päätepisteen ja reaaliaikainen PCR. Endpoint PCR suoritettiin 25 ul reaktioissa KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) ja asianmukaisesti suunniteltu alukeparia (tavoite promoottorisekvenssi: Forward: tta CAA TGT gaa GTC TTC gat gta Nousevan: CTC TAC TCC CAC CCC gc; RNA Pol II kohdesekvenssi: hGAPDH-Forward: CAA tTC ccc atc TCA GTC gt; hGAPDH-Reverse: tag tag CCG GGC CCT teko tt, 246 emäsparia). PCR-olosuhteet olivat seuraavat: 95 ° C: ssa 2 min, jota seurasi 40 sykliä denaturointi 95 ° C 30 sekuntia, pariutuminen 58 ° C: ssa 30 sekunnin ajan, ja pidennys 72 ° C: ssa 30 sekunnin ajan, ja sitten lopullinen jatkoaika 72 ° C: ssa 10 minuutin ajan. Tuotteet visualisoitiin käyttämällä agaroosigeelielektroforeesia. Signaalin voimakkuuden mittaukset laskettiin Photoshop CS3. Reaaliaikainen PCR suoritettiin kolmena kappaleena käyttämällä 1 ui ChIP DNA reaktiota kohti, yhdessä 1X TaqMan Master Mix (ABI), 500 nM kutakin aluketta ja 250 nM koetinta. Alukkeet olivat Forward: tga sertin CCA CTT CAA CGA GG ja Reverse: TCT CTG AAT GCT GGA CTC gc, ja koetin oli sertin GCT tta gca gaa ccc gag gag, leimattu FAM ja ZEN sammuttaja (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, USA). Reaktiot suoritettiin käyttäen standardia parametrien seuraamiseksi ViiA7 välinettä (Life Technologies). Ct-arvot normalisoitiin IgG näytteitä ja suhteellinen määrä (RQ) lasketaan RQ = 2

-ΔCt.

miRNA cDNA-synteesi ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR

Yhteensä RNA oli suoritettiin kuten edellä on kuvattu. Kaupallisesti saatavissa miRNA cDNA synteesi kit (TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit, Applied Biosystems) käytettiin kääntää puhtaaksi ehdokas miRNA erityisiä RT alukkeilla (TaqMan® miRNA määritykset, Applied Biosystems). Sequence-specific määritykset (TaqMan® reaaliaikainen PCR-määrityksissä, Applied Biosystems, taulukko S3) käytettiin tunnistamaan kypsän ehdokas miRNA primääri- kasvaimen kudosuutteista.

RNU44

, pieni ei-koodaavan RNA: n, jossa on laaja ja jatkuvasti jakautuminen kudoksiin (Applied Biosystems), käytettiin endogeenisen ohjaus. Kolme rinnakkaista reaktiot suoritettiin kullekin geenille, ja kunkin näytteen, ja PCR suoritettiin käyttämällä SDS-7900HT järjestelmän (ABI), kuten on kuvattu [8]. SDS 2.1 -ohjelmisto (ABI) käytettiin laskettaessa ΔΔCt suhteellinen ilmaisu arvot normalisoituivat endogeeninen kontrolli (

RNU44

) ja suhteessa ilmentyminen normaalien munasarjan ja munanjohtimen epiteelin kudosnäytteistä (kasvaimen kudoksen mittaukset) tai menettää tavallisesti soluihin (for OvCa solulinjoilla).

miRNA matkii ja inhibiittorit

SKOV3- soluja 12-kuoppalevyillä transfektoitiin 50 nM miR93, miR144 ja miR382 jäljittelee tai estäjiä tai vastaava ei-koodaava ohjaus matkivat tai inhibiittori (Applied Biosystems) käyttäen 3 ui Lipofectamine 2000 (Invitrogen) reagenssia kohti valmistajan ohjeiden mukaisesti. 72 tunnin jälkeen transfektion, kokonais-RNA eristettiin ja cDNA syntetisoitiin, kuten on kuvattu edellä. Ekspressiotasot KIF14 ja miRNA kiinnostavia analysoitiin kuten edellä, jossa qPCR suoritettiin käyttäen Applied Biosystems Vlla ™ 7 reaaliaikainen PCR-järjestelmää. Suhteellinen ilmentyminen arvot (RQ) on KIF14 tai miRNA normalisoitiin endogeenisen kontrolligeenin ja suhteessa kontrolliin hoitoon laskettiin käyttäen Vlla ™ 7 version 1.2 ohjelmistolla.

