Krooninen sairaus

tiivistelmä

Mastermind-like 1 (MAML1) on transkription säätelijäproteiinien aktivaattoreita eri signalointireiteissä, kuten Notch, p53, lihassolujen tehostajana tekijä 2C (MEF2C) ja beeta-kateniinia. Aiemmissa tutkimuksissa osoitimme, että MAML1 tehostettu p300 asetyylitransferaasivaikutus, mikä lisäsi asetylaatio Notch mukaan p300. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että MAML1 indusoituu voimakkaasti asetylointi transkriptiotekijän varhaisen kasvun vaste-1 (EGR1), jonka p300, ja lisääntynyt EGR1 proteiinin ilmentyminen alkion munuaissoluja.

EGR1

mRNA-transkriptien myös voimistunut läsnä ollessa MAML1. Osoitamme, että MAML1 fyysisesti vuorovaikutuksessa, ja toimi yhteistoiminnallisesti EGR1 lisäämään transkription aktiivisuutta EGR1 ja p300 promoottorit, jotka molemmat sisältävät EGR1 sitoutumiskohtia. Bioinformatiikka arviointi paljasti korrelaatio

p300

,

EGR1

ja

MAML1

kopioluvun ja mRNA muutoksiin munuaisten selkeä karsinooma ja

p300

,

EGR1

ja

MAML1

geenin muutokset liittyivät kasvanut selviytymistä. Tulosten perusteella näyttää MAML1 voi olla komponentti transkription verkkojen jotka säätelevät EGR1 kohdegeenien aikana nephrogenesis ja se voisi myös vaikuttaa kehittämiselle munuaissyövän.

Citation: Hansson ML, Behmer S, Ceder R, Mohammadi S, Preta G, Grafström RC, et ai. (2012) MAML1 Acts yhteistyökykykyisiä EGR1 Aktivoi EGR1 säätelemät Promoottorit: vaikutukset Nephrogenesis ja kehittäminen Munuaisten Cancer. PLoS ONE 7 (9): e46001. doi: 10,1371 /journal.pone.0046001

Editor: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Catolica de Chile, Chile

vastaanotettu 23. huhtikuuta 2012 Hyväksytty: 27 elokuu 2012; Julkaistu: 27 syyskuu 2012

Copyright: © Hansson et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat sai tukea Ruotsin Research Council, Swedish Cancer Society ja Ruotsin lasten Cancer Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mastermind-like 1 (MAML1) on ihmisen homologi

Drosophila

Mastermind, neurogeeninen geeni liitettiin geneettisesti Notchiin toiminto [1], [2]. Notch-signalointireitin on tärkeä rooli monissa kehitysprosesseissa vaikuttamalla solujen lisääntymistä, erilaistumista ja apoptoosia. Tumassa, Notch solunsisäinen domeeni (Notch ICD) kumppaniaan transkriptiotekijä CSL (tunnetaan myös RBP-Jk tai CBF1 selkärankaisilla, vaimennin on karvaton in

Drosophila

ja Lag-1

C . elegans

), kun se on sidottu DNA: n ja koaktivaattoreiden kuten PCAF [3], GCN5 [3], p300 [4] ja MAML1 [1], [2], rekrytoidaan aktivoida ilmentymistä Notch kohdegeenien . Äskettäin MAML1 on osoitettu toimimaan koaktivaattorikompleksien transkription tekijöitä erilaisissa Notch-riippumaton signalointireittien, kuten lihassolujen tehostajana tekijä 2C (MEF2C) [5], p53 [6] ja beeta-kateniini, [7] ja N-pään MAML1 on ratkaisevan tärkeää näiden vuorovaikutusten. Nämä havainnot viittaavat siihen, että MAML1 toimii koaktivaattorikompleksien erilaisissa solun prosesseja ja voi olla välittäjänä ylikuulumisen eri signalointireitteihin. MAML1 voivat myös vaikuttaa eri signalointireittejä vuorovaikutuksessa p300, yleisesti käytetty koaktivaattorikompleksien. Me ja muut tutkijat ovat aikaisemmin raportoitu, että MAML1 välittää Notch ICD-välitteisen transkription in vivo, ja voivat myös muodostaa chromatin malleja in vitro, rekrytoimalla p300 DNA-CSL-Notch kompleksi [8], [9], [10]. Me raportoi äskettäin, että MAML1 parantaa p300 autoacetylation, histoni asetyylitransferaasi (HAT) aktiivisuus ja koaktivaattorikompleksien toiminto [11]. Olemme myös havainneet, että p300 acetylates Notch1 ICD soluviljelymäärityksillä ja

in vitro

, ja että alueet sijaitsevat Notch C-päässä ovat välttämättömiä Notch asetylointi. MAML1 ja CSL, komponentit Notch transkription monimutkainen, voimakkaasti parantaa Notch asetylaatio ja ehdotimme, että MAML1 lisää Notch asetylaatio by tehostava p300 autoacetylation [12]. p300 voi myös acetylate MAML1, vaikka vaikutus tämän posttranslational muutos on tehtävä MAML1 ei tällä hetkellä tunneta. MAML1 on fosfoproteiini, ja olemme aiemmin tunnistettu GSK3ß yksi kinaasin vastuussa fosforylaation MAML1

in vitro

[13]. Aktiivinen muoto GSK3ß suoraan vuorovaikutuksessa N-päähän MAML1 estää MAML1 transkriptionaalista aktiivisuutta [13]. Lisäksi MAML1 N-pää edellyttää SUMOylation, joka myös tukahduttaa transkriptionaalista aktiivisuutta MAML1 [14].

