Krooninen sairaus

tiivistelmä

Cortactin (CTTN), ensimmäinen havaittu olevan merkittävä substraatti Src-tyrosiinikinaasin, osallistuu aktiivisesti aluevaltaus F-aktiini kokoonpano sekä solun liikkuvuus ja invaasiota.

CTTN

geeni monistetaan, ja sen proteiini on yli-ilmentyy useiden syöpätyyppien. Fosforyloitu muoto cortactin (pTyr

421) tarvitaan syöpäsolujen liikkuvuutta ja invaasiota. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että suurin osa testatuista ensisijaisen peräsuolen kasvain näytteet osoittavat suuresti parannettu ilmaus pTyr

421-CTTN, mutta mitään muutosta mRNA-tasolla verrattuna terveisiin henkilöihin, mikä viittaa siihen translaation jälkeisen aktivoinnin sijaan geenivahvistus näissä kasvaimissa. Curcumin (diferulolylmethane), luonnollinen yhdiste lupaavia chemopreventive ja Kemoherkistävien vaikutuksia, vähensi epäsuora yhdistys cortactin kanssa solukalvon proteiini murto paksusuolen adenokarsinoomasolua mitattuna pinta Biotinyloinnin massaspektrometria, ja Western blotting. Curcumin vähensi pTyr

421-CTTN in HCT116-soluissa ja SW480-soluissa, mutta oli tehoton HT-29-soluja. Curcumin fyysisesti vuorovaikutuksessa PTPN1 tyrosiinifosfataasien kasvattamaan aktiivisuutta ja johtaa defosforylointia pTyr

421-CTTN. PTPN1 esto poistuu vaikutuksia kurkumiinista pTyr

421-CTTN. TRANSDUKTIO adenoviraalisesti-koodattuja CTTN lisäsi muuttoa HCT116, SW480 ja HT-29. Curcumin vähentynyt migraatio HCT116 ja SW480-soluja, jotka suuresti nimenomaista PTPN1, mutta ei HT-29-solujen kanssa vähensi merkitsevästi endogeenisen ilmentymisen PTPN1. Curcumin vähensi fyysistä vuorovaikutusta CTTN ja pTyr

421-CTTN kanssa p120 kateniinin (CTNND1). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että curcumin on aktivaattori PTPN1 ja voi vähentää soluliikkuvuus paksusuolen syövän kautta defosforylointia pTyr

421-CTTN joita voidaan hyödyntää varten uusia terapeuttisia lähestymistapoja paksusuolen syövän hoidossa perustuu kasvaimen pTyr

421 -CTTN ilme.

Citation: Radhakrishnan VM, Kojs P, Young G, Ramalingam R, Jagadish B, Mash EA, et al. (2014) pTyr

421 Cortactin yliekspressoituu Colon Cancer ja Is defosforyloitiin Curcumin: osallistuminen Non-Receptor Type 1 proteiinityrosiinifosfataasin (PTPN1). PLoS ONE 9 (1): e85796. doi: 10,1371 /journal.pone.0085796

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 22 elokuu 2013; Hyväksytty: 02 joulukuu 2013; Julkaistu: 22 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Radhakrishnan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: National Institutes of Health [5 R01 DK067286 on PRK ja FKG]. NIH avustusta, P30 CA 23074 [EAM] NIEHS myöntää ES006694 Lounais Environmental Health Sciences Center (SWEHSC), NIH /NCI avustus CA023074 Arizona Cancer Center ja jonka BIO5 Institute of Arizona yliopisto. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Cortactin, jota koodaa