metylointi analyysi

Genominen DNA eristettiin ensisijainen OvCa kasvainkudoksissa ja normaalin munasarjan valvontaa, kuten aikaisemmin on kuvattu [8]. Genomi-DNA: ta (200 ng) modifioitua ja puhdistettiin käyttäen kaupallisesti saatavilla olevaa bisulfiittia muutos Kit (Imprint® DNA Modification Kit, Sigma) valmistajan ohjeiden mukaisesti. CpG saari tunnistettiin (https://cpgislands.usc.edu/) puitteissa 4500 emäsparin

KIF14

promoottorialue (-2371–1129) (kuvio S1A), ja metylaatiospesifistä alukkeita (~120 ep) vastaan ​​suurimman CpG-saarekkeen sisällä

KIF14

promoottori käyttämällä online-ohjelmisto Methprimer suunniteltiin (https://www.urogene.org/methprimer/) (Kuva S1B). Alukesekvensseissä olivat seuraavat: Metyloidut erityisiä: Forward: att taa agg ggg tta agt ttt ACGT; Reverse: gat AAT TAA teko CCG ata acc GTC; Metyloimatonta-erityisiä: Forward: att taa agg ggg GTT agt ttt atgt; Reverse: CAA TAA tta aac TCC AAT aac CATC. Neljäsosa puhdistettua bisulfiitti-käsitellyn DNA: n (5 ui 20 ui eluaattia) käytettiin metylaation PCR-reaktiossa. Päätepiste PCR-reaktiot tehtiin 25 ul: n lopulliseen tilavuuteen kanssa Maxima Hot Start Taq polymeraasia (Fermentas). PCR-olosuhteet olivat seuraavat: 94 ° C 3 min, jota seurasi 40 sykliä denaturointi 94 ° C 30 sekuntia, pariutuminen 60 ° C: ssa 30 sekunnin ajan, ja pidennys 72 ° C: ssa 30 sekunnin ajan, ja sitten lopullinen jatkoaika 72 ° C: ssa 10 minuutin ajan. Tuotteet (~120 bp) visualisoitiin käyttämällä agaroosigeelielektroforeesia. Densitometria suoritettiin harmaasävykuvat Image J. tarkastaminen bisulfiitin muuntaminen DNA suoritettiin modifioimattoman calponin-spesifisiä alukkeita (kuvio S2), kuten on kuvattu [17].

Tilastollinen analyysi

Expression arvot (lusiferaasiaktiivisuus, mRNA miRNA tai proteiini lauseke) arvioitiin välillä normaalia kudosta valvontaa ja OvCa tuumorikudoksia tai ohjaavat ja hoidettujen ryhmien avulla pariksi tai pariton t-testejä. KIF14 ilmaisun jälkeen miRNA estäjä /matkivat käsittely analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA. Ellei toisin mainita, kaikki tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen Graph Pad Prism 4.0. Korrelaatiot

KIF14

saada vs.

KIF14

no gain luokkia ja

SP1

,

YY1

ja

HSF1

mRNA ilmaisu analysoitiin käyttämällä Pearsonin korrelaatiokerrointa (r).

tulokset

tunnistaminen

KIF14

cis säätelyalueen munasarjasyövän solulinjoissa

4500 emäsparin alue genomisen DNA: n välittömästi ylävirtaan ihmisen

KIF14

transkription aloittaa päällä monistettiin normaalin ihmisen DNA: n, ja deleetionaalisista toimittaja analyysit tehtiin kloonaamalla peräkkäin pienemmät alueet

KIF14

promoottorista pRSV-Luc promoottorialueen. Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin OvCa429, SKOV3- ja HeLa-solut, ja promoottorin aktiivisuus laskettiin suhteessa pRSV-Luc ilmaisun (asetettu 100%). Koko promoottorialue konstruktin (pGL3-4555) osoittivat lusiferaasiaktiivisuuden lähellä, että positiivisen kontrollin (pRSV-Luc). Yksi erittäin aktiivinen alue välillä havaittiin -2366 ja -2245 bp: n, joka osoittaa vastaavaa toimintaa, täyden promoottorikonstruktiin, mutta huomattavasti enemmän lusiferaasin aktiivisuus verrattuna kaikkiin muihin deleetiorakenteita kaikkien kolmen solulinjoissa (P 0,05, kuvio 1). Bioinformatiikka- analyysi tämän aktiivisen alueen kautta verkossa analyysin ohjelmisto (Genomatix) tunnistettiin otaksutun transkriptiotekijän sitoutumiskohdat