transkriptiotekijä varhaisen kasvun vaste-1 (EGR1) ilmentyy vasteena erilaisiin solunulkoisen signaalit , kuten kasvutekijöitä, sytokiinejä, säteilytys, ja erilaisia ​​stressiä. Monissa normaalit solut, kasvutekijä stimulaatio aiheuttaa nopeasti ilmentymisen EGR1, joka myöhemmin johtaa aktivaatioon loppupään kasvun polkuja [15]. Kuitenkin EGR1 voi myös tukahduttaa kasvua, kun yli-ilmennetään transformoiduissa soluissa useissa kokeellisissa järjestelmissä [16]. Soluvasteen EGR1 suhteen apoptoosin vaihtelee: EGR1 voi indusoida apoptoosia stimuloimalla joko p53- tai PTEN; kuitenkin, EGR1 voi myös edistää selviytymistä tietyissä solutyypeissä vastustamalla p53-riippuvaista apoptoosia [17]. EGR1 on tärkeä rooli, koska tuumorisuppressori rinta-, aivo- ja keuhkosyöpä, kuten EGR1 on huonosti ilmaistu näissä kudoksissa ja toimii vaimentimen kasvun ja muuttumisen, kun yli-ilmentynyt [16]. Sitä vastoin ilmaus EGR1 näyttää säilytetään suuri osa eturauhasen ja munuaisten syövät, joissa se edistää kasvua. EGR1 on poissa tai ekspressoituu vähäisinä määrinä normaalissa eturauhasessa kudoksissa; kun taas EGR1 promoottori säätelee positiivinen takaisinkytkentäsilmukka välillä EGR1 ja kasvutekijät eturauhassyöpäsoluissa, joka johtaa konstitutiiviseen kasvuun. Eturauhassyöpäkudoksille myös ilmaista korkeita p300, joka johtaa konstitutiivisesti korkeita stabiileja asetyloitua EGR1 proteiinia, joka on tärkeä osa muutosta ja etenemistä tämä tauti [18]. Tasot EGR1 kasvaa aste maligniteetin eturauhassyövässä, kuten on osoitettu Gleason kasvain pisteet [15]. Kyky vähentää EGR1 ilmentyminen voi tarjota tehokas kliininen hoito eturauhasen syöpä, koska downregulation EGR1 voi vähentää kasvutekijän induktio ja positiivista palautetta EGF1 promoottori.

EGR1 on osoitettu olevan tärkeä tekijä nephrogenesis ja kehittäminen munuaissyövän. Alkionkehityksen aikana, EGR1 ilmentyy lähes kaikissa jakautuviin soluihin, mukaan lukien metanephric blastems; kuitenkin, se on yleensä vaimentua aikana munuaisten kehitystä [19]. Expression of EGR1 on myös kohonnut monissa Wilmsin kasvaimia verrattuna normaaliin munuaisten kudoksiin. Wilmsin kasvain on pediatrinen maligniteetti munuaisen, joka on usein alkion alkuperä [20]. Yliekspressio EGR1 on raportoitu lisätä leviämisen, parantaa kasvaimen kasvua ja antagonisoida tuumorisuppressorigeenin Wilms kasvain 1 (WT1) in rotanpoikasen munuaissoluissa [21]. Munuaissolukarsinooma (RCC) on yleisin munuaissyöpää aikuisilla, osuus 80-85% ensisijaisen munuaisen malignances. Tyhjennä solu (tavanomainen) RCC ja munuaispapillan karsinooma ovat kaikkein ja toiseksi yleisin tyyppisiä RCC, vastaavasti. Strefford ja kollegat raportoitu, että 5-kromosomissa oli yliedustettuna ja järjestetty uudelleen merkittävä osa 19 munuaissyövän solulinjat, joissa geenit, jotka koodaavat

EGR1

(5q31.1) ja

CSF1R

(Colony- kasvutekijä 1 -reseptorin) (5q33-q35) useimmin muuttunut kromosomissa 5, mikä edelleen tukee rooli EGR1 munuaisten syöpä [22]. Aikaisemmassa tutkimuksessa raportoimme että MAML1 lisääntynyt p300 autoacetylation ja p300 asetylointi aktiivisuutta alkion munuaissolut (HEK293) [11]. Tavoitteena tässä tutkimuksessa oli selvittää, ovatko MAML1 ja p300 säädellä tasot EGR1 in munuaissoluissa.

