Krooninen sairaus

tiivistelmä

polysialohappo (PSA), joka on α2,8- liittyy homopolymeeri N-asetyylineuramiinihapon (Neu5Ac), on kehityksellisesti säännelty ja sen ilmentyminen on ajateltu rajoittuvan muutamaan kudoksiin aikuisilla. Osoitimme äskettäin, että kaksi ihmispatogeenien ilmaistuna johdannainen PSA sisältävät de-N-asetyyli siaalihappotähteiden (NeuPSA). Tässä osoitamme, että epitoopin tunnistaa anti-NeuPSA monoklonaalinen vasta-aine, SEAM 3 (SEAM 3-reaktiivinen antigeeni tai S3RA), ilmentyy ihmisen melanoomat, ja myös solunsisäisesti ihmisen melanoomasolulinjan (SK-MEL-28), ihmisen T-solun leukemian solulinja (Jurkat), ja kaksi neuroblastooma solulinjoja (CHP-134 ja SH-SY5Y). SEAM 3 sitoutuminen indusoi apoptoosin neljässä testatut solulinjat. Epätavallinen solunsisäinen jakauma S3RA oli samanlainen kuin on kuvattu PSA polysialyltransferases, STX ja PST, joka ilmaistaan ​​myös neljä solulinjoissa käytetään tässä. Mielenkiintoista, tukahduttaminen PST mRNA: n ilmentymisen transfektoimalla SK-MEL-28-solujen PST-erityinen lyhyt häiritsevä RNA (siRNA) alensivat sauman 3 sitovia. Tulokset viittaavat siihen, lisätutkimuksia hyödyllisyyttä vasta-aineiden, kuten SEAM 3 terapeuttisina aineina tiettyjen pahanlaatuisten kasvainten.

Citation: Steirer LM, Moe GR (2011) Vasta-aine, De-N-asetyyli siaalihappomäärä sisältävät-Polysialic acid Tunnistaa solunsisäinen antigeeni ja indusoi apoptoosia ihmisen Cancer Cell Lines. PLoS ONE 6 (11): e27249. doi: 10,1371 /journal.pone.0027249

Editor: Roger Chammas, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, Brasilia

vastaanotettu: 18 elokuu 2011; Hyväksytty: 12 lokakuu 2011; Julkaistu: Marraskuu 9, 2011

Copyright: © 2011 Steirer, Moe. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Rahoitus oli tarjoamat NIH NIAID lupanumeroon AI064314 (www.niaid.nih.gov/Pages/default.aspx), NIH NCRR lupanumeroita CO6 RR-16226 ja S10RR025472 (www.ncrr.nih.gov), lastensairaala oksat, Inc. ( www.childrenshospitalbranches.org), NIH NHLBI T-32 5T32DK078514-09 (grants.nih.gov/training/nrsa.htm), Swim Across America San Francisco Bay Area (www.swimacrossamerica.org), ja Jennifer Leigh Wells Family (www.moonlight4meningitis.com/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

PSA muutos näyttää rajoittuvan muutamaan eläinproteiineja ja kapselipolysakkaridit on neuroinvasive bakteerit

Neisseria meningitidis

B-ryhmän (NMB) ja

E. coli

K1 [1]. Ihmisillä, PSA: n on osoitettu olevan läsnä hermosolujen adheesiomolekyyli (NCAM) [2], synaptic adheesiomolekyyli 1 [3], alfa-alayksikköä jänniteherkkää natrium- kanavan [4], integriini alfa-5-alayksikön [ ,,,0],5] scavenger-reseptori CD36 [6], neuropiliini-2 [7], ja PSA polysialyltransferases ST8Sia2 ja ST8Sia4, joka tunnetaan myös nimellä STX ja PST, vastaavasti [8]. NCAM on runsain polysialylated proteiinia, varsinkin sikiön kehitykseen, ja rooli polysialylation in NCAM toiminto on perusteellisimmin tutkittu [9]. NCAM polysialylation estää liiman ominaisuudet NCAM sallimaan solujen vaeltamiseen ja moduloida muiden NCAM toiminnot [9]. Aikuisilla hiirillä, PSA ilmentyminen rajoittuu muutamiin kudoksiin aivoissa, jotka osoittavat synaptisen plastisuus kuten hajukäämissä ja hypotalamuksen [9] ja voi olla rooli T-solujen kehitystä [10]. Jotkut ihmisen kasvaimista, mukaan lukien astrosytooma [11], pienisoluinen ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [12], multippeli myelooma [13], neuroblastooma [14], rabdomyosarkooma [15], ja Wilmsin kasvain [16] ilmaista PSA: n ja suhteellisen taso PSA ilmaisun joidenkin syöpien on liittynyt huonoon ennusteeseen [12], [17].

aikana rokotteiden kehittäminen ehkäisyyn aiheuttaman taudin NMB, huomasimme, että hiiren monoklonaalinen vasta-aine (mAb ) SEAM 3, joka on tuotettu immunisoimalla N-propionyylijohdannainen NMB kapselipolysakkarideja (N-Pr Mbps) -pohjaisen rokote [18], että PSA antigeenejä, jotka sisälsivät de-N-asetyloitu neuramiinihappo (Neu) jäämät [19] , [20], [21]. Läsnäolo Neu tähteiden N-Pr MBPS-tetanustoksoidi rokote oli tahaton sivutuotteena johtuvat epätäydellinen re-N-asylointi. Sen jälkeen, osoitimme, että neuramiinihappoa sisältäviä PSA (NeuPSA), kuten täysin de-N-asetyloitu PSA, oli immunogeeninen ja toi esiin vasta-aineita, jotka olivat suojaavat NMB ja NmC kantoja [19].

