Krooninen sairaus

tiivistelmä

maksasolusyövän (HCC) on viidenneksi yleisin syöpä maailmassa. β-kateniinin, Keski orchestrator kanonisen Wnt polku ja tunnetun onkogeeni on ensiarvoisen HCC synnyssä. Annettu fenobarbitaali (PB), joka sisälsi vettä (0,05% w /v), kuten kasvaimen promoottori seuraavat alustavat injektoidaan vatsaonteloon (IP) diethylnitrosamine (DEN) injektiota (5 ug /g kehon paino), kuten kasvaimen induktori on yleisesti käytetty malli tutkia HCC in hiirillä. Tässä yhdeksän viidentoista päivän uros β-kateniinin hiirten (KO) ja viisitoista villityypin pesuetove- valvonta (WT) tehtiin DEN /PB hoitoa ja tutkittiin maksan kasvaimien synnyn kahdeksan kuukautta. Paradoksaalisesti huomattavasti suurempi tuumorikuorma havaittiin KO (p 0,05). Kasvaimia KO olivat β-kateniinin ja glutamiinisyntetaasi- negatiivinen ja HGF /Met, EGFR IGFR signalointi oli mukavalta. Merkittävä kasvu PDGFRα ja sen ligandi PDGF-CC, mikä lisää fosfotyrosiini-720-PDGFRα havaittiin kasvain KO-hiirissä (p 0,05). Samanaikaisesti nämä maksa näkyy lisääntynyt solukuolema, stellate solujen aktivaation, maksan fibroosi ja solujen lisääntymistä. Edelleen, PDGF-CC merkittävästi aiheuttama hepatoomasolulinjassa lisääntymistä erityisesti seuraavat β-kateniinin tukahduttaminen. Tutkimuksemme osoittavat myös, että hyödynnetään DEN /PB protokolla WT C57BL /6 hiiret eivät valikoida β-kateniinin geenimutaatioita aikana hepatokarsinogeneesin. Siten DEN /PB parannettu HCC hiirillä puuttuu β-kateniinin maksassa voi johtua niiden ineptness säännellä solujen eloonjäämistä, joka parantaa fibroosia ja uudistumista läpi PDGFRα aktivointia. β-kateniinin downregulation myös hepatoomasolujen herkempiä reseptorityrosiinikinaaseilla ja täten voidaan hyväksi terapeuttisten.

Citation: Awuah PK, Rhieu BH, Singh S, Misse A, Monga SPS (2012) β-kateniinin Loss hepatosyyteissä Edistää Hepatosellulaarinen Cancer jälkeen Diethylnitrosamine ja fenobarbitaali hallintoa Hiiret. PLoS ONE 7 (6): e39771. doi: 10,1371 /journal.pone.0039771

Editor: William B. Coleman, University of North Carolina School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 27 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 30 toukokuu 2012; Julkaistu: 25 kesäkuu 2012

Copyright: © 2012 Awuah et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health myöntää 1R01DK62277 (National Institute of Digestive Diseases ja munuainen) ja 1R01CA124414 (National Cancer Institute) ja SPSM ja Rango n rahasto Enhancement of Pathology Research. P.K.A. rahoitettiin osittain T32 EB001026 (National Institute of Biomedical Imaging ja biotekniikan). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

hepatosellulaarinen karsinooma (HCC) on viidenneksi yleisin syöpä ja kolmas syöpäkuolemien syy maailmanlaajuisesti [1]. On vahva tarve rajata molekyylitason muutoksia vastaavan aloittamisesta ja pahenemiseen tämän taudin. Jotta voidaan tutkia solun ja molekyylin häiriöiden HCC, monessa prekliinisessä strategioita työllistävät geneettisten ja kemiallisten malleja syövän. Anto diethylnitrosamine (DEN) yksin tai yhdessä fenobarbitaali (PB) hiirillä on usein käytetään aiheuttaa HCC hiirillä.