Materiaalit ja menetelmät

Plasmidit

pcDNA3.1-FLAG- EGR1 ja pGL3-p300 ostettiin Addgene (Cambridge, MA, USA). Plasmidi 4xEBS1-luc oli ystävällinen lahjoitus tri G. Thiel (University of Saarland Medical Center, Homburg, Saksa) ja pGL3-EGR1 oli jalomielinen lahjoitus Dr. T. E. Eling (National Institute of Environmental Health Sciences, NC, USA). pcDNA3.1-FLAG-MAML1 (1-1016), (1-625) ja CMV-p300-HA on kuvattu aikaisemmin [11]. CDNA, joka koodaa MAML1 (1-127) ja (75-1016) monistettiin PCR: llä ja subkloonattiin ekspressiovektoriin FLAG-pcDNA3.1.

Solulinjat

MAML1 solulinjoja rakennettava transfektoimalla ihmisalkion munuaisen (HEK) -293 soluja vektoreilla pcDNA3.1-FLAG-MAML1 tai pcDNA3.1-MAML1 ja vakaa kloonit valittiin genetisiinillä [11].

siRNA transfektion

HEK-293-soluja transfektoitiin ohimenevästi 100 nM MAML1 siRNA (valmiista MAML1 SMARTpool sarja 4 siRNA: iden, Dharmacon) tai kontrolli-siRNA käyttäen DharmaFECT 1 siRNA reagenssit (Dharmacon, Lafayette Colorado, USA), ja niitä viljeltiin, kun läsnä tai poissa 50 ng /ml TPA (12-O-tetradekanoyyliforboli-13-asetaatti) (Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA).

reportterigeenimäärityksessä

HEK-293-solut 24 kuoppaiset levyt transfektoitiin ohimenevästi käyttäen TransIT-LT1 reagenssia (Mirus, Madison, WI, USA) ja 200 ng reportteri-DNA ja 150 ng EGR1 tai MAML1 ekspressiovektorin DNA: ta, kuten on esitetty kuvioissa. Solut hajotettiin Reporter Lysis-puskuria (Promega, Madison, WI, USA) 24 tunnin jälkeen, ja lusiferaasiaktiivisuus mitattiin käyttäen LucySoft3. Tiedot ilmoitetaan keskiarvoina vähintään kolmen itsenäisen kokeen.

Reaaliaikainen PCR

Kokonais-RNA puhdistettiin käyttämällä RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Saksa) mukaan valmistajan protokollaa ja cDNA syntetisoitiin käyttäen Superscript III ensimmäisen juosteen synteesi järjestelmä (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen Virta SYBR Green master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) Applied Biosystems 7500 Sequence ilmaisin käyttäen seuraavia alukkeita sarjaa:

EGR1

eteenpäin, 5′-TACGAGCACCTGACCGCAG- 3 ’;

taaksepäin, 5′-CACCAGCACCTTCTCGTTGTT-3′;

18S rRNA eteenpäin, 5′-CCTGCGGCTTTAATTTGACTCA-3 ’;

taaksepäin, 5′-AGCTATCAATCTGTCAATCCTGTC- 3 ’.

EGR1

mRNA ilmaisun normalisoitiin 18S rRNA kussakin näytteessä.

in vivo

asetylointi määritys

HEK -293-solut transfektoitiin ohimenevästi pcDNA3.1-FLAG-EGR1, pcDNA3.1-MAML1 ja cMV-p300-HA käyttäen TransIT-LT1 transfektioreagenssia (Mirus, Madison, WI, USA). 24 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin 10 mM natriumbutyraatilla. Solut kerättiin 40 h transfektion jälkeen, hajotettiin hajotuspuskurissa (50 mM Tris-HCI, pH 8, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100 ja täydellinen EDTA-vapaa proteaasi-inhibiittori Pierce). FLAG-EGR1 suoritettiin käyttäen M2-agaroosia, joka tunnistaa FLAG-epitoopin. Tulo- ja immunosaostuksella (IP) analysoitiin Western-blottauksella käyttäen seuraavia vasta-aineita: EGR1 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), asetyloitu lysiinien EGR1 (Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA), p300 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), MAML1 (Bethyl Laboratories, Cambridge, Iso-Britannia, Millipore, Billerica, MA, USA) ja asetyloitu p300 lysiiniä 1499 (Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA).

