Krooninen sairaus

tiivistelmä

EMT (epiteelin-mesenkymaalitransitioon) on ratkaisevaa syöpäsolujen hankkia invasiivisia fenotyyppejä. A549 keuhko adenokarsinoomasolua, TGF-β esiin EMT in Smad-riippuvaisella tavalla ja TNF-α nopeuttanut tätä prosessia, mikä vahvistetaan solujen morfologia, ilmaus EMT markkereita, kapasiteetti liivate hajoamiseen ja solujen invaasiota. TNF-α stimuloi fosforylaatiota Smad2 Kytkijäalue, ja tämä vaikutus oli heikennetty estämällä MEK tai JNK-reitin. Kattava ilmentymisen analyysi purkaa geenien differentiaalisesti säätelee TGF-β: n ja TNF-α, kuten sytokiinien, kemokiinien, kasvutekijät ja ECM (matriiseina), mikä viittaa siihen, jyrkkä muutos autokriininen /parakriininen signaaleja sekä solu-ECM vuorovaikutusta. Integroitu analyysi mikroRNA allekirjoituksen meille mahdollisuuden tunnistaa osajoukko geenien, mahdollisesti säätelee MikroRNA. Niistä, olemme vahvistaneet TGF-β-välitteinen induktio miR-23a keuhkoepiteelin solulinjoissa, kohdegeenien, jotka tunnistettiin edelleen geenin ilmentymisen profilointi. Yhdessä in silico lähestymistapoja, päätimme HMGN2 alavirran kohteena miR-23a. Nämä havainnot tarjoavat rivi näyttöä siitä, että vaikutukset TGF-β ja TNF-α oli osittain välittyy MikroRNA, ja valottavat monimutkaisuus molekyylitason tapahtumien aikaansaama TGF-β ja TNF-α.

Citation : Saito A, Suzuki HI, Horie M, Ohshima M, Morishita Y, Abiko Y, et ai. (2013) yhdennetty Expression Profilointi paljastaa kohdegeenien TGF-β ja TNF-α Mahdollisesti Tukena MikroRNA Lung Cancer Cells. PLoS ONE 8 (2): e56587. doi: 10,1371 /journal.pone.0056587

Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Lasten Hospital Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 30 elokuu 2012; Hyväksytty: 11 tammikuu 2013; Julkaistu: 20 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Saito et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat KAKENHI (Grants-in-tuki Scientific Research) alkaen opetus-, kulttuuri-, urheilu-, tiede-, ja tekniikka ja avustukset terveysministeriön, Labour and Welfare of Japan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yleisin syöpä tyyppi, joka aiheuttaa kuoleman yli miljoona ihmistä joka vuosi. Ymmärtäminen molekyyli tapahtumia, jotka säätelevät invasiivisen /metastaattinen syöpäsolujen leviämiseen on ratkaisevan tärkeää kehittää uusia terapeuttisia keuhkosyöpään. Epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) on eriyttäminen kytkin ohjaa epiteelisolujen hankkia mesenkymaalisten fenotyyppejä, joka pelaa avainroolit alkionkehityksen aikana sekä syövän invaasio /etäpesäke. Tunnusmerkki EMT on E-kadheriinin downregulation ja myöhemmin menetys solu-solu kiinnikkeistä, joka on yhdessä lisääntyneen ilmentymisen mesenkymaalisten markkereita mukaan lukien N-kadheriinin ja vimentiinista. Lisäksi EMT liittyy solujen morfologisia muutoksia ”cuboidal ’to’ kara-tyyppisiä esiintymisiä, jotka vastaavat aktiini uudelleenjärjestely ja cytoskeltal muutoksia, jotka johtavat hankintaan fibroblastien kaltainen muuttavien fenotyyppi [1], [2].

