Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Normal solunjakautumisen koordinoi kaksinapainen sukkularihmaston, varmistaa symmetrinen kromosomien segregaatiota. Syöpäsolut kuitenkin joskus jakaa kolmeen tai useampaan suuntaan. Tällaisia ​​moninapainen mitoosien on ehdotettu tuottaa geneettisen monimuotoisuuden ja siten edistää klonaalisia evoluution. Kuitenkin tämä käsite on vähän validoitu kokeellisesti.

Keskeiset havainnot

kromosomi eriytymistä ja DNA sisällön tytär soluja moninapaista mitoosien arvioitiin multiphoton Poikkileikkauksia ja fluoresenssi in situ -hybridisaatiota syöpäsoluissa ja ei-neoplastisia transformoitujen solujen. DNA aiheutuva jakelun moninapainen solunjakautumisen havaittiin olevan erittäin vaihteleva, usein nullisomies on tytärsolujen. Time-lapse kuvantamisen H2B /GFP-leimatun moninapaista mitoosien paljasti, että aika aloittamisen metafaasissa alkuun Anaphase pidennettiin ja että metafaasivaiheen levyt usein kytketty napaisuus useita kertoja ennen metafaasissa-Anaphase siirtyminen. Moninapaisen metafaasissa-Anaphase siirtymisen liitteenä oli normaali väheneminen solun sykliini B tasolla, mutta tyypillisesti tapahtunut ennen loppuun normaalin separase toiminnan aikana. Sentromeerisen AURKB ja MAD2 pesäkkeitä havaittiin usein jäädä sentromeerien on moninapainen ana-telophase kromosomeja, mikä osoittaa, että moninapainen mitooseja pystyivät kiertämään kehräkokoonpanon tarkistuspisteen joitakin sisar kromatidia jäljellä erottamattomat jälkeen Anaphase. Niinpä teki jakautuminen yksittäisten kromosomien moninapainen tytär ytimien paljasti tiheä nondisjunction tapahtumista, tuloksena on lähes binomimallia jaossa sisko kromatidien tytär soluihin.

Johtopäätös

Kyky on moninapainen mitoosien kiertää kehräkokoonpanon tarkistuspiste järjestelmä tyypillisesti johtaa lähes satunnaista jakautumista kromosomien tytärsoluihin. Karan multipolarismi voisi siis olla erittäin tehokas generaattori geneettisesti erilaisia ​​vähemmistön kloonit transformoitiin solupopulaatioissa.

Citation: Gisselsson D, Håkanson U, Stoller P, Marti D, Jin Y, Rosengren AH et ai. (2008) Kun Genome Toistot Dice: kiertäminen Karan Assembly Checkpoint ja Lähi-Random Kromosomi eriytyminen Moninapainen Cancer Cell mitoosien. PLoS ONE 3 (4): e1871. doi: 10,1371 /journal.pone.0001871

Editor: Cayetano Gonzalez, tutkimusinstituutti biolääketieteen, Espanjassa

vastaanotettu 22 lokakuuta 2007; Hyväksytty: 22 helmikuu 2008; Julkaistu: 02 huhtikuu 2008

Copyright: © 2008 Gisselsson et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Ruotsin Lasten Cancer Foundation, Ruotsin Cancer Society, Ruotsin Research Council, Ruotsin Medical Society, Swiss National Science Foundation (Grant 3152A0-100431), Lundin yliopistollisen sairaalan lahjoitus rahastojen, Gunnar Nilsson Cancer Foundation, lääketieteellisen tiedekunnan Lundin yliopiston, Crafoord Foundation, Erik-Philip Sörensen Foundation, Lundgren Foundation, ja Swärd Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen tekeminen tai kerääminen, analysointi, tietojen tulkintaa, tai valmisteen, tarkastelun tai hyväksyntä käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet että ei kilpailevia etuja olemassa.

Johdanto

normaalit solut, mitoosissa tyypillisesti tapahtuu kaksinapaisen tavalla, tuloksena on kaksi tytärsoluksi identtisillä ydin- genomien. Tämä rajoitettu napaisuus perustuu tiukasti kurissa sentrosomimäärän kierron niin, että enintään kaksi sentrosomien ovat samanaikaisesti aktiivisia mitoosin aikana [1], [2]. Kuitenkin syöpäsoluissa, liiallinen määrä sentrosomien voivat aiheuttaa ylimääräisten karan napaa, jotka voivat järjestää moninapaista mitoosia (MM), jossa kromosomi täydennyksessä vedetään kolmeen tai useampaan suuntaan at Anaphase [3], [4]. Koska ensimmäinen havainnot MM karsinoomia mukaan Hansemann vuonna 1890 [5] moninapainen karat ja centrosomal poikkeavuuksia on raportoitu yleisimmistä syövistä [6] – [8]. Jotkut tutkimukset ovat myös osoittaneet, että MM voi olla vahva merkki haitallisia ennusteen kasvaintauti [9] – [11]. Lisäksi häiriöt sentrosomimäärän määrä ja rakenne on liitetty häiriintynyt toiminta useiden solusyklin signalointireittejä, kuten inaktivaatio TP53-, RB1- [12], [13], BRCA1- [14], [15], BRCA2 – [16], ja CDKN1A-proteiinit [17], samoin kuin AURKA yli-ilmentyminen [18]. Kautta CCNE ja PLK4, centrosomal häiriöitä on myös liittynyt altistumisesta virusten karsinogeeneja, erityisesti korkean riskin papilloomavirukset [19], [20].