Co- immunosaostus

Koko-solulysaateista HEK-293-soluja esi-selvitetty ja endogeenisen MAML1 immunosaostettiin käyttäen MAML1 vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Panos ja IP näytteet analysoitiin Western blottauksella käyttäen seuraavia vasta-aineita: MAML1 (Bethyl laboratoriot, Cambridge, Yhdistynyt kuningaskunta) ja EGR1 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA).

immuunivärjäytyminen

HCT116-solut transfektoitiin pcDNA3-FLAG-EGR1 ja pcDNA3.1-MAML1 käyttäen TransIT-LT1 transfektioreagenssia (Mirus, Madison, WI, USA), inkuboitiin 24 tuntia, pestiin PBS: llä, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja permeabilisoitiin 0,5% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA). Solut immunovärjättiin käyttämällä FLAG (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) ja MAML1 (Millipore, Billerica, MA, USA) vasta-aineet, ja analysoitiin käyttäen Leica konfokaalimikroskopialla (Leica, Wetzler, Saksa).

GST pull-down määritys

HEK293-solut transfektoitiin pcDNA3.1-FLAG-EGR1 käyttäen TransIT-LT1 transfektioreagenssi, ja viljeltiin 2 tuntia 50 ng /ml TPA 24 h transfektion . Kokosolulysaateille valmistettiin ja 100 ul: n proteiini-uutetta lyysipuskuria (50 mM Tris-HCI, pH 8, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM DTT: tä ja 1 x täydellisen EDTA-vapaa proteaasi-inhibiittori cocktail) olivat inkuboitiin GST-proteiineja (valmistettu kuten on kuvattu [14]) sidottu Glutathione Sepharose 4B (GE Healthcare, Little Chalford, Iso-Britannia) BC-150-puskuria (50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 150 mM KCI, 10% glyseroli ) yön yli 4 ° C: ssa. Kun oli pesty BC-150-puskuria, sitoutuneet proteiinit eluoitiin SDS-PAGE-latauspuskuria (1 M Tris-HCI, pH 6,8, 50% glyserolia, 10% SDS, 1% bromifenolisinistä, 1 mM DTT), erotettu käyttäen 7,5% SDS-polyakryyliamidigeeleillä, siirrettiin PVDF-kalvoille (GE Healthcare, Little Chalford, Yhdistynyt kuningaskunta) ja inkuboitiin tunnistavaa vasta-ainetta EGR1 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA).

Protein vakauden määritys

HEK-293-FLAG-MAML1 ja HEK-293-ohjaus-soluja viljeltiin 24-kuoppaisilla levyillä ja käsiteltiin 50 ng /ml TPA: ssa 2 h ja 50 ug /ml syklohek- (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) 1 h. Solut kerättiin hajotuspuskuriin (50 mM Tris-HCI, pH 8, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100 ja täydellinen EDTA-vapaa proteaasi-inhibiittori cocktail), proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla ja alistettiin immunoblottauksella käyttäen tunnistavaa vasta-ainetta EGR1 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Intensiteetit kvantitoitiin Image J (rsb.info.nih.gov/ij/index.html).

bioinformatiikka- analyysi

MAML1, EGR1

ja

p300

Expression of

MAML1

,

EGR1

ja

p300

analysoitiin tuumorinäytteissä 20 eri syövän tutkimukset käyttämällä web-pohjainen cBio Cancer Genomics Portal (https://www.cbioportal.org/, viimeinen näytetty 26.07.12) sisältäen genomiikan tietoja, esimerkiksi DNA: n kopioiden määrä dataa 5134 näytteistä (array-vertaileva genominen hybridisaatio) ja mRNA: n ilmentymisen tietoja 2430 näytteistä ( RNA-sekvensointi). Otaksuttu kopiomäärä muutoksiin kuten monistukset ja homotsygoottisia deleetioita saatiin sisällä portaaliin käyttämällä ”genomista merkityksellisten tavoitteiden syöpä” algoritmi [23]. MRNA ilmentyminen muuttuu pidettiin merkittävinä, jos näytteet näytetään Z-score ≥2 verrattuna vertailupopulaation (diploidi kasvaimia tai normaali viereisten kudosten tarvittaessa). Yhdistyksen muuttuneen geeniekspression eloonjäämiseen arvioitiin valittu syöpä tutkimukset käyttäen Kaplan-Meier-analyysi. Potilas näytteet jaettiin kahteen ryhmään sen perusteella, ”geeniperimä muutettu” tai ”geeni asetettu ei muuteta” käyttäen valittua genomiikan tietoja, ja merkittäviä selviytymisen eroja ryhmien välillä määritettiin käyttäen log-rank-testi;

p

-arvot 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset ja keskustelu

MAML1 säätelee EGR1 mRNA ja proteiinin ilmentyminen

EGR1 proteiini vakaus on ollut raportoitu stabiloida p300 asetylointi, joka johtaa transaktivaation selviytymisen geenejä [18]. Kuten aiemmin todettu, että MAML1 lisää p300 autoacetylation, mikä tehosti asetylaatio aktiivisuutta P300 [11], ryhdyimme selvittämään, EGR1 ekspressiotasoja voitiin kohotetaan MAML1. Ensin transfektoitiin alkion munuaissolut (HEK-293-solut)

