Krooninen sairaus

tiivistelmä

Laajalti hyväksytty paradigma alalla syövän biologian että kiinteitä kasvaimia ovat uni-esi on johdettu yhdestä perustaja ja sen jälkeläiset . Kuitenkin tiedot ovat tasaisesti kertyvät jotka osoittavat alussa kasvaimia hiirillä ja ihmisillä voi olla usean esi alkuperän, jossa aloitti primogenitor helpottaa muutosta viereisen co-genitors. Olemme kehittäneet uuden hiirimallissa, että on mahdollista määrittää klonaalisen arkkitehtuurin suoliston kasvaimet

in vivo

ja

ex vivo

, ovat vahvistaneet tätä mallia, ja sitten käytetään sen arvioimiseksi klonaalisen arkkitehtuuria adenoomien , intramucosal karsinoomat, ja invasiivisia adenokarsinoomat suolistossa. Prosenttiosuus usean esi kasvaimia ei merkittävästi muutu kasvaimia eteni adenoomia on matala-asteinen dysplasia [40/65 (62%)], jotta adenoomia kanssa dysplasiaan [21/37 (57%)], jotta intramucosal karsinoomien [10/23 (43%]), invasiivisia adenokarsinoomat [13/19 (68%)], mikä osoittaa, että klooni johtuvat primogenitor jatkuu rinnalla klooneja johtuvien co-genitors. Lisäksi neoplastiset solut muodostavat erillisiä klooneista sisällä usean esi adenokarsinooma on jopa havaittu samanaikaisesti hyökätä alla olevaan lihaksisto [2/15 (13%)]. Näin ollen, kasvaimeen heterogeenisyys johtuvat aikaisin kasvaimen muodostumisessa jatkuu koko kasvaimen kehittymisen.

Citation: Zahmer CD, Szulczewski JM, Leystra AA, Paul Olson TJ, Clipson L, Albrecht DM, et ai. (2016) Advanced Suoliston Syövät usein Säilytetään Multi-Ancestral Architecture. PLoS ONE 11 (2): e0150170. doi: 10,1371 /journal.pone.0150170

Editor: Kwong-Kwok Wong, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 06 lokakuu 2015; Hyväksytty: 10 helmikuu 2016; Julkaistu: 26 helmikuu 2016

Copyright: © 2016 Zahmer et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Cancer Institute (https://www.cancer.gov/) National Institutes of Health (R01 CA123438 kohteeseen RBH; P30 CA014520 University of Wisconsin Carbone Cancer Center P30 DK058404, Prekliiniset mallit Digestive Diseases Core, Vanderbilt Digestive Diseases Research Center P50 CA095013, translaatiotutkimus patologia ja Imaging Core, Vanderbilt GI SPORE, K08 CA84146 ATT, T32 CA009135 on CDZ ja AAL sekä T32 CA090217 on TJPO) ja käynnistys varoja Wisconsinin yliopisto Division of Gastroenterology ja Hepatology, Sisätautien, ja School of Medicine and Public Health RBH.

Kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, ettei kilpailevia etuja olemassa.

Johdanto

heterogeenisuus kasvaimia on tunnustettu jo vuosikymmeniä. Neoplastisia soluja yhden kasvain vaihdella useilla erotettavissa ominaisuuksia kuten erilaistuminen valtio, leviämisen nopeus, metastaattisen potentiaalin ja hoitovaste. Historiallisesti kaksi mallia selittää kasvaimensisäisenä heterogeenisuus ehdotettiin. Klonaalisen evoluutiomalli väittää, että eri subklooneja syntyvät yhdestä kantaisä seurauksena molekyylitason muutosten jälkeen valitaan erilaisia ​​mikroympäristöihin sisällä kasvain [1]. Sitä vastoin syöpä kantasolujen malli väittää, että pieni kantasolujen populaatio peräisin yhdestä kantaisä on vastuussa kasvaimen huoltoa, mutta jälkeläiset voivat erilaistua monella eri tavoin [1]. Molemmissa malleissa kaksi keskeistä oletukset ovat, että kasvaimet ovat uni-esi, johdettu yhdestä perustaja, ja että subklooni lopulta kerätä mutaatioita, jotka ajavat etäpesäke muihin elimiin.

