Krooninen sairaus

tiivistelmä

Eturauhassyöpä (PCA) on yleisin syöpätyyppi löytyy miehillä ja yksi johtavista syistä syövän kuolema länsimaissa. Esillä olevassa tutkimuksessa vertasimme yksittäisen proteiinin ilmentymisen kuviot histologisesti tunnettu PCa ja ympäröivän hyvänlaatuinen kudokseen saadaan ohjeen mikro leikkely käyttäen erittäin herkkiä kaksiulotteista ero geelielektroforeesilla (2D-DIGE) yhdistettynä massaspektrometrialla. Proteomic tiedot paljastivat 118-proteiinin paikkoja ilmentyä erilailla syöpä (n = 24) verrattuna hyvänlaatuinen (n = 21), eturauhasessa. Nämä paikat analysoitiin MALDI-TOF-MS /MS ja 79 eri proteiineja tunnistettiin. Käyttämällä Pääkomponenttianalyysin voisimme selvästi erillisiä kasvain ja normaali kudos ja kaksi erillistä kasvain ryhmään sen perusteella proteiinin ilmentymisen kuvio. Käyttämällä systeemibiologian lähestymistavan, voisimme kartta monet näistä proteiineista sekä suuriin reittejä mukana PCa etenemiseen sekä ryhmään mahdollisia diagnostisia ja /tai prognostisia markkereita. Johtuen monimutkaisuuden voimakkaasti verkottunut lyhin polku verkossa, toiminnalliset sub verkkoihin paljasti joitakin mahdollisia ehdokas biomarkkereiden proteiineja lisävalidointia. Käyttämällä systeemibiologiaan lähestymistapa, meidän Tutkimus osoitti uusien proteiinien ja molekyylien verkostoja on muuttunut ilme PCA. Edelleen toiminnallinen validointi yksittäisten proteiinien on käynnissä ja voi tarjota uusia oivalluksia PCA eteneminen saattaa johtaa suunnitteluun uusien diagnostisten ja hoitostrategioita.

Citation: Ummanni R, Mundt F, Pospisil H, Venz S, Scharf C , Barett C, et ai. (2011) tunnistaminen kliinisesti merkittävää proteeinikohteet in Eturauhassyöpä 2D-DIGE kytkettyä massaspektrometriaa ja systeemibiologian Network Platform. PLoS ONE 6 (2): e16833. doi: 10,1371 /journal.pone.0016833

Editor: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australia

vastaanotettu: 30 elokuu 2010; Hyväksytty: 16 tammikuu 2011; Julkaistu: 11 helmikuu 2011

Copyright: © 2011 Ummanni et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Saksan liittovaltion opetus- ja tutkimuksen puitteissa Ohjelma Medical Genome Research (Avustukset: 01GS0890, 01GS0892, 01GS0189). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on tällä hetkellä johtava syöpä miehillä länsimaissa [1]. Ruumiinavaus tutkimukset ovat osoittaneet, että noin 30% miehistä yli 50-vuotiaat ja 80% miehistä heidän 70s on mikroskooppinen näyttöä eturauhassyövän [2], [3]. Vuonna 2007 Yhdysvalloissa arviolta 218890 uutta tapausta diagnosoidaan ja 27050 miestä kuoli Eturauhassyövän [4]. The (varhainen) havaitsemismäärä ja siten ilmaantuvuus PCa on kasvanut voimakkaasti johtuen käyttöönoton PSA. Kuitenkin seerumin PSA näytteille joitakin merkittäviä rajoituksia, kuten kohonneet tiiviisti korreloivat sekä liikakasvu ja syöpä.

Kaksi-geelielektroforeesi (2DE), tehokas työkalu, jota käytetään proteiinien erottamiseen ja ilmaisun profilointi on yksi ydintekniikoihin Proteomiikassa [5], [6]. Proteiinin ilmentymisen analyysi potilaan materiaalit ovat informatiivisia johti tunnistaa syövän markkereita diagnosointiin, hoitotavoitteet ja on perusta paljastavat erilaisten sellulaaristen tapahtumien liittyy syövän etenemiseen [7]. Tähän mennessä useat tutkimusryhmät ovat jo suorittaneet proteiinin ja geeniekspressioprofilointi tutkimuksia kirurgisten ja koepala PCa näytteet [8] – [12], mutta suurin osa mahdollisista raportoitu markkereita ei kliinisissä hakemus lopullisen diagnoosin Eturauhassyövän. Kuitenkin aiemmat tutkimukset keskityttiin yksilöiden välisiä vertailuja proteomiikka analyysi radikaalin prostatectomies syöpäpotilaista niille ei syöpäpotilaiden tavanomaisella 2DE. Yksilökohtainen analyysi kasvain ja hyvänlaatuinen kudosnäytteet (vieressä kasvain) samasta syöpäpotilaiden voi vähentää teknisiä vaihtelevuutta ja siten tarjota keinoja kasvattaa spesifisyyden tuloksista ja lisätä mahdollisuuksia tunnistaa tietyn taudin liittyvä proteiini muutoksiin.