Vaikka NeuPSA ei ollut on kuvattu aiemmin ihmisillä, lyhyempi Neu sisältävät siaalihappoa antigeenejä (NeuSia), kuten gangliosidit oli raportoitu olevan läsnä joissakin ihmisen kasvaimissa, ja syöpäsolulinjoissa [22], [23], [24]. NeuSia antigeenejä ilmaistuna ihmisen kasvaimia ovat NeuSia variantit mono- ja disialylogangliosides GM3 ja GD3: a [22], [23], [24], [25], [26], vastaavasti. Hakomori ja työtoverit osoittivat, että NeuSia GD3 ilmentyy ihmisen epiteelikarsinoomasolulinja A431 oli voimakas aktivaattori epidermaalisen kasvutekijän reseptorin kinaasin Triton X-100-käsiteltyjä soluja [27], [28]. Tulos viittaa siihen, että NeuSia GM3 johdannainen voi olla rooli aktivoinnissa reseptorin polkuja, jotka edistävät solujen lisääntymistä. Käyttämällä radioaktiivinen leimaaminen kokeiluja melanoomasolulinjaan Varki ja työtoverit osoittivat, että N-asetyyliryhmiä gangliosideissä GD3 ja GM3 käännetään nopeammin kuin perusmolekyyleille, mikä viittaa olemassaolo NeuSia sisältävien gangliosidien näissä soluissa [25]. Äskettäin Popa et al eristetty ja rakenteellisesti ominaista NeuSia sisältäviä GD3 primäärisistä ihmisen melanooma kasvaimissa [26]. Koska jotkut syöpäsolut ilmentävät NeuSia antigeenejä, se herätti kysymyksen, onko enää NeuPSA modifioitua antigeenejä ilmentyy myös ihmisen syöpäsoluja. Seuraavassa tutkimme reaktiivisuus SEAM 3 normaalin ihmisen ihoon, ihon primaarinen ihmisen melanooma kasvaimissa ja useissa ihmisen syöpäsolulinjoja, mukaan lukien leukemia, melanooma, ja neuroblastoomasoluja, ja toiminnallinen aktiivisuus SEAM 3 näitä syöpäsolulinjoja.

tulokset

erityisyys mAb SEAM 3

Olemme aiemmin osoittaneet, että SEAM 3 on reaktiivinen erilaisia ​​Neu sisältävien oligosialic happoa (OSA) /PSA johdannaiset [18], [19], [20]. Määritellä spesifisyyden SEAM 3 nähden NeuOSA /PSA antigeenejä todennäköisesti ilmaistaan ​​luonnollisesti (esim. N-asetyyli-johdannaisia ​​sisältävät), valmistimme osittain de-N-asetyloitu johdannaiset OSA miedolla emäskäsittelyllä puhdistettua oligosakkarideja, joilla on polymerisaatioaste (DP) 2, 3, ja 4. keskimääräinen määrä Neu määritettiin käyttäen muunnettua resorsinolia määritys, jolla voidaan mitata määrän neuramiinihappoyhdiste (Neu) ja N-asetyylineuramiinihapon (Neu5Ac) PSA [19] . Sen jälkeen kun lievä emäskäsittelyssä oligosakkaridit sisälsi -25% Neu ja osa oli hajoamista pidempään oligosakkaridit, että trimeeri sisälsi sekä dimeerejä ja trimeerejä ja tetrameerin sisälsi dimeerit ja tetrameerejä. Suhteellinen kyky oligosakkaridien inhiboida SEAM 3 nimellinen N-Pr Mbps-antigeeni määritettiin ELISA: lla. Tulokset on esitetty yhteenvetona taulukossa 1. pitoisuudet oligosakkaridin, joka tarvitaan inhiboimaan SEAM 3 sitovat ovat ylärajoilla, koska valmisteet sisältävät seoksen lyhyempi oligosakkaridien lisäksi pisin merkitty DP. Lisäksi, numero annetaan DP ei oteta huomioon mahdollista vähentää C2 karbonyyliryhmä pelkistävän pään tähde, joka on tarpeen estää hajoamisen aikana emäskäsittely. Myös näiden seikkojen oligosakkarideja, jonka DP on 4 olivat parhaat estäjät SEAM 3 sitovia. Kyky oligosakkaridien estää SEAM 3 sitoutuminen ei vaikuta inkuboimalla niitä pH: ssa 5 kanssa tai ilman exoneuraminidase 37 ° C: ssa 48 tunnin ajan (tuloksia ei ole esitetty). Hoidot rikastuttaa oligosakkaridien ketjuja, on Neu Muiden kuin vähentää lopussa [19]. SEAM 3 sitoutuminen ei inhiboinut läheistä sukua MCPS (ts. Poly α2,9 N-asetyylineuramiinihappo) joko silloin, kun täysin N-asetyloitu tai sisältävät de-N-asetyloitu tähteet (taulukko 1). Yhdessä voimme päätellä, että SEAM 3 tunnistaa oligo tai polysialohappo johdannaiset, jonka DP on 4 tai suurempi, jossa on noin joka neljäs jäännös on Neu, joka voi sijaita ei-pelkistävässä päässä tai sisäinen asemissa polymeerin (kuvio 1 ).