CTTN /EMS1

geeni, on v-Src-substraatin paikallistaa aivokuoren aktiini solukalvolle ja yli-ilmennetään monissa syöpätyypeissä [1]. Cortactin yli-ilmentyminen tulokset 11q13.3 geenivirhe vahvistus erilaisissa syövissä, kuten pään ja niskan levy- karsinooma, maksasyövän, rinta- ja virtsarakon syöpä, ja korreloi huonon potilaan ennustetta ja laski eloonjääminen [2] – [5]. Cortactin, yleensä läsnä useita erilaisia ​​solutyyppejä, on rikastettu aivokuoren rakenteisiin, kuten kalvo ruffles ja lamellipodioihin, ja sillä keskeinen roolit hehkulangan-kalvo vuorovaikutusta sekä signaalien trans- solun pinnalta solun tukirangan [6], [7 ]. Cortactin osallistuu aktiivisesti Arp2 /3-välitteistä aktiini polymerointi liittyvät solukalvon [7] ja toimii F-aktiini modulaattori tyrosiinikinaasi-säädellään solun tukirangan uudelleenjärjestely [8] viittaa mekanismi sen roolia liikkuvuudessa. Sen rooli solujen maahanmuuton ja invaasiota on hyvin tutkittu epiteelisolujen, fibroblastit, endoteelisolut ja rintasyövän soluja [8] – [10]. Fosforylaatiota hiiren cortactin at Tyr

421, Tyr

466 (Tyr

470 ihmisellä) ja Tyr

482 (Tyr

486 ihmisellä) tarvitaan tehokasta soluliikkuvuus useissa solutyypeissä , mikä osoittaa, että cortactin tyrosiinifosforylaatio on tärkeä rooli solujen vaeltamiseen [8], [11], [12]. Yleensä tyrosiinifosforylaatio cortactin laukaisee rekrytointi SH2-domeenin proteiinit, mukaan lukien useita kinaasien ja NCK sovitin proteiinia NCK1, joka yhdistää cortactin kanssa Wiskott-Aldrichin oireyhtymä kaltainen proteiini (Wasl, N-WASP) ja WAS /Wasl vuorovaikutuksessa proteiinin perheenjäsenen 1 (WIF1, WIP). Tämä puolestaan ​​johtaa tehostetun aktivoinnin Arp2 /3 kompleksi (aktiini-sukuinen proteiini 2 homologi /3 homologi) ja johtaa aktiinifilamentin haarautumisen [13] – [16].

Useat epidemiologiset tutkimukset ovat osoittaneet, että kasvipohjaisia ​​fenoliyhdisteiden ruokavalion aineet tärkeitä rooleja kemopreventatiivisesti paksusuolisyövän [17], toiseksi yleisin syöpä miehillä ja kolmanneksi yleisintä naisilla. Säännöllinen kulutus hedelmiä ja vihanneksia, jotka sisältävät näitä yhdisteitä on liittynyt alentunut peräsuolisyövän ilmaantuvuus [18]. Niistä luonnollinen bi-fenoliyhdisteitä, curcumin, joka on curcuminoid juurakosta

kurkumaa longa

, on tunnettu anti-syöpä, ja tulehdusta, antioksidantti in vivo ja in vitro [19] – [ ,,,0],21], ja on hyvin siedetty suurina annoksina. Faasin II tutkimuksessa pitkälle edennyttä haiman syöpäpotilaiden annoksena 8 g annettiin 2 kuukauden todettu myrkyllisyys [22]. Toinen vaiheen I kliinisen tutkimuksen arvioitiin siedettävyyttä curcumin 25 kautta korkeilla riski syövän esiaste. Histologinen parannuksia havaittiin 7 25 aiheita, ilman hoitoon liittyvän toksisuuden jopa 8 g /vrk [23]. Anticancer vaikutukset kurkumiinin ja sen johdannaisia ​​on yleensä katsottu johtuvan soluproliferaation inhibointi, solusyklin pysähtymisen ja /tai apoptoosin induktion [21], [24], [25]. Eräs kliininen tutkimus osoitti, että annosten enintään 2,2 g

Curcuma

purkaa (joka sisälsi 180 mg curcumin) päivässä enintään 4 kuukauden kuluttua todettiin kliinistä hyötyä potilaille, joilla on edennyt tulenkestävä peräsuolen syöpä [26].