Kun otetaan huomioon laaja Tämänhetkisten tietojen molekyylitason muutokset aiheuttavat kara multipolarismi syöpäsoluissa, yllättävän vähän kokeellista tietoa on esitetty seurauksista karan multipolarismi transformoiduissa ihmissoluissa. Aiemmat tutkimukset ovat rajoittunut

in vitro

malleja ei-neoplastisten solujen myyrän, minkki, härkä, ja Reesusapina jossa polyploidized soluissa edennyt moninapaista solunjakautumisen [21] – [24]. Näissä malleissa sisko kromatidia tyypillisesti erillisiä läpi MM haploidisoluissa sarjaa, jolloin euploid kromosomissa numerot tytär soluissa. Tämä euploid jakaantumiskuvio on muodostanut perustan keskusteluille roolista MM ihmisen kasvaimissa [25]. Nyt näyttää, että kromosomi eriytyminen MM ihmisen aneuploidi transformoiduissa soluissa harvoin, jos koskaan, johtaa erottelua suhdeluvut odotetaan periaatteista euploid erottelua. Pikemminkin yhdistelmä yleisen epäsymmetrinen DNA jakelua ja kiertäminen kehräkokoonpanon Checkpoint johtaa lähes satunnainen hajottua kromosomin täydennys.

Tulokset

Koejärjestely

periaatteiden euploid erottelun malli merkitsee, että niillä on käytössä, jolla säädellään tiukasti liikkeen haploid kromosomisto osaksi tytär solujen mitoosin [24]. Ekstrapolointi tämä teoria on tyypillisesti aneuploidi karyotyyppejä havaittiin syöpäsolujen tarkoittaa sitä, että jokaisen sarjan homologisia kromosomeja erottelee kuin jos koko kromosomiluku pystyisi jakaa erillisiin kokonaislukuratkaisut suhteet. Näin ollen, ainakin yhden kopion jokaisesta kromosomi on läsnä kussakin tytärsolu, lukuun ottamatta sukupuolikromosomeiksi. Solussa jako kaksi kopiota tietyn kromosomin (disomic) jakamalla kolmeen suuntaan (kolminapaisena), tämä päätellä jakaantumiskuvio, jonka kautta kaksi tytär kromosomien erillisiä yhteen tytärsolut, kun taas yksi tytär kromosomin erillisiä jokaiselle kaksi muuta tytärsoluksi (

eli

2-1-1 erottelu). Toinen mahdollinen disomic /kolminapaisena erottelu kuvioita (4-0-0, 3-1-0, ja 2-2-0) olisi kaikki tulos ainakin yhdessä nullisomic tytärsolu ja ei täten olisi sopusoinnussa erottelu haploidisoluissa sarjoiksi.

Voit testata, onko erottelu malleja yksittäisten kromosomien ihmisen moninapaista solunjakautuminen noudatettiin periaatteita euploid erottelun, käytimme kaksi hyvin tutkittu syövän solulinjoja, joissa mitoosi multipolarismi on liitetty kromosomi epävakaus (CIN),

eli

WiT49 peräisin anaplastinen Wilmsin kasvain 7% MM [10], [26] ja SW480 peräisin kolorektaalisyövän 4% MM [27], [28]. Jotta vertailla syöpäsolulinjat ei-neoplastisia kuolemattomien solujen, me myös adenovirus-transformoitu ihmisen alkion solulinjaa HEK293 monimutkaisen karyotyyppi ja 1% MM [29]. Näissä solulinjoissa, rajat merkinnät DNA ja karan pylväät beeta-tubuliinin vasta-aineita, osoitti, että suurin osa moninapaisen solunjakautumisten olivat joko kolminapainen tai tetrapolar, kun taas 10% MM oli korkeampi polaarisuus numero (kuvio 1A-D ). Kunkin solulinjan sentromeerien kaksi kromosomia, jotka oli osoittanut vain vähän solujen välisen rakenteellisen heterogeenisyyden [10], [28] leimattiin fluoresenssi in situ -hybridisaatiolla (FISH): kromosomien 12 ja 17 WiT49, X ja 18 SW480, ja 3 ja 4 HEK293, vastaavasti. Tämä valinta tehtiin minimoimiseksi sekoittavia päässä Anaphase sillan ja muut mitoosi poikkeavuuksia ensisijaisesti johtavat poikkeavuuksia kromosomin rakenne. Sitten seulottiin jakelun näistä kromosomeista klo Anaphase kaksisuuntaisen mitoosin ja MM.