immunohistokemiallinen (IHC) värjäys normaalista ihmisen ihon ja primäärisen melanooman kasvaimia

normaaleissa kudoksissa, de-N-asetyyli GD3 oli kuitenkin ilmaisi ”at alhainen muutaman verisuonissa, soluttautuminen mononukleaarisia soluja ihon ja paksusuolen ja kohtuullisella tasolla ihossa melanosyyttien ”[22]. Korkeammalla ilmaistiin ihosyövän [22]. PSA-NCAM ilmentyy laajalti endodermaalinen, mesodermal, ektodermaalinen ja neuro-ektodermaalinen peräisin kudoksia eri vaiheissa sikiön kehitykseen, mutta ilmentyminen aikuisilla on rajoittunut muutamaan aivoalueilla näytteille hermoston plastisuus [29]. Sen määrittämiseksi, onko antigeenejä reaktiivinen SEAM 3 ilmaistiin normaalin ihmisen ihon ja ensisijainen melanoomat, suoritimme IHC jäällä ja formaliinilla kiinnitetyt parafiiniin upotetut kudosnäytteet. MAb R24 käytettiin merkitä GD3. Chammas et ai., Ovat raportoineet, että formaliinikäsittely kudosnäytteiden voi aiheuttaa muutoksia de-N-asetyyli GD3 aminoryhmät formaldehydin kanssa, aiheuttaen reaktiivisuus anti-de-N-asetyyli-GD3-mAb: t [22]. Lisäksi, IHC värjäys läsnäolo GD3 formaliiniin parafiiniin upotettu kudosten näytteet on kuvattu olevan herkkä menetys anti-GD3 reaktiivisuus seurauksena antigeenin takaisinperintämenettelystä [30]. Löysimme kunkin värjäyskuviot havaittu kunkin mAb testattiin oli samanlainen riippumatta siitä, mitä menetelmää käytettiin valmistettaessa näytteitä, paitsi että värjäys väheni jonkin verran jäädytetty, tallentamattomiin yksilöitä verrattuna parafiiniin, formaliinilla kiinnitetyt kudokset. Lisäksi se oli vaikeampi saada suuria, katkeamaton osa kudoksen korjaamatta yksilöitä. Koska vahvistamisesta näytteet johtivat ylivoimainen säilyttäminen kudoksen rakenteen ja suuremman herkkyyden värjäys, ainoastaan ​​käyttäen saadut tulokset kiinteitä kudoksia on esitetty.

IHC värjäystä kiinteän normaalin ihmisen ihon osoittaa, että SEAM 3 pistettä solujen levyepiteelin epiteelin ja tunkeutuvia lymfosyyttejä (kuvio 2A), kun taas negatiivinen kontrolli merkityksetön hiiren IgG2b ja IgG3-mAb: t eivät osoittaneet reaktiivisuutta. Sitä vastoin anti-GD3-mAb oli reaktiivinen vasta antigeenien muutaman melanosyyttejä normaalissa ihossa (kuvio 2A, esimerkiksi nuolella). SEAM 3 värjäys näytti olevan pitkälti sytoplasman erottuva rakeinen. SEAM 3 sitoutumista antigeenien normaalin ihon voitiin estää enemmän kuin 90%, kun mAb: tä esi-inkuboida N-Pr Mbps (50 ug /ml). N-Pr Mbps on polysakkaridi-antigeeni, jota käytetään tuottamaan SEAM 3 [18]. Tulos osoittaa, että SEAM 3 sitoutuminen välittyy vasta-aineen.

IHC-analyysi SEAM 3 ja anti-GD3 sitoutumisen normaaliin ihmisen ihoon (A) ja primäärisen melanooman (B). Formaliinifiksoidusta normaali ihosta (A) ja primäärisen melanooman (B) inkuboitiin merkityksetön IgG2b, SEAM 3, SEAM 3 polysakkaridin kanssa estäjän N-Pr Mbps, merkityksetön IgG3, ja anti-GD3-mAb R24 esitetyllä. Sitoutuminen havaittiin käyttäen DAB, joka tuottaa ruskean sakan. Counterstaining suoritettiin käyttäen hemotoksyliinillä. Nuolta mikroskooppikuva SEAM 3 sitoutumisen normaali iho näyttää esimerkin SEAM 3 merkinnän tunkeutuva lymfosyytti- ja anti-GD3 micrograph, melanosyyttejä. Viite baaria = 40 um.