SP1

,

YY1

ja

HSF1

(kuvio 1), mikä viittaa läsnäolon mahdollisen

cis

säätelyalueen sisällä

KIF14

promoottori.

promoottori deleetiorakenteita fuusioitunut Luciferase testattiin aktiivisuuden suhteen HeLa, SKOV3- ja OvCa429 soluja. pRSV-Luc, positiivinen kontrolli, 0, tyhjä vektorisäätö. Numerot ovat emäsparia suhteessa transkription aloituskohdan (0). Bioinformatiikan analyysi (Genomatix) kaikkein aktiivisen alueen sisällä

KIF14

promoottori (-2366–2245) tunnistettu otaksuttu sitoutumiskohtia transkriptiotekijöitä YY1, HSF1 ja SP1. Erityinen transkriptiotekijän tunnustamista kohdat on alleviivattu, ja tilaan järjestyksessä tarkoittaa sijainnin deleetiorakenteita. N = 3, * merkitys osoitteessa

P

0,05, pariton t-testi.

P

= 0,01 (HeLa);

P

= 0,01 (SKOV3);

P

= 0,03 (OvCa429).

SP1 ja YY1 endogeenisesti säädellä KIF14 ilmentyminen OvCa solulinjoissa

Testasimme ovatko nämä transkriptiotekijät vaikuttaa

KIF14

mRNA ilmentyminen siRNA-välitteisen knockdovvn endogeenisen

SP1

,

HSF1

ja

YY1

vuonna SKOV3- ja OvCa429 soluja. Ohimenevä knockdown johti merkittävään vähentämiseen transkriptiotekijän (

SP1

,

HSF1

,

YY1

) mRNA (kuvio 2A, B). Vaikka knockdovvn

HSF1

ei ollut merkittävää vaikutusta

KIF14

geeniekspressiota,

SP1

ja

YY1

Knockdown johti merkittävästi vähentynyt

KIF14

mRNA, mikä viittaa siihen, että sekä SP1 ja YY1 toimivat lisääjinä

KIF14

transkriptio. Vastauksena

SP1

ja

YY1

pudotus, laskua transkriptiotekijän proteiinin ilmentymistä ja siihen liittyvät KIF14 proteiinia ollessa vahvistettiin immunoblot (kuvio 3) on SKOV3- soluissa. Vaikka HSF1 proteiinin tasot laskivat vastauksena pudotus, ei merkittävää muutosta KIF14 proteiinin ilmentymisen nähtiin. Samanlaisia ​​tuloksia nähtiin OvCa429 soluja (tuloksia ei ole esitetty), mikä osoittaa, että

SP1

ja

YY1

voi ohjata ilmentymistä

KIF14

in OvCa solulinjoissa. Väheneminen KIF14 mRNA ja proteiinin ilmentyminen vasteena SP1 pudotus oli pienempi kuin YY1 pudotus, ja se voisi todennäköisesti tehokkuuteen liittyviä transkriptiotekijän pudotus (kuvio 2A, B ja kuvio 3A, B). Väheneminen

KIF14

mRNA ja proteiini oli huomattavampi vastaus

YY1

Knockdown, mikä viittaa siihen, että YY1 voi olla merkittävä toimija säätelyssä

KIF14

yliekspressio näissä soluja.

siRNA knockdovvn endogeenisen

SP1

(oranssi),

HSF1

(vihreä), ja

YY1

(punainen) transkriptiotekijöitä, ja mittaus niiden mRNA ilmaisun yhdessä vastaavien

KIF14

mRNA tasolla (sininen) kautta reaaliaikainen PCR A SKOV3 ja B OvCa429 soluja. Y-akselit: normalisoitu mRNA: n ilmentymisen suhteen mock. GL2, ohjaus siRNA; N = 3, * merkitys osoitteessa

P

0,05, pariton t-testi. Kolme eri siRNA-molekyylejä (A, B, C) käytettiin kaataa kunkin geenin. P-arvot paneeli A (SKOV3- solut):

P

= 0,02 SP1 lauseke (oranssi) SP1 siRNA: t A, B, ja C;

P

= 0,03 (siRNA-A),

P

= 0,047 (siRNA-B),

P

= 0,04 (siRNA-C) KIF14 lauseke (sininen) .