MAML1

siRNA tai ohjaus (Ctrl) siRNA, ja viljellään soluja TPA: n läsnäollessa ilmentymisen indusoimiseksi EGR1. Proteiinit havaittiin immunoblottauksella tunnistavien vasta-aineiden MAML1, EGR1 ja GAPDH. Ilmentyminen EGR1 indusoitui soluissa, viljeltiin TPA (kuvio 1A, kaistat 3 ja 4); kun taas tasot EGR1 vähenivät käsitellyissä soluissa

MAML1

siRNA (kaista 4), verrattuna soluihin, käsiteltiin ohjaus siRNA (kaista 3). Seuraavaksi valmistetaan kokosoluekstraktien HEK-293-soluista, jotka ilmentävät stabiilisti MAML1 ja ohjaus HEK-293-soluissa, sen jälkeen kun asiakkuutta ilmaus EGR1 kanssa TPA. Proteiinit havaittiin immunoblottauksella tunnistavien vasta-aineiden MAML1, EGR1 ja GAPDH. Kuten kuviossa 1B on esitetty, EGR1 indusoitiin TPA (kaistat 2 ja 4) ja ilmentymistä EGR1 huomattavasti soluissa, jotka yliekspressoivat MAML1 (kaista 4). Seuraavaksi, tutkimme MAML1 vaikuttaa

EGR1

mRNA-tasoja. HEK-293-solut transfektoitiin

MAML1

siRNA tai valvoa siRNA, viljeltiin TPA: ssa 2 tuntia, ja

EGR1

mRNA: n ekspressio analysoitiin reaaliaikaisella RT-PCR: llä. Transfektio HEK-293-solujen

MAML1

siRNA vähensi ilmaus

EGR1

mRNA, verrattuna soluihin transfektoitu ohjaus siRNA (kuvio 1 C). Suostumuksella Tämän havainnon,

EGR1

mRNA lisääntyi MAML1-ilmentävä solulinja induktion jälkeen TPA, vertailuryhmän HEK-293-solut (kuvio 1 D). Siten meidän tiedot osoittivat, että MAML1 saattaa olla mukana säätelyssä EGR1 mRNA ja proteiinin ilmentyminen alkion munuaissoluissa.

(A) HEK-293-soluja transfektoitiin

MAML1

siRNA tai valvontaa (Ctrl) siRNA, ja viljeltiin TPA: n läsnäollessa ilmentymisen indusoimiseksi EGR1. Proteiinit havaittiin immunoblottauksella käyttämällä vasta-aineita tunnustaa MAML1, EGR1 ja GAPDH. (B) Koko solu-uutteet valmistettiin soluista, jotka ilmentävät MAML1 ja ohjaus HEK-293-soluja viljeltiin yhdessä TPA. Proteiinit detektoitiin immunoblottauksella käyttäen mainituilla vasta-aineilla. (C) HEK-293-solut transfektoitiin

MAML1

siRNA tai valvoa siRNA, viljeltiin TPA; sitten

EGR1

mRNA ilmentyminen analysoitiin reaaliaikaisella PCR: llä. (D) HEK-293-kontrollisoluissa ja HEK-293-soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti FLAG-MAML1 viljeltiin TPA; sitten

EGR1

mRNA ilmentyminen analysoitiin reaaliaikaisella PCR: llä. Tiedot esitetään keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon (SEM) ja ilmaistu suhteessa

EGR1

tasoilla ohjaus HEK-293-soluja viljeltiin ilman TPA.

EGR1 on erillinen ajallisesti ja ekspressiokuviota aikana nephrogenesis [19], ja häiriöitä säätelyssä EGR1 proteiinin ilmentymisen voi aiheuttaa ei-toivottuja vaikutuksia normaalin solun kohtalon. Yliekspressio EGR1 on raportoitu lisäävän leviämisen munuaissoluissa ja parantaa kasvaimen kehittymisen [21]. Näin ollen proteiinit, jotka vaikuttavat ilmentymisen EGR1, kuten MAML1, saattaa lopulta liittää EGR1 signalointireitin, joka määrittää solun kohtalon.

MAML1 fyysisesti vuorovaikutuksessa EGR1

tutkimme seuraavaksi MAML1 voivat aiheuttaa ekspression EGR1 kohde-promoottori, transfektoimalla 4xEBS-luc-reportterin sisältää neljä EGR1 sitoutumiskohtia ilmentäviin soluihin FLAG-MAML1 ja ohjaus HEK-293-soluja, ja soluja viljellään TPA: lla. Reportteri aktiivisuus lisääntyi, kun EGR1 aiheutettiin ohjaus soluissa käyttämällä TPA; kuitenkin, toimittaja aktiivisuus parannettu lähes kolminkertaiseksi FLAG-MAML1 viljeltyjen solujen kanssa TPA, verrattuna kontrollisoluihin viljeltiin TPA (kuvio 2A). Lisäksi, HEK-293-solut kotransfektoitiin 4xEBS-luc ja ilmentävät EGR1 ja /tai MAML1. Vaikka sekä EGR1 ja MAML1 lisääntynyt aktiivisuus EGR1 promoottori; yhdessä EGR1 ja MAML1 indusoida synergistisesti 500-kertainen aktiivisuuden EGR1 kohde-promoottorin (kuvio 2B). Näin ollen tietomme osoittavat, MAML1 voidaan ottaa palvelukseen promoottorit säätelevät EGR1, lisätä geenien ilmentymistä säätelee EGR1.