kromosomi 12 erityinen alfa-satelliitin koetin (vihreä) yhdistettynä immunofluoresenssimenetelmällä beta tubuliinin (punainen) ja DNA-counterstaining by DAPI ( sininen) näyttää tetrasomic /kaksisuuntainen solunjakautumisen at metafaasissa /varhaisessa Anaphase (A) ja myöhäinen Anaphase (B) ja disomic /kolminapaisena solunjakautumista at metafaasissa (C) ja telophase (D); jakaantumiskuvio on 4-4 (B) ja 3-1-0 in (D). Time-lapse mikroskopiaan

H2B /GFP

transfektoitujen HEK293-soluissa näyttää peräkkäin kolminapainen metafaasivaiheeseen kokoonpano (E; pylväät merkitään ac) kahden peräkkäisen kromosomi eriytymistä tapahtumia neljä tytär ytimiä ja siitä tetrapolar metafaasivaiheeseen kokoonpano (F) kautta kolminapaisena ana-telophase kolmeen tytär ydinten esitetty kolmiulotteinen rekonstruktio konfokaali kuvan pino T = 40 min (T, aika ensimmäisestä kuva).

Euroopan euploid erottelu malli voi olla vääräksi

yhteensä 15 490, 9 000, ja 36 667 mitoosien seulottiin SW480 WiT49, ja HEK293 vastaavasti ja ana-telophase solut valittiin analysoitavaksi kromosomin erottelun (taulukko 1). Voit testata tarkkuutta koetin järjestelmän ensin seulotaan morfologisesti normaali kaksisuuntainen ana-telophases, jossa 01:01 eriytyminen voidaan olettaa. Kaikki nämä solunjakautuminen (2 323, 1 350 ja 5 500 solua WiT49, SW480 ja HEK293, vastaavasti) osoitti yhtä monta kromosomien kahdessa tytär napaa (kuvio 1 B). Näytteenotto moninapainen anaphases Sitten tehtiin myös disomic solut SW480 ja disomic sekä tetrasomic soluja WiT49 ja HEK293. Syynä tähän valintaan on, että SW480 10% soluista osoitti kopioluvun erilainen kuin 2, mutta WiT49 ja HEK293 noin 20% soluista oli tetrasomic valitun kromosomeja. Kaikkiaan 158, 54, ja 49 analysoitiin moninapainen Anaphase solujen WiT49, SW480, ja HEK293 vastaavasti pisteytettiin. Harvoja poikkeuksia lukuun ottamatta moninapaisen solujakaantumisia johti epätasainen kromosomien segregaatiota joukossa tytär soluja (kuvio 1 D). Yhteenvedon tiedot disomic /kolminapaisena alueet, 2-1-1 erottelu oli yleisintä (43%), jota seurasi 3-1-0 (28%), 2-2-0 (23%), ja 4-0- 0 (6%) Suotautumat. Niistä tetrasomic /kolminapaisena solun rajapintoja, 3-3-2 erottelu oli yleisin (22%), jota seurasi 4-3-1 (20%), ja 4-2-2 (18%), kun taas muissa kokoonpanoissa oli taajuuksilla 10%. Lopuksi, että disomic /tetrapolar kokoonpanoissa 2-1-1-0 kokoonpano (42%) oli yleisin, kun taas tetrasomic /tetrapolar solujen 4-2-2-0, 3-2-2-1 , ja 2-2-2-2 konfiguraatiot (kukin 19%) olivat yleisimmät.

Niinpä vastoin tavanomaista kaksisuuntainen mitoosia, MM tyypillisesti johti epätasainen copy-numero tutkittu kromosomien tytär soluissa. Lisäksi useimmat moninapainen mitooseja johtanut merkittävään solujen osuus, joissa nullisomy ainakin yksi tytärsolujen: 55% (78/143) ja disomic /kolminapaisena, 31% (26/85) ja tetrasomic /kolminapaisena, 92% ( 11/12) ja disomic /tetrapolar, ja 48% (10/21) ja tetrasomic /tetrapolar mitoosien, vastaavasti. Tämä kumoaa hypoteesia, että moninapainen solujakaantumisia transformoiduissa solujakaantumisia voidaan mallinnettu euploid kromosomi eriytymistä malleja löytyy ei-transformoiduissa soluissa [25].