P

= 0,001 HSF1 ilmaisu (vihreä) kanssa HSF1 siRNA: t A, B, ja C;

P

= 0,23 (siRNA-A),

P

= 0,12 (siRNA-B),

P

= 0,4 (siRNA-C) KIF14 lauseke (sininen) .

P

= 0,01 YY1 lauseke (punainen) kanssa YY1 siRNA: t A, B ja C;

P

= 0,006 varten KIF14 lauseke (sininen) kanssa YY1 siRNA: t A, B, ja C. P arvot paneeli B (OvCa429 solut):

P

= 0,03 SP1 lauseke (oranssi) SP1 siRNA: t A, B, ja C;

P

= 0.05 (siRNA-A),

P

= 0,04 (siRNA-B),

P

= 0,045 (siRNA-C) KIF14 lauseke (sininen) .

P

= 0,003 varten HSF1 ilmaisu (vihreä) kanssa HSF1 siRNA: t A, B, ja C;

P

= 0,31 (siRNA-A),

P

= 0,45 (siRNA-B),

P

= 0,39 (siRNA-C) KIF14 lauseke (sininen) .

P

= 0,02 (siRNA-A),

P

= 0,01 (siRNA-B),

P

= 0,01 YY1 lauseke (punainen);

P

= 0,02 (siRNA-A),

P

= 0,001 (siRNA-B),

P

= 0,006 (siRNA-C) KIF14 lauseke (sininen) .

siRNA knockdown endogeenisen SP1 (oranssi), HSF1 (vihreä), ja YY1 (punainen) transkriptiotekijöitä ja mittaamalla niiden proteiinin ilmentymisen yhdessä vastaavan KIF14 proteiinin tasot (sininen) kautta immunoblot in SKOV3- soluissa. x-akseli: normalisoitu proteiinin ilmentymisen suhteen mock. B Edustavia immunoblottia KIF14 ja transkriptiotekijä ilme. Numerot ovat normalisoidut lauseke arvot esitettyä koetta. Vastaavia tuloksia saatiin kanssa OvCa429 soluihin. GL2, ohjaus siRNA; N = 3; *,

P

0,05 transkriptiotekijän ilmaisun; #,

P

0,05 KIF14 ilmaisun, paritonta t-testiä.

P

arvot paneeli A (SKOV3- solut):

P

= 0,009 (siRNA-A),

P

= 0,003 (siRNA-B),

P

= 0,006 (siRNA-C) SP1 lauseke (oranssi);

P

= 0,005 (siRNA-A),

P

= 0,007 (siRNA-B),

P

= 0,004 (siRNA-C) KIF14 lauseke (sininen) .

P

= 0,01 HSF1 ilmaisu (vihreä) kanssa HSF1 siRNA: t A, B, ja C;

P

= 0,54 (siRNA-A),

P

= 0,65 (siRNA-B),

P

= 0,41 (siRNA-C) KIF14 lauseke (sininen) .

P

= 0,001 YY1 lauseke (punainen) kanssa YY1 siRNA: t A, B ja C;

P

= 0,01 (siRNA-A),

P

= 0,02 (siRNA-B),

P

= 0,005 (siRNA-C) KIF14 lauseke (sininen) .

Voit tarkistaa, onko SP1 ja YY1 voi yhdistää suoraan

KIF14

promoottori, kromatiinin immunoprecipiation (chip) testit suoritettiin SKOV3, OvCa429 ja HeLa-solut. Olemme havainneet, että sekä SP1 ja YY1, mutta ei HSF1 näytteillä on paljon suurempi sitoutumisaffiniteetti

KIF14

promoottorialueen kuin IgG-kontrolli (korkeampi suhteellinen ilmentyminen arvot, kuvio 4). OvCa429 solut osoittivat suurinta rikastamiseen sitoo molempia SP1 ja YY1 (yli 10-kertainen, kuvio 4A, B), kun taas SKOV3- ja HeLa-solut osoittivat vaatimatonta rikastus (keskimäärin 4-kertainen, kuvio 4A, B). Sitoutuminen HSF1 että KIF14 promoottori paljon vähemmän (keskimäärin 2-kertainen kaikissa solulinjoissa, kuvio 4C). Väkevöittäminen SP1 YY1 sitoutuminen myös osoittanut kautta päätepiste PCR (kuva S3). Nämä tulokset vahvistavat myös mRNA ja proteiinin ilmentyminen tulokset osoittavat, että molemmat SP1 ja YY1 voi sitoutua suoraan

KIF14

promoottori. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että SP1 ja YY1 voi endogeenisesti säädellä

KIF14

ilmentyminen OvCa solulinjoissa.