Data on tasaisesti kertyy kolmannelle malli kasvaimensisäistä heterogeenisuus: kiinteä kasvain voi olla usean esi arkkitehtuuri [2]. Olemme osoittaneet, että perinnöllinen ja karsinogeeni aiheuttama suoliston kasvaimia laboratoriossa hiiri voi olla peräisin useista perustajien [3, 4]. Meidän havainnot ovat yhdenmukaisia ​​toisen laboratorion osoittavat, että perinnöllinen ja satunnainen Kolorektaalituumorien ihmisillä voi olla monen esi arkkitehtuurin [5, 6]. Toisin kuin laajalti hyväksytty paradigman alalla syövän biologian, kiinteät kasvaimet voivat olla monen esi alkuperä ja siksi se on heterogeeninen niinkuin ne vain alkaa muodostua.

Ensimmäinen tutkimuksissa eläinmalleissa ensisijaisesti tukeutunut on aggregaatiokimeerejä. Tällaiset hiiret tuotettiin fuusioimalla yhteen aikaisin alkioita. Tyypillisesti yksi alkio kantoi Rosa26 linjan markkeri, joka ilmentää p-galaktosidaasia, niin että solut tämän alkion tahra sininen, kun läsnä on 5-bromi-4-kloori-3-indolyyli-β-D-galaktopyranosidi, kun taas solut muista alkion pysyvät valkoinen. Kasvaimia, jotka ovat heterotypic, joka koostuu sininen ja valkoinen neoplastiset solut, on monen esi alkuperä. Käyttö aggregaatiokimeerejä on tarjonnut uusia oivalluksia alkuvaiheessa kasvaimen. Valitettavasti tämä voimakas kokeellinen työkalu on joitakin merkittäviä rajoituksia. Sukupolven aggregaatiokimeerejä on hyvin aikaa vievää ja kallista, joten eläinten lukumäärä analysoidaan on usein alhainen. Klonaalisen arkkitehtuuri tahansa kasvain voidaan määritellä vain pitkällisen värjäyksen menettely, joka sisältää kaksi kiinnitys vaiheet ja inkuboitiin yön yli 37 ° C: ssa. Värjäytyminen on usein puutteellinen, koska alustan täytyy diffundoitua kasvain; Näin ollen ei kaikki kasvaimet voidaan pisteyttää. Lisäksi ankarissa olosuhteissa kieltää myöhemmän molekyylitason analyysi.

Tässä tutkimuksessa kehitimme uuden hiirimallissa, joka mahdollistaa klonaalinen arkkitehtuuri suoliston kasvaimet määritetään

in vivo

ja

ex vivo

, validoitu tätä mallia, ja sitten käytetään sen määrittämiseen klonaalisen arkkitehtuuri suoliston syövät. Tulokset tukevat käsitystä, että adenoomia ovat usean esi peräisin ja että tämä varhainen moninaisuus jatkuu kuten kasvaimia siirtyminen hyvänlaatuisesta pahanlaatuiseen tilaan.

Methods

Hiiri kantoja ja sukupolvi mosaiikki hiirten

eläinten tutkimukset suoritettiin pöytäkirjojen mukaisesti hyväksymien Institutional Animal Care ja Käytä komitean University of Wisconsin noudattaen politiikan viraston asettaman laboratorion Animal Welfare National Institutes of Health. C57BL /6J (B6), FVB /NJ (FVB), ​​B6.Apc

Min /J-hiiret, jotka olivat heterotsygoottisia

Min

alleelin

adenomatoottisen polypoosin coli-geeni

(

APC

Min /+), ja B6.129 (Cg) -Gt (ROSA) 26Sor

TM4 (ACTB-tdTomato, -EGFP) Luo /J hiirten hemizygous varten mT /mG reportteri saatiin The Jackson Laboratory. FVB /N-Tg