Yksi polku ratkaisevan tärkeää HCC on Wnt /β-kateniinin signalointi. β-kateniinin on keskeinen efektori kanoninen Wnt signalointia, joka on erittäin konservoitunut koulutusjakson säätelemällä kriittinen solun prosessit, kuten proliferaatiota, erilaistumista, selviytyminen ja itseuudistumisen [2], [3], [4], [5]. Puuttuessa Wnt, β-kateniinin fosforyloituu amino-terminaalisia seriini- ja treoniinitähteitä ja suunnattu ubikitinaatio [6]. Kun sitoutuminen Wnt-proteiinia sen solun pinnan reseptorin Frizzled ja co-reseptorin alhaisen tiheyden lipoprotein- liittyvä proteiini 5/6 (LRP5: stä /6), signaali transdusoidaan kautta epäsiisti, joka mahdollistaa inaktivoimiseksi hajoamisen monimutkaisia ​​koostuu glykogeenisyntaasikinaasi 3β (GSK3p), adenomatoottisen polypoosin coli-geenin tuote (APC) ja kaseiinikinaasi Iα, joka mahdollistaa β-kateniinin erottaa ja tumaan sitoutua lymfaattisen edistäjän sitovan tekijän /T-solun kasvutekijä (LEF /TCF) perheen proteiinien transaktivoimaan kohdegeenien. Wnt /β-kateniinin reitin on liitetty osajoukko HCC, jossa aktivoivat mutaatiot β-kateniinin geenin (

CTNNB1

) on raportoitu 20% -40%: lla potilaista [7], [8 ]. Knockdovvn β-kateniinin hepatoomasolujen johtaa vähentyneeseen kasvua ja selviytymistä. Edellä mainituista syistä, β-kateniinin on hyvin tunnustettu onkogeenin ja pitää arvokkaana terapeuttinen kohde.

Tätä taustaa vasten me arveltu, että puute β-kateniinin hepatosyyteissä voi suojaavat kemiallisia aiheuttaman syövän synty varsinkin malliin, jossa HCC on hedelmöitettu kasvaimen induktiota DEN ja kasvaimen edistämisen kautta jatkuva käyttö PB [9], [10]. Käytimme mies ehdollinen hepatosyyttispesifinen erityinen β-kateniinin pudotuspelit (KO) hiiriä ja sukupuolen Hyväksytty villi-tyypin pesuetove- valvonta (WT) tutkimaan tuumorigeneesiä vastauksena DEN /PB. Raportoimme paradoksaalinen lisääntyminen maksan kasvainten synnyssä ilman β-kateniinin, joka johtui tehostetun vammoja, fibroosia ja seurannut uudistaminen, jotka näyttävät taustalla on melko ei-klassisen epiteelisolujen reseptori tyrosiinikinaasin reseptoria PDGFRα. Osoitamme myös, että hyödyntämällä yleisesti käytetään DEN /PB protokolla C57BL /6 hiirissä kasvaimen kehittymisen ei tapahdu kautta β-kateniinin mutaatiot havaitaan C3H hiirillä. Lopuksi β-kateniinin esto lukemiin PDGFRα aktivointia ja voi siten tehdä hepatoomasolujen sopivampia reseptorityrosiinikinaaseilla eston hoitoja.

Tulokset

β-kateniinin menetys hepatosyyteissä synnyttää parannettu hepatokarsinogeneesin vuonna hiirissä vasteena DEN /PB

WT ja KO-uroshiiriä (C57BL /6), annettiin yksi annos (5 ug /g) ja DEN injektion syntymän jälkeisenä päivänä 14 päivää ja kaksi viikkoa myöhemmin annettiin

mielin määrin

pääsy PB sisältävän juomaveden 8 kuukautta, jona aikana hiiret tutkittiin maksan kasvaimia (Fig. 1A). Kiehtovan, hiiret puuttuu β-kateniinin hepatosyyteissä näytetään merkittävästi parannettu tumorigeneesin kuin WT hiirillä, jotka oli selvästi tuntuva kuin suuremmat ja suurempi määrä kasvaimia (Fig. 1 B). H 0,05) (Fig. 1 D).