ChIP määritykset endogeenisen YY1, SP1 ja HSF1 seuraa reaaliaikaista PCR: llä

KIF14

promoottorialue (-2300–2133) solulinjoissa SKOV3, OvCa429, ja HeLa verrattuna IgG: tä (negatiivinen kontrolli). Arvot edustavat keskimääräinen määrä promoottorialueen tuotteen verrattuna IgG valvontaa. Virhepylväät edustavat keskihajonta kolmena määrityksiä.

SP1 ja YY1 yli-ilmentyminen korreloi KIF14 yliekspressio

Olemme aiemmin dokumentoitu genomista voitto

KIF14

jopa 30 % ensiarvoisen OvCa kasvaimia, jotka korreloi hyvin korkea yliekspressioon

KIF14

mRNA (

KIF14

HIGH) [8]. Nämä tiedot viittaavat siihen, että genomi-vahvistus on yksi mekanismi, jonka kautta

KIF14

yli-ilmennetään näissä kasvaimissa. Sen määrittämiseksi, onko

KIF14

yli-ilmentymisen OvCa kasvaimia voitaisiin myös liittää transkription säätelyyn, mittasimme mRNA ilmaus

SP1

,

YY1

ja

HSF1

alaryhmässä OvCa kasvain kudosten kanssa (15 näytettä) ja ilman (50 näytettä)

KIF14

genomista voitto. Vuonna OvCa kasvaimet ilman genomista vahvistus (50), me kaksijakoinen näytteet kahteen ryhmään perustuen mediaani ilmaisun, kumpaankaan

KIF14

HIGH tai

KIF14

LOW ryhmiä, kuten olemme aiemmin raportoitu [8]. Monet 19

KIF14

HIGH OvCa kasvaimet ilmaisivat merkittävästi korkeampaa

SP1

ja

YY1

mRNA (kuvio 5) kuin ne, joilla on

KIF14

LOW yliekspressio (31), mikä osoittaa mahdollisia rooleja SP1 ja YY1 ylläpitää korkeaa

KIF14

tasoja kasvaimissa.

HSF1

mRNA-tasot olivat samanlaisia ​​kaikissa OvCa kasvaimissa, mikä on vähemmän todennäköisesti tärkeitä säätelyssä

KIF14

mRNA. Keskimääräinen

YY1

ekspressiotaso ensisijainen OvCa kasvaimissa on paljon suurempi kuin keskimääräinen

SP1

ilmaisun tasolla; yhdessä

YY1

pudotus datan solulinjoissa (kuviot 2 ja 3), nämä tulokset viittaavat siihen, että YY1 on tärkeä säätelijä KIF14 yli-ilmentymisen OvCa kasvaimia. Tämän tueksi, vahva korreloi

KIF14

ja

SP1

tai

YY1

ilmaisu, kun taas yksikään olemassa

HSF1

(taulukko 1 ja Kuvio S4d-F). Kasvaimista KIF14 genomista voitto ei osoittanut transkriptiotekijä korrelaatiota (taulukko 1 ja kuvio S4A-C), joka vahvistaa, että genominen voitto on mekanismi valvoa

KIF14

yliekspressio näissä kasvaimissa. Mielenkiintoista, osa (noin 40%) on

KIF14

HIGH kasvaimia osoitti

SP1

ja

YY1

ilmaus lähellä normaalia kudosta tasoilla (kuvio 5), edelleen syytetään muita biologisia mekanismeja mahdollisesti ohjata

KIF14

yli-ilmentymisen OvCa kasvaimissa.

kvantitatiivinen mRNA: n ilmentymisen analyysi ensisijainen OvCa kasvainten

KIF14

HIGH (punainen) ja <