tumma värjäys melanooman näytteen tuloksena SEAM 3 sitoutumisen (kuvio 2B) osoittaa, että S3RA antigeenejä ilmennettiin kasvain. Kuten normaali iho, SEAM 3 sitoutuminen antigeeneihin melanooman näyte inhiboi liukoisen N-Pr Mbps (kuvio 2B). Voimakas värjäytyminen melanooman näytteen viittaa siihen, että S3RA ilmaistiin korkeammalla tasolla kasvain verrattuna normaaleihin epiteelisoluihin. Kaikki kasvainsolujen sisällä osassa, joka oli mitat ovat noin 1 cm x 2 cm, värjättiin. Sitä vastoin anti-GD3-mAb osoittivat heterogeeninen sitoutumisen kasvainkudokseen joidenkin solujen merkitty mAb, kun taas toiset eivät osoittaneet mitään värjäytymistä (kuvio 2B).

lisäksi esimerkiksi primaaristen ihmisen melanooma on esitetty kuviossa 2B , joukko 12 pienempää ensisijainen ihmisen melanooman otettujen yksilöiden ihon, ruokatorven, korvasylkirauhasen, ja peräsuolen kasvaimet arvioitiin SEAM 3 ja merkityksetön IgG2b reaktiivisuus IHC. Kaikki melanooma näytteet array olivat reaktiivisia SEAM 3, kun taas merkityksetön IgG2b mAb ei osoittanut mitään reaktiivisuutta (tuloksia ei ole esitetty). Värjäytymisen intensiteetti tuloksena SEAM 3 sitovia melanoomakasvaimen array oli samanlainen kuin esimerkissä on esitetty kuviossa 2B. Näytteet normaali iho otettujen alueiden vieressä joitakin ihosyövän jotka sisältyivät näytteen jono oli samat rakenteessa SEAM 3 reaktiivisuus kuin kuviossa 2A normaalin ihon (tuloksia ei ole esitetty).

Expression ja S3RA syöpäsolulinjoissa

koska de-N-asetyyli siaalihappoa sisältävien johdannainen disialyloganglioside GD3 on raportoitu olevan läsnä melanoomasolulinjoja [24] sekä primaaristen ihmisen kasvaimissa [26 ], ja olemme havainneet, että SEAM 3 on reaktiivinen ensisijainen melanoomia (kuvio 2B), suoritimme virtaussytometria mittaamiseksi SEAM 3 sitovaa neljä ihmisen syövän solulinjat, jotka ilmentävät erilaisia ​​Sia sisältävät antigeenejä (taulukko 2).

Kuvio 3 esittää sitoutumisen alaluokan vastaavan epärelevantin mAb IgG2b verrattuna sauma 3, anti-GD3-mAb R24 ja anti-NCAM (CD56) mAb sitoutumisen SK-MEL-28 melanooma ja SH-SY5Y neuroblastooma solujen poissa ollessa ja läsnä Triton X-100 käsittelyä, kuten on osoitettu. Gates määritellään soluja sitoutumiselle positiivisina asetettiin käyttäen alaluokkaan Hyväksytty isotyyppikontrolleja ja on merkitty kunkin histogrammin kuvassa 3. Koska pesuainetta, 29% SK-MEL-28-solut olivat positiivisia SEAM 3 sitoutumiseen verrattuna 80% anti-GD3 ja 3% varten merkitystä mAb. Kuitenkin, kun solut on tehty läpäisevä mAb: t pesuaineella hoito, 82% SK-MEL-28-soluja oli positiivisia SEAM 3 sitovia ja suhteellinen fluoresenssi kasvoi yli 10-kertaiseksi. Prosenttiosuus anti-GD3 positiivisten solujen kasvoi hieman 92%. Sitovat anti-NCAM mAb oli verrattavissa merkitystä IgG1-mAb: n läsnä ollessa tai detergentin poissa ollessa, ja näin ollen N-CAM ei ollut esitetty SK-MEL-28-soluihin. SH-SY5Y-solulinjan, 20% ei-pesuaineella käsitellyt solut olivat positiivisia SEAM 3 sitovia, joka kasvoi 96%, kun läsnä on detergenttiä (kuvio 3). Lisäksi suhteellinen fluoresenssi kasvoi yli 10-kertaiseksi. Suurempi kuin 85% SH-SY5Y solut olivat positiivisia anti-NCAM ja alle 21% anti-GD3 sitova molemmissa ehjät tai läpäiseviksi soluja. Tulokset esitetään yhteenvetona taulukossa 3 neljän solulinjat osoittavat, että positiivisten solujen prosenttiosuuden ja SEAM 3 sitovia ja keskimääräinen fluoresenssi-solujen oli vaihteleva joukossa testatuissa solulinjoissa. Kuitenkin ehjät solut kunkin solulinjan olivat pääosin negatiivisia sauman 3 sitovia. Sen sijaan lähes kaikki solut kunkin solulinjan sisälsi solunsisäisiä SEAM 3-reaktiivisen antigeenejä (S3RA). Hallitseva solunsisäinen jakautuminen S3RAs ei vastannut jakeluun GD3 tai PSA-NCAM, joka pääasiassa paikallisia solun pinnalla. Tulos viittaa siihen, että S3RAs eivät de-N-asetyyli Sia johdannaisia ​​joko GD3 tai PSA-NCAM tai että solunsisäinen kollegansa näiden molekyylien eivät olleet reaktiivisia vastaavien mAbien.