Tässä tutkimuksessa osoitamme, että pTyr

421 cortactin on yli-ilmentynyt kolorektaalisyövässä ilman samanaikaista muutosta mRNA. Curcumin vähentynyt tasot pTyr

421 cortactin paksusuolen syöpäsoluissa

in vitro

fyysisesti vuorovaikutuksessa ei-reseptorin tyypin 1 proteiinityrosiinifosfataasin (PTPN1, PTP1 B) lisäämään aktiivisuutta, ja defosforyloivat cortactin, mikä vähentää syövän solujen vaeltamiseen. Tuloksemme viittaavat siihen voikin olla hyödyllistä pTyr

421 cortactin immuunivärjäysmenetelmällä biomarkkerina invasiivisen paksusuolen syövän ja antaa tarkempi käsitys mekanismi chemopreventive vaikutusten kurkuma ja sen mahdollisen roolin estää metastaattinen paksusuolen syövän.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

curcumin kanssa 98.05%: n puhtaudella ja kontaminoivia kurkuminoidien (demetoksi-kurkuma ja bis-demetoksi curcumin), oli tilaustyönä puhdistettiin ChromaDex (Irvine, CA). PTPN1 estäjä XXII (3-(3,5-dibromo-4-hydroxy-benzoyl)-2-ethyl-benzofuran-6-sulfonicacid-(4-(thiazol-2-ylsulfamyl)-phenyl)-amide), solun läpäisevä, selektiivinen, palautuva ja ei-kilpailevat allosteerinen estäjä PTPN1 [27] saatiin EMD Millipore (Billerica, MA). Rekombinanttiadenoviruspartikkeleiden cortactin saatiin Vector Biolabs (Philadelphia, PA).

Antibodies, solulinjojen ja ihmisen kudoksissa

T-84-solut (ihmisen kolorektaalisyöpää) alunperin kuvanneet Murakami ja Masui [28 ] saatiin Dr. Declan McCole, University of California San Diego, CA. HCT116, HT29 ja SW480-solut saatiin ATCC: stä ja viljeltiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM; Gemini Bio Products, West Sacramento, CA), 10% naudan sikiön seerumia (Cellgro, Manassas, VA), ja 1% penisilliini-streptomysiiniä (Life Technologies, Grand Island, NY). Soluja kasvatettiin 10 cm: n maljalla tai kuuden kuoppalevyillä (Greiner Bio-One, Monroe, NC). Hiiren monoklonaalinen anti-GAPDH, kanin polyklonaalista fosfospesifisiä (pTyr

421) cortactin vasta-aineen, ja anti-PTPN1-vasta-aine hankittiin EMD Millipore. Anti-cortactin hiiren monoklonaalinen anti-cortactin kanin polyklonaalisia vasta-aineita saatiin Santa Cruz Biotechnologies, (Santa Cruz, CA). Hiiren monoklonaalinen anti-p120 kateniinin vasta-aine hankittiin BD Biosciences, (San Jose, CA). Jäädytetyt ihmisen paksusuolen kasvain näytteet ja ei-pahanlaatuiset kudokset saatiin Cooperative Human Tissue Network, Vanderbilt University Medical Center (Nashville, TN). 44 näytettä valittiin perustuen kasvaimen tyypistä ja prosenttiosuus kasvainsolun sisältöä ( 80%) yhdessä 37 normaaleissa kudoksissa. Nämä tutkimukset arvioitiin Arizonan yliopiston Human aiheet Protection Program ja arvioitiin vapautetaan, kun näytteet tunnistamattomiksi.

qRT-PCR

Yhteensä RNA uutettiin kudoksista käyttäen TRIZOL mukaan valmistajan protokollan (Life Sciences). 500 ng kokonais-RNA: ta käänteistranskriboitiin käyttämällä cDNA-synteesi kit (Bio-Rad, Hercules, CA). QPCR suoritettiin Taqman qPCR mix (Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD) ja valmiista TaqMan alukkeiden ja koettimien (kaikki Applied Biosystems /Life Technologies) mukaan valmistajan protokollan kanssa iCycler CFX96 (Bio-Rad). QPCR mittaus arvioitiin perustuen suhteelliseen kvantifiointia CTTN geenin normalisoida ilmaus GAPDH. Tiedot ilmaistiin ACt arvoja ja t-testiä käytettiin analysointiin.

immunohistokemia

Kolorektaalisyöpä kudoksen joukko parafiiniin näyte ytimiä saatiin USA BioMax Inc (Rockville, MD). Fosfospesifiselle anti-pTyr

421 cortactin ja koko cortactin vasta-aineita käytettiin immunovärjäämistä. Objektilasit poistettiin parafiini, huuhdottiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS, pH 7,4) ja tukittiin vuohen seerumia (Santa Cruz). Sitten ne inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla 4 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Levyjä pestiin ja inkuboitiin sitten vuohen anti-kani-HRP-konjugoitu vasta-aine (Santa Cruz), huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan. Objektilasit kehitettiin DAB substraattipakkausta (Vector Labs) ja vastavärjättiin hematoksyliinillä.