Tässä tutkimuksessa selvitimme vertaileva proteomiin eturauhassyövän ja sen vieressä histologinen hyvänlaatuinen kudosta syöpäpotilaista lopullisina patologinen luonnehdinta meidän 2-D-ero-geelielektroforeesin (DIGE) järjestelmä proteiini 2-D elektroforeesi [13 ] ja MALDI-TOF-MS /MS proteiinien tunnistamiseen. Differentiaalisesti ilmaisi proteiinit analysoitiin MetaCore ™ (Gene GO) ja kekseliäisyyttä Pathway Analysis ohjelma (Ingenuity Systems). Tärkeimmät solmukohdat merkittäviä sub verkkojen todensi reaaliaikaista PCR-analyysillä. Systeemibiologia verkko analyysi voisi tarjota mahdollinen rooli proteiinien eri säätelyreittejä jotka ohjaavat PCa etenemistä ja ennustaa uusia biomarkkereita, jota voidaan edelleen validoitu käyttäen Western blotting ja immunohistokemiallinen (IHC) lähestyy.

Materiaalit ja menetelmät

Kliiniset näytteet ja eettinen lausunto

kudosnäytteitä ja potilastietojen saatiin tietoisen kirjallisen suostumuksen. Tutkimuksen hyväksyi eettisen komitean yliopistollisen sairaalan Hamburg Eppendorf ja toteutetaan ilmoituksen mukaisesti Helsingin. Proteiinien ilmentyminen analyysiä koko eturauhanen kerättiin sen jälkeen eturauhasen potilailta koholla PSA-arvot ja preoperative patologiset tutkimukset Martini Klinikat, Hampuri, Saksa. Potilaat saivat ei preoperative terapiaa. 24 potilasta valittiin ja vastaavat kliiniset ja patologiset data toimitetaan ovat taulukossa 1. seerumin PSA-tasot näiden potilaiden määritettiin ja kaikilla potilailla oli välillä 3,9 ja 30,4 ng /ml (keskiarvo PSA-arvo = 10,93 ng /ml) ja Gleason pisteet välillä 3 + 3 ja 4 + 5 [14], [15].

Kun eturauhasen näytteet jäädytettiin nestetypessä käyttöön saakka. Kasvain ja hyvänlaatuisia alueet merkitty kohdat. Meillä työskentelee manuaalinen mikro leikkelyn tapa hankkia patologisesti tunnettu materiaaleja meidän proteomiikka lähestymistapa. Vastaavat alueet muissa lohkoissa leikattiin pois terävällä veitsellä, upotettu Tissue-tek® ja säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti.

Protein eristäminen ja leimaamisen CyDyes

Tissue oli huuhdellaan fysiologista suolaliuosta (0,9% NaCl) poistamiseksi jäljellä asennus materiaaleja, värimerkkaus- ja verta. Viipaloitu kudokset suoraan homogenisoitiin DIGE lyysipuskuria (30 mM Tris, 2 M Thio ureaa, 7 M urea, 4% CHAPS, noin 0,5 ml /200 mg kudosten). Saatu homogenaatti selvitetty poistaa kaikki roskat sentrifugoimalla 12000 15 minuuttia 4 ° C: ssa, proteiinia supernatantti kerättiin, ja sen proteiinipitoisuus määritettiin modifioidulla Bradfordin menetelmällä [16]. Laatu näytteistä DIGE arvioitiin mini 2DE (7 cm IPG nauhat, pH 4-7). Proteiini lysaatit leimattiin Cy Väriaineet mukaan valmistajan protokollaa minimaalinen merkintöjä (CyDye DIGE Fluor minimaalinen väriaineet, GE Healthcare). Jotta minimoidaan väriaine-erityisiä merkintöjä esineitä, Cy3 ja Cy5-merkintöjä kuviot vaihdettiin kesken samassa Näyteryhmä. Sisäinen standardi altaan yhtä suuret määrät kutakin proteiinia näytettä (25 ug) käytetään vähentämään välistä geeli vaihtelua. Yhdistetty sisäisiä standardeja leimattiin Cy 2. 50 ug proteiinia kustakin näytteestä leimattiin 400

p

mol vastaavan väriaineen jäissä pimeässä 30 minuutin ajan. Reaktio pysäytettiin /pysäytettiin 10 mM L-lysiiniä 10 minuuttia samoissa olosuhteissa.