(A) FLAG-MAML1 ilmentäviä soluja ja HEK-293-kontrolli-solut transfektoitiin lusiferaasin toimittaja sisältää neljä EGR1 sitoutumiskohtia (4xEBS-luc), ja viljeltiin TPA ilmentymisen indusoimiseksi EGR1. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD. (B) HEK-293-solut ko-transfektoitiin 4xEBS-luc ja ilmentävät EGR1 ja MAML1. (C) Koko-solu-uutteet valmistettiin HEK-293-soluihin ja MAML1-proteiini immunosaostettiin käyttäen vasta-ainetta tunnistamaan MAML1. Proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla ja analysoitiin Western blottauksella käyttäen vasta-aineita, tunnustetaan MAML1 ja EGR1. (D), jotka ilmentävät FLAG-EGR1 ja MAML1 olivat kotransfektoidaan HCT116-solut; 24 tunnin kuluttua solut immunovärjättiin käyttämällä mainituilla vasta-aineilla ja analysoitiin konfokaalimikroskopialla 100 x öljyä linssi.

selventämiseksi jos MAML1 vuorovaikutuksessa EGR1, koko-solu-uutteet valmistettiin HEK-293-soluissa ja MAML1 immunosaostettiin käyttäen vasta-ainetta tunnistamaan MAML1. Proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla ja Western-blottaus suoritettiin käyttäen vasta-aineita tunnustetaan MAML1 ja EGR1. Kuten kuviossa 2C on esitetty, MAML1 ja EGR1 vuorovaikutuksessa in solu-uutteiden (kaista 3). Sen määrittämiseksi, onko EGR1 colocalized kanssa MAML1, HCT116-solut kotransfektoitiin FLAG-EGR1 ja MAML1 vektoreita ja immunovärjättiin tunnistavien vasta-aineiden FLAG ja MAML1. EGR1 ja MAML1 voimakkaasti colocalized tumassa (kuvio 2D). Olemme huomanneet, että ekspressiomalli EGR1 tumassa muuttunut läsnä MAML1. Me ja muut ovat aikaisemmin raportoitu, että MAML1 colocalize MAML1-vuorovaikutuksessa proteiinien ydin- elimille [24]. Tuloksemme viittaavat siihen, että EGR1 ja MAML1 voivat muodostaa osan transkription tehostaja monimutkainen, mikä voi lisätä geenien kanssa EGR1 sitoutumiskohtia. Sekä MAML1 ja EGR1 endogeenisesti ilmaistaan ​​alkion munuaissoluissa, ja nämä molemmat transkriptiotekijöiden on osoitettu säätelevän geenien ilmentymistä aikana kehitysprosesseja [25], [26]; kuitenkin vielä selvittämättä onko MAML1 ja EGR1 yhteistyössä säädellä tahansa näistä geeneistä.

MAML1 ja EGR1 synergistisesti aktivoida p300-promoottorin

P300-promoottori on raportoitu sisältävän EGR1 sitoutumiskohtia ja säänneltävä EGR1 [18]. Siksi me kotransfektoidaan HEK-293-soluista, joissa on p300-luc-reportterin ja ilmentävät EGR1 ja MAML1, ja sitten viljeltiin soluja TPA: n läsnäollessa. EGR1 yksin aktivoi p300-luc reportteri TPA: n läsnäollessa, ja kotransfektoimalla MAML1 kanssa EGR1 voimakkaasti lisääntynyt aktiivisuus p300 reportteri (kuvio 3A). Oletimme, että MAML1 voi säädellä ilmentymistä p300, sekä asetylaatio toimintaa p300 [11]. Lysaatit valmistettiin FLAG-MAML1 solulinja ja HEK-293-kontrollisoluissa, ja tasot p300 analysoitiin Western blottauksella käyttäen vasta-ainetta tunnistamaan p300. Ilmentymistä p300 kasvoi MAML1-ilmentävä solulinja, kontrollisoluihin verrattuna (kuvio 3B, vertaa kaista 2); kun taas ilmentymistaso GAPDH, joka ei ole MAML1 kohde, oli samankaltainen molemmissa solulinjoissa (kaistat 1 ja 2).