Transforming kasvutekijä (TGF) -β on keskeinen rooli säätelyssä EMT ja esittelee sen dalmatialaistäpläisiä sitoutumalla reseptoreihin tyypin I (TβR-I) ja tyypin II (TβR-II). Ligandin indusoima Heteromeerisen kompleksin muodostuminen TβR-I ja TβR-II, TβR-I fosforyloituu TβR-II ja välittää erityinen solunsisäinen signalointi kautta fosforylaation reseptorin-säänneltyjen Smad: ien (R-Smad: ien: Smad2 ja Smad3 TGF-β) . Fosforyloitua R-Smad: ien vuorovaikutuksessa Smad4 ja translokoituvat tumaan, jossa ne säätelevät kohdegeenien transkription [3], [4]. TGF-β on usein yli-ilmentynyt kasvainkudoksissa, ja helpottaa syövän etenemisen kautta monipuolinen ohjelmistoon kasvainsolulyysiksestä-autonominen ja isäntä-kasvain vuorovaikutuksia, mukaan lukien parantaminen solun liikkuvuus ja invaasio, johon liittyy parhaillaan EMT [5].

Kertyvät todisteita purkaa molekyylitason mekanismeja, joilla tulehdusreaktioita edistävät syövän etenemistä [6]. Tuumorinekroositekijä (TNF) -α on yksi voimakkaimmista proinflammatoristen sytokiinien tuotetun kasvaimen mikroympäristössä. Kun stimulaatio, aktivoitu IKK (IKB-kinaasi) fosforyloi NFKB estäjä (IKB) ja laukaisee sen nopea hajoaminen kautta proteasomin proteolyysin, mikä johtaa vapautumisen NFKB, joka sitten siirtyy tumaan ja indusoi lukemattomia geenin ilmentymisen mukana immuunivasteen [7 ]. Panos NFKB signaloinnin aloittamiseen ja etenemistä syöpä on selvästi dokumentoitu, ja useita rivejä todisteita osoittavat, että TNF-α ja /tai NFKB signaloinnin avainasemassa säätelyssä EMT [8], [9], [10 ].

Ei-koodaavat MikroRNA (miRNA) kiinnitetään yhä enemmän huomiota avaintekijät solusignalointia, jotka säätelevät ekspressiotasoja useiden proteiineihin, pääasiassa sitoutumalla 3’alue (UTR) tavoitteiden. Tärkeitä rooleja miRNA on esitetty kasvainprogression moduloimalla solujen erilaistumisen, lisääntymistä, invaasiota ja etäpesäkkeiden. MicroRNA-200 (miR-200) ja miR-205 ovat kriittisesti mukana säilyttäen epiteelisolujen fenotyyppi ja vaimennetaan TGF-β [11]. On myös raportoitu, että miR-21 ja miR-31 synergisesti aiheuttama TGF-β: n ja TNF-α, jotka helpottavat syöpäsoluinvaasiota [12].

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että TNF-α parantaa TGF- β-välitteisen EMT keuhkosyövässä /epiteelisolujen [13], [14], [15], mikä viittaa mahdollisen ylikuulumisyhdistelmää näiden signaaleja. Kuitenkin tiedetään vähän molekyylitason tapahtumia miten nämä signaalit järjestettyjä moduloida EMT. Olemme aiemmin osoittaneet, että TGF-β indusoi EMT A549 keuhkoadenokarsinooma soluihin [16], jotka tarjoavat sataman aktivoivan K-ras-mutaation ja muodostaa kasvain hyvin erilaistunut adenokarsinooma histologia kun ihon alle ruiskutetaan immuunivasteeltaan hiiriin [17], [18] . Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet taustalla olevien mekanismien EMT välittämien TGF-β: n ja TNF-α A549-soluissa. Etsimään kohdegeenien ja miRNA, suoritimme kattavan ilme analysoidaan yhdessä in silico seulonta. Nämä tiedot rajattu osajoukkoja geenien differentiaalisesti tai yhteistyössä säätelee TGF-β: n ja TNF-α, ja tunnistaa miR-23a kuin miRNA kohteena TGF-β. Nämä analyysit edelleen hiljaista mahdollisuutta, että osajoukko TGF-β kohdegeenien voitaisiin säädellä miRNA valotetaan monimutkaisuudesta molekyylitason tapahtumien aikaansaama TGF-β ja TNF-α keuhkojen syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit ja vasta-aineet

TGF-β1: n ja TNF-α ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) ja R 0,05 (Studentin t-testi).

