Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Syöpä etäpesäke on tärkein syy, joka johtaa taudin uusiutumisen ja korkea kuolleisuus syöpäpotilailla. Siksi metastaasin inhiboinnissa prosessi tai tappaminen metastaattinen syöpäsolujen indusoimalla apoptoosin on kliinistä merkitystä parantamisessa syöpäpotilaan säilymiseen. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että fukoidani, fukoosin runsaasti polysakkaridi eristettiin meren ruskolevät, on lupaava luonnontuote merkittäviä syövän vastainen vaikutus. Kuitenkin tiedetään vähän roolista Endoplasmakalvosto (ER) stressiä fukoidaanista aiheuttamaa apoptoosia.

Keskeiset havainnot

raportoitu että fukoidaanista hoito estää solujen kasvua ja indusoi apoptoosin syöpäsoluissa . Fucoidan hoitoja johti alas-säätely glukoosin säätelemä proteiini 78 (GRP78) Metastasoituneessa MDA-MB-231 rintasyövän soluja, ja ER-proteiinin 29 (ERp29) Metastasoituneessa HCT116 koolonkarsinoomasoluissa. Kuitenkin fukoidaanista hoito edistää ER Ca

2 +: sta riippuvaisen kalmoduliinista riippuvainen kinaasi II (CaMKII) fosforylaatio, Bcl-liittyvät X-proteiinia (Bax) ja kaspaasi 12 ilmentymistä MDA-MB-231-soluissa, mutta ei HCT116-soluissa. Sekä syöpien soluja, fukoidaanista aktivoitua fosforylaation eukaryoottisten initiaatiofaktoria 2-alfa (p-eIF2α) \\ CCAAT /tehostajan sitovan proteiinin homologista proteiinia (CHOP) pro-apoptoottisen kaskadin ja inhiboi fosforylaatiota inositoli-vaativat kinaasi 1 (p- IRE-1) \\ X-box sitovia proteiineja 1 silmukoinnin (XBP-1s) pro-selviytymisen cascade. Lisäksi CHOP knockdown esti DNA-vaurioita ja solukuolemaa aiheuttama fukoidaanista.

Päätelmä /merkitys

Fucoidan kykenee sen anti-kasvain toiminto moduloimalla ER stressin porrastetusti. Osuus ER stressiä fukoidaanista aiheuttaman apoptoosin täydentää ymmärrystämme molekyylitason mekanismeista sen antituumorivaikutuksen ja tarjoaa todisteita terapeuttisen soveltamisen fukoidaanista syövässä.

Citation: Chen S, Zhao Y, Zhang Y Zhang D (2014) Fucoidan aiheuttaa syöpää, solukuoleman moduloimalla Endoplasmakalvosto Stress Cascades. PLoS ONE 9 (9): e108157. doi: 10,1371 /journal.pone.0108157

Editor: Yu-Jia Chang, Taipei Medicine University, Taiwan

vastaanotettu: 18 huhtikuu 2014; Hyväksytty: 17 elokuu 2014; Julkaistu: 18 syyskuu 2014

Copyright: © 2014 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tuki National Natural Science Foundation of China (81370524). Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpä on krooninen sairaus, jossa korkea kuolleisuus johtuen suuresta metastaattisen kyvyn ja kestävyys kemo- ja radio-terapia. Huolimatta sofistikoituneita terapeuttisen strategian syövän hoitoon, hoitoa ei 100% tehokas levitetty /metastaattinen. Viime aikoihin asti useimmat terapeuttisten lääkkeiden kohdistaa on proliferatiivinen syöpäsolujen hoitoon ensisijainen kasvaimia. Koska useimmat syöpäkuolemista ovat seurausta etäpesäkkeitä, ymmärtämään mekanismeja syövän etäpesäkkeiden ja kehittää lääkkeitä metastaattinen todellakin uusilla aloilla syövän solubiologian ja syövän hoidossa.

kehittäminen luonnontuotteiden syövän hoito on lupaava strategia syövän hoitoon ja ehkäisyyn. Esimerkiksi fukoidaanista, fukoosin-rikas polysakkaridi, eristetään ruskeasta merilevästä kuten

Cladosiphon okamuranus

ja

Fucus evanescens

[1], [2]. Fukoidaanista on rakenteellisesti samanlainen kuin hepariini, joilla on huomattava osuus L-fukoosia [3], [4]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet sen erilaisia ​​biologisia aktiviteetteja, kuten tulehdusta, antikoagulantin [5], anti-HIV- ja anti-syöpä [6] – [9] toimintaa. Merkittävää on, fukoidaanista osoittaa korkeaa tehokkuutta hoidettaessa erilaisia ​​syöpiä, mukaan lukien rintasyöpä, eturauhassyöpä, keuhkosyöpä, hepatooma ja leukemia [7], [8], [10] – [12]. Sen anti-kasvain aktiivisuus kohdistuu säätämällä useita signalointireittien syöpäsoluissa. Todettiin, että fukoidaanista voi indusoida apoptoosin

kautta

kaspaasi-kaskadissa, ekstrasellulaarisen signaalin säännelty kinaasi-mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin (ERK1 /2 MAPK) ja inaktivaation p38MAPK ja fosfatidyyli-3-kinaasi ( PI3 K) /proteiinikinaasi B (Akt) [7], [11], [13]. Lisäksi fukoidaanista estää myös Wnt /β-kateniinin väylän laskevan sykliini D1 ilmentyminen, mikä johtaa solusyklin pysähtymisen

in vitro

ja

in vivo

[7], [14].