DIGE-Two-geelielektroforeesi (DIGE-2-DE) B

Ensimmäinen ulottuvuus isoelektrisen fokusoinnin suoritettiin käyttäen 24 cm immobilisoitua pH-gradienttia kuiva nauhat (IPG) lineaarisella pH 4-7 kaltevuus. Analyyttinen geelit, pari Cy3 ja Cy5 merkitty näytteet (kukin 50 ug proteiinia) ja 50 ug Cy2 leimatun sisäisen standardin yhdistettiin ja täytettiin 150 ul 2 x näytepuskuria (7 M urea, 2 M tioureaa, 4 % CHAPS, 2% DTT), jota oli täydennetty 2% (v /v) IPG pH 4-7). Rehydratointiin, laimennetaan näytettä 2 x nesteytys-puskuria (8 M ureaa, 4% CHAPS, 13 mM DTT), jota oli täydennetty 1% (v /v) IPG pH 4-7 ja muutaman jyvät bromifenolisinistä) lopulliseen tilavuuteen 450 ui. IPG nauhat (24 cm, pH 4-7, GE Healthcare) on passiivisesti nesteytyksestä yön yli 20 ° C: ssa IPGPhor kasetteja. Preparatiiviseen geelit, 750 ug merkitsemätöntä proteiinia yhdistettiin yhtä suurista määristä näytteitä käytettiin. Proteiinit erotettiin jonka PROTEAN IEF järjestelmä (Bio-Rad) käyttäen ohjelmoitu jännitegradienttikokoonpanon 20 ° C: nykyinen raja 50 uA kohti liuska pimeässä seuraavissa olosuhteissa: 4 tuntia 250 V, 8000 V lineaarinen gradientti 15000 V tuntia, nopea 8000 V 75000 V tuntia, yhteensä 90 KVH. Jälkeen IEF, IPG liuskat tasapainotettiin puskurilla 1 (50 mM Tris-HCI, pH 8,8, 8 M ureaa, 30% glyserolia, 2% SDS: ää ja 0,5% DTT) ja puskuri 2, joka sisälsi 4,5% jodiasetamidi sijaan DTT kussakin tapauksessa 15 minuuttia.

toinen ulottuvuus suoritettiin PROTEAN® Plus Dodeca ™ Cell järjestelmä. Tasapainotettuun nauhat levitettiin päälle 12,5% SDS-PAGE-geeleissä ja suljettiin 1% agaroosia SDS-Tris-glysiini-puskuria jälkiä bromifenolisinistä kuin seuranta-väriaine seurata elektroforeesilla. Polyakryyliamidigeeleillä (12,5%) valettiin pieni fluoresenssi lasilevyille. Elektroforeesi suoritettiin vakiojännitteellä (80 V) 20 ° C: ssa, kunnes väririntama saavutti geelin alaosassa. Täydellinen laite on suojattu valolta. Elektroforeesin jälkeen analyyttinen geelikasetit pestiin DDH

2O ja pyyhitään pölytön pehmopaperit. Cy 2 (sisäinen standardi), Cy3 ja Cy5 leimatut proteiinit kussakin geeli visualisoitiin käyttämällä Typhoon 9400 ™ laserskannerin (GE Healthcare) 100 mikronia tiheys käyttämällä erilaisia ​​viritys- ja emissioaallonpituudet suoraan geeleistä lasilevyjen väliin. Optimaalinen heräte /emissioaallonpituuksia fluoresenssidetektoinnilla ovat 488/520 nm Cy2, 532/580 nm Cy3, ja 633/680 nm Cy5. Preparatiivinen geelit värjättiin Roti®-Blue, kolloidista Coomassie brilliant blue G250 tahra. Lyhyesti, geelit fiksattiin 40% metanolia, 15% etikkahappoa, vähintään 4 tuntia ja upotettiin sitten kolloidisen värjäyksen liuokseen yli yön. Jos haluat poistaa taustavärjäyksen geelit pestiin 20% metanolia.

Kuva-analyysi

Delta 2D ero analyysi ohjelmistoversio 4.0 (DECODON GmbH, Saksa) käytettiin tässä tutkimuksessa. Yksittäisten Geelianalyysin, täplät havaittiin, määrällisesti ja normalisoitu mukaan tilavuussuhde vastaavien paikkoja havaittu Cy 2 kuva yhdistettyjen näytteiden sisäistä standardia käyttämällä sisäisen standardin moduuli. Kaikki normalisoitu paikalla määriä geelit kollektiivisesti analysoitiin kaksi riippumatonta ryhmää ”Kasvain” ja ”hyvänlaatuinen”, joka mahdollistaa yhteensopivuuden useiden geeli kuvia eri potilaiden välillä tilastotietoja keskimäärin runsautta kunkin proteiinin spot joukossa DIGE geelit sisältyvät analyysiin . Kolme geelit hyvänlaatuisesta ryhmästä jätettiin analyysin takia ongelma DIGE merkinnöissä. Opiskelijan

t

-testi arvioimiseksi suoritettiin tilastollisen merkityksen ilmentyvät eri proteiineja. Perustuen keskimääräinen spot tilavuuden suhde, täplät joiden suhteellinen ilmentyminen muuttuu vähintään 1,5-kertainen (lisäys tai vähennys) välillä hyvänlaatuiset ja kasvaimia 95%: n luotettavuustasolla (t-testi, p 0,05) katsottiin olevan merkittäviä. Myöhempinä massaspektrometria analyysi merkittävä paikka koordinaatit siirrettiin Coomassie värjätään preparatiiviseen geeli spot poiminta.