Seuraavaksi tutkimme vaikutus TβR-I estäjä, LY-364947. Blockade endogeenisen TGF-β-signaloinnin LY-364947 johti tasaisesti cuboidal solujen morfologia, ja vaikutus eksogeenisen TGF-β selvästi kumottiin läsnä LY-364947. Toisaalta, TNF-α-välitteisen solun morfologista muutosta havaittiin vielä, vaikkakin vähäisemmässä määrin, että solut esikäsitellään LY-364947, joka osoittaa vaikutusta TNF-α yksin kohdistama puuttuessa endogeenisen TGF-β signalointi (kuvio 1A, alempi paneeli).

Nämä morfologiset muutokset kvantitoitiin mittaamalla solun pyöreyden (kuvio 1 B). Soluissa kostimuloiduissa TGF-β: n ja TNF-α, solu- kierron väheni merkittävästi, mikä viittaa siihen, synergisen vaikutus solujen morfologiaan. Kun läsnä on LY-364947, niiden vaikutukset olivat enimmäkseen estyy, mikä kriittinen osuus TGF-β on havaittu synerginen vaikutus.

menetelmä EMT mukana downregulation E-kadheriinin ja säätelyä N -cadherin, joka kutsutaan kuin kadheriinin kytkin [1], [2]. Seuraavissa kokeissa olemme tutkineet ilmentyminen E-kadheriinin ja N-kadheriinin, kuten epiteeli- ja mesenkymaalisten markkereita, vastaavasti. E-kadheriinin ilmentyminen oli enimmäkseen kumottu TGF-β hoito taas TNF-α yksin näkyy marginaalinen vaikutus E-kadheriinin downregulation at proteiinin taso (kuvio 1 C). Yhdenmukainen muutos E-kadheriinin ilmentymisen, N-kadheriinin oli voimistunut käsittelemällä TGF-β tai TNF-α. Lisäksi mukaisesti dramaattisen muutoksen solun morfologiassa, TNF-α parannettu vaikutus TGF-β epiteeli- /mesenkymaaliset markkereita. Vaikutus TGF-β ilmentymiseen E-kadheriinin /N-kadheriinin estyi LY-364947 taas TNF-α-välitteistä säätelyä N-kadheriinin havaittiin myös riippumatta LY-364947 hoitoon.

EMT on mukana parantamiseksi proteaasiaktiivisuuksien jotka helpottavat hajoamista tyvikalvon ja matriiseina (ECM) ympäröivä kasvainsoluja, joka on kriittinen kasvaimen invaasio /etäpesäke. Analysoida proteolyyttistä toimintoa, metalloproteinaasien (MMP: t), että käsiteltyjen solujen TGF-β ja /tai TNF-α, teimme gelatiinitsymografialla (kuvio 1 D). TGF-β parannettu MMP-2, kun taas TNF-α parannettu, että MMP-9. Erityisesti, kostimuloinnilla TGF-β: n ja TNF-α merkittävästi edistänyt toimintaa sekä MMP-2 ja MMP-9, mikä viittaa synergistisen vaikutuksen parantamiseksi MMP toimintaa. Kun läsnä on LY-364947, vaikutus TGF-β oli selvästi inhiboitu, kun taas vaikutus TNF-α parantaa MMP-9-aktiivisuus havaitaan vielä, vaikkakin vähäisemmässä määrin, että ilman endogeenistä TGF-β-signalointia.