DNA sisällön moninapaisessa tytärsoluksi on erittäin vaihteleva

määrittää koko jakelu DNA moninapaista ana-telophases, WiT49 valittiin lisäanalyysiä varten, koska tämä solulinja sisälsi korkein taajuus MM. Aiemmat tutkimukset DNA-sisällön kasvainsolun mitoosien on suorittanut Feulgen värjäytymistä kaksiulotteinen asetus [30]. Kuitenkin, MM on usein suurempi kromatiinin tilavuus kuin normaali mitoosien, joiden halkaisija on enintään 100 um, ja monimutkainen kolmiulotteinen rakenne [31]. Voidakseen määrällisesti suhteellisen DNA-pitoisuus tytär ana-telophases näissä olosuhteissa, haimme fluoresenssi kvantifiointiin DAPI-leimatun DNA multiphoton poikkileikkaustoiminnoilla mikroskoopilla. Tämä tekniikka tarjoaa korkean spatiaalisen resoluution kuvantamisen kolmiulotteisessa ympäristössä johtuen epälineaarinen signaali sukupolvi laserin tarkennus [32]. Lokalisoitu heräte pienentää huomattavasti out-of-keskittyä fluoresenssi ja valovalkaisukykyä. Esineellistää analyysi edelleen, useita erilaisia ​​kynnysarvoja DAPI-intensiteetin valittiin, joka ulottuu lähellä kohinaa. Kunkin kynnysarvon, määrän suhde fluoresenssin kullakin alueella, että ensimmäinen alue laskettiin. Keskiarvonilmaisimella suhteellinen DNA-pitoisuus kussakin ana-telophase napa laskettiin sitten keskiarvo tulokset kaikki kynnysarvot (kuvio 2A-C).

Uudelleenkoottu kolmiulotteisen multiphoton poikkileikkaustoiminnoilla kuvia bipolaarisen (A) ja moninapainen (B) telophase solussa WiT49 osoittaa epäsymmetrinen DNA-jakauma jälkimmäisessä kokoonpano. Kvantifiointi suhteellisen määrän chromatin (C) kaksisuuntaisen mielialahäiriön (musta), kolminapainen (punainen) ja tetrapolar (vihreä) ana-telophase solujen vahvistaa laaja vaihtelu DNA-pitoisuus moninapaista tytär solujen (X-akseli esittää paremmuusjärjestyksessä mukaan DNA sisältöä). Mittaaminen osuus BrdU-positiivisten kaksisuuntainen (sininen) ja moninapainen (punainen) mitoosi soluissa eri ajankohtina leimauksen jälkeen (D) ilmaisevat viivästynyt poistuminen mitoosin for moninapaista solun jakautumisen WiT49 ja HEK293 (virhe palkit osoittavat keskihajonta). Viivästys kuvantamisen H2B /GFP HEK293 osoittavat pitkittynyt metafaasissa-Anaphase välein, ja alennettu Anaphase-interphase aikaväli moninapainen verrattuna kaksisuuntaisen solujakaantumisia (E); yhden ja kahden hengen Tähdet osoittavat merkitsevyyttä 0,05 ja 0,01 tasoja vastaavasti (Mann-Whitney U-testi). Yhden minuutti- Viivästys kuvantaminen (F) 12 moninapaista mitoosien, joista kukin vastaa virtauksen värjäytyneet nuolet, näyttää usein napaisuus muunnokset (I = interphase, PM = prometaphase, M2 = kaksisuuntainen metafaasissa, M3 = kolminapainen metafaasissa, M4 = tetrapolar metafaasissa, A = Anaphase, T = telophase). Kvantifiointi koko intensiteetin mielivaltainen fluoresenssiyksiköinä suhteessa centrosomal gamma tubuliinin fluoresenssi (G) esittää voimakas väheneminen separase tasojen telophase verrattuna metafaasissa kaksisuuntaisen muttei moninapaista solujakaantumisia (virhe palkit osoittavat keskihajonta). Diplochromosomes (H, nuolet) G-porrastettuja osittainen metafaasiin leviää WiT49.

Menetelmää testattiin ensin 20. metanolilla kiinnitettyjen morfologisesti normaali tytär ana-telophases kaksisuuntaisesta solunjakautuminen. Näiden suhteellinen DNA-pitoisuus yksittäisten napojen verrattuna kokonaismäärään kromosomaalisen DNA: n kunkin solun jakautumisen oli noin 50%, mikä vastaa hyvin odotettua 01:01 erottelua. Sitten arvioitiin tytär pylväiden kolminapaisena ja tetrapolar ana-telophases, vastaavasti. Tässä suhteellinen DNA-pitoisuus tytär ana-telophases osoittivat laajaa vaihtelua, 18-46% koko solun DNA sisällön kolminapaisena osastojen ja 16-34% vuonna tetrapolar osastojen. Se, että DNA ei erottuvat vakaa, toistuvat suhteet tukee lisäksi ei-euploid malli kromosomi eriytymistä ja osoitti suurta epäjärjestyksestä näissä solunjakautuminen.