Experimental strategia yhteenveto DEN /PB hoitoa KO ja WT hiirillä. A. Edustavia valokuvia kasvain maksa in DEN /PB käsitelty KO ja WT hiirillä aikaan sadonkorjuun 8 kuukauden iässä. B. DEN /PB aiheuttama mikroskooppinen kasvainkeskusten (hahmoteltu nuolenpäin) visualisoitu H 0,05). Kasvaimet laskettuna H 0,05). E. Merkityksetön erot näkyivät Tyr-849-PDGFRα välillä WT ja KO.

Voit selvittää seuraukset tehostetun PDGF-CC /PDGFRα tasoilla KO arvioimme tasoa PDGFRα fosforylaation useita erityisiä tyrosiini jäämiä käyttäen vasta-aineita luetellaan menetelmiä. Kuten on esitetty densitometrinen analyysejä, merkittävä kasvu Tyr720-PDGFRα (p 0,05) (Fig. 5D), mutta ei Tyr849-PDGFRα (Fig. 5E) tai Tyr572 /574- ja Tyr754-PDGFRα (ei esitetty) havaittiin KO. Nämä havainnot osoittavat PDGFRα aktivoinnin KO, joka voi olla pelissä tärkeä rooli hepatokarsinogeneesin.

PDGFRα ligandi stimuloi hepatoomasolulinjassa lisääntymistä vasta kun β-kateniinin tukahduttaminen

edelleen selville merkitystä PDGFRα signalointi puuttuessa β-kateniinin, käytimme ihmisen hepatoomasoluissa. PDGF-CC kyennyt aiheuttamaan merkittävää lisäämistä Hep3B solussa DNA-synteesin verrattuna HCl, jota käytettiin liuotus PDGF lähes konfluentteja soluviljelmissä (Fig. 6). β-kateniinin Knockdown verrattuna hallita siRNA transfektion, vähensi merkitsevästi tymidiinin inkorporaation Hep3B soluissa (p 0,0005) (Fig. 6). Vain kun β-kateniinin hiljentäminen, oli PDGF-CC hoito pystyy aiheuttamaan huomattavia DNA-synteesiin Hep3B soluissa verrattuna HCl (p 0,005). Näin β-kateniinin vaimennus käytössä PDGF-CC on mitogeeninen ja Hep3B-soluissa.

PDGF-CC: llä (10 ng /ml) käsittely ei lisätä DNA-synteesin verrattuna HCl: hoitoon Hep3B-soluissa. β-kateniinin pudotus johti merkittävästä vähenemisestä tymidiinin verrattuna kontrollieläimiin siRNA (p 0,0005). Kuitenkin PDGF-CC hoito johti merkittävään kasvuun tymidiinin inkorporaation β-kateniinin tukahdutti verrattuna ohjata siRNA-transfektoiduissa soluissa (p 0,005).

Keskustelu

ymmärtää molekyyli- ja solutason perusteella HCC potilailla, useissa prekliinisissä ovat käytössä myös DEN tai DEN /PB hoito jyrsijöillä. DEN on yleisesti käytetty karsinogeeniksi aiheuttaa HCC jyrsijöiden, mutta se on erittäin venyvää spesifisyys. C57BL /129Sv x C3H /He-hiiret, kanta alttiimpia hepatokarsinogeneesin, DEN injektio noin 6 viikon iässä annoksella 90 ug /g kehon paino, indusoi HCC kautta Ha-ras-mutaatioiden, kun taas sisällyttäminen PB juominen vesi jälkeen 3 viikon DEN, edistää kasvaimen kehittymisen vuoksi

CTNNB1

mutaatioita. [15]. Kuitenkin toinen tutkimus urospuolisilla B6C3F1 hiirillä, saadaan interbreeding naispuolinen C57BL /6J ja mies C3H /HeJ hiiriä, pistetään DEN 10 ug /g kehon paino 3 viikon iässä ilman PB, osoitti HCC kautta