tarkastella käytännön seikka EMT, teimme invaasiomääritys, jossa käytetään kammiot päällystetty matrigeelin matkien tyvikalvon. TGF-β tai TNF-α-hoito johti hieman korkeampi määrä valtaavat solujen alapinnalla kammioiden, kun taas kostimuloinnilla TGF-β ja TNF-α johti tehostetun invasiivisia kapasiteetin kanssa edellä havaitut muutokset (kuva 1E). TGF-β hoito epäonnistui parantaa invasiivisia kapasiteettia vankka kuin muutokset EMT markkereita, mikä viittaa siihen, että muutokset markkereita eivät ole suoraan kytkettynä soluun invasiivisuus. Prosessi invaasion erityissuojattu soluliikkuvuus ja proteolyyttisiä toimintoja. Yhdessä tulokset gelatiinitsymografialla, lisääntynyt invasiivisia kapasiteettia soluissa kostimuloiduissa TGF-β ja TNF-α näyttivät liittyvän tehostetun MMP toimintaa.

Yhdessä TGF-β-välitteinen EMT oli selvästi parannettu TNF-α arvioituna solumorfologian, EMT markkereita, liivate lyysin ja solujen invaasiota. TNF-α yksinään voi myös aiheuttaa osa näistä muutoksista vaikka läsnä LY-364947, kuten N-kadheriinin ilmentymisen lisääntyminen ja MMP-9 aktivoinnin. Nämä havainnot sai meidät tutkimaan mahdollisia ylikuulumisyhdistelmää välillä TGF-β ja TNF-α, ja molekyylitason tapahtumia, jotka säätelevät EMT A549-soluissa.

TGF-β-välitteinen EMT on Smad riippuva

Smad: ien ovat merkittäviä anturi TGF-β signalointia; Smad2 ja Smad3 fosforyloivatko TβR-I, ja muoto komplekseja Smad4. Nämä kompleksit kerääntyä tumaan ja säätelevät kohdegeenien transkription [20]. Lisäksi Smad-välitteisen transkription, TGF-β aktivoi muita signa-, kuten MAPK (mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi) reitit [21].

tutkia Smad välittämä signalointi on osallisena säätelyssä EMT A549 solut, me tippuu alas endogeenisen Smad4, joka on yleisesti tarvitaan Smad välittämän transkription säätelyyn. Transfektio siRNA tehokkaasti vaiennettu Smad4 ilmentymistä (kuvio 2A, vasen), ja edelleen tukahdutti ilmentymistä Smad-säänneltyjen kohdegeenien TGF-β, kuten Smad7 ja PAI-1 (plasminogeeniaktivaattori-inhibiittori-1, joka tunnetaan myös nimellä

SERPINE1

) (kuvio 2B). Tässä asetelmassa, TGF-β jättänyt downregulate E-kadheriinin arvioituna kvantitatiivisen RT-PCR (kuvio 2A, oikealla), mikä viittaa siihen, että TGF-β-välittämä EMT säätelee pääasiassa Smad kautta. Nämä vaikutukset varmistettiin vielä immunoblottauksella. TGF-β ole säätelevät vaimentaen E-kadheriinin tai upregulate N-kadheriinin tehokkaasti kontrollina siRNA transfektoiduissa soluissa, kun endogeeninen Smad4 hiljennettiin (kuvio 2C).

(A-B) A549-solut transfektoitiin siRNA: illa Smad4 ( si Smad4), tai negatiivinen kontrolli siRNA: ita (SI NTC) ja viljeltiin 48 tuntia. Soluja viljeltiin edelleen 5 ng /ml TGF-β1 ja /tai 10 ng /ml TNF-α 2 h (B) tai 24 h (A), ja RNA kerättiin. Kvantitatiivinen PCR suoritettiin Smad4, E-kadheriinin, Smad7 ja PAI-1 ilmoitettuina ajankohtina. Expression normalisoitiin että GAPDH. Virhepalkkeja: SD. (C) Solulysaatit kerättiin 48 tuntia sen jälkeen TGF-β1 ja /tai TNF-α hoitoon. Immunoblottaus suoritettiin E-kadheriinin, N-kadheriinin ja Smad4. α-tubuliinin käytettiin latauskontrollina.