Moninapainen metafaasissa pitkittyy ja läpi polaarisuus kytkimet

näennäisesti monimutkainen käyttäytyminen kromosomien MM sai meidät tutkimaan ajan kurssin moninapainen verrattuna kaksisuuntainen mitoosien. Arvioidaan kokonaiskeston mitoosissa, ensin merkitty kromosomien WiT49 ja HEK293-soluissa bromideoksiuridiinia (BrdU). Sen jälkeen solukierron pysähtymisen seerumin nälkään, BrdU liitettiin 1 h seerumin-rikas väliaine, minkä jälkeen solut kerättiin joka toinen tunti. Mitoosi solu-allas, joka oli ollut S-vaiheen aikana merkintöjä aikana havaittiin sitten anti-BrdU-vasta-aineita. Niistä kaksisuuntainen mitoosien molemmissa solulinjoissa, leimattu solun altaan muodostivat enemmistön jakautuvien solujen 4 h, kun taas hyvin harvat leimattuja mitoosi soluissa jäi jälkeen 8 h (kuvio 2D). Niistä MM leimattu solupopulaatio myös huipussaan 4 h kuluttua, mutta pysyi sen jälkeen muodostavat suuren osan jakautuvien solujen jopa 8 h. Tämä osoitti, että MMS kesti merkittävästi pidempään kuin kaksisuuntainen solujakaantumisia poistu mitoosin.

Validoida tämä havainto loimme vakaa HEK293 transfektantissa ilmentämään histoni-2B /vihreä fluoresoiva fuusioproteiini, joka mahdollistaa reaaliaikaisen seurannan aikana kromosomien solunjakautumisen (Elokuva S1) [33]. Sitten seurasi 10 kaksisuuntainen ja 12 moninapainen solujakaantumisia välillä prometaphase myöhempään interphase ja mittasi välein aloittamisesta metafaasivaiheeseen metafaasin-Anaphase siirtyminen ja metafaasissa-Anaphase siirtyminen telophase-interphase siirtyminen. Kaksisuuntaisen rajapintojen välin aloituksesta metafaasissa alkuun Anaphase oli 34 min (vaihteluväli 23-49), kun taas MM se oli erittäin vaihteleva, mutta kaiken kaikkiaan huomattavasti laajennettu (P 0,05, U-testi), jossa on keskiarvo 91 min (vaihteluväli 16-220 min, kuvio 2E). Sen sijaan aika aloittamisen Anaphase kunnes interphase oli hieman lyhyempi MM kuin kaksisuuntaiseen mitoosien (keskiarvo 23 min verrattuna 32 min; P 0,01).

Niistä 12 moninapaista mitoosien että seurattiin, yksi ei erottuvat tytär soluihin, mutta pidätettiin kolminapaisena metafaasissa ja sitten palasi InterPhase (kuvio 2F). Lopuista 11 soluja, neljä koki joko kolminapainen tai tetrapolar mitoosia ilman muutosta kokoonpanon. Muut seitsemän solut osoittivat yhden tai useamman polariteetin kytkimiä. Yksi solu tehtiin kromosomi erottelu kahdessa erillisessä vaiheessa, ensin menee kolminapaisena metafaasissa ja kolminapaisena Anaphase joissa yksi kolmesta napojen jälleen jaettu, yhteensä tuottavat neljä tytär ytimet (kuva 1 E; Elokuva S2). Muut kuusi solut siirrettiin eri metafaasissa kokoonpanoissa ennen siirtymistä Anaphase (kuvio 1 F, elokuvat S3 ja S4). Niistä 11 solut, jotka oli seurata prometaphase kautta telophase, kolme ei näytä selvään Anaphase pylväät, näennäisesti kulkee monimutkainen metafaasissa kokoonpano suoraan kaksi telophase (Elokuva S5), jossa aika näiden vaiheiden ollessa 10 minuuttia tai vähemmän. Koska aika-raukeavat kuvantaminen tehtiin vain kahdessa ulottuvuudessa, sitä ei voida sulkea pois, että ainakin osa havaitusta napaisuudesta siirtymät johtuivat kääntää mitoottista luvut Z-tasolla, vaikka mitään tällaista kierrosta olivat selviä. Kuitenkin, meidän tiedot osoittivat, että dynamiikka MM poikkesi kaksisuuntaisesta mitoosia, tyypillisesti pidemmän metafaasiin kesto jossa napaisuus kytkimet saattaa esiintyä.