Massaspektrometria

valmistaminen peptidiseosten MALDI-TOF-MS /MS.

proteiini tunnistaminen tehtiin kuten äskettäin [11]. Lyhyesti, proteiinit leikattiin Kolloidinen Coomassie Brilliant Blue värjättiin 2-DE geelit käyttämällä paikalla leikkuri. Trypsiinillä hajotusta ja myöhemmin tarkkailu peptidin ratkaisujen päälle MALDI-tavoitteet tehtiin automaattisesti Ettan Spot Handling Workstation. Geelipalat pestiin 50 mM ammoniumbikarbonaatissa /50% (v /v) metanolia ja 75% (v /v) ACN. Kuivauksen jälkeen trypsiini, joka sisälsi 20 ng /ul trypsiinillä 20 mM ammoniumbikarbonaatissa ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 120 min. Peptidin uutto, geelipalat peitettiin 50% (v /v) ACN /0,1% (w /v) TFA: ta ja inkuboitiin 30 min 37 ° C: ssa. Peptidi sisältävä supernatantti siirrettiin uuteen mikro- levyn ja uutto toistettiin. Supernatantit yhdistettiin ja kuivattiin täydellisesti 40 ° C: ssa 220 min. Peptidit liuotettiin 0,5% (w /v) TFA /50% (v /v) ACN ja täpliksi MALDI-kohde. Sitten matriisi-liuosta (50% (v /v) ACN /0,5% (w /v) TFA: ta), joka oli kyllästetty CHCA lisättiin ja sekoitettiin näyteliuoksen imemällä seos viisi kertaa. Ennen mittauksen MALDI-TOF-laitteen, näytteiden annettiin kuivua tavoite 10-15 min.

MALDI-TOF-MS: llä.

MALDI-TOF-mittaukseen täplikäs peptidi ratkaisut tehtiin 4800 MALDI TOF /TOF ™ Analyzer. Spektrit kirjattiin heijastin tilassa massa-alue 800-4000 Da sisäinen yhden pisteen-kalibrointi Autolyyttisen fragmentti trypsiiniä (mono-isotooppinen (M + H)

+ m /z at 2211,104, signaali /kohina ≥10). Lisäksi MALDI-TOF-MS /MS-analyysi suoritettiin 5 vahvin huiput TOF-spektri vähentämisen jälkeen vastaavat piikit tausta tai trypsiini fragmentteja. Sisäinen kalibrointi suoritetaan automaattisesti, koska yhden pisteen kalibroinnin, jos mono-isotooppinen arginiini (M + H)

+ m /z on 175,119 tai lysiini (M + H)

+ m /z on 147,107 saavutti signaalikohinasuhde (S /N) on vähintään 5 kalibroinnin jälkeen yhdistetty tietokantahaku MS ja MS /MS-mittauksia tehtiin käyttämällä GPS Explorer ohjelmisto v3.6 (Applied Biosystems, Foster City, USA). Peak luettelot verrattiin SwissProt rel.49 rajattu ihmisen taksonomian tai IPI ihmisen v3.12 tietokantaan käyttäen Mascot hakukoneen 1,9 (Matrix Science Ltd, Lontoo, Iso-Britannia). Peptidiseosten että tuotti vähintään kahdesti mowse pisteet vähintään 56 SwissP- tai ainakin 59 IPI tietokannan tuloksia pidetään positiivisina tunnistamista.