TNF-α fosforyloi Smad2 Kytkijäalue

R-Smad ja Smad4 sisältävät konservoitunut N-terminaalista MH1 ja C-terminaali MH2 verkkotunnuksia, reunustavat linkkerin segmentti. Ligandin indusoiman vuorovaikutusta R-Smad: ien aktivoidulla TβR-I tulokset suoraan fosforylaatio C-terminaalisen SSXS motiivin [20], joka on keskeinen tapahtuma on Smad aktivointia. Lisäksi muut kinaasi reitit säädellä Smad signaloinnin kautta fosforylaation linkkerialueeseen R-Smad: ien [21], [22]. Sitä paitsi NFKB signalointi, TNF-α tiedetään tuovan esiin MAPK polkuja, jotka koostui kolmesta subfamilies eli ekstrasellulaarinen signaali säädelty kinaasi (Erk) 1 ja 2, p38 MAPK ja c-Jun N-terminaalinen kinaasi (JNK).

tutkia mahdollisuuksia modulaatioon Smad signalointia TNF-α, tutkimme fosforylaation C-terminaalin tai kytkytfragmenttialueet R-Smad: ien. TGF-β voimakkaasti esiin fosforylaatiota Smad2 ja Smad3 C-terminaalisia alueita kun taas TNF-α eivät osoittaneet mitään vaikutusta. Toisaalta, TNF-α stimulaatio johti fosforylaation linkkerin alueen Smad2, riippumatta TGF-β stimulaatio (kuvio 3A).

(A) A549-soluja stimuloitiin TGF-β1 ja /tai TNF-α 60 min ja immunoblottaus suoritettiin yhteensä Smad2, fosforyloitu Smad2 (Kytkijäalue: Ser 245/250/255), fosforyloitu Smad2 (C-pään alueen: Ser 465/467), yhteensä Smad3, fosforyloidun Smad3 (C- terminaalinen alue: Ser 423/425). (B) A549-soluja esikäsiteltiin DMSO tai kemialliset estäjät (LY-364947, U0126, SP600125 ja SB203580) 60 minuutin ajan, minkä jälkeen TNF-α stimulaatiota. Solulysaatit kerättiin osoitetuissa aikapisteissä, ja immunoblottaus suoritettiin Smad2, fosforyloitu Smad2 (Kytkijäalue: Ser 245/250/255), Erk, fosforyloitu Erk, p38, fosforyloitu p38 ja fosforyloitu c-Jun. α-tubuliinin käytettiin lastaus ohjaus.

Seuraavaksi edelleen pyrkinyt selvittämään, joka kinaasi on osallisena TNF-α-välitteisen fosforylaation Smad2 Kytkijäalue, käyttäen kemiallista inhibiittorit, kuten LY-364947, U0126 , SP600125 ja SB203580 (kuvio 3B). TNF-α stimulaatio johti fosforylaation Erk, p38 ja c-Jun, substraatin JNK. TNF-α stimulaatio myös herättänyt fosforylaatioon linkkeriin Smad2 vuonna 30-120 min, huipussaan 60 min. LY-364947 ei ole poistaa tätä, joka esittää vaikutusta TNF-α riippumaton TβR-I-kinaasiaktiivisuuden. Ja testattuja inhibiittoreita, TNF-α-välitteisen Smad2 linkkeri fosforylaation kumottiin U0126, joka on MEK-inhibiittori, joka voi myös poistaa fosforylaation Erk, alavirran substraatti MEK. JNK-inhibiittori, SP600125 poistetaan fosforylaatiota c-Jun, alavirran substraatti JNK, ja inhiboivat osittain Smad2 linkkeri fosforylaatiota. P38 MAPK estäjä, SB203580 ei vaikuta Smad2 linkkeriin fosforylaationa pitoisuuden osoitettu olevan tehokas aiemmissa raporteissa.