CTNNB1

mutaatiot [16]. Toinen malli hyödyntää DEN annoksella 5 ug /g kehon C57BL /6, kanta suhteellisen resistenttejä HCC. Täällä, DEN indusoi DNA addukteja hepatosyyteissä meneillään solunjakautumisen ja lopulta johtaa kehitystä HCC [17], [18]. Sisällyttäminen PB parantaa kasvaimen kehittymisen kautta kasvain edistämällä kyky [9], [10]. Tutkimuksessamme osoitamme, että toisin kuin C57BL /129Sv × C3H /He-hiiret, DEN /PB aiheuttama maksan kasvaimia C57BL /6-hiirten eivät osoittaneet ydinvoiman /sytoplasman lokalisaatio β-kateniinin eikä siten valikoivasti aiheuta HCC kautta

CTNNB1

mutaatioita. Näin Hiirikanta vastikkeena opiskeluun tuumorigeneesiä vastauksena erikoisprotokollia on erittäin merkityksellinen.

Monet reittejä suurin piirtein luokiteltu Ras /MAPK, PIK3CA /AKT ja Wnt /β-kateniinin signalointi, on osoitettu olevan merkitystä HCC [11], [19]. β-kateniinin, keskeinen orchestrator Wnt signaloinnin, on tunnettu onkogeenin, koska sen vaikutuksia erilaisia ​​syöpiä, mukaan lukien 20% -40% kaikista HCCs [20]. Kiehtovan kuitenkin yli-ilmentyminen joko villityypin tai mutantti-muodossa β-kateniinin hiiren maksa ei kykene aiheuttamaan spontaani HCC [21], [22], [23], [24]. Kuitenkin, kun läsnä on toisen osuman muodossa siirtogeenin tai kemiallinen karsinogeeni, nämä eri hiiret osoittavat parannetun kasvaimien syntyyn [23], [25], [26]. Paradoksaalisesti ehdollinen menetys β-kateniinin hepatosyyteissä C57BL /6-hiirten johti ennakoitua suuremman herkkyys DEN aiheuttamaa HCC [27]. Toinen ryhmä on myös hiljattain osoitti havaittu olevan tuumorigeneesiä KO hiirissä vasteena DEN /PB,

vaikkakin

C3H /N hiirillä [28]. Nykyisessä tutkimuksessa, tarjoamme todisteita siitä, että β-kateniinin KO hiiret C57BL /6 taustalla alistetaan DEN välittämää kasvain induktio P14 seurasi tuumoripromootiossa 2 viikkoa myöhemmin PB johti myös merkittävästi suurempi kasvaintaakka.

DEN tai DEN /PB aiheuttama HCC missään hiirikannassa ei yleensä liity mihinkään maksan fibroosi. Kuitenkin β-kateniinin ehdollinen nollahiiriä DEN /PB altistumisen seurauksena kehittämiseen HCC, joka liittyi maksan fibroosi ja noudattaa viimeaikaiset tutkimukset muille ja meille [27], [28]. Näimme myös kasvua solukuoleman ja lisääntyviin solujen lisääntymisen. Itse asiassa olemme määritelleet lisääntynyt stellate soluaktivoitumisessa vaatimaton kasvu PDGFRβ ja seurannut maksan fibroosi. Nämä tulokset osoittavat, että β-kateniinin menetys tekee maksa alttiimpia genotoksinen vahinkoa ja lopulta kasvaimen kehittymisen jäljittelemällä vallitseva tilanne ihmisen HCC jossa kasvaimia esiintyy usein maksakirroosia taustalla [29]. Role of β-kateniinin säätelyssä redox tila on hiljaista monissa viimeaikaisissa tutkimuksissa, joissa sen vuorovaikutusta HIF1α, FOXO3 ja muut voivat olla kriittinen [30], [31]. On siis tärkeää ymmärtää perusteella tällaisten ”kasvain tukahduttava” roolit β-kateniinin HCC jotka voivat lopulta edellyttävät huolellista valintaa potilaita on hoidettu anti-β-kateniinin hoitojen [32].