bioinformatiikan analyysi proteomic tietojen

merkittäviä ilmentyvät eri proteiinien ja niiden biologiset toiminnot tai suhteet määritettiin käyttäen Kegg tietokannan (https://www.genome.jp/kegg/) ja Entrez proteiinin tietokanta (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites /Entrez? db = proteiinia) NCBI. Proteiini verkkojen analysointiin lyhimmän polkuja välillä tunnistettujen proteiinien rakensi MetaCore ™ (Gene GO) ohjelmistojen ja kekseliäisyyttä Pathways Analysis (IPA) ohjelma (Ingenuity Systems) tunnistamiseksi molekyylien osallistuvat kumppanit tietyn sairauden. Master maailmanlaajuinen verkosto kaikki ilmentyvät eri proteiineja (tulosobjektit) luotiin mukaisesti julkaistun kirjallisuuden-pohjainen merkintöjä, ja sitten edelleen alaluokkiin verkostoja rakennettiin master verkon keskittyä aktivoitu kokeita ja /tai reittejä. Suurissa solmukohdissa tunnistettiin perustuu yhteyksien ja reunat verkossa. Proteiini ilmentyminen Aineisto analysoitiin hierarkkinen klusterointi ja osio analyysi R-kielen löytää mahdollisia markkereita voidaan luokitella kaikki näytteet kuin kasvain ja hyvänlaatuinen suurella varmuudella. Valvomatonta klustereiden suoritettiin käyttäen Euklidinen etäisyys toimenpide ja agglomeraatiomenetelmällä keskimääräinen ”log muunnettuja arvoja kaikkien merkittävien ilmentyvät eri proteiineja 45 näytteiden mukaan analyysiin set.

Lukk et al. osoittivat, että genomin laajuinen ero ilmentymisen välillä kasvainten ja valvonnan kudos voidaan karakterisoida käyttäen pääkomponenttianalyysi (PCA) avulla pahanlaatuisuuden parametrin, joka on ominaista yhtenäinen ero ilmentymisen kuviot, jotka liittyvät kasvaimen muodostumisen. Selvittääkseen vaikutuksen yhteistyössä säätely proteiiniekspressiossa biomarkkereiden tunnistamiseen, valvomattoman PCA on sovellettu proteiinin ekspressiotietojen (normalisoitu logaritminen asteikko), niin kasvain ja normaali kudosnäytteistä. PCA tehtiin Matlab [MathWorks Inc, Version 14]. Tuloksena pääkomponentit PCA painotetaan avulla yhden proteiinin ilmaisuja, kun painotus tunnistetaan automaattisesti niin, että tärkeimmät vaihtelu proteiinin ilmentymisen tietojoukon voidaan selittää muutaman ensimmäisen pääkomponentit.

jotta vältettäisiin vääriä tuloksia poikkeavuuksien kaksivaiheista lähestymistapaa sovellettiin, jossa ensimmäisessä vaiheessa PCA levitettiin alkuperäisen datan. Ulompien tunnistus levitettiin ilmauksia pääkomponenttien. Toisessa vaiheessa PCA tehtiin ilman poikkeavia havaintoja. Tuloksena lauseke arvot vakiintunut pääkomponentit jossa käytettiin lisäanalyysiä. Selvittääkseen suhde tietojen suhteen differentiaalikaavojen joka edustaa kolmen ensimmäisen pääkomponenttien ja jäljelle jäävän tilan, kunkin proteiinin ilmentymistä arvot kaikissa kudoksissa, määrällisesti että vektorin x

i, jossa jaettu kaksi osaa: missä x

p, i on komponentti x

i, joka edustaa kolmen ensimmäisen pääkomponentit PCA (S3) ja x

r, i määrällisesti jäljellä proteiini lausekkeita täydentäviä tila CS3, joita ei voida edustaa kolmen ensimmäisen pääkomponentit PCA. Sen tarkistamiseksi jakelun ero ilmaisun molempien komponenttien, alkuperäisen datan antaman x

i, PCA perustuvia komponentteja x

p, i, ja jäljellä komponentteja x

r, ia kaksi sivuinen t-testi ero ilmaisun välillä normaalin ja kasvaimen näytteissä on suoritettu.

RNA: n eristys ja mittaukset geenitranskriptien etujen kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR

kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysi transkription tasot proteiinien etuja suoritettiin käyttämällä SYBR Green, kuten aikaisemmin on kuvattu. Lyhyesti RNA eristettiin samasta koepaloja käytetään proteomianalyysi käyttäen TRIzol® reagenssia (Invitrogen, Karlsruhe, Saksa) mukaan valmistajan protokollaa. CDNA valmistettiin käänteiskopioimalla 1 ug kokonais-RNA: sta käyttäen oligo dTprimer (15-meerinen) ja M-MLV käänteistranskriptaasia (Fermentas Life Sciences GmbH, Saksa). Quanti Tect alukkeita kiinnostavat geenit GAPDH (siivous geeni) hankittiin suoraan Qiagen, Saksa. Alukesarjat osoitettiin tuottaa yhden amplikonin halutun koon arvioitiin RT-PCR seurasi agaroosigeelielektroforeesi. Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR suoritettiin lämpösyklilaitteessa (Stratagene, Saksa) käyttäen Dynamo Flash SYBR Green qPCR Kit (Finnzymes, Suomi). PCR tavoitearvo ja siivous geenit tehtiin kolmena rinnakkaisena ja keskimääräiset suhteelliset ekspressiotasot raportoitu. Edellytykset reaaliaikainen PCR-reaktiolle olivat seuraavat: 1 sykli 94 ° C 3 min ja 40 sykliä 94 ° C 20 s, 60 ° C 30 s ja 68 ° C: ssa 30 s. Lopussa PCR-näytteet alistettiin sulamisanalyysikokeita spesifisyyden varmistamiseksi amplikonin. Saadakseen tilastollista merkittävyyttä saadut analysoitiin parittomalla opiskelija

t

-testi suoritetaan ja p-arvo 0,05 pidettiin merkittävänä.