(A) HEK-293-solut ko-transfektoitiin kanssa p300-luc-reportterin , EGR1 ja MAML1, viljeltiin sitten TPA: n läsnäollessa ilmentymisen indusoimiseksi EGR1. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD. (B) Koko solu-uutteet valmistettiin FLAG-MAML1 transfektoitu ja ohjaus HEK-293-solut (Ctrl) ja MAML1, p300 ja GAPDH havaittiin Western-blottauksella. (C) Koko-solu-uutteet valmistettiin HEK-293-solut transfektoitiin vektoreilla, jotka ilmentävät FLAG-EGR, MAML1 ja p300; FLAG-EGR1 immunosaostettiin käyttäen tunnistavaa vasta-ainetta FLAG-epitooppia. Proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla ja detektoitiin Western-blottauksella käyttämällä vasta-aineita, tunnustetaan EGR1, asetyloidut lysiinien EGR1, MAML1, p300 ja asetyloitu lysine1499 ja p300. (D) HEK-293-soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti FLAG-MAML1 ja HEK-293-ohjaus soluja viljeltiin TPA (2 h) läsnä ollessa tai poissa ollessa syklohek- (1) ja EGR1 proteiinin ilmentyminen analysoitiin Western-blottauksella käyttämällä vasta-ainetta, tunnustetaan EGR1 . Kaavion, EGR1 proteiinin ekspressiota MAML1 stabiili solulinja ilmaistaan ​​suhteessa kontrolliin käsiteltyjen solujen syklohek-. Suhde juovien voimakkuudet, ennen kuin lisättiin sykloheksimidi ja 1 tunnin kuluttua hoidon sykloheksimidillä määritettiin Image J.

EGR1 on substraatti asetyloinnin p300 [18], ja olemme aikaisemmin osoittaneet että MAML1 säätelee p300 aktiivisuutta lisäämällä p300 autoacetylation [11]. Siksi me tutkimme, MAML1 säätelee p300-riippuvainen asetylaatio EGR1. Koko-solu-uutteet valmistettiin HEK-293-soluihin ja EGR1 immunosaostettiin käyttäen vasta-ainetta tunnistamaan EGR1. Proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla ja Western-blottaus suoritettiin käyttäen vasta-aineita tunnustaa EGR1, asetyloitu lysiinien EGR1, MAML1, p300 ja asetyloitu lysiinin 1499 ja p300 (merkki P300 autoacetylation). Olemme huomanneet, että ilmentyminen EGR1 kasvoi, kun läsnä on koekspressoi MAML1 ja /tai p300 (kuvio 3C, vertaa kaista 1 kaistat 2-4). Kuitenkin vain havaitsimme asetyloitiin EGR1: n läsnä ollessa koekspressoi p300 (kaistat 3 ja 4), joka on lisääntynyt, kun läsnä on MAML1 (kaista 4). Lisääntynyt ilmentyminen EGR1 proteiinin läsnä ollessa koekspressoi MAML1 (kaista 2) saattaa johtua MAML1 riippuvainen säätely EGR1 mRNA: ta (katso kuvio 1). Suostumuksella meidän aikaisempiin havaintoihin, p300 autoacetylation kasvatti merkittävästi MAML1 (vertaa kaistat 3 ja 4). Täten oletamme, että autoacetylated p300 acetylates EGR1 tehokkaammin.

Lukuisat raportit ovat kuvanneet miten asetylointi voi lisätä proteiinin vakautta [27]. Siksi olemme indusoima EGR1 käyttämällä TPA soluissa, jotka ilmentävät stabiilisti MAML1 ja HEK-293-kontrollisoluja. 1 h kuluttua inkubaation syklohek-, huomattavasti enemmän EGR1 proteiinia oli läsnä MAML1-ilmentävä solulinja kontrollisoluihin verrattuna (Kuva 3D). Niinpä ehdotamme, että MAML1 voi olla osallisena säätelyssä vakautta EGR1, mahdollisesti lisäämällä asetylaatio EGR1. Asetylaatio EGR1 mukaan p300 on raportoitu lisäävän proteiinin tasot EGR1, stimuloimaan ilmentyminen solujen kasvua ja selviytymistä geenejä, kuten FGF2, PDGFB, TGFB1 ja IGF2, ja siten sillä on keskeinen rooli eturauhassyövän [15], [18 ]. Kuten EGR1 ilmentyy suurina määrinä eturauhasen syöpä ja myös tietyt munuaisten syövistä [21], [22], on vielä tutkittava, onko p300-riippuvainen asetylointi EGR1 vaikuttaa ilmentymisen EGR1 kohdegeenien tai on rooli kehityksessä munuaissyöpä.