SK-MEL-28 ja SH -SY5Y solut olivat joko käsittelemättömiä havaitsemaan pinnalle sitoutumisen (ylempi paneeli jokaisen sarjan kaksi paneelia), tai niitä käsiteltiin Triton-X 100 havaita solunsisäistä sitoutumisen (alempi paneeli) virtaussytometrialla. Soluja inkuboitiin 5 ug /ml kutakin primaarisen vasta-aineen, jota seurasi inkubointi 2 ug /ml Alexa Fluor 488-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineella. Merkityksetön hiiren IgG2b, IgG3, ja IgG1: n mAb: t käytettiin negatiivisten kontrollien SEAM 3, anti-GD3, ja anti-NCAM, vastaavasti, ja niitä käytetään määrittämään perustason fluoresenssi. Sitoutuminen havaittiin käyttämällä guava EasyCyte virtaussytometriä. Gates käytetään määrittelemään positiivisten solujen sitoutumisen on osoitettu yläreunassa kunkin histogrammin.

spesifisyyden osoittamiseksi sitoutumisen, kiinteiden ja permabolized Jurkat tai SK-MEL-28-soluja inkuboitiin SEAM 3 puuttuessa ja läsnä ollessa N-Pr Mbps estäjä. Toisin kuin kiinteä kudosnäytteet kuitenkin suhteellisen suuria pitoisuuksia SEAM 3 (5 ug /ml), yhdessä liukoisen N-Pr Mbps estäjä tuottanut epäselviä tuloksia. Joissakin kokeissa osittainen esto havaittiin mutta toisissa polysakkaridia estäjän jossa ei ollut vaikutusta tai lisännyt sitoutumisessa. On mahdollista, että muuttuja lisäämisen vaikutuksia N-Pr Mbps sitovaan reaktio johtui taipumuksesta NeuPSA johdannaisten läsnä N-Pr Mbps valmiste muodostaa aggregaatteja, jotka ovat liian suuria paeta läpäiseviksi soluja tai että solut ovat reseptorit for NeuPSA että myös sitoutuvat N-Pr MBPS.

fluoresenssimikroskopia.

Immuno-fluoresenssimikroskopiaan (IFM) käytettiin edelleen tutkia solun sijainnin SEAM 3-reaktiivisia epitooppeja pesuainetta käsittelemättömän ja käsiteltiin SK-MEL-28 ja CHP-134-solujen (kuva 4). Tulokset virtaussytometrialla sitovia kokeita SK-MEL-28-soluja ei ole käsitelty tai niitä käsiteltiin pesuaineella (kuvio 3) viittasi siihen, että SEAM 3 reaktiivisia epitooppeja oli solusijaintipaikasta, joka oli erilainen kuin GD3 ja PSA-NCAM. Yhdenmukainen nämä tulokset, vain osa SK-MEL-28 ja CHP-134 soluja ei käsitelty pesuainetta olivat reaktiivisia SEAM 3 by IFM (punainen fluoresenssi kuvassa 4). Kuten on esitetty kuviossa 4, SK-MEL-28-soluja, jotka olivat kaikkein reaktiivisia SEAM 3 oli ”pyöristetään” solut, joissa on suhteellisen kondensoidaan tuman DNA, kuten on esitetty DAPI-värjäyksellä. Pitkänomainen solut olivat vähemmän reaktiivisia SEAM 3 (vertaa SK-MEL-28 solujen valomikroskooppikuvan kuvassa 4 IFM). Sitä vastoin anti-GD3 leimattua kaikki solut (vihreän fluoresenssin kuten on esitetty kuviossa 4). Kuitenkin, kun SK-MEL-28-soluja käsiteltiin pesuainetta, kaikki solut olivat positiivisia SEAM 3 sitoutumisen (kuvio 4). Pesuaine-käsiteltyjä soluja, SEAM 3 reaktiivisuus hajallaan sytoplasmaan rakeen-rakenteita (kuvio 4, esimerkiksi osoitettu nuolella). Anti-GD3 reaktiivisuus leimasi hajanainen värjäysmallia täplät väkevää reaktiivisuus sekä käsittelemätöntä ja pesuaineella käsiteltyjä soluja (kuva 4). Oli jonkin verran kolokalisaation ilmi komposiitti kuvia SEAM 3 ja anti-GD3-leimattua soluja (keltainen kuvassa 4), mutta selviä eroja samoin. Näin ollen, SEAM 3 reaktiivisuus ei korreloi suoraan GD3 muut kuin satunnaisesti lokalisointi kalvon läsnä ollessa tai ilman pesu- ja ilmentymisen S3RAs oli rajoitettu osajoukko soluja.