Sister-kromatidin erottaminen on unsynchronized vuonna moninapainen mitoosien

epäsäännöllinen ja nopea siirtyminen metafaasissa ja telophase-interphase MM, ja puuttuvat selkeät Anaphase kokoonpanoissa joissakin soluissa osoitti että sisar-kromatidin erottaminen ei ehkä tapahdu tietyllä tavalla. Valvomaan sisarkromatiinin erottaminen yksityiskohtaisemmin MM käytimme sentromeerisen koetin edellä kuvatun järjestelmän ja valittu myöhään metafaasissa /aikaisin Anaphase solujen analyysiä varten, jossa ainakin yksi pari sisko sentromeerien in metafaasivaiheen /aikaisin Anaphase levy oli irronnut, mistä on osoituksena kohta kohdalta FISH-signaaleja kaksinkertaisen pisteen muodostumisen. Sekä WiT49 ja HEK293, valtaosa (97% ja 98%, vastaavasti, taulukko 2) solujen kanssa kaksisuuntainen kokoonpano, jossa yksi sentromeerin oli erotettu osoitti erottamisen myös muista sentromeeristä (s), joka ilmaisee hyvin koordinoitu metafaasi -anaphase siirtyminen näissä soluissa. Vuonna moninapainen solut WiT49 ja HEK293, valitaan samalla kriteerit, alle puolet analysoitu solunjakautumisten olivat samalla koordinoitu. Itse asiassa 59% ja 55%, vastaavasti, näiden solujen näytteillä erottaminen vain osa tutkitun sisko sentromeerien kun taas toiset pysyi erottamattomat (kuvio 3A). Sisarkromatiinin MM oli siis usein unsynchronized, verrattuna normaaliin solunjakautuminen.

Kalojen etsintä (A) kromosomissa 17 centromere (vihreä) yhdistettynä immunofluoresenssimenetelmällä beta tubuliinin (punainen) osoittaa erottaminen sisar sentromeerien of yksi (nuoli), mutta ei muita homologin (nuolenkärki). Immunofluoresenssimenetelmällä havaitseminen separase (oranssi) ja beeta tubuliinin (vihreä) näyttää paikallistaminen separase karaan navat metafaasissa (B) ja varhainen Anaphase (C) ja heikko intensiteetti värjäytymistä keskiosalla klo telophase (D). Kolokalisaation separase (punainen) ja sentrosomien (gamma tubuliinin vihreä) havaitaan varhaisessa kaksisuuntainen Anaphase (E, ylhäällä vasemmalla), kun useita muita separase pesäkkeitä ovat läsnä viereisessä tetrapolar varhainen Anaphase cell (E, alhaalla oikealla). Co-merkitseminen separase (oranssi) ja beeta-tubuliinin (vihreä) vahvistaa tämän päätelmän (F, tetrapolar at vasemmassa yläkulmassa ja kaksisuuntaisen alemmilla oikealla), ja näyttää köyhtyminen separase on kaksisuuntainen telophase solu (G, oikealla) ja useat pesäkkeitä pysyvät tetrapolar telophase solu (G, vasen). Immunofluoresenssimenetelmällä varten CCNB1 (vihreä) ja AURKA (punainen) tuottaa sytoplasmista värjäytymistä kaksisuuntaisessa (H) ja moninapainen (J) metafaasisoluihin kun mikään värjäytymistä havaittavissa bipolar (I) ja moninapainen (K) Anaphase soluja; AURKA värjää pericentrosomal alueet sekä metafaasissa ja Anaphase. Immunofluoresenssimenetelmällä beta tubuliinin (vihreä) ja AURKB (punainen) osoittaa lokalisointi AURKB yksinomaan sentromeerien on kaksisuuntainen (L) ja moninapainen (M) metafaasissa, ja ainoastaan ​​kara midzone on kaksisuuntainen anafaasia (N); toisin moninapaisen ana-telophase soluja (O, P) näytteille AURKB että midzone sekä useita kromosomeja, mikä osoittaa, ettei erottaa sisar kromatidia joidenkin kromosomeja (O, nuoli). Immunofluoresenssimenetelmällä beta tubuliinin (vihreä) ja MAD2L1 (punainen) osoittaa MAD2L1 lokalisointi sentromeerien on kaksisuuntainen prometaphase (Q); at kaksisuuntainen ana-telophase MAD2L1 pesäkkeitä on läsnä vain kromosomia ei sisällytetty mitoosi prosessissa (R, nuoli), ottaa huomioon, moninapainen ana-telophase, useita MAD2L1 pesäkkeitä ovat läsnä kromosomien (S).

Moninapainen metafaasissa-Anaphase siirtymä tapahtuu kehräkokoonpanon tarkistuspiste luistoa