varmistua molekyylitasolla HCC puuttuessa β-kateniinin, olimme kiinnostuneita signalointireittejä, jotka ovat hyvin tunnettuja kehittämiseen ja pahenemiseen HCC. C-Met ja IGFR fosforylaatio nostettiin WT mutta ei KO hiirillä kun EGFR aktivaatio oli vain lievästi koholla WT. Niinpä vaikka nämä RTK voi olla tärkeä rooli kasvainten synnyssä WT altistuu DEN /PB, niiden osallistuminen KO on epätodennäköistä. Perustuen aiempiin havaintoihin DEN aiheuttaman tuumorigeneesiä KO [27] ja riippumattomat tutkimukset osoittavat tärkeä rooli PDGFR signaloinnin HCC [12], [13], [14], tutkimme sen ilmaisun ja aktivoinnin DEN /PB tutkimukset . PDGFRα tasot olivat merkitsevästi yläreguloituja KO jälkeen DEN /PB-altistuksen. Lisäksi, PDGF-CC selektiivinen ligandi PDGFRα, joiden yli-ilmentyminen maksassa erityisiä transgeenisissä hiirissä on osoitettu aiheuttavan maksakirroosi ja HCC [33], on myös lisääntynyt KO. Itse asiassa PDGF-CC paikallistettiin hepatosyyttien KO alttiina DEN /PB (tuloksia ei ole esitetty), mikä viittaa siihen, autokriinisellä silmukan signalointia. Saadut tulokset tymidiininsisällytysmääritys että Hep3B soluissa, vahvistavat

in vivo

havaintoja. Vaikka vähentynyt soluproliferaatiota havaittiin hepatoomasolujen jälkeen β-kateniinin Knockdown [34], PDGF-CC edistänyt niiden mitogeneesiin vahvemmin vasta β-kateniinin tukahduttaminen joka johtaa PDGFRα säätelyä [27]. Tämä vahvistetaan myös PDGFRα signalointi keinona paeta β-kateniinin terapeuttinen eston.

PDGFRα yli-ilmentymisen läsnä ollessa lisääntynyt PDGF-CC lisännyt Tyr720-PDGFRα tuumoreita KO mutta ei WT maksa jälkeen DEN /PB. Fosforylaation tyrosiini 720 tiedetään aktivoida fosfataasi SHP2, joka puolestaan ​​defosforyloi Src, mikä sen aktivointi [35]. Src aktivointi on osoitettu indusoivan c-Myc, joka on tärkeä proto-onkogeenin [36], joka on samanaikaisesti kohonnut KO. Muut tyrosiini sivustoja PDGFRα osoitti huomaamaton muutoksia fosforylaation välillä KO ja WT ja voi siten olla vähemmän merkitystä nykyisessä kasvainten synnyssä malli.

Vain noin 3% kaikista kasvaimista 9 KO: n 8 kuukautta DEN /PB hoito oli β-kateniinin-positiivisia kasvaimia, jotka voivat johtua ”vuotavat” cRE-rekom-. p-kateniinin-syöpäkasvain olivat myös negatiivisia GS ja enimmäkseen negatiivisia sykliini-D1. Emme ole seurannut mitään eläimiä tässä tutkimuksessa yli 8 kuukautta. Toiset ovat viime aikoina raportoitu laaja spontaani harvenneiden Ko maksa

joskin

18-20 kuukauden iässä [37]. Yksi ryhmä on raportoinut vankempi spontaani kannan uudelleen ja maksan adenomatoo- Ko, jota ei ole raportoitu muulla ryhmä työskentelee yhdessä β-kateniinin ehdollinen hiirten [38]. Ainoa esimerkki laaja harvenneiden että KO hiiret kokemuksemme havaittiin jatkuvan käytön jälkeen ruokavalio, joka sisältää 0,1% 3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine (DDC) 5 kuukautta [39]. Itse KO hiirillä on tutkittu osittaisen hepatektomian jälkeen, metioniini-koliini puutteellinen ruokavalio, alkoholin ruokavalion tai DEN ja ovat näytteillä puute maksan kannan lisäämis- kanssa β-kateniinin-positiivisten maksasolujen [27], [31], [40], [41] .