Western blotting

Proteiiniekstraktit erotettiin 12% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin elektroforeettisesti PVDF-membraanille. Estäminen suoritettiin 1 x Rotiblock liuosta (Roth Chemicals) ja sen jälkeen inkuboimalla kalvo primaarisen vasta-aineen yli yön 4 ° C: ssa. Ylimääräinen vasta-aineet poistettiin pesemällä NaCl-Tris-Tween 20. Inkubointi sekundäärinen vasta-aine oli konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin [anti (hiiren IgG) tai anti (kani IgG), laimennettu 1:5000 1 × Rotiblock] suoritettiin 1 h huoneenlämpötilassa. Kolmen pesun jälkeen, reaktio on kehitetty lisäämällä LumiGLO alustan (Thermo). Lähetetyn valon vangittiin röntgenfilmille (GE Healthcare).

Tulokset

2D-DIGE analyysi ja massaspektrometria

Tässä tutkimuksessa pystyimme luomaan normaali menettely käsin mikro leikkelyn eturauhasen näytteiden saamiseksi patologisesti arvioidaan kasvain ja hyvänlaatuinen kudosten proteomianalyysi. Lisäksi olemme analysoineet proteomiin prostates 24 syöpäpotilaiden ja heidän vastaavien hyvänlaatuinen kudoksen 21 tapauksessa (taulukko 1) 2D-DIGE kanssa pl erilaisia ​​4,0-7,0 ja molekyylipainon välillä 10 kDa ja 120 kDa. Näissä olosuhteissa, yhteensä 1324 täplät havaittiin selvästi ja sen jälkeen analysoitiin käyttäen Delta2D ohjelmisto ero proteiinin ilmentymisen. 118 täplät muutu merkitsevästi niiden runsaus joukossa kaikki näytteet ovat analyysiin asettaa ja valittiin edelleen tunnistamiseen. Keskimääräinen runsaus täplät kvantitoitiin ja ne, joilla suhteelliset muutokset runsaasti yli 1,5 kertaa välillä hyvänlaatuinen ja kasvaimen (ylös tai alas) 95%: n luotettavuustasolla (

p

0,05) katsottiin merkittäviksi. Mielenkiintoisia paikkoja leikattiin preparatiivisen geelit proteiinin tunnistus (ID) tryptisesti in-geeliä ruuansulatuksen ja MALDI-TOF MS /MS-analyysillä. Jälkeen Mascot tietokantahaku käyttämällä saatua MS-tiedot 96 täplät 79 proteiineja tunnistettiin ilmennetty eri syövän verrattuna hyvänlaatuinen kudokseen. Pilkut proteiini ID kuvataan kuviossa 1. Yksittäisten proteiinit heijastuu useita paikkoja todennäköisesti johtuu posttranslational muutos johtaa siirtymiä 2-DE. Proteiinit tunnistettiin ryhmiteltiin eri luokkiin perustuen toiminnallisen tiedon käytettävissä. Useimmat tunnistetuista proteiineista ovat joko solun tukirangan proteiinit, entsyymit välittäjän aineenvaihdunnan, signaalitransduktion, lämpösokkiproteiinit, kasvaimeen liittyvien proteiinien, oksidatiivisen stressin liittyvät proteiinit tai proteiinien toimintaa ei tunneta (kuvio 2B). Tiedot proteiinin tunnisteiden, proteiini pisteet, sekvenssi kattavuus, teoreettinen pl-arvo ja molekyylipaino sekä keskimääräinen suhteellinen muutos on esitetty taulukossa S1.

Proteiinit ratkaistiin IEF yli pl 4-7, jonka jälkeen 12,5% SDS-PAGE ja yhdistelee Delta2D. Purkamisen jälkeen kudoksista, proteiinit leimattiin Cy3 ja Cy5. Sisäistä standardia koostuu samasta määrästä proteiinien kaikista näytteistä (hyvänlaatuinen ja PCa ryhmille) leimattiin Cy 2 ja sisältyy kaikkiin geelit. Vihreä täplät osoittavat vaimentua proteiineja, kun taas punaiset läiskät osoittavat yliaktiivista proteiineja PCa suhteessa vastaavaan hyvänlaatuinen kudosta. Tunnistetut proteiineja, jotka osoittivat merkittävästi muuttunut ilmentyminen PCA on merkitty nuolilla ja merkitty respectives proteiinin tunnukset.