in vivo

tutkimukset osoittivat, että fukoidaanista tukahdutti kasvaimen kasvun ja huomattavasti vähentynyt keuhkojen etäpesäke 4T1 rintasyövän solujen [14] – [16]. Yhdessä nämä tulokset tukevat mahdollinen kehittyminen fukoidaanista syöpälääkkeenä. Vaikkakin Tämän vaikutusmekanismeja että Fucoidan kiinnostavuus syöpäsolujen apoptoosin ei ole täysin ymmärretty. Erityisesti tiedetään vain vähän osallistumisesta Endoplasmakalvosto (ER) stressi, keskeinen signalointia, joka määrittelee solun kohtalon, että fukoidaanista välittämää antituumorivaikutuksen.

ER on keskeinen rooli Ca

2+ homeostaasiin ja solujen patofysiologia. Kertyminen laskostumattoman tai väärin laskostuneen proteiineja sisällä ER tai Ca

2+ store ehtyminen aiheuttaa ER stressiä ja laukaisee unfolded proteiinivaste säilyttää ER homeostaasin [17]. Alle lepää olosuhteissa, ER kaperoniproteiinin, glukoosin säätelemä proteiini 78 (GRP78), tiivistää huokosten ja translocon ER ja siten vähentää ER Ca

2+ vuotaa [18]. Under ER stressi, GRP78 vapautuu translocon ja laukaisee ER Ca

2+ ehtyminen [19]. Sytosoliset Ca

2+ sitoutuu kalmoduliinia aktivoimaan Ca

2+ \\ kalmoduliinista riippuvan kinaasin II (CaMKII) signalointia, joka johtaa ER stressin aiheuttama apoptoosin kautta aktivoimalla mitokondrioiden apoptoosireitin [20].

ER stressi johtaa myös dissosiaatiota GRP78 päässä komplekseja muodostettu luminal osa ER membraaniproteiineja, proteiinikinaasi RNA (PKR) kaltaisia ​​ER kinaasi (PERK), inositoli-vaativat kinaasi 1 (IRE1) ja aktivoiva transkriptiotekijä 6 (ATF6), jolloin autofosforyloinnin PERK ja IRE-1 ja translokaation ATF6 Golgin pilkkomiseen [21]. Nämä muutokset aiheuttavat aktivoitumisen niiden alavirran signalointireittien. Esimerkiksi aktivoitua PERK fosforyloi eukaryoottinen initiaatiofaktoria 2-alfa (eIF2α) vaimentamaan proteiinin translaation ja vähentää ER-proteiinin ylikuormitus [22]. Pitkäaikainen ER stressi indusoi myös ATF4 ja CCAAT /tehostajan sitovan proteiinin homologista proteiinia (CHOP) ilmentyminen, joka johtaa apoptoosin [17]. Selvitäkseen ER stressiä, aktivoitu IRE-1 toimii endonukleaasilla lisätä X-box sitova proteiini 1 (XBP-1) liittämiseen, mikä johtaa säätelyä geenien tärkeä solujen eloonjäämistä aikana ER stressin [23]. ATF6 aktivointi tapahtuu, kun proteolyyttisen katkaisun Golgin, jonka jälkeen sen tumaansiirtymiseen adaptiivisen stressivaste [24]. Jossain määrin, ER stressi on keskeinen merkitys tuning näissä signalointi saldot manipuloida solun kohtalon [17].

Tässä tutkimuksessa tutkimme onko ER stressi liittyy fukoidaanista aiheuttaman solujen apoptoosin erittäin invasiivisia ja metastaattinen MDA-MB-231-rintasyöpäsolujen [25] ja HCT116 paksusuolen syövän soluja [26]. Osoitimme, että fukoidaanista hoitoa säätelee ER Ca

2 + -modulated fosforylaatiota CaMKII on riippuvaista solutyypistä tavalla. Kuitenkin fukoidaanista kohtelu sekä syöpäsolujen aktivoitu p-eIF2 \\ CHOP pro-apoptoottisen kaskadin ja inhiboivat p-IRE-1 /XBP-1s pro-selviytymisen cascade. Siksi ER stressi vaikuttaa, ainakin osittain fukoidaanista aiheuttamaa apoptoosia.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Ihmisen MDA-MB-231 rintasyöpäsolujen ja HCT116 paksusuolen syövän soluja hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), ja niitä viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-kasvualustassa (DMEM), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Invitrogen, Eugene, OR). Soluja viljeltiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa kostutetussa inkubaattorissa.