Light mikroskooppikuvia SK-IMEI 28 ja CHP-134 esittävät yleisestä muodosta solujen tuman DNA merkitty sinisellä. Anti-NeuPSA mAb SEAM 3 sitovia (punainen) ja SK-MEL-28 ja CHP-134-solujen ei ole käsitelty tai niitä käsiteltiin Triton X-100: permeablize soluja, verrattiin anti-GD3 ja PSA vihreä, kuten . Solunosasijaintia S3RA SK-MEL-28-solujen Golgi (Giantin, golgin 97 ja Tuba) ja ER (kalneksiini) markkereita näkyvät alapaneelin keltaisella. Nuolet osoittavat rakeinen vesicular kaltaisia ​​rakenteita suhteellisen voimakas sauman 3 värjäystä. Viite viivoilla = 20 pm.

CHP-134-solut, SEAM 3-reaktiivisia epitooppeja (punainen fluoresenssi kuvassa 4 CHP-134 soluja kuten) pääosin paikallistettu rajojen kosketus solujen välillä. PSA antigeenejä, kuten havaitaan anti-PSA-mAb 2-1-B [31] (vihreän fluoresenssin kuviossa 4, kuten on osoitettu), myös sijaitsevat pääasiassa alueilla, solu-solu-kontakti. Vaikka fluoresenssin tuloksena SEAM 3 sitoutuminen oli pienempi, niin suhteellinen intensiteetti ja jakelu fluoresenssin tuloksena anti-PSA-sitoutuminen on samanlainen kuin SEAM 3 ehjien solujen, kuten on esitetty keltaisella värillä johtuvat päällekkäisyys punainen ja vihreä fluoresenssi komposiitti kuva (kuvio 4). Tämä oli osoitus SEAM 3-merkittyä antigeeniä on sijoitettu solun pinnalla. Lisäksi SEAM 3 merkintöjä korreloi anti-PSA-merkintää (Mandersin kerroin vihreä = 0,998) ja vähemmässä määrin anti-NCAM merkinnät (Mandersin kerroin raakana = 0,642; micrographs ei kuvassa) joko poissa tai läsnä Triton X-100. Kuitenkin, kun solut käsiteltiin pesuaineen oli vähemmän päällekkäisyyttä SEAM 3 ja anti-PSA-merkinnät (merkitty suhteellisesti suurempi määrä punaisen fluoresenssin pesuaineen käsitelty komposiitti mikroskooppikuva), mikä viittaa siihen, että kyseessä oli osa antigeenejä tunnustettu mAb yhteisiä ja erillisiä antigeenejä kirjataan erikseen.

Koska SK-MEL-28-solujen enemmistö antigeenien kanssa reagoivia SEAM 3 sijaitsi rakeisen rakenteita solujen sisällä, teimme IFM käyttämällä markkereita Golgin ja solulimakalvostoon ( ER) onko SEAM 3 reaktiivisuus liittyi kyseisiä subsellulaarisista organelles. Golgin markkereita mukana Giantin ja golgin-97 cis /mediaalisen ja trans-Golgin kalvoja vastaavasti ja Tuba, monikäyttöinen proteiinin ajatellaan liittyvän säätelyssä soluliitos ja endosyyttisissä kaupan [32] ja Golgi-johdettujen rakkuloiden sytoplasmassa [33] . Kalneksiini, molekyyli- kaperoniproteiinina käytettiin ER markkeri [34]. Kuten on esitetty läsnäolo tai puuttuminen keltaisen fluoresenssin komposiitti kuvia, SEAM 3 oli olennaisesti samassa paikallistaa Golgin ja ER (kuten kuviossa 4) markkereita. Co-lokalisointi analysoitiin edelleen käyttämällä JACoP [35] Image J. Kaikki Golgin ja ER markkereita havaittiin olevan korkea rinnakkaispaikantumisen varten markkeri vs. SEAM 3 (Mandersin kertoimet vihreitä kaikille yli 0,92) ilmeisiä jakelu S3RAs ulkopuolella organelles samoin. Lähin yleinen rinnakkaispaikantumisen oli välillä SEAM 3 ja Tuba, kuten on esitetty kuviossa 4. Näin ollen, NeuPSA antigeenit havaitaan käyttäen SEAM 3 lähinnä sijaitseva solujen sisällä ja liittyy Golgin, ER ja soluväliaineen, mutta ne olivat myös läsnä pinnalla alaryhmien kustakin solulinjasta.

ilmentäminen polysialyltransferases PST ja STX syöpäsolulinjoissa

neuroblastoomasolu- linjat CHP-134 ja SH-SY5Y tiedettiin ilmaisemaan korkeita PSA muodossa PSA -NCAM, kun taas Jurkat ja SK-MEL-28-soluja ei tiedetä ilmaista PSA tai NCAM. Koska NeuPSA on todennäköisesti peräisin PSA, mittasimme ilmentymisen α2,8 polysialyltransferases ST8Sia2 (STX) ja ST8Sia4 (PST) mRNA: n neljän solulinjoissa kvantitatiivisella PCR: llä. SH-SY5Y-solujen on osoitettu ilmentävän sekä STX ja PST [36], ja niitä käytettiin vertailussa STX ja PST ekspressiota muita solulinjoja. Käyttämällä absoluuttisia, päätimme STX ilme oli korkein SH-SY5Y soluja, 1,2 x 10