(Fabp1-Cre) 1Jig hiiret hemizygous varten Fabp1-Cre-siirtogeenin, jossa promoottori rotan rasvahappoa sitovan proteiinin on fuusioitu geeni, joka koodaa Cre-rekombinaasia, jolloin mosaiikki ekspression Cre ennen valmistumisen suolen morphogenesis, saatiin National Cancer Institute Mouse Repository at Frederick. Varastot näistä kannoista ylläpidettiin Sisarusten ristejä ja takaisinristeyttämäl- kanssa B6 tai FVB hiirten tuodaan joka viides sukupolvi. Jälkeläisiä genotyypattiin käyttämällä DNA eristettiin varvaskoukkujen PCR kuvatulla toimittajien eläimiä.

hiiri kuljettaa

Min

alleelin

APC

tunnistettiin laboratoriossa Dr. William F. Dove at University of Wisconsin mutageneesin jälkeen ethylnitrosourea [7, 8]. Perustaja ja sen jälkeläisten esittelyyn vaalean jalat takia veren tappio kasvaimia suolistossa [7]. Kasvainten lukumäärää, kasvu ja eteneminen

APC

Min /+ hiiret ovat riippuvaisia ​​geneettinen tausta. B6

APC

Min /+ hiiret kehittävät keskimäärin 100 suoliston kasvaimet ja kuolevat tyypillisesti 150 päivän iässä [7]. Kasvaimet aloitetaan menettämisen APC aktiivisuuden suolen epiteelisolujen pian syntymän jälkeen ja ne ovat lähes aina hyvänlaatuisia adenoomia [9-13]. Sitä vastoin (SWRxB6) F1

APC

Min /+ hybridit kehittää muutama kasvaimia ja elävät tyypillisesti vuoden tai enemmän [14]. Kasvaimet hiirissä ovat usein invasiivisia syöpiä, jotka joskus etäpesäkkeitä alueellisiin imusolmukkeisiin, oletettavasti lisääntyneen eliniän [14].

Koehiiriin syntyy ensimmäisessä risteyksessä B6

mT /mG

naaraita B6

APC

Min /+ miehillä tuottaa B6

APC

Min /+;

mT /MG

hiiriä, jotka oli sitten ristissä FVB

Fabp1-Cre

hiirten tuottamiseksi (FVBxB6) F1

APC

Min /+;

Fabp1-Cre

;

mT /MG

hybridit. Kokeellinen F1 hybridit annettiin ikä 150 päivää tai kunnes kuolemaisillaan arvioida klonaalisen arkkitehtuuria kasvaimia eri vaiheissa.

Fluoresenssi tähystys

Fluoresenssi endoskopia tehtiin käyttäen modifioitua Karl Storz Coloview järjestelmä aiemmin on kuvattu [15, 16]. Lyhyesti, hiiret nukutettiin isofluraanilla ja niille annettiin peräruiske lämmintä PBS poistaaksesi ulosteet. Endoskooppi sijoitettiin noin neljä senttimetriä ja sitten hitaasti peruutettu käyttäen Optotronics diodi-pumpataan solid-state-laser asetettu 437nm teholla 100 mW, kun valonlähde. Video kerättiin koko menettelyn ja still-kuvia otettiin kiinni kunkin kasvaimen. Hiirten annettiin herätä toimenpiteen jälkeen.

Videot ja yksittäiskuvat prosessoitiin Fidžin paketti ImageJ visualisoida normaalia ja dysplastic crypts ilmentävät vihreää fluoresoivaa proteiinia.

kuvantaminen koko kiinnikkeet

suoliston poistettiin ehjä ruumiinavauksessa, avataan pituussuunnassa, huuhdeltiin PBS: lla, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 4 tunnin ajan ja säilytettiin 4 ° C: ssa 70% etanolia. Ohutsuolessa, umpisuoli ja paksusuoli oli asennettu 0,4% agaroosia PBS: ssä ja kuvattavan kaapata punaisen fluoresenssin (mT tdTomato) ja vihreän fluoresenssin (mg; EGFP) käyttäen joko Zeiss mikroskoopilla 12,5x ja tai Nikon mikroskoopilla 20x suurennoksella (katso S1 File for lisätietoja).