Vasta-aineet ja reagenssit

Seuraavia vasta-aineita käytettiin tässä tutkimuksessa: kanin anti-GRP78 ja kanin anti-ERp29 alkaen Novus Biologicals (Littleton, CO); kanin anti-eIF2a, hiiren anti-fosfo-eIF2a (S51), kanin anti-P58

IPK, kanin anti-lohkaista PARP, kanin anti-saumattu XBP-1 (XBP-1s), kanin anti-lohkaista kaspaasi 3ja hiiri anti-GADD153 /CHOP Cell Signalling Technology (Beverly, MA); hiiren anti-β-aktiini Sigma-Aldrich (St. Louis, MO); kanin anti-CaMKII, kanin anti-Bax, kanin anti-kaspaasi 12 ja kanin anti-fosfo-CaMKII (T286) peräisin Abcam (Cambridge, MA).

Fucoidan eristää

rakkolevä

ostettiin Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO). Täydellinen, EDTA-vapaa proteaasi-inhibiittori cocktail tabletteja saatiin Roche Diagnostics (Indianapolis, IN). Fosfataasi cocktail-inhibiittorit I ja II ja thapsigargin (TG) saatiin Sigma-Aldrich (Steinheim, Saksa). Lipofectamine 2000 transfektioreagensseilla toimitettiin Invitrogen (Eugene, OR). Salubrinal hankittiin Tocris Bioscence (Ellisville, MO).

Solun kasvun ja elinkelpoisuuden

Solun kasvu määritettiin käyttämällä CellTiter96 vesikerros Solution Cell Proliferation Assay (Promega, Madison, WI). Lyhyesti, solut ympättiin kolmena rinnakkaisena 96-kuoppalevyillä tiheydellä 5000 solua per kuoppa 100 ul: aan vastaavaa väliainetta. Seuraavana päivänä, media imettiin ja korvattiin tuoreella väliaineella, joka sisälsi ilmoitetut pitoisuudet fukoidani (0, 10, 50, ja 100 ug /ml). Soluja inkuboitiin standardeissa viljelyolosuhteissa jopa 4 päivää, ja elävät solut arvioitiin. Absorbanssi 492 nm: ssä mitattiin käyttäen Infinite F200 mikrolevylukijalla (TECAN Austria GmbH, Grodig, Itävalta). Kolmena kappaleena kokeet suoritettiin kunkin hoidon. Solujen elinkelpoisuus tutkittiin myös käyttämällä trypaanisinieksluusiolla määrityksessä.

solun apoptoosin

solun apoptoosi määritettiin käyttämällä terminaalista deoksinukleotidyylitransferaasia-välitteisen dUTP nick end merkintöjä (TUNEL) määritys [27]. Lyhyesti, soluja (2,5 x 10

4 per kuoppa) ympättiin 6-kuoppaisille viljelylevyille, jossa peitelasi ja 24 tuntia myöhemmin, 2 ml: ssa tuoretta kasvualustaa fukoidaanista (lopullinen pit. 100 ng /ml) lisättiin kuhunkin kuoppaan . Sitten soluja käsiteltiin 3 päivää ja sen jälkeen TUNEL värjäys käyttäen DeadEnd Fluorometric TUNEL järjestelmä kit (Promega, Madison, WI), mukaisesti valmistajan protokollaa. Levyt asennetaan käyttäen mikroskooppipreparaatin haalistumista estävää nestettä sisältäviä DAPI. Green (apoptoottinen solu tuma) ja sinisen (DAPI, yhteensä solut) fluoresoivat signaalit otettiin käyttäen Olympus Fluoview FV1000 konfokaali laserkeilauksen mikroskooppi (Olympus, Japani). Prosenttiosuus apoptoottisten solujen keskiarvona ilmaistuna viisi satunnaisesti valittua kenttää (300 solua per kenttä). Lisäksi apoptoosia tutkittiin myös immunoblottauksella ilmaus pilkotun kaspaasi 3 ja halkaistut Poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP).

RNA-interferenssi

Pieni häiritsevät RNA: t (siRNA: t) kohdistaminen CHOP (CHOP siGENOME SMARTpool, Dharmacon, Lafayette, CO) ja siGENOME kuin kohdistaminen siRNA käytettiin CHOP knockdown ja valvontaa, vastaavasti. Lyhyesti, soluja kasvatettiin 6-kuoppalevyille ja transfektoitiin ohimenevästi 60-80% konfluenssiin siRNA lopullisessa pitoisuudessa 25 nM käyttäen Lipofectamine 2000 transfektioreagenssia (Invitrogen, Eugene, OR) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen soluja inkuboitiin tuoretta väliainetta yksin tai väliainetta, jossa 100 ug /ml fukoidaanista. 3 päivän kuluttua hoidon jälkeen, solut kerättiin analysoimalla elinkelpoisuus käyttäen trypaanisinieksluusiolla määritys ja tasojen arviointiin CHOP ja pilkkoa PARP immunoblottauksella.