Materiaalit ja menetelmät

Eläinkokeet

Kaikki eläinkokeet suoritettiin suuntaviivojen mukaisesti National Institutes of Health ja institutionaalisten eläinten käytön ja hoidon komitea yliopistossa Pittsburgh. Tutkimukset suoritetaan vallitsevalla raportissa hyväksyi Institutional Animal käytön ja hoidon komitea yliopiston Pittsburgh. Hiiret ehdollisen poistamisen β-kateniinin hepatosyyteissä kanssa genotyypin Ctnnb1

loxP /loxP, Alb-Cre

+/- ovat viitattu kuten hiirten (KO) ja on kuvattu aiemmin [41]. Pentuesisarukset kanssa jokin seuraavista genotypes- Ctnnb1

loxP /loxP, Alb-Cre

– /-, Ctnnb1

loxP /WT, Alb-Cre

+/-, Ctnnb1

loxP /WT, Alb-Cre

– /- kutsutaan villityypin tai WT. Nämä hiiret ovat C57BL /6-taustalla.

Male KO (n = 9) ja WT (n = 15), hiiriin injektoitiin intraperitoneaalisesti DEN (Sigma-Aldrich, Inc.) annoksella 5 ug /grammaa kehon painoa syntymän jälkeisenä päivänä 14 ja päivänä 28 lähtien juomavettä saatavilla

halun

sisälsi fenobarbitaali (PB) (0,05% w /v). Vettä sisältävä tuore PB valmistettiin viikoittain ajaksi opintojen. Hiiret lopetettiin 8 kuukautta ja maksan kerättiin histologiaa varten ja proteiinin analyysi.

Western blot-analyysi:

Yhteensä kudoksen lysaatit valmistettiin radio immunosaostuksella määritys (RIPA), joka sisälsi 1% IGEPAL CA -630, 0,5% natriumdeoksikolaatti, 0,1% SDS: 1 x PBS: ssä yhdessä proteaasi fosfaatti estäjä (1:100) (Thermo Scientific). Proteiinit erotettiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesin 4-15% geeleissä ja siirrettiin sitten Immobilon-P -kalvoille (Millipore, Bedford, MA) siirtoa, joka sisälsi 10% metanolia. Kalvoja testattiin primaarisilla vasta-aineilla (katso jäljempänä) Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa, jossa Tween-20, joka sisältää 5% rasvatonta maitoa tai BSA: ta. Piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita käytettiin 1:50,000 laimennus- ja-signaalin arvioitu Super Signal West Pico kemiluminesenssin substraattia (Pierce, Rockford, IL) ja autoradiografia. Kalvot (Molecular Technology Sales, St. Louise, MI) skannattiin saada integroitua optiikkaa densitomery (IOD) käyttäen NIH Imager ohjelmisto. Keskimääräinen IOD proteiinia verrattiin välillä KO ja WT ryhmiä ja arvioidaan tilastollisen merkittävyyden opiskelijan

t

testiä ja p 0,05 pidettiin merkittävänä.

Antibodies.

Ensisijainen käytetyt vasta Western blottaus olivat: c-Met (1:500), fosfori-Met Tyr1234 /1235 (1:1000), EGFR (1:1000), fosfori-PDGFRα Tyr849 (1:1000), fosfori-IGFR (1:1000) kaikki Cell Signaling Technology; β-kateniinin (1:1000) BD Biosciences; PDGFRα (1:180), PDGFRβ (1:500), fosfo-EGFR (1:500), fosfori-PDGFRα Tyr720 (1:200), c-myc (1:200), PDGFA (1:200), PDGFB (1:200), PDGFC (1:200), fosfori-PDGFRα Tyr754 (1:200), Glutamiini Synthethase (1:200), ja GAPDH (1:1000) kaikki Santa Cruz Biotechnology; fosfo-PDGFRα Tyr572 /574 (1:800, Invitrogen); Sykliini D1 (1:200, Neomarkers); alfa sileän lihaksen aktiini (1:300, Abcam); ja β-aktiini (1:2000, Millipore).