(A) valvomaton klusterointi (euclidean etäisyys toimenpide ja ”keskimääräinen” kokkaroimismenetelmällä) oli suoritettiin käyttäen log-transformoituja ilmaus proteiinia arvoja 45 näytettä. Näytteet on esitetty vaakasuunnassa, proteiinit pystysuunnassa. Dendrogrammissa edustavat väliset etäisyydet klustereita. Ylemmässä väripalkki, kasvain näytteet on merkitty punaisella, normaali kudosten näkyvät vihreinä. (B) Biologiset prosessit säätelevät kaikki merkittävät ilmentyvät eri proteiineja arvioitiin Gene ontologia etsintä ja tiivistää niiden toimintoja.

Hierarkkinen klusterointi ja osio näytteiden analysointi

Kuva 2A näyttää klusterointi tuloksen. Korkeammat ilmaisut ovat värillisiä punainen, alemmat vihreällä. Näytteet näkyvät sarakkeet ja rivit osoittavat proteiineja. Dendrogrammissa edustavat väliset etäisyydet klustereita. Kasvain ja hyvänlaatuiset näytteet eivät muodosta kaksi erillistä erillistä klustereita. Kuitenkin hierarkkinen klusterointi paljasti yhden ryhmän hyvin samanlaiset kasvain näytteet (10 näytettä) muodostavat klusterin. Nämä näytteet pidetään kasvaimen alaryhmäksi tarkempaa analyysiä. Partition analyysi ilmaisun arvojen tuloksena todettiin, että yksi proteiini, PPA2 voidaan luokitella näytteitä merkitys (Fisher testi p-arvo 6.682e-09). Kasvain alaryhmä oli luokiteltu oikein, yksi (out of 14) jäljellä kasvainten oli luokiteltu virheellisesti hyvänlaatuinen ja kolme (pois 21) hyvänlaatuisia näytteet luokiteltu virheellisesti kasvaimet (tuloksia ei ole esitetty). Osio analyysin tulokset ovat myös osoittaneet, monia proteiineja voidaan luokitella kaikki näytteet oikein (tietoja ei esitetty). Yrittää määrittää PSA erityisen proteiinin allekirjoitusta, ei ole suoraa korrelaatiota PSA ja differentiaalisesti ilmennettyjen proteiinien havaittiin (tietoja ei esitetty). Yhdessä enemmän kuin yksi proteiini voi erottaa kaikki näytteet, koska ne oli määrätty ryhmissä.

Pääkomponenttianalyysi (PCA) B

3-ulotteinen scatterplot kolmen ensimmäisen pääkomponentit kudosnäytteet osoittaa hyvää toisistaan ​​kasvaimet ja normaaleissa kudoksissa (kuvio 3A). Lisäksi kuvio 3B, joka kuvaa logaritminen p-arvot alkuperäisen datan x

i kutakin proteiinia x-akselin ja komponentit x

p, i ja x

r, i-y- akseli, osoittaa, että lähes kaikki ero ilmentyminen voidaan heijastuu PCA-komponentin (punainen tähdet).

(A) scatterplot kolmen ensimmäisen pääkomponentit PCA proteiinista ekspressiotietojen. Sininen tähdet edustavat normaaleissa kudoksissa, kun taas punaiset tähdet osoittavat kasvaimia. (B) Tiedon jakaminen suhteen differentiaalikaavojen välillä kasvain ja normaaleissa kudoksissa. Jokainen cross edustaa proteiinia. P-arvot kaksipuolinen t-testi edustaa x-akselin, kun taas ulokkeet (punainen: projisointi S3, sininen: projisointi täydentävä tila) edustaa arvoja y-akselilla. Ilmeisesti kaikkien proteiinien merkittävä ero ilmaisua alkuperäiset tiedot (log10 (p) -2) tasauspyörästön ilmaus jäljellä komponentin (sininen tähteä) ei ole merkittävä (log10 (p) -1), kun taas p -arvot PCA perustuvia komponentteja (punaiset tähdet) ovat samanlaisia ​​kuin alkuperäiset p-arvot (x-akseli). (C-D) Mediaani tarkkuus ja kertoimet suhde ennustava kasvain /normaali luokitus. Sininen käyrät osoittavat kasvua mallin laatua lisäämällä otoskoko käytetty biomarker mallia. Punaiset tähdet esittävät ominaisuuksia logittimalli perustuu ensimmäiseen kolmeen pääkomponenttien. (E) Tuotos regressiomallin (y-akseli) osoittaa, että on olemassa kaksi kasvaimen luokkaa eroavat merkittävästi niiden separoituvuus. Normaalien kudosten (sininen ja vihreä laatikot) käyttäen proteiinin ilmentymisen.