tutkimiseksi edelleen metafaasissa-Anaphase siirtyminen MM, havaitsimme solunsisäistä lokalisoinnin ESPL1 (separase) proteiini eri vaiheissa solunjakautumisen . Nisäkässoluissa, tämä proteaasi tarvitaan normaaliin sisarkromatidin erottaminen pilkkomalla cohesin n kleisin alayksikköä, mutta se ei ole välttämätöntä muiden näkökohtien mitoosi etenemistä, kuten sytokineesiin [34]. Ihmisen separase asuu pääasiassa noin keskusjyvänen myöhään anafaasia, kun se hajoaa autokatalyyttisen prosessin laukaisee oman aktivointi anafaasia edistävän kompleksin [35] – [38]. Immunofluoresenssi (IF) havaitseminen vastaisella vasta-aineella keskiosassa separase (aminohapot 1200-1300) kaksisuuntaisen mitoosien alkaen WiT49, HEK293, ja ohjaus solulinjat ilman MM (fibroblastien ja CHP212 neuroblastoomasolujen) vastaavasti johti fluoresenssi rajoittuu karan navat metafaasissa ja varhainen Anaphase (kuvio 3B ja C). Kaksisuuntaisen metafaasissa, oli myös satunnaisesti ylimääräistä separase pesäkkeitä paikalla sukkularihmaston ja päällekkäin sijainti kromosomien, samanlainen jakeluun aiemmin raportoitu hiivasoluissa ilmentävät separase-GFP-fuusioproteiini, [39]. Kaksisuuntaisen telophase soluissa, separase oli hävinnyt näistä paikoista ja voi vain havaita vähemmistö (1-10%) soluista osoittaa heikko signaali keskiosalla (kuvio 3D). Edelleen määräarviota solun separase fluoresenssia 30 kaksisuuntaisen solujakaantumisia kustakin solulinjasta osoitti huomattavaa vähentämistä at telophase, odotetusti normaalista separase seurannut aktivoituminen autokatalyyttisillä hajoaminen (P 3 x 10

-5 kaikissa solulinjoissa, t-testi, kuvio 2G). Separase jälkeen havaittujen ja mitattujen moninapainen metafaasissa ja varhainen Anaphase solujen WiT49 ja HEK293 (21 ja 15 solut määrällisesti, tässä järjestyksessä). Samanlaisia ​​kaksisuuntainen rajapintoja, separase paikalla sentrosomien näissä rajapinnoissa, mutta extra-centrosomal fluoresenssi oli jyrkempi kuin kaksisuuntaisessa alueet (kuvio 3E ja F). Jyrkässä ristiriidassa kaksisuuntainen soluja, moninapainen telophase solut säilytetään sekä centrosomal ja kara-sijaitsee separase ja koko separase fluoresenssi ei vähentynyt tässä vaiheessa verrattuna metafaasissa (kuviot 2G ja 3G, P = 0,83 ja 0,37 WiT49 ja HEK293 vastaavasti ).

epätäydellinen hajoaminen separase vuonna telophase soluissa osoitti, että moninapainen solujakaantumisia pystyivät ohittamaan kehräkokoonpanon tarkistuspisteen (SAC), joka normaalisti estää metafaasissa-Anaphase siirtyminen ennen kuin kaikki Kinetokori on kiinnitetty vastakkaisiin kara pylväät. On On raportoitu, että SAC selkärankaisten soluja ei pidättää mitoosi prosessi pysyvästi. Itse asiassa solut voidaan mahdollisesti ajetaan mitoosin jonka mukaan proteasomin riippuvan hajoamisen sykliini B (CCNB) [40]. Sen arvioimiseksi, onko tämä ilmiö voisi selittää, miksi moninapaista mitoosien edennyt Anaphase huolimatta epätäydellisen separase sykli, CCNB1 ja CCNB2 havaittiin monoklonaalisia vasta-aineita kaksisuuntaisessa ja moninapainen mitoosien vuonna WiT49 ja HEK293. Solut rajat leimattiin Aurorakinaasi A (AURKA) vasta-aineita, jotta helposti tunnistaa jakamalla soluja. AURKA paikantuu pääasiassa pericentriolar Se ilmaisi alkaen, kun sentrosomimäärän päällekkäisyyttä G2 kunnes mitoosi exit [41]. Kuten odotettua, suurin osa kaksisuuntainen prometaphase ja metafaasisoluihin olivat vahvasti positiivisia CCNB1 ja CCNB2, kun kaksisuuntainen Anaphase solut olivat negatiivisia molemmissa solulinjoissa (kuvio 2 H ja I; P 7 x 10

-15 pro /metafaasissa versus Anaphase; Fisherin testiä; 69-197 solua teki kussakin solulinjassa). Samoin moninapainen prometaphase ja metafaasisoluihin olivat positiivisia, kun taas kaikki Anaphase solut olivat negatiivisia sekä CCNB1 ja CCNB1 (kuvio 3J ja K; P 2 x 10

-4; 20-55 solu sijoitettiin).