N-pään MAML1 yhteistyössä EGR1 aikana transkription aktivaation

MAML1 proteiini sisältää eri aloilla, jotka ovat tärkeitä proteiinien vuorovaikutusten ja toiminta MAML1 (ks kaavamainen kuvassa 4A). Aminohapot 1-74 ja MAML1 vuorovaikutuksessa Notch ICD ja MEF2C, kun taas aminohapot 75-305 ovat tärkeitä vuorovaikutusta p300. N-terminaalinen domeeni MAML1 myös vuorovaikutuksessa p53: n kanssa ja GSK3ß [24]. Sen tutkimiseksi, joka MAML1 domeeni vaaditaan aktivointi promoottorit säätelevät EGR1, ilmentävien plasmidien EGR1 ja erilaisia ​​MAML1 domeenit kotransfektoitiin kanssa 4xEBS-luc-reportterin, joka sisältää neljä EGR1 sitoutumiskohtia, HEK-293-soluja. Kuten on esitetty kuviossa 4B, MAML1 (1-1016) ja (75-1016) parantavat vahvasti lusiferaasireportterigeenillä aktiivisuus, kun läsnä on EGR1, kun taas MAML1 (1-625) ei ollut havaittavaa vaikutusta EGR1-promoottorin aktivaation. MAML1 (1-1016) ja (75-1016) ekspressoitiin samanlaisilla tasoilla soluviljelmämäärityksessä, kun havaitsimme korkeampi MAML1 (1-625) (kuvio 4C).

(A) Kaavamainen esimerkki MAML1 verkkotunnuksia. (B) HEK-293-solut ko-transfektoitiin 4xEBS-luc ja ilmentävät EGR1, MAML1 ja typistyk- MAML1, kuten kuviossa on esitetty. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD. (C) Western-blotit osoittavat ilmentymisen tasoja MAML1 täyspitkät ja mutanttien proteiinit HEK-293-soluja. (D) PageBlue Protein-värjätty SDS-geelistä, jossa muuttoliike puhdistettua GST-merkitty MAML1 proteiineja käytetään proteiini-proteiini-vuorovaikutuksen määritys. (E) GST-leimatun MAML1 johdannaiset ja GST kytketty glutationi-Sepharose-helmiä inkuboitiin HEK-293-kokosoluekstraktien, ja MAML1-vuorovaikutuksessa EGR1 havaittiin immunoblottauksella. Tulo on 2% koko solu-uutteen käytetty sitova reaktio. (F) HEK-293-solut ko-transfektoitiin 4xEBS-luc ja ilmentävät EGR1, MAML1 (1-1016) ja (1-127). Tiedot esitetään keskiarvona ± SD.

Jotta voidaan tutkia millä alueella on MAML1 vuorovaikutuksessa EGR1, täyspitkä GST-merkitty MAML1 proteiinia ja MAML1 johdannaiset (kuvio 4D) inkuboitiin kokosolu otteet HEK293 transfektoitujen solujen EGR1. EGR1 vuorovaikutuksessa voimakkaasti täyspitkän GST-MAML1 proteiinia ja MAML1 (1-300); mutta vain osoitti viikossa vuorovaikutusta MAML1 (1-625) ja (309-625) (kuvio 4E). Koska havaitsimme vahvan EGR1-vuorovaikutuksessa etenkin MAML1 (1-300), olemme edelleen tutkittiin miten N-päähän MAML1 in EGR1 transkription kotransfektoimalla HEK-293-solujen kanssa 4xEBS-luc-reportterin ja ilmentävien plasmidien EGR1, MAML1 täyspitkä ja MAML1 (1-127). Kuten on esitetty kuviossa 4F, MAML1 (1-127) repressoi MAML1-EGR1 synergistinen aktivoituminen EGR1-promoottori. Voimme päätellä, että verkkotunnuksen alueella aminohapot 75-127 ja MAML1 voi olla tärkeää, että synergistinen vaikutus MAML1 ja EGR1 geenien transkription. MAML1 N-pää on raportoitu vuorovaikutuksessa Notch, MEF2C, p53 ja GSK3beeta, ja niillä on tärkeä rooli transkriptionaalista aktiivisuutta näiden tekijöiden [1], [2], [5], [6], [13] . N-terminaalinen domeeni MAML1 tarvitaan myös vuorovaikutuksen MAML1 kanssa P300, mikä johtaa lisääntyneeseen p300 autoacetylation ja HAT toimintaa [12]. Lisäksi, MAML1 sisältää kaksi N-terminaalista SUMOylation sivustoja (K217 ja K299), joka tukahduttaa MAML1 toimintaa [14]. Siksi vuorovaikutuksia MAML1 olisi edelleen tutkittava, jotta voidaan määrittää, onko vuorovaikutus EGR1 kanssa MAML1 esiintyy kilpailua, tai kenties synergia, muiden transkriptiotekijöiden kuten Notch ja p53.

MAML1 positiivisesti korreloi jossa EGR1 ja p300 vuonna munuaissyövän

vahvan mekanistinen esitetyn näytön myötäsääntelyä välillä MAML1, EGR1 ja p300, me arvioinut genomiikka tietokannan tällaisen suhteen. Meidän bioinformatiikan analyysi kopioluvun muutoksia (mukaan lukien monistukset ja homotsygoottisia deleetioita)

MAML1

,

EGR1

ja

p300

geeniperimä paljasti muutoksia 18 20 syöpä