Ilmeisesti ero proteiinin ilmentymisen välillä kasvainten ja normaaleissa kudoksissa ei voida määrätä yhdelle yksittäinen proteiini, mutta näyttää riippuvan yleisestä proteiinin ilmentymiseen kuvioita, jotka ovat edustaa vain kolmesta osasta PCA mukaisesti kuvattujen tulosten mukaan Lukk et al. [17]. Siksi kaikki (tavallinen, ei-tarpeeton) yhdistelmiä vähintään kolmen proteiinin, joka voidaan mitata suurella tarkkuudella pitäisi riittää osoittamaan biomarkkerit samanlaisia ​​ennustavan suorituskykyä, jos proteiinit osoittavat merkittävästi kolmen ensimmäisen pääkomponentit PCA. Vastaavat proteiini sarja voidaan valita mukaan kokeellista kriteerien, ei-redundanssin ja merkitys korrelaatio vastaaviin PCA komponentteja. Koska rakentamisen pääkomponentit PCA painotettuina avulla ilmauksia lähes kaikki proteiinit, pääkomponenttien voi täyttää roolin ”luontainen kohina suodatin”. Siksi on aiheellista ilmi kunkin pääkomponenttina keskimääräisellä ilmaus (pieni) ryhmä proteiineja, jotta hyötyä melutason tukahduttamista keskimäärin samoin. Luvut 3C-D esittää vaikutuksen keskiarvon. Ilmaisu Kunkin pääasiallisen komponentti on edustaa keskimäärin ilmaus 1-25 proteiineja, jotka on satunnaisesti valittu joukko 38 proteiinien suurin korrelaatio kuhunkin pääasiallinen komponentti. Ilmeisesti tarkkuutta ja kertoimet suhde riippuu otoksen koosta proteiineja käytetään edustus pääkomponenttien. Mediaani mallin ominaisuuksia on samaa kokoa ominaisuuksia markkereita, jotka perustuvat biologiseen perustelut, mikä osoittaa, että ero ilmaisua voi hallita laajamittaista, voimakkaasti yhteistyötä säännellyn proteiinin ilmentymisen siirtyy johtuen kasvaimen muodostumisen.

jotta tarkistaa odotettua ennustavan suorituskykyä, logit-malli on todettu käyttäen vain kolme ensimmäistä pääkomponentit PCA. Rajat validointi (jätettävissä yksi) tarkkuutta ennustaminen kasvaimen ja normaaleissa kudoksissa testissä-set oli 86%. Kolme (21) normaaleissa kudoksissa ja 3 (24) kasvaimen kudokset on luokiteltu väärin. Malli osoittaa, että kasvaimia voidaan jakaa kahteen ryhmään eroavat merkittävästi suhteessa niiden separoituvuus normaaleista kudoksista (kuvio 3E ja taulukko 2). Tilastolliset testit osoittivat ole suoraa yhteyttä kasvaimen ryhmiä selityksin kasvain luonnehdintoja (Gleason, PSA merkki jne). Siksi joko vaikuttavuuskertoimet syrjään proteiinin ilmentyminen voi myötävaikuttaa eturauhasen kasvain ominaisuuksia tai erittäin monimutkainen, ei-monotonista yhteistyöhön prosessien välillä proteiinit vaikuttavat kasvaimen asema, joka ei kuulu pääkomponentit PCA käytettävien logit regressiomallin. Funktionaalinen luokittelu 26 tunnistaa proteiinit ilmentyvät differentiaalisesti kummankin kasvaimen ryhmien on esitetty yhteenvetona kuviossa 4A-C. Yhteensä 70% proteiineista tämän aineisto luokiteltiin metabolisia prosesseja ja yli 60% oli luokiteltu katalyyttinen tai sitovien toimintojen.

(A) biologisia prosesseja, (B) molekyylipaino toiminnot ja (C ) solun osiin säätelevät ilmentyvät eri proteiinien molempien kasvaimen ryhmien arvioi Gene ontologia hakua.

verkot analyysi tunnistettujen proteiinien syövän vs. hyvänlaatuisia näytteitä

Pathways ja verkot, jotka osallistuvat valkuaista 2-D DIGE kokeiluja differentiaalisesti ilmaistut PCa analysoitiin MetaCore ™, web-pohjainen integroiva ohjelmisto. Verkon arkkitehtuuri edustaa yhteydet yksittäisten proteiinien (solmut).

Tässä analyysissä navat (avain proteiineja) proteiinia verkkojen ehdotetaan olevan avain säätelyproteiineihin mukana monisoluisten prosesseissa. Rakennettu Lyhin verkon (kuvio 5A) paljastaa, että c-Myc, p53, androgeenireseptorin, 14-3-3-epsilon, vimentiinistä, PSA ja estrogeenireseptori 1 kuten verkon solmukohtien.