6 kopiota /1 x 10

7 kappaletta GAPDH (kuva 5). CHP-134 esittänyt vastaavia tasoja STX, kun SK-MEL-28-soluissa ilmaisivat lähes 100-kertaisesti vähemmän ja Jurkat-solut ilmaisivat lähes 1000 kertaa vähemmän STX. SH-SY5Y solut ilmensivät vähiten PST verrattuna muihin kolme solua riviä, jossa 9,0 x 10

2 kopiota /1 x 10

7 kappaletta GAPDH. CHP-134, SK-MEL-28, ja Jurkat-solut ilmensivät 60, 140, tai 550-kertaisesti enemmän PST, vastaavasti, verrattuna SH-SY5Y-soluja (kuva 5).

1 ug kokonais-RNA: kukin solulinja käänteiskopioitu cDNA, käytetään sitten templaattina qRT-PCR-reaktiossa. MRNA kopioida useita STX, PST, ja GAPDH määritettiin standardikäyrästä sarjaan laimenna standardien esitetään kaaviossa kohde-mRNA kopiota 10

7 GAPDH mRNA kopiota. Virhe palkit ovat SEM kolminkertaisten mittausten kolmesta itsenäisestä populaatioiden kunkin solulinjan.

Riippuvuus SEAM 3 reaktiivisuus SK-MEL-28-soluissa ilmentymistä koskevat polysialyltransferase PST

Osoittaakseen, että SEAM 3 on reaktiivinen antigeeni, joka on peräisin PSA, me tutkimme, ekspression inhiboimiseksi polysialyltransferase PST mRNA SK-MEL-28-solujen PST-erityisiä sirna (siRNA) johtaisi vähenemiseen SEAM 3-positiivisten solujen virtaussytometrialla. Negatiivinen kontrolli salattu siRNA tai PST erityisiä-siRNA transfektoitiin SK-MEL-28-soluissa ja 72 tunnin kuluttua, suhteellinen määrä (RQ) PST läsnä pieneni merkitsevästi (P ​​ 0,0001) soluissa transfektoitu PST siRNA (RQ = 0,124) verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu negatiivinen kontrolli siRNA (RQ = 1) (kuvio 6).

SK-MEL-28-soluja transfektoitiin väliaikaisesti 50 nM siRNA: ssa 72 tunnin ajan kolmena kappaleena ja sitten kokonais-RNA: ta kustakin solulinja käänteiskopioitu cDNA: n ja käytettiin templaattina qRT-PCR-reaktiossa. Suhteellinen kvantitointi määritettiin käyttäen vertailevaan CT menetelmä, normalisoitu GAPDH-mRNA: n.

Tässä kokeessa vain osajoukko soluja, jotka on transfektoitu ja siRNA tyhjentynyt ennestään PSA johdannaisia ​​voidaan odottaa näyttämään kuolleen reaktiivisuus SEAM 3 jos antigeeni reaktiivinen mAb riippui aktiivisuudesta PST. Näistä rajoituksista huolimatta, kolmessa erillisessä kokeessa, jossa on kaksi suoritettiin kolmena rinnakkaisena, osa SEAM 3-positiivisten solujen merkittävästi vähentynyt transfektoiduissa soluissa PST siRNA verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu salattu siRNA (taulukko 4). Tulos osoittaa selvästi, että antigeenit SEAM 3 SK-MEL-28-solut olivat riippuvaisia ​​ilmaus PST.