edelleen testata hypoteesia, että MMS voisi siirtyy metafaasissa ja Anaphase mukaan CCNB hajoamisen huolimatta jättämisestä täysin tyydyttää SAC, aurora-kinaasin B (AURKB) ja MAD2L1 havaittiin immunofluoresenssilla WiT49 kaksisuuntainen ja moninapainen mitoosien. Normaali metafaasissa, AURKB paikantuu sentromeerien kunnes bi-suuntautunut kiinnitys Kinetokori saadaan, jonka jälkeen se sijoittuu uudelleen karan midzone on ana- ja telophase [41]. Ei tiedetä tarkasti, miten tämä siirtäminen on säännelty, mutta on ehdotettu, että jännitteitä bi-suuntautunut sisko kromatidia sequesters AURKB sisemmässä centromere, mikä rajoittaa saavutettavuuden tämän kinaasin sen alustoille ja lievittää kehräkokoonpanon tarkastuspiste [42] . MAD2L1 etsii sen Kinetokori kromosomien jotka eivät ole vielä bi-suuntautunut, ja viiveet Anaphase puhkeamista sitoutumalla ja estämällä CDC20 kunnes kaikki kromosomit mukautettu metafaasivaiheen levylle; kun normaali metafaasissa-Anaphase siirtyminen, MAD2L1 ei enää havaittavissa sentromeerien [43]. Niinpä immunofluoresenssimenetelmällä varten AURKB värjäsi sentromeerisen alueilla kaikkien kromosomien kaksisuuntaisen ja moninapainen WiT49 prometaphase ja metafaasisoluihin (kuvio 3L ja M) ja karan midzone useimmissa (97%) kaksisuuntainen Anaphase soluja (kuvio 3N). Sen sijaan suurin osa (76%) moninapaista ana-telophase solut osoittivat AURKB pesäkkeitä ei pelkästään midzone mutta säilytti värjäys joissakin kromosomeissa (kuva 3 O ja P; P 1,1 x 10

-16 kaksisuuntaisen vs. moninapaista ; 189 ana-telophases sijoitettiin). Joissakin Anaphase soluissa AURKB pesäkkeitä oli selvästi näkyvissä kromosomeja, joissa erottamattomat sisko kromatidia (kuvio 3O). Kuten odotettua, MAD2L1 pesäkkeitä havaittiin on sentromeerien kaksisuuntaisen ja moninapainen prometaphase soluja (kuvio 3Q). Kaksisuuntaisen ana-telophase solut MAD2L1 pesäkkeitä havaittiin vain harvoissa solujakaantumisia kanssa kromosomi jääneet (kuvio 3R) ja suurin osa (97%) morfologisesti normaali kaksisuuntainen ana-telophases olivat MAD2L1-negatiivisia. Sen sijaan suurin osa (92%) moninapaista ana-telophases osoitti kahden tai useamman MAD2L1 pesäkkeitä (kuva 3 S; P 2 x 10

-17 kaksisuuntaisen vs. moninapaista, 168 ana-telophases sijoitettiin). Siten MMS pystyivät hajottamaan CCNB ja poistu mitoosin ilman maailmanlaajuisesti täyttävä SAC, mistä on osoituksena säilyttäminen AURKB ja MAD2L1 pesäkkeet joissakin ana-telophase kromosomit.

Kyky kehräkokoonpanon tarkistuspiste liukumista ei rajoitu moninapaista mitoosien

käsitellä sitä, kyky kiertää SAC on rajoitettu moninapaista solunjakautuminen, olemme alttiina normaalien fibroblastien ja WiT49 solujen kara-häiritsevää ainetta Kolkisiinia 18 tuntia, minkä jälkeen solut värjättiin vasta-aineilla AURKA ja CCNB1. Jälkeen Kolkisiinia altistuminen fibroblastien suhde CCNB-positiivisia metafaasisoluihin ja CCNB-negatiivisten ana-telophase solujen (M /A) siirretään dramaattisesti 1,8 (133/74) 15,2 (214/14). Altistumattomilla WiT49 M /A-suhde oli 2,0 (528/258) kaksisuuntaisen mitoosien, kun se oli 5,9 (100/17) ja MM (P 2 x 10

-5 kaksisuuntaisen vs. moninapaista). Alempi taajuus ana-telophase kokoonpanoissa keskuudessa moninapainen mitoosien on yhdenmukainen metafaasiin pitkittymisen verrattuna Anaphase MM. Sen jälkeen Kolkisiinia altistuminen, M /A-suhde kasvoi sekä kaksisuuntainen ja moninapainen WiT49 mitooseja, 50,3 (302/6) ja 27,5 (110/4), vastaavasti, joilla ei ole merkittävää eroa (P = 0,47). Siten pieni osa (2-6%) ja mitoosien sekä fibroblasteissa ja WiT49 solut pystyivät ohittamaan kehräkokoonpanon Checkpoint riippumatta napaisuus, mikä osoittaa, että tämä tarkistuspisteen liukumista mekanismi ei ole ainutlaatuinen moninapaista mitoosien.

Checkpoint luistoa johtaa usein nondisjunction vuonna moninapainen mitoosin

havainto, että moninapainen mitoosien poistui mitoosin ilman täydellistä separase aktivointia ja säilytti kromosomi MAD2L1- ja AURKB pesäkkeitä ennusti, että ainakin jotkut kromosomien tuloksena tytär solut koostuisivat sisko kromatidia että pysyi kiinni heidän sentromeerien. Tällaiset diplochromosomes on kuvattu ominaisuus separase-poistetaan solut ja ne on otettu todisteena siitä, että separase on tarpeen sisarkromatidin erottaminen [34]. [9].