immunoblottianalyysi

Solut 70-80% yhtymäkohdassa käsiteltiin fukoidaanista eri pitoisuuksina (0, 1,0, 5,0, 10, 50 ja 100 ug /ml, vastaavasti) ja 3 päivää. Sekä liitteenä ja keskeytettiin solut kerättiin proteiiniuutto. Solulysaatit uutettiin RIPA-puskuria (1% Igepal, 1% natriumdeoksikolaatti, 0,15 M natriumkloridia, 0,01 M natriumsulfaattia, pH 7,2 ja 2 mM EDTA), jota on täydennetty proteaasi-inhibiittoreita (Roche Diagnostics) ja fosfataasi cocktail-inhibiittorit I ja II (1:100, Sigma-Aldrich). Western-blottaus suoritettiin, kuten on kuvattu [28]. Lyhyesti, kokonais-proteiineja (30 ug /kaista) erotettiin 10% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin PVDF-membraaneille. Membraanit blokattiin 5% rasvatonta maitoa Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa puskuria, jossa oli 0,1% Tween 20: ssa 1 h huoneen lämpötilassa ja tutkittiin, jossa on esitetty ensisijaisen vasta-aineita. Vuohen anti-hiiri piparjuuriperoksidaasi (HRP; Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) tai vuohen anti-kani-HRP-sekundaarista vasta-ainetta (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) käytettiin sekundaarisena vasta-aineita. Kemiluminoiva signaali kehitettiin SuperSignal West Pico kemiluminesenssisubstraatilla (Pierce, Rockford, IL). Signaali-intensiteetti analysoitiin käyttämällä GeneTools ohjelmistoa (Syngene, Frederick, MD). Taso β-aktiini käytettiin latauskontrollina.

Tilastolliset analyysit

Yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA) ja Studentin

t

testejä käytettiin analysoimaan erojen merkitsevyyden. p 0,05 pidettiin merkittävänä. Kaikki soluviljelmässä kokeet suoritettiin kolmena kappaleena. Tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta (SD) ja toimitetaan taulukossa S1.

Tulokset

Fucoidan hoito indusoi apoptoosia

Aikaisemmat tutkimukset osoittivat merkitsevän eston fucidan on kasvaimen kehittymisen ja syöpäsolumetastaasi [14] – [16]. Ymmärtää vaikutus fukoidaanista solujen kasvuun ja apoptoosin, sekä metastaattisen MDA-MB-231-soluja ja HCT116-solut käsiteltiin fukoidaanista on osoitettu pitoisuus enintään 4 päivää, ja solujen kasvu määritettiin. Kuten on esitetty kuviossa. 1A, solujen kasvu estyi merkittävästi, kun soluja käsiteltiin 50 ug /ml fukoidaanista päivänä 3 MDA-MB-231-soluja, ja päivänä 2 HCT116-soluissa, verrattuna niiden kontrollisoluihin. Lisäksi sen määrittämiseksi, onko apoptoosin määritteet Solujen kasvun estämisen, molemmat soluja käsiteltiin fukoidaanista (100 ug /ml) 3 päivää ja solujen apoptoosi arvioitiin tutkimalla ekspressiota katkaistun kaspaasi 3 ja TUNEL. Kuten kuviossa 1 B, hoitoon fukoidaanista suurilla annoksilla (

esim

., 100 ug /ml) aiheutti korkean ilmentymisen pilkottiin kaspaasi 3 molemmissa soluissa. TUNEL analyysi osoitti myös noin 25% soluista olevien DNA-vaurioita fukoidaanista käsiteltyjä soluja (Fig. 1 C). Siksi fukoidaanista hoito johti merkittävä DNA-vaurioita näissä soluissa.

(A) Cell kasvua. Soluja käsiteltiin fukoidaanista on ilmoitetun pitoisuuden ja elävät solut arvioitiin käyttäen CellTiter96 vesikerros Solution Cell Proliferation Assay. (B) Kaspaasi 3 aktivointi. Soluja käsiteltiin fukoidaanista 3 päivää ja ilmaus pilkottiin kaspaasi 3 tutkittiin Western blot. (C) TUNEL. Tunel-analyysi, solut käsiteltiin fukoidaanista 100 ug /ml 3 päivää ja solujen apoptoosin analysoitiin käyttämällä TUNEL-määritystä. Apoptoottisia soluja (vihreä) laskettiin viiden satunnaisesti valitun kentät (300 solua per kenttä) ja esitetään keskiarvona ± SD prosentteina apoptoottisten solujen yli koko soluja (DAPI, sininen). Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD kolmena kappaleena kokeissa. * P 0,05; ** P 0,01.