Koko-mount kuvia käytetään tilastolliseen analyysiin saatiin Zeissin mikroskoopilla ja käsiteltiin käyttäen Fiji kuvankäsittely- paketti ImageJ [17]. Makro käytettiin varmistamaan yhtenäisyyden kuvia. Lyhyesti, makro etsinyt hakemiston Zeiss kuvatiedostoja (Zvi) ja muunnetaan ne Open Microscopy Environment (OME) merkitty kuvatiedoston (TIFF) käyttäen LOCI Bio-muodot tuoja /viejä säilyttämään metatietoa [18]. Sen jälkeen valmistunut seuraavat joukko toimintoja asetukset, joiden perusteella proteiini kuvattiin (tdTomato tai EGFP): vähennetty tausta, parannettu paikallista kontrastia (CLAHE), asettaa autothreshold, ja muunnetaan binary. Kerran binary, aloilla kuvan, joka ei sisällä kudosta olivat täynnä keltaisia. Tuloksena oli binary kuva, jossa valkoinen edustaa kudosta ilmentävät tdTomato ja musta edustaa kudoksen ilmentävät EGFP (S1 Kuva).

Patch koko analyysi

välisen suhteen arvioimiseksi mosaicism ja klonaalisen arkkitehtuuri, punainen ja vihreät laikkuja suoliepiteeliin kokeellisessa hiirillä analysoitiin matkan karttoja, kuten aiemmin on kuvattu aggregaatiokimeerejä [3, 4]. Lyhyesti, litteä binäärikuvissa jokaisen suolen osassa muutettiin etäisyyttä karttakuvia, joka osoittaa kullekin paikalle Euclidean etäisyys lähimpään päinvastainen väri, käyttäen EBImage ohjelmapaketti [19]. Keskimääräinen vähimmäisetäisyys toiselle värille mittaa mosaiikki laastarin koko, jota verrattiin patch koot aggregaatiokimeerejä (S2 Kuva).

3D jälleenrakentamiseen kasvainten

Jotkut adenoomia hiiristä lopetetaan eutanasian 150 päivää ikäisiä leikattiin irti ja optisesti sammutetaan 2,2-tiodietanolin (TDE) kuten aiemmin on kuvattu [20]. Selvä adenoomia kiinnitettiin

kokonaisuutena

97% TDE ja multiphoton heräte kuvantaminen suoritettiin Prairie Technologies Ultima IV Imaging järjestelmän LOCI.

Kuva pinot päässä Ultima IV oli ommeltu yhteen käyttämällä oletusasetukset Grid /Collection Stitching plug-in ImageJ joka jaetaan osana Fidžin hankkeen [21]. Taustan vähentäminen suoritettiin molemmilla kanavilla käyttäen ImageJ vähennyslaskua tausta toimintoa liikkuvan pallon säde on 40 pikseliä. Kun näytetään EGFP vain, kynnys käytettiin poistamaan kudosta autofluoresenssia. Kynnys sovellettiin yhtäläisesti kaikilla kaikki kuvat, joita käytettiin jälleenrakentamiseen. Kuvat avattiin sitten käyttämällä ImageJ 3D katsoja plug-in (Näyttö kuten: Volume, Väri: Ei mitään, Threshold: 0, Resampling kerroin: 1) tuottaa laadukkaita 3D rappaukset OME aineisto.

Immunohistokemia

Kaikki leikattiin kasvaimet joko upotettu FSC 22 (Surgipathilla) ja flash jäädytetty tai sijoitetaan formaliinilla, käsitellään ja upotettiin parafiiniin. Lohkot sarjoittain leikattiin ja järjestettiin kaksi 5pm Kustakin dia. Joka kymmenes objektilasi värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla. Saat täydellinen analyysi, dioja kohteisiin värjättiin immunohistokemiallisesti for CTNNB1 (1: 200 Puhdistettu Mouse Anti-β-kateniinin Antibody, BD Transduction Laboratories) käyttäen HistoMouse Max Kit (Invitrogen) tai immunofluoresenssilla vihreän fluoresoivan proteiinin (EGFP) tai punainen fluoresoiva proteiini (tdTomato) (primary- 1: 1000 Living Colors EGFP monoklonaalinen vasta-aine, Clontech, ja sekun- däärinen 1: 1000 vuohen anti-hiiri-Alexa Fluor 488, Invitrogen, ja /tai primary- 1: 200 anti-tdTomato, Rockland ja sekun- däärinen 1: 1000 vuohen anti-kani Alexa Fluor 568, Invitrogen) ja 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI) soveltamalla pidentää Gold DAPI kiinnitysväliaineet (Molecular Probes). Huomaa, että värjäys EGFP ja tdTomato oli tarpeen, koska kiinnittäminen sammuttaa fluoresenssisignaali.

Immunofluoresenssikoe

histologiset kohdat värjätään immunofluoresenssimenetelmällä oli kuvattu kuvatulla koko-mount kuvantamisen osassa; ainoa muutos oli käyttöä 4x, 5x, 10x tai 20x objektiivit. Jälkikäsittely kuvantaminen ei ollut tarpeen. Histologinen osat värjättiin immunohistokemiallisella tai hematoksyliinillä ja eosiinilla (H soluissa, jotka ilmentävät Cre alkaa päivänä E13.5 (ennen loppuun suolen morfogeneesin ja ennen Min kasvaimen muodostuminen), vihreää fluoresoivaa proteiinia (EGFP) on yksinomaan tuotettu koodaava geeni tdTomato poistettiin seuraavasti rekombinaatiolla. Siten nämä kaksi elementtiä luotu kirjava kuvio ilmentävien solujen punainen tai vihreä fluoresoiva proteiineja distaalisessa ohutsuolen, umpisuoli ja paksusuoli (S3 kuvassa). Tämä malli oli stabiili kaikkina ajankohtina arvioidaan (S5 kuvio). Kolmas elementti oli yhden kopion

Min

alleelin

adenomatoottisen polypoosin coli

(

APC

) geenin [8]. Tämä mutaatio alttiita hiirten spontaaniin kasvaimia koko ohutsuolen ja paksusuolen. Koska toimittaja asema määräytyy ennen kasvaimia muotoilu ja Cre ilme on vakaa aikana tuumorigeneesiprosessin kasvaimet joka koostuu punaisen ja vihreän neoplastiset solut ovat monen esi arkkitehtuuri.

Luonnehtia suolen kasvainten synnyssä tässä mallissa, kohortin 20 hiiriä syntyi ja lopetettiin 150 päivän iässä. Ilmaantuvuus suolen kasvainten oli 100% ja keskimääräinen moninaisuus 11 ± 5. alhainen tuumorimassa oli odotettavissa, koska homogeeninen F1 geneettisen taustan ja on erittäin toivottavaa, koska se rajoittaa mahdollisuutta kahden itsenäisesti aloitettiin kasvainten saostus seurauksena läheisyyden [23]. Kaikki kasvaimet tämän ryhmän hiirillä, jotka analysoitiin olivat adenoomia on matala-asteinen dysplasia.

Monet adenoomien näissä hiirissä oli multi-esi arkkitehtuuri. Koostumus paksusuolen kasvainten näkyi

in vivo

fluoresenssilla endoskopialla (kuvio 1A) ja

ex vivo

fluoresoivalla mikroskoopilla (kuvio 1 B). Ja 63 kasvainten distaalisessa ohutsuolessa ja paksusuolessa, 32 (51%), vahvistettiin koostuvan punainen ja vihreä neoplastisten solujen histologia (taulukko 1 ja kuvio 1C-1F). Ominaisuudet transformaation normaalista limakalvon neoplasia /dysplasia oli menetys crypt arkkitehtuuri, ehtyminen pinta musiinin, ja lisääntynyt mitoosin sekä ydinvoimaosakkuusyhtiöissä muutoksia myös syrjäyttämisen, kerrostuneisuus, venymään ja hyperchromasia. Lisäksi dysplastic punainen ja vihreä soluilla oli kohonnut CTNNB1 (β-kateniinin), ja usein tämä proteiini tumassa vahvistaa, että solut sekä suvusta olivat neoplastisten (kuvio 1C-1F). Lopuksi, punainen ja vihreä neoplastisten kloonit usein suorittaa ainutlaatuinen mutaatioita

Apc

(taulukko 2 ja S4 kuviossa), osoittaa edelleen, että nämä kloonit ovat peräisin eri perustajien. Siten tämä innovatiivinen hiirimallissa sopii hyvin tutkittaessa klonaalisen arkkitehtuuri suoliston kasvaimia. Lisäksi tärkeä etu tämä malli on, että visualisointi eri suvusta estä molekyyli- analyysejä lukien immunohistokemia ja DNA-sekvensoinnilla.

klonaalinen arkkitehtuuri paksusuolen kasvaimista on näkyvissä

in vivo

fluoresenssi tähystykseen. Suolen epiteeli on yksi kerros soluja, jotka on korvattu joka kolmas viisi päivää. Uusia soluja muodostuu kantasoluista makaa pohjan lähellä kukin crypt. Mallissa, kryptissa ovat homotyyppisessä punaisia ​​tai homotyyppisessä vihreä jälkimmäinen erityisen selvästi aikana fluoresenssi tähystys, sillä jokainen krypta näkyy erillisinä vihreä ympyrä (A). Kasvaimet voivat koostua vain punaista kryptissa (vasen paneeli), sekoitus punaista ja vihreää crypts (keskimmäinen paneeli), tai vain vihreät crypts (oikea paneeli). Kasvaimet on esitetty valkoisena. Korkea vaihtelevuus klonaalisia arkkitehtuuri ilmenee myös koko kiinnikkeet (B). Kasvaimet olivat homotyyppisessä punainen (vasen paneeli), heterotypic (keskimmäinen kolme paneelit), tai homotyyppisessä vihreä (oikea paneeli). Seos punaista ja vihreää crypts vaihtelee multi-esi kasvaimia, joista osa on pääasiassa koostuu joko punaista kryptissa tai vihreä crypts, kun taas toiset ovat suunnilleen yhtä monta molempia. Histologia on tarpeen määrittää arkkitehtuuri, koska kasvaimet voivat esiintyä heterotypic neoplastisiin kryptissa yksivärinen sekoittunut normaali crypts toisen värin. Klonaalisen arkkitehtuuri Kasvainten laukoi histologisen kohdat. Neoplastiset solut visualisoitiin H size bar = 1mm. Paneelit C ja E esitetään samaan suurennos; size bar = 500 um. Paneeli D näyttää 4x laajentumista viereisessä osassa esitettyjen alueen paneelissa C. Paneeli F näyttää 4x laajentumista rajattu alue paneelissa E.

prosenttiosuus multi-esi kasvaimia mosaiikit oli samanlainen prosenttiosuus havaittu aiemmissa tutkimuksissa aggregaatiokimeerejä (S2 kuvio; 40-52% mosaiikit verrattuna 22-47% vuonna aggregaatiokimeerejä). Tämä havainto todennäköisesti kuvastaa sitä, että tilkkutäkki punainen ja vihreä soluja distaalisessa ohutsuolen ja paksusuolen meidän mosaiikki hiirillä oli verrattavissa tilkkutäkki sininen ja valkoinen soluja havaittiin aggregaatiokimeerejä aiemmissa tutkimuksissa (S2 Kuva). Kaikki 165 kasvaimia proksimaalisessa ohutsuolessa oli homotyyppisessä punainen (taulukko 1), kun rotan rasvahappoa sitovan proteiinin 1-promoottori on tuskin ilmaistaan ​​tällä alueella suolistossa (S3 kuvassa). Tämä havainto osoittaa, että ilmaus loisteputki proteiinien toimittaja on vakaana tuumorigeneesin. Koska kasvaimien syntyyn ei johda aktivoinnin Cre tai mutaatioita reportteri, heterotyyppisten kasvaimia voi tarkasti määrittää saada usean esi alkuperä. Tämä lähestymistapa voidaan yleensä tutkia klonaalisen arkkitehtuuri kasvaimia muista kudoksista, jotka vaativat vain käyttämällä eri siirtogeenin ilmentävät Cre-rekombinaasia.

multi-esi arkkitehtuuri kasvainten vahvistettiin edelleen kautta kuvantaminen. Yhteensä viisi monen esi adenoomia eristettiin, keskeytettiin TDE kuin kiinnitysväliaine vähentää sirontaa lipidien ja kuvaamisen kanssa multiphoton mikroskoopilla. Kunkin adenooma, kerätyt kuvat oli ommeltu yhteen tuottaa kolmiulotteisen jälleenrakentamiseen. Nämä tiedot viittaavat siihen, että jotkut kasvaimet voivat olla monimutkaisempia kuin pelkästään biclonal; useita erillisiä värillisiä alueita vaihteli kahdesta neljään (S2 taulukko). Yhdessä pääasiassa punainen adenooma, kolme erillistä viheralueiden voitaisiin nähdä, mikä osoittaa, että tämä kasvain voi olla peräisin neljästä perustajien jos kukin klooni on syntynyt ainutlaatuisen alkutapahtuma (kuvio 2). Kuitenkin valmistautuminen kuvantamisen esti meitä pysty suorittamaan sekvensointi tutkimuksia, joiden avulla voisimme selvittää, onko erillinen vihreä laastarit oli eri mutaatio profiileja, mikä antaisi lisää näyttöä niiden alkuperästä.

ilmaus fluoresoivat proteiinit helpottaa käyttöä multiphoton herätteen kuvantamisen rekonstruoida kasvaimen kolmiulotteisesti Rekonstruktioiden sallivat tutkia rakenteen pinnan alla kasvainten (A, pinta, B, sivukuva) ilman vääristymiä ja esineitä, jotka tapahtuvat kun kuvataan useita histologisia osia. Neljä selkeää värillistä alueilla näkyivät yhdellä kasvain. Kolme erillistä vihreä alueet olivat ilmeisiä, kun punainen on vähennetty (C). Nämä alueet vihreää erotettiin vähintään 100 mikronia, mikä vastaa halkaisija 1-2 crypts.

Multi-esi arkkitehtuuri jatkuu kuten kasvaimia edetä hyvänlaatuisia pahanlaatuiseen toteaa. Toinen ryhmä hiiriä syntyi ja annettiin vanheta kunnes kuolemaisillaan. Keskimääräinen ikä kuollessa oli 494 ± 93 päivää. Ilmaantuvuus suolen kasvainten oli 100% ja keskimäärin moninaisuus 15 ± 5, mikä oli hieman suurempi kuin on havaittu hiirillä tapetaan 150 päivän iässä (p = 0,04; Wilcoxonin summa, kaksipuolinen). Vuonna kuolemaisillaan hiirillä, 16%: n kasvaimia distaalisen ohutsuolen ja paksusuolen olivat intramucosal karsinoomien ja 13% oli invasiivisia adenokarsinoomat (taulukko 3). Samankaltainen kuin ihmisen peräsuolen vaurioita, intramucosal karsinoomat osoittavat vainsolukasvun invaasion joko lamina propria tai musculariksesta limakalvoa ja voidaan liittyä desmoplastic vaste (kuvio 3). Huomaa, että edellinen tutkimus osoitti, että pitkäikäinen Min hiiret kehittävät edenneen taudin vaikka kasvaimia esiintyi hieman geneettinen epävakaus [14]. Jotta vaurio pidetään invasiivisen adenokarsinooma oli oltava hyökkäystä neoplastisten solujen ulkopuolella muscularis limakalvon ainakin osaksi submukoosasta. Neoplastiset solut olivat usein columnar ulkonäöltään merkittävässä nucleoli, oli seulamaisessa arkkitehtuuri back-to-back rauhaset puuttumatta strooman, rakeinen eosinofiilinen karyorektisen roskia läsnä onteloon rauhanen, lisääntynyt mitoosi toimintaa ja liittyy desmoplastic vastauksen. Monen esi arkkitehtuuri havaittiin 62% adenoomia on matala-asteinen dysplasia, on 57% adenoomia kanssa dysplasiaan, 43% intramucosal karsinoomien ja 68% invasiivisen adenokarsinoomat (taulukko 3).

hiirillä, jotka saivat ikään saakka kuolemaisillaan, jotkut kasvaimet olivat adenoomia kanssa dysplasiaan (A ja B), kun taas toiset olivat intramucosal karsinoomat (CF). Neoplastiset solut tunnistetaan H size bar = 1mm. Paneelit C ja E ovat samat suurennos; size bar = 1mm. Paneelit D ja F ovat 4x laajentumisten rajattu alue C.

pahanlaatuiset solut valtaavat submukoosa ja muscularis propria voi jopa olla peräisin eri perustajista. Yhteensä 15 invasiivisia adenokarsinoomien 10 hiiret analysoitiin. Samanaikainen hyökkäystä punaista ja vihreää neoplastisia soluja havaittiin 13%. Tämä havainto osoittaa, että vuorovaikutus kloonit saattavat kestää jopa kasvaimia alkaa hyökätä päässä submukoosassa osaksi muscularis propria.

Keskustelu

syntyy uudenlainen hiirimallissa peräsuolen syövän, suoritetaan validointi tutkimuksia vertaamme tuloksia aiempiin kokeellisissa malleissa, ja sitten hyödynnetään mallin tutkia klonaalisen arkkitehtuuria pahanlaatuisten syöpien suolistossa. Havainnot ei ainoastaan ​​osoittaa, että syöpien koostuvat soluista, jotka ovat peräisin useista perustajien mutta solujen erillisten alkuperä voidaan samanaikaisesti hyökätä suoraan paksusuolen seinään lihaksista. Tämä löytö on ristiriidassa ajatus, että kaikki kiinteitä kasvaimia ovat uni-esi ja että yksittäinen subklooni lopulta hankkii valikoivan edun kautta epigeneettisellä muutoksia tai mutaatioita ja siten metastasizes primaarikasvaimen kaukaisiin kohtiin.

malli oli validoitu käyttämällä useita erilaisia ​​lähestymistapoja. Fabp1-Cre-siirtogeenin valittiin, koska se on stabiilisti ilmaistu distaalinen ohutsuoli, umpisuoli ja paksusuoli alkionkehityksen aikana [24, 25], ja ennen kuin kasvaimen kehittymisen tapahtuu Min hiiri. Tämän mukaisesti väitteen, kryptissa normaalin suolen olivat joko kokonaan punainen puuttuessa Cre ilmentymisen tai kokonaan vihreitä läsnäollessa Cre ilmaisua. Lisäksi rakenteessa mosaikismin on samankaltainen hiirillä tapetaan 150 päivän iässä ja kuolleiden kuolemaisillaan olevien, mikä osoittaa, että malli perustettu varhaisen alkionkehityksen aikana on stabiili aikuisilla hiirillä (S5 Kuva, S6 kuvio, ja S3 taulukko). Jos Cre oli spontaanisti aktivoituvat eri soluissa, suolessa olisi vähitellen kääntyä enemmän vihreitä kuin hiiret ikä koska vihreät solut ei voida muuntaa takaisin punainen. Molemmissa ryhmissä hiiriä, proksimaalinen puoli suolistossa oli lähes kokonaan punainen, kun taas distaalinen puoli oli sekoitus punainen ja vihreä kaksoispiste muodostuessa 37,6% vihreät solut hiirissä lopetetaan eutanasian 150 päivää ja 38,1% vihreät solut hiirillä tapettiin, kun tämä kuolemaisillaan (p = 0,46, t-testi). Kaikki 165 kasvaimia, jotka on muodostettu proksimaaliseen puoli ohutsuolen ja 24 63 kasvaimia paksusuolen ja distaalinen puoli ohutsuolen olivat homotyyppisessä punainen (taulukko 1). Tämä havainto osoittaa, että Fabp1-Cre-siirtogeenin ei poikkeavasti aktivoitu seurauksena neoplastisen transformaation. Muita kasvaimia distaalisessa puolet suoliston olivat homotyyppisessä vihreä tai heterotypic. Prosenttiosuus heterotypic tai avoimesti multi-esi, kasvaimet oli samanlainen kuin aikaisemmissa tutkimuksissa, joissa aggregaatiokimeerejä työskenteli (S2 Kuva). Rakenteessa punaiset ja vihreät neoplastisia kloonit yksittäisessä kasvain vaihtelee dramaattisesti punaiset ja vihreät on erittäin sekoittuneet joissakin kasvaimissa (kuvio 1 B). Tällaisia ​​monimutkaisia ​​seoksia olisi vaikea selittää, että määrittelemätön ilmaus Fabp1-Cre siirtogeenin sisällä yksittäinen klooni.