Nämä tulokset viittaavat siihen, TNF-α saa aikaan fosforylaation Smad2 Kytkijäalue, jotka saattavat moduloida Smad säädelty geeni transkriptio [22]. Tämä vaikutus näytti olevan paljolti välittämä MEK-Erk polku ja luultavasti JNK saattaa myös olla merkitystä, tosin vähäisemmässä määrin (kuvio 3B).

Microarray Analysis Näyttää Differential Gene asetuksen TGF-β ja TNF α

Jotta saataisiin kattava oivalluksia transkription tapahtuvien muutosten yhteydessä TGF-β ja /tai TNF-α hoito, geeniekspressioprofilointi suoritettiin. Kokonais-RNA-näytteet valmistettiin A549-soluja käsiteltiin TGF-β ja /tai TNF-α: ssa 2 tuntia tai 24 tuntia, ja analysoitiin edelleen microarray-analyysillä (kuvio 4A). Selostukset aiheuttama 1,5-kertainen tai tukahdutetaan 0,67-kertainen, mukaan lukien ne eivät selityksin, lueteltiin File S1 ja File S2 (dataa 2 h ja 24 h, vastaavasti).

(A ) sirontakuvaajaan edustus transkriptien käsitellyt näytteet TGF-β1 ja /tai TNF-α 2 h tai 24 h (Y-akseli), verrattiin stimuloimattomasta ohjaus (X-akseli). Selostukset piirretään käyttäen log2 normalisoitu data. Kynnys on transkriptipitoisuuksissa asetettiin aiheuttama 2,0-kertainen tai tukahdutetaan 0,5-kertaiseksi, ja osoitetaan kunkin hajontakuva. (B) Venn-kaavio, joka havainnollistaa päällekkäisiä geenien ilmentyminen lisääntyy (Up) tai vaimentua (Alas) TGF-β1 ja /tai TNF-α hoito 2 h tai 24 h. Kynnys on transkriptipitoisuuksissa asetettiin aiheuttama 2,0-kertainen tai tukahdutetaan 0,5-kertaiseksi. Luvut osoittavat määrän selityksin geenejä. (C) sirontakuvaajaan edustus kypsä miRNA näytteissä käsitelty TGF-β1 ja /tai TNF-α 24 h (X-akseli), verrattiin stimuloimattomasta ohjaus (Y-akseli). Kynnys on miRNA tasot asetettiin aiheuttama 2,0-kertainen tai tukahdutetaan 0,5-kertaiseksi, ja osoitetaan kunkin hajontakuva. (D) Kvantitatiivinen RT-PCR kypsälle miR-23a. A549, H441 ja BEAS2B soluja käsiteltiin TGF-β1: ssa 24 tuntia. Ilmentyminen oli normalisoitu ja U6. Virhepalkkeja: SD.

tarkempaa analyysiä, asetamme rajan transkriptipitoisuuksissa kuin aiheuttama 2,0-kertainen tai tukahdutetaan 0,5-kertaiseksi, ja ulkopuolelle annotoimaton selostukset. Näin ollen olemme määritelleet geenejä, joilla on muuttunut ekspressio verrattuna stimuloimattoman ohjaus, 3 vertailevassa sarjaa, eli TGF-β-stimuloidun TNF-α-stimuloitujen ja TGF-β /TNF-α-stimuloiduissa ryhmissä (kuvio 4B).

Koska yleinen suuntaus, TGF-β-säänneltyjen ja TNF-α geenien olivat harvojen, näytetään ero geenien transkription säätelystä. Lisäksi upregulated geenit tunnistettiin paljon enemmän kuin vaimentua. Geenien aiheuttama TNF-α olivat näkyvämpiä kuin TGF-β 2 h, kun taas määrä geenejä voimistuvan TGF-β oli paljon suurempi 24 h verrattuna 2 h, tai ne, joita TNF-α. 24 h, oli osa geeneistä, jotka olivat ylä- tai vaimentua TGF-β: n ja TNF-α kostimulaatio, mutta ei kummankaan.