Fucoidan hoito johtaa erilaisiin ER vasteen MDA-MB-231 ja HCT116-solut

Sen tutkimiseksi, ER stressi on osallisena fukoidaanista aiheuttaman apoptoosin me aluksi tarkasteltiin ilmentymisen ER stressin markkereita mukaan lukien GRP78 ja ERp29. Mielenkiintoista on, toisin kuin solut, joita käsiteltiin ER stressin indusoija TG ,, ilmentyminen GRP78 oli vähentynyt fukoidaanista-käsitellyn MDA-MB-231-solujen, joilla ei ole vaikutusta ERp29 ilmentymisen näissä soluissa, verrattuna kontrollisoluihin (ei fukoidaanista hoitoa ) (Fig. 2A). Sen sijaan, ilmentyminen ERp29 on pienentynyt huomattavasti fukoidaanista käsiteltyjen HCT116-soluissa, kun taas ekspressio GRP78 oli hieman lisääntynyt, kun soluja käsiteltiin 5 ug /ml, mitä seuraa pelkistys suuria annoksia hoitoja (Fig. 2B). GRP78 on useita toimintoja syöpäsoluissa esimerkiksi olevan vastuussa solujen lisääntymistä, solujen suojaaminen apoptoosin ja kiihtyvä ER liittyvä proteiini hajoamista väärin laskostuneen proteiinien [29]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat myös käsitelty roolia ERp29 syöpäsolun selviytymisen vastaan ​​kemo- ja radio-hoito [27], [30]. Vähentäminen GRP78 tai ERp29 on fukoidaanista-käsitellyissä soluissa viittaa siihen, että fukoidaanista indusoi solukuoleman ilmentymisen estämiseksi näiden eloonjääminen proteiinien MDA-MB-231 ja HCT116-soluissa.

Solut 70-80% konfluenssiin oli käsitelty fukoidaanista ilmoitettuina pitoisuuksina ja 3 päivää, ja molemmat on kiinnitetty ja suspendoidut solut kerättiin proteiinin ilmentymisen analyysi. (A): n ilmentyminen GRP78, mutta ei ERp29, estyi fukoidaanista MDA-MB-231-solujen; (B) ekspressio ERp29 lievensi merkittävästi fukoidaanista on HCT116-soluissa, kun taas GRP78 oli vain hieman vähentynyt (~1.5-kertainen) käsitellyissä soluissa fukoidaanista on 50 ug /ml. Positiivisena kontrollina, soluja käsiteltiin ER stressin indusoija TG (2,0 uM) 24 tuntia. Data edustaa keskiarvoa ± SD kolmena kappaleena kokeita. * P 0,05; ** P 0,01.

Fucoidan käsittely johtaa aktivoitumiseen p-CaMKII \\ Bax ja kaspaasi 12 ilmentymistä solussa-tilanneriippuvaista tavalla

Koska GRP78 voi sitoutua kanssa translocon ER kalvo estää Ca

2+ levittämisestä sytosoliin [18], me seuraavaksi analysoidaan onko vähentäminen GRP78 MDA-MB-231-solujen voi aiheuttaa Ca

2 + -välitteisen aktivaation CaMKII ja ilmaisun apoptoosin liittyvien proteiinien Bax. Kuten on esitetty kuviossa. 3A, suhteellinen fosforylaatio CaMKII (p-CaNKII /CaMKII) lisättiin progressiivisesti soluissa käsitelty fukoidaanista kontrolliin verrattuna soluihin (ei fukoidani hoitoa), mikä osoittaa, että aktivoinnin Ca

2+ \\ CaMKII signalointia. Tämän mukaisesti, Bax ilmaus oli myös merkitsevästi lisääntynyt ja ylläpidetään samalla tasolla soluissa käsitelty fukoidaanista (10-100 ug /ml). Sen sijaan, verrataan kontrollisoluihin, suhteellinen fosforylaatio CaMKII (p-CaNKII /CaMKII) kohtalaisesti lisääntynyt (~1.5-kertaisesti) HCT116-soluissa käsiteltiin 10 ug /ml fukoidani, mitä seuraa pelkistys niissä soluissa, joita käsiteltiin 100 ug /ml fukoidaanista. Kaiken fukoidaanista hoito HCT116-solut eivät aiheuta merkittävää muutosta suhteellisen fosforylaation CaMKII ja Bax ilmaisun (Fig. 3B). Huomasimme myös, että ilmaus kaspaasi 12 oli erittäin lisääntynyt fukoidaanista pitoisuus MDA-MB-231-solujen, mutta ei HCT116-soluissa (kuvio. 3C). Lisäksi mitään pilkkominen kaspaasi 12 havaittiin, kun koettimena vasta-aineella. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että fukoidaanista säätelee Ca

2 + \\ CaMKII signalointi ja kaspaasi 12 on riippuvaista solutyypistä tavalla.

(A) suhteellinen fosforylaatio CaMKII ja Bax ilmentyminen lisätään asteittain fukoidaanista MDA-MB-231-solujen; (B) Suhteellinen fosforylaatio CaMKII kohtalaisesti stimuloitiin (~1.5-kertainen) 10 ug /ml, minkä jälkeen inhibitio (~1.4-kertainen) fukoidaanista 100 ug /ml. Bax ilmentyminen eivät vaikuttaneet fukoidaanista sisään HCT116-soluissa. (C) kaspaasi 12 ilme ja pilkkominen. Fucoidan tehokkaasti indusoi kaspaasi 12 ilmentymistä MDA-MB-231-solujen, eikä HCT116-soluissa. Mitään katkaisua ei kaspaasi 12 havaittiin molemmissa soluissa. Data edustaa keskiarvoa ± SD kolminkertaisista kokeista. * P 0,05; ** P 0,01.