Solun pinnan biotinylaatio

Apical solun pinnan biotinylaatio suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [29]. Lyhyesti, 2 x 10

5 T84 paksusuolen syövän soluja ympättiin Transwell-suodattimet (Corning Incorporated) ja kasvatettiin 5 -7päivä kunnes yksikerroksista vastuksen saavuttanut vähintään 600 Ω

.cm

2. Sitten soluja käsiteltiin kurkumiini (50 uM) tai dimetyylisulfoksidia (DMSO, ajoneuvo) on apikaalisella puolella 1 tunnin ajan. Pintaproteiinit biotinyloitiin käyttämällä 0,5 ml NHS-S-S-biotiinia (Pierce, Rockford, IL) PBS: ssä 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa apikaalisella puolella. Sammutuksen jälkeen, suodattimet irrotettiin ja solut hajotettiin 0,5 ml RIPA hajotuspuskuria, joka sisältää proteaasi ja fosfataasiestäjät (Halt proteaasi /fosfataasinestäjällä cocktail, Pierce). Hajotetut näytteet sonikoitiin, sentrifugoitiin 13000 rpm: llä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja supernatantti kerättiin ja sitä käytettiin proteiinimäärityksellä ja pull-down kokeissa. Biotinyloidut proteiinit vedetty alas streptavidiinilla -agaroosihelmiin (Pierce). Sitoutuneet proteiinit eluoitiin inkuboimalla helmiä radioimmunosaostuskokeella puskurissa (RIPA; 50 mM Tris-HCI, pH 7,42, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,25% Na-deoksikolaattia, proteaasi ja fosfataasi-inhibiittori cocktailit ja fenyylimetyylisulfonyylifluoridia) 98 ° C: ssa 5 min. Näytteitä sentrifugoitiin 10000 rpm: ssä 5 minuutin ajan, ja supernatantti erotettiin ja sekoitettiin 0,125 ml trikloorietikkahappoa (TCA), inkuboitiin 10 minuutin ajan jäillä ja sentrifugoitiin 14000 rpm: llä 5 minuutin ajan. Supernatantit heitettiin pois ja pelletit pestiin kolme kertaa jääkylmällä asetonilla. Pellettejä ilmakuivattiin ja proteiini kvantitoitiin ennen kuin se prosessoitiin MS-analyysiä. Immunoblottausta, proteiinit erotettiin SDS-PAGE, jota seurasi immunoblottaus anti-cortactin vasta-aine. Jopa lastaus biotinyloitua pinnan proteiinien varmistettiin vuohen polyklonaalisen anti-transferriini-reseptori-vasta-aineen (Santa Cruz).

Proteiinin tunnistaminen kvadrupoli lennon tandem-massaspektrometrialla (QTOF MS /MS) B