Seuraavaksi käytimme julkaistut tiedot asetetaan mikrosirun, joka oli suoritettiin A549-soluja stimuloidaan TGF-β [23], [24]. Ottaen huomioon induktio 2,0-kertaisesti niin merkittävä, poimimamme mahdollisia TGF-β kohdegeenien yleisesti aiheutettiin kolmessa riippumattomien tutkimusten eli 17 geenien 2h, ja 129 geeniä 24 tuntia, joka on esitetty File S3.

osajoukot geenien Differentially tai yhteistyössä säätelemä TGF-β ja TNF-α

Useat transkriptiotekijät ovat sekaantuneet transkriptionaalista tukahduttaminen E-kadheriinin, kuten

SNAI1

(etana),

SNAI2

(Slug),

ZEB1

,

ZEB2

ja

TWIST1

[25], [26]. Näistä

SNAI1

oli nopeasti aiheuttama TGF-β 2 h, kun taas TNF-α pikemminkin tukahdutetaan se, joka merkitsee ero mekanismeja säädellä EMT. 24 h, E-kadheriinin (

CDH1

) oli selvästi vaimentua TGF-β (0,27-kertainen), kun taas estävä vaikutus TNF-α oli vaatimaton (0,78-kertainen). Mukaisesti, TGF-β ja TNF-α voimistunut ilmentyminen N-kadheriinin (

CDH2

) enintään 2,32-kertainen ja 1,47-kertaiseksi. Synergisen vaikutuksen TGF-β ja TNF-α havaittiin myös suhteessa transkription säätelyyn

CDH1

ja

CDH2

, vastaa tuloksia, kuviossa 1.

Lisäksi geenien ilmentyminen lisääntyy enemmän kuin 3,0-kertaisesti 2 h tai 24 h, otettiin eritellään, ja taulukossa 1 ja 2, mukaan tunnettuja toimintoja. Koska akuuttia 2 h, TNF-α voimakkaasti indusoi useita sytokiinien /kemokiinien, kuten

CCL2

(MCP-1),

CCL5

(RANTES),

CCL20

,

CXCL1

,

CXCL8

(IL8),

IL1A

,

IL1B

ja

IL6

. Signalointikomponentteja TNF-α-NFKB reitin myös voimistunut myös

TNF

,

TRAF1

,

NFKB1

,

NFKBIA

ja

NFKBIE

. Lisäksi soluadheesiomolekyylit kuten

VCAM1

ja

ICAM1

aiheutettiin. 2 h stimulaation jälkeen, TGF-β aiheuttama rajallinen määrä geenejä, mukaan lukien tunnettujen kohdistu suoraa kuten

Smad7

ja

HEY1

. 24 h, TGF-β stimulaatio johti lisääntynyt ilmentyminen eri geenien luokitellaan (i) säätelijänä pieniä GTPaasi, (ii) adheesiomolekyyli, ja (iii) ECM, kun taas TNF-α stimulaatio oli vain vähäisiä vaikutuksia niitä.

Regulators pienten GTPaasina mukana guaniininukleotidiä vaihto tekijät (GEFs), kuten

RASGRP1

,

RASGRP3

,

RASGRF2

,

DOCK2

ja

DOCK4

, jotka aktivoivat Ras, Rac ja Rap1 sekä jäsenet Rho perheen GTPaaseja kuten

Rnd1

ja

RHOU

. Soluliikkuvuus ja morfologisia muutoksia säädellään pieniä GTPaaseja kuten Ras, Rac, Cdc42 ja Rho perheitä, jotka voidaan mukauttaa myötävirtaan TGF-β signalointi [27].