Histologia ja immunohistokemia

Neljän mikronin leikkeitä parafiiniin upotettu maksakudoksissa käytettiin histologia ja immunohistokemiallisella värjäyksellä. Hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 0,05 pidettiin merkittävinä.

Immunohistokemiaa antigeeni haku saavutettiin sekä höyryllä ruoanlaitto tai keittämällä liukuu mikroaaltouuni sitraattipuskurissa 20 minuuttia tai 10 minuuttia, vastaavasti. Leikkeet inaktivoitiin endogeenisen peroksidia, tukossa ja inkuboitiin primaarisen vasta-aineen yön yli huoneen lämpötilassa tai yksi tunti huoneen lämpötilassa, pestiin ja inkuboitiin asianmukaisten biotiini-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen kanssa 30 minuutin ajan. Leikkeet pestiin, inkuboitiin ABC-reagenssia, pestiin ja inkuboitiin DAB. Leikkeitä seuraava vastavärjättiin Shandon hematoksyliinillä liuosta (Sigma) ja kansi putosi käyttämällä Cytoseal XYL (Richard Allen Scientific, Kalamazoo, MI). Negatiivisia kontrolli, ensisijainen vasta-aine oli jätetty pois protokollassa. Objektilasit näytettiin alle Axioskop 40 (Zeiss) pystyssä tutkimus mikroskoopilla ja digitaalisia kuvia saatu. Kollaaseja valmistettiin käyttämällä Adobe Photoshop CS4-ohjelmiston. PCNA ja TUNEL, positiivisten solut laskettiin neljällä satunnaisesti 400 × kentät viidessä edustaja maksat jokaisesta ryhmästä ja keskiarvoja verrattiin merkitys ryhmien välillä opiskelijan

t

testiä. P-arvo on vähemmän kuin 0,05 katsottiin merkitseväksi. Kvantitatiivista analyysiä β-catenin- ja PDGFRα-positiivisuus kasvaimissa, kaikki mikroskooppisen pesäkkeitä KO ja WT maksa arvioitiin. Jokainen kasvainkeskusten osoittaa soluliman ja /tai ydin- β-kateniinin värjäystä leimattiin olevan β-kateniinin-positiivisia ja kaikki pesäkkeet näytteille sytoplasmista värjäytymistä PDGFRα verrattuna ympäröiviin ei-kasvainta alueilla leimattiin olevan PDGFRα-positiivisia. Tämä mahdollisti meille mahdollisuuden laskea prosentteina β-kateniinin ja /tai PDGFRα-positiivisia kasvaimia kussakin ryhmässä sen jälkeen, kun DEN /PB hoitoon.

Soluviljely ja käsittely

Hep3B-solut (ATCC) kasvatettiin 100% konfluenssiin 10% FBS ja EMEM media. Solut trypsinoitiin ja maljattiin 6-kuoppaisille levyille, jotka sisälsivät 2 ml 10% FBS EMEM median ja seerumia yön yli. Transfektio suoritettiin käyttämällä esi-validoitu β-kateniinin ja ohjaus siRNA (Ambion) lipofektamiinin avulla kuten aiemmin on kuvattu [34]. 24 tuntia transfektion jälkeen solut käsiteltiin 10 ng /ml rekombinanttia PDGF-CC: llä (R & D systems) tai HCl: a (käytetään rekonstituutioon PDGF-CC) 4% väliaineessa, joka sisältää tritiumtymidiiniä. 24 tunnin jälkeen, väliaine heitettiin pois ja 1 ml 5% trikloorietikkahappoa (TCA), lisättiin kuhunkin kuoppaan ja levyt sijoitetaan 4 ° C: ssa 15 minuuttia. Solut pestiin, kuivattiin ja suspendoitiin 1 ml: aan 0,33 M NaOH: ssa 20 minuuttia, ja 300 ui koko seosta kustakin kaivosta lisättiin 3 ml: aan tuikenestettä, ja sitten laitetaan tuikelaskimessa.