neljä sata nano g solukalvon liittyvien proteiinien, saatu edellä kuvatulla tavalla, prosessoitiin tryptisen ruuansulatuksen ja analysoitiin nestekromatografia-massaspektrometrialla, jonka Arizona Proteomics Consortium jaettu laitokseen. QTOF MS /MS-analyysi trypsiinillä pilkottu proteiinien suoritettiin käyttämällä kvadrupoli-lentoaika-massaspektrometrillä (QTOF; Waters Q-TOF Premier, 2008). Peptidit eluoitiin käyttäen Vydac C18 (Hesperia, CA), käyttäen gradienttia 0-65% liuotinta (98% metanoli /2% vettä /0,5% muurahaishappo /0,01% trifluorietikkahappoa), yli 60 minuutin aikana virtausnopeudella 350 nl /min. Peptidi liuos sumutettiin potentiaalia 1,6 kV, ja kapillaarin lämpötila 200 ° C: ssa. Riippuvien tietojen skannaus suoritti Xcalibur v 2.0 SR2 ohjelmistojen [30], oletusarvo vastaa 2, eristämiseen leveys 1,5 amu, aktivointi amplitudi 35%, aktivointi aika 30 ms, ja minimaalinen signaali 10000 ioni laskee . Globaali riippuvainen data asetukset olivat seuraavat: hylkää massa leveys 1,5 amu, dynaaminen syrjäytyminen käytössä, toista lasken 1, toista kesto 1 min, ja syrjäytyminen kesto 5 min. Scan tapahtuma sarja kuului yksi täysi tarkistus kanssa massa-alue 350 – 2000 Da, jota seurasi 3 riippuvainen MS /MS skannaa voimakkain ioni. Dynaaminen syrjäytyminen oli päällä ajaksi 60 sekuntia. Tandem MS spektrit peptidien analysoitiin Turbo SEQUEST ™ v 3.1, ohjelma, jonka avulla korrelaatio kokeellisen tandem MS data teoreettista spektrit tunnetuista proteiinisekvenssien. Hakukriteerit, joita käytettiin alustavan positiivisen peptidin tunnistus ovat samat kuin edellä on kuvattu, nimittäin peptidiprekursori ionien kanssa +1 maksu, jonka Xcorr 1,8, +2 Xcorr 2.5 ja +3 Xcorr 3.5. DcN pisteet 0,08 ja fragmentti-ionin suhde kokeellisen /Teoreettisessa 50% käytettiin myös suodatus kriteerit luotettava Hyväksytty peptidin tunnistaminen [31]. Kaikki Hyväksytty peptidit vahvistettiin silmämääräisen tarkastuksen spektrien. Kaikki spektrit etsittiin vastaan ​​ipiHuman 3,72 proteiinia, tietokannan, joka on siinä sekvenssi

Rhodobacter

ja naudan seerumialbumiinia. Yleensä, naudan seerumin albumiinia lisätään viittaus proteiinia, mutta koska naudan ja ihmisen seerumin albumiinia ovat samanlaisia, käytimme T33V mutantin sekvenssin

Rhodobacter

. Telineiden (versio Scaffold_3.1.2, Proteome Software Inc., Portland, OR) käytettiin vahvistamaan MS /MS-pohjainen peptidin ja proteiinin tunnistamista. Peptidi tunnistuksiin hyväksyttiin, jos ne voidaan koota yli 90,0% todennäköisyydellä määrittelemällä tavalla peptidi Profeetta algoritmi [30]. Proteiini tunnistuksiin hyväksyttiin, jos ne voidaan koota yli 90,0% todennäköisyydellä ja sisälsivät ainakin yhden identifioitu peptidi. Proteiini todennäköisyydet jaettiin Protein Profeetta algoritmi [32]. Proteiineja, jotka sisälsivät samanlaiset peptidit ja ei voi eriyttää perustuu MS /MS-analyysi yksin ryhmiteltiin tyydyttää periaatteita parsimonian.

Western blotting ja immunosaostus

proteiinilysaattien saatu paksusuolen kasvainkudoksista ja paksusuolen syövän solulinjat valmistettiin RIPA-puskuria. Esipuhdistettiin proteiini Näytteet kvantitoitiin [DC (pesuaine-yhteensopiva) kolorimetristä proteiinimääritysmenetelmällä kit; Bio-Rad], ja näytteet erotettiin SDS-PAGE ja sen jälkeen immunoblottauksella. Täplät visualisoitiin SuperSignal West Pico kemiluminesenssisubstraatilla (Pierce). Immunosaostukseen, solut lyysattiin RIPA-puskuri, ja proteiinin määrä määritettiin DC-proteiinin määrityskittiä (Bio-Rad). 5 ug anti-pTyr

421 cortactin vasta-ainetta lisättiin 1 mg HCT-116-solulysaateista ajan 4 ° C: ssa ja inkuboitiin yön yli. Näytteitä inkuboitiin sitten A /G-proteiinin agaroosihelmiä (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Immunoblottaus suoritetaan pesty ja denaturoitu komplekseja.

Immunofluoresenssikoe

Soluja kasvatettiin EZ-kammioissa (Millipore), ja käsiteltiin curcumin 50 uM 15 minuuttia ja kiinnitettiin 2 % paraformaldehydillä 0,2 M fosfaattipuskuria, pH 7,4 (45 min), läpäiseviksi 0,