Fucoidan hoito estää p-IRE-1 \\ XBP-1 liittämiseen

Edellä esitettyjen havaintojen että fukoidaanista voi moduloida ER stressiä vastaus syöpäsoluissa meidän seuraava tutki fukoidaanista erilaisesti säätelee IRE-1 \\ XBP-1 s, cascade määritellään solujen selviytymistä vastaus

kautta

up-ekspressiota sääteleviä chaperones ER taitto kapasiteettia [31], ja PERK \\ P -eIF2α \\ CHOP proapoptoottisten cascade [17]. Kontrolliin verrattuna, fukoidaanista estivät merkittävästi ekspressiota XBP-1s molemmissa soluissa (kuvio. 4A, B). Tämä johtui vähentynyt fosforylaatio IRE-1 fukoidaanista käsiteltyjä soluja, koska aktivoidut p-IRE-1 toimii synnyttämiseksi jatkettuja XBP-1-merkinnät silmukoimattoman XBP-1 mRNA alle ER stressin [32]. Toisin kuin TG-käsitellyt solut, jotka osoittavat parannetun IRE-1-fosforylaation ja XBP-1s ilmentymistä (Fig. 4A, B), nämä tulokset osoittavat estovaikutusta fukoidaanista on ER stressiin liittyvät solun eloonjäämisen cascade. Emme kuitenkaan eivät havainneet merkittävää muutosta P58

IPK yksi alavirran tavoitteista XBP-1s ja ATF6 [23], in fukoidaanista-käsitellyissä soluissa.

Soluja käsiteltiin fukoidaanista kuvatulla kappaleessa ”Materiaalit ja menetelmät” ja kuvassa 2. fosforylaatio IRE-1 (p-IRE-1) ja XBP-1 liitos oli huomattavasti vähennetty fukoidaanista arvioituna immunoblottauksella. Sen alavirran kohde, P58

IPK, ei myöhemmin vähentynyt. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD kolmena kappaleena kokeissa. Huomaa, että TG-käsitellyt solut (2,0 uM, 24 h) osoittivat lisääntyneen p-IRE-1 ja XBP-1s molemmissa soluissa. * P 0,05; ** P 0,01.

Fucoidan aktivoi eIF2α fosforylaatiota ja ylössäätelee CHOP ilmaisun

fosforylaatio eIF2α on klassinen mekanismi alaspäin säätäminen globaali proteiinisynteesiä selviytymään ER stressistä [33 ]. Kuitenkin liiallinen ER stressin myös edistää solujen kuoleman

kautta

upregulating ATF4 \\ CHOP Cascade [17]. Se on näin ollen spekuloitu, että tämä kaskadin on todennäköisesti aktivoidaan osallistua fukoidaanista-indusoidun apoptoosin. Todellakin, sopusoinnussa TG-käsiteltyjä soluja, fosforylaatiota eIF2α ja ilmentymisen CHOP oli asteittain indusoi annoksesta riippuvalla tavalla molemmissa soluissa (kuvio. 5A B). Näin ollen, fukoidaanista voi aiheuttaa ER stressiin liittyvät pro-apoptoottisen kaskadin näissä syöpäsoluissa.

Soluja käsiteltiin fukoidaanista, kuten on kuvattu kohdassa ”Materiaalit ja menetelmät”, ja kuviossa 2. suhteellinen fosforylaatio eIF2α (p -eIF2α /eIF2α) ja CHOP ilmentyminen merkittävästi kasvanut fukoidaanista arvioituna immunoblottauksella. TG hoito (2,0 uM, 24 h) aiheuttama aktivointi p-eIF2α ja CHOP ilme. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD kolmena kappaleena kokeissa. * P 0,05; ** P 0,01.

Salubrinal hoito parantaa fukoidaanista aktivoituvan eIF2α fosforylaation ja CHOP ilmaisun

Salubrinal on selektiivinen eIF2α defosforylaatiosta ja indusoi hyperfosforylaatiota eIF2α estämällä GADD34-PP1C monimutkaisia ​​[34], [35]. Sen arvioimiseksi, onko salubrinal hoitoa helpottaa fukoidaanista aiheuttaman ER stressiä cascade, MDA-MB-231 ja HCT116-soluja käsiteltiin salubrinal (50 uM) yksin tai yhdessä fukoidaanista (100 ug /ml) 48 tunnin ajan ja ilmentymistä p- eIF2α ja CHOP tutkittiin. Kuten kuviossa 6, solut käsiteltiin salubrinal ja fukoidaanista osoitti suurempi ekspressio p-eIF2α fosforylaation ja CHOP kuin soluja käsiteltiin salubrinal tai fukoidaanista yksin. Nämä tiedot osoittavat edistävä vaikutus fukoidaanista on salubrinal aiheuttama p- eIF2α \\ CHOP cascade.