Sytotoksinen toiminnallinen aktiivisuus SEAM 3 syöpäsoluja vastaan ​​

funktio S3RA soluissa ei tunneta. Sen määrittämiseksi, mikä vaikutus häiritä toimintaa S3RA ilmentyy solun pinnalla saattaa olla soluja inkuboitiin yön yli SEAM 3: mAb pitoisuuksina, joita käytetään sidonta-tutkimuksissa on kuvattu edellä. Alle mikroskooppinen tutkimus, solut esillä ominaisuudet apoptoosin (tuloksia ei ole esitetty). Tämän perusteella havainnon, käytimme kaksi riippumatonta määrityksissä mittaamaan vaikutusta SEAM 3 elinkelpoisuudesta neljän solulinjojen: virtaussytometria kanssa ViaCount reagenssilla ja laktaattidehydrogenaasin (LDH) vapautumisen määrityksellä. Ensimmäinen perustuu kalvon läpäisevä ja läpäisemätön DNA: ta sitovan fluoresoivia väriaineita ja LDH-määritystä vapauttamisesta LDH johtuva menetys kalvon eheyden. Tulokset, jotka koskevat pitoisuudesta riippuva vaikutus SEAM 3 elinkelpoisuuden neljän solulinjojen 16 tunnin kuluttua inkuboinnin käyttäen LDH-määritystä on esitetty kuviossa 7A. Puhdistettu SEAM 3 oli sytotoksinen vastaan ​​neljä solulinjoja testattu, mutta vaikutus oli vaihteleva kunkin solulinjan. Jurkat-solut olivat herkkiä sauma 3 välittämää vasta-riippuvaista sytotoksisuutta (ADC), kun SK-MEL-28-solut olivat vähiten herkkä. Noin 45% Jurkat-solujen ja 25% SK-MEL-28, CHP-134, ja SH-SY5Y solut tapettiin korkeimmalla SEAM 3 testattu pitoisuus. SEAM 3 sytotoksisuus näytti tasoittuvan kiinteällä osa soluista. Esimerkiksi ADC vastaan ​​Jurkat ja SH-SY5Y solut välittävät SEAM 3 lähestyi enintään noin 10 ug /ml SEAM 3 vain marginaalinen kasvu tappaen 20 ug /ml (kuvio 7A). Tulokset saattavat johtua siitä, että sekä solujen lukumäärä ja määrä S3RA ilmaistaan ​​solujen vaihteli välillä solulinjoja (katso taulukko 3), ja että antigeenin määrä pysyy suhteellisen vakiona solujen populaatio yli 16 tunnin ajan ajanjakso. Tulokset ovat samankaltaisia ​​kuin kuviossa 7A esitetty, saatiin käyttämällä guava ViaCount määrityksessä (tuloksia ei ole esitetty). Spesifisyyden osoittamiseksi SEAM 3 ADC toimintaa, yritimme estää tappamisen liukoisen N-Pr Mbps. Kuitenkin esto koe sekoitti koska liukoisen N-Pr MBPS otettiin mukaan eläviä soluja johtaen merkittävään kasvuun ilmaus S3RA (BT Hagen ja GR Moe, julkaisematon).

(A), vasta-aine riippuvainen sytotoksisuus SEAM 3 vastaan ​​SK-MEL-28, CHP-134, SH-SY5Y, ja Jurkat-solut mitattuna LDH vapautumisen määrityksellä. Kukin solulinja inkuboitiin kasvavilla pitoisuuksilla SEAM 3 16 tuntia. LDH: n vapautuminen mitattiin ja prosenttia sytotoksisuus määritettiin käyttäen spontaani vapautuminen ja maksimaalinen vapautuminen hoidon jälkeen Triton X-100. (B), analyysi SEAM 3 välitteistä apoptoosia vastaan ​​SK-MEL-28 melanoomasoluja virtaussytometrialla. SK-MEL-28-soluja inkuboitiin merkityksetön IgG2b mAb (5 ug /ml), DMSO, 0,1 uM Staurosporiini, tai 5 ug /ml SEAM 3 12 tai 24 tuntia. Sitten solut värjättiin fluoresoivasti leimattu anneksiini V ja propidiumjodidi ja osa elävää (avoimet pylväät), apoptoottiset (cross-viivoitetut pylväät), ja kuolleet solut (mustat palkit) mitattiin virtaussytometrialla.

SEAM 3 sitovia indusoi apoptoosin Jurkat ja SK-MEL-28-solujen

Voit selvittää SEAM 3 sytotoksisuutta johtui apoptoosin Jurkat ja SK-MEL-28-soluissa, vertasimme vaikutus SEAM 3 sitoo solujen vaikutuksesta staurosporiinin, yleinen inhibiittori, joka on klassinen apoptoosin indusoija [37]. Esimerkissä on esitetty kuviossa 7B, SK-MEL 28 soluja inkuboitiin 12 ja 24 tuntia merkityksetön mAb, DMSO, staurosporiinia tai SEAM 3, ja useita live, apoptoottisten ja kuolleet solut kvantitoitiin käyttäen virtaussytometristä määritystä että mitataan ulkonäkö fosfatidyyliseriinin solun pinnalla kautta anneksiini V: n sitoutumisen ja DNA-pitoisuus propidiumjodidilla värjäys. Kuten on esitetty kuviossa 7B, käsittelemällä SEAM 3 tai staurosporiinin lisäsi prosenttia apoptoottisten ja kuolleet solut sen jälkeen, kun 12 tuntia ja 24 tuntia verrattuna IgG2b ja DMSO valvontaa, vastaavasti. Tulokset Jurkat-soluja inkuboitiin 10 ug /ml SEAM 3 olivat samanlaisia ​​kuin on esitetty SK-MEL 28 solujen kuviossa 7B (tuloksia ei ole esitetty).

Keskustelu

tiedetään vähän ilmaus de-N-asetyyli siaalihappoa sisältäviä antigeenejä normaaleissa tai sairaat ihmisen kudoksia. Tutkimukset mennessä julkaistut ovat esittäneet näyttöä ilmaus gangliosidien GM3 ja GD3 sisältäviä Neu joissakin syöpäsolun linjat ja Neu sisältävien GD3 primaarisissa ihmisen melanooman kasvaimia [23], [24], [26]. Laboratoriossamme ovat osoittaneet, että NMB kannat ja alkueläinloinen

Leishmania suuria

näihin NeuPSA [19], [20], [38], [39], joita ei ole kuvattu aiemmin tahansa organismista.