Soluja käsiteltiin salubrinal (50 uM) yksin tai yhdessä fukoidaanista (100 ug /ml) 48 h . Solulysaateista (30 ug) pantiin analysointiin ekspression p-eIF2α ja CHOP immunoblottauksella. ** P 0,01; *** P 0,001.

CHOP hiljaisuus estää fukoidaanista indusoima pilkotun PARP

Kun arvioidaan fukoidaanista aiheuttama CHOP molemmissa syöpäsolujen liittyy havaittu solujen apoptoosin, soluja käsiteltiin siRNA kohdistaminen CHOP vähentämään endogeenisten pitoisuuksien tai käsitelty sekoituskoodin siRNA kontrollina. Alustavien tutkimusten mukaan molemmat soluja käsiteltiin 25 nM siRNA 48 h voisi johtaa 70% tukahduttaminen CHOP ilmaisun verrattuna hoidettu ohjaus siRNA. Näitä soluja käsiteltiin sitten fukoidaanista (0 tai 100 ug /ml) 2 päivää ja CHOP ilmaisun ja DNA-vaurioita (arvioituna pilkotun PARP) analysoitiin. Kuten on esitetty kuviossa. 7A, taso CHOP väheni 70-90% valvonnan molemmissa solujen käsittelyn jälkeen. Soluissa esikäsitelty siRNA ohjaus, fukoidaanista hoito selvästi lisääntynyt CHOP ilmaisun ja PARP lohkaisu solujen päälle ilman fukoidaanista hoitoa. Sen sijaan, fukoidaanista käsittely ei kyennyt indusoimaan CHOP ilmaisun ja PARP lohkaisu CHOP-vaimennettu soluissa, mikä osoittaa, että hiljentäminen CHOP pystyy estämään fukoidaanista indusoima pilkkoa PARP. Nämä tiedot osoittamaan, että CHOP osallistuu fukoidaanista aiheuttaman DNA-vaurioita.

(A) CHOP pudotus siRNA estää fukoidaanista indusoima katkaistun PARP. Solut 70-80% konfluenssiin käsiteltiin CHOP siRNA tai hajotus- siRNA 48 h, jonka jälkeen fukoidaanista hoitoa (0 tai 100 ug /ml) 2 päivää. Tasot CHOP ja pilkkoa PARP arvioitiin immunoblot. (B) hiljentäminen CHOP antagonisoi fukoidaanista solukuolema. Solut on esikäsitelty CHOP siRNA tai ohjaus siRNA käsiteltiin fukoidaanista (0 tai 100 ug /ml) 2 päivää ja solujen elinkelpoisuus tutkittiin käyttäen trypaanisinieksluusiolla määrityksessä. Solujen elinkyky ilmaistaan ​​prosentteina siRNA ohjaus soluja ilman fukoidaanista hoitoa (3 sarakkeessa MDA-MB-231-soluja, sarake 7 HCT116-solut). Huomaa, että CHOP pudotus ei yksin vaikuta solujen elinkelpoisuus molemmissa soluissa (sarake 1

vs.

3, sarake 5

vs.

7). Sen sijaan, CHOP pudotus huomattavan estää solun indusoiman apoptoosin fukoidaanista 100 ug /ml (sarake 2

vs.

4 MDA-MB-231-solujen, sarake 6

vs.

8 HCT116-soluissa ). Tulokset tulkitaan keskiarvo (± SD) kolminkertaisten kokeita. * P 0,05; ** P 0,01.

CHOP tukahduttaminen antagonisoi fukoidaanista aiheuttaman apoptoosin

vaikutuksen tutkimiseksi CHOP Knockdown on fukoidaanista aiheuttaman apoptoosin, solujen elinkelpoisuuden näiden käsiteltyjen solujen tutkittiin. Suhteessa solujen elinkelpoisuuden siRNA ohjaus soluja ilman fukoidaanista hoitoa (Fig. 7B, 3 sarakkeessa MDA-MB-231-solujen, sarake 7 HCT116-soluissa), solujen elävyys CHOP-vaiennettu soluissa oli samanlainen kuin havaittiin näiden ohjaus solut (Fig. 7B, sarake 1

vs.

3, sarake 5

vs.

7), mikä osoittaa, että hiljentäminen CHOP yksinään voinut vaikuttaa solujen elävyyden. Soluissa esikäsitelty ohjaus siRNA, fukoidaanista hoidon seurauksena noin 50-60%: n vähennys solujen elinkelpoisuuden verrattuna ilman fukoidaanista hoitoa (Fig. 7B, sarake 4

vs.

3, sarake 8

vs.

7; p 0,01). Kuitenkin fukoidaanista käsittely aiheuta vain noin 10-20%: n vähennys solujen elinkelpoisuuden CHOP-vaiennettu soluja (Fig. 7B, sarake 2

vs.

1, sarake 6

vs.

5) . Huomattavaa on, että tukahduttaminen CHOP molemmissa soluissa johti merkittävään kasvuun solujen elinkelpoisuuden jälkeen fukoidaanista hoidon verrattuna soluihin käsitelty ohjaus siRNA ja fukoidaanista (Fig. 7B, sarake 2

vs.

4; sarake 6

vs.

8; p 0,05). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että pudotus CHOP voisi suojata soluja fukoidaanista-indusoidun apoptoosin.

Keskustelu

Fucoidan on osoitettu olevan uusi terapeuttinen aine syövän hoitoon. Mekaaniset tutkimukset paljastivat, että fukoidaanista voidaan estää syöpäsolun selviytymisen, kasvaimen kehittymisen ja etäpesäkkeiden säätelemällä useita signalointireittien [5], [7], [11] – [14]. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että fukoidaanista moduloi ER stressiä kaskadissa syöpäsoluja ja aktivoitu CHOP ilmaisu on vastuussa fukoidaanista indusoiman apoptoosin.

ER stressi laukaisee useita prosesseja tarpeen apoptoosin. Yksi niistä on vapauttaminen ER Ca

2+ tallentaa sytosoliin aktivoida Ca

2 + -signaali anturin CaMKII, mikä apoptoosin kautta: (

i

) aktivointi c-Jun N-pään kinaasin (JNK) aiheuttamaan kuoleman reseptori Fas (11); (

ii

) stimulaation Ca

2+ ottoa mitokondriot ja vapauttamaan apoptogens [36]. Siksi CaMKII aktivaatio ER Ca

2+ vuoto on keskeinen rooli apoptoosin. Olemme kuitenkin havaittu, että fukoidaanista indusoi aktivaation p-CaMKII MDA-MB-231-soluja ennemmin kuin HCT116-soluissa. Johdonmukaisesti, mitokondrio apoptoottinen proteiini Bax ja ER-liittyvä kaspaasi 12 lisättiin merkittävästi fukoidaanista saaneilla MDA-MB-231-soluja. Ottaen huomioon, että GRP78 sitoutuu ER Ca

2+ ja translocon ER kalvo estää ER Ca

2+ vuotaa [18], tämä selittyy sillä, että fukoidaanista hoitoa MDA-MB-231-solujen , ei HCT116-soluissa, aiheutti vähentäminen cytoprotective GRP78, mikä johtaa ER Ca

2+ päästessä sytosoliin aktivoida CaMKII fosforylaatioon. Sitä vastoin, ei ollut merkittävää muutosta CaMKII fosforylaation ja Bax ja kaspaasi 12 ilmentymistä fukoidaanista käsiteltyjen HCT116-solut, vaikka CaMKII fosforylaation kohtuullisesti edesauttavat fukoidaanista 10 ug /ml ja estettiin 100 ug /ml. Tämä on luultavasti johdonmukainen sen havainnon, että ilmaus GRP78 ei merkittävästi vaikuttanut fukoidaanista sisään HCT116-soluissa. Kuitenkin vaikutus fukoidaanista aiheuttaman downregulation ERp29 on maltillisesti CaMKII fosforylaation HCT116-soluissa ei pitäisi sulkea pois. Lisäksi on raportoitu, että ER-liittyvä, Ca

2 + indusoimaa kaspaasi 12 aktivointi on myös osallisena ER stressin indusoiman apoptoosin [37], mutta emme ole havaittu aktivaatio pro-kaspaasi 12 ( pilkkominen kaspaasi 12) fukoidaanista-käsitellyissä soluissa, mikä viittaa siihen, että tämä kaspaasi kaskadi ei saa aktivoida. Koska GRP78 ja ERp29 ovat välttämättömiä ER proteiineja säilyttämisessä ER homeostaasiin ja toimintoja, kuten taitto ja proteiinien erittymistä ja hajoaminen väärin laskostuneen proteiinien [29], [38], on todennäköistä, että fukoidaanista voimistaa vahinkoa ER: n toimintoa lieventävien ilmaisun GRP78 tai ERp29 solussa tilanneriippuvaista tavalla, jossa hienomekanismin on tarkemmin.

ER stressiin välittämää signalointireittien on kytketty kahteen kaskadeja: solukuolemaan liittyvät PERK \\ P-eIF2α \\ CHOP cascade ja solujen eloonjäämistä liittyvien AFT6 (IRE-1) \\ XBP-1 liittämiseen cascade [17]. Selviytymään ER stressiä, XBP-1-mRNA on saumattu, että aktivoitu p-IRE-1 tuottaa XBP-1s [32]. XBP-1s on erittäin aktiivinen transkriptiotekijä ja on yksi keskeisistä sääntelyviranomaiset ER taitto kapasiteetin [31]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että jatkaminen IRE-1-signalointia ER stressi voi edistää solujen eloonjäämistä [39]. Näin ollen vaimennus tämän Cascade voisi laukaista solujen apoptoosin. Todellakin, meidän tutkimukset osoittivat, että fukoidaanista hoito merkitsevästi esti XBP-1 silmukointi estämällä IRE-1 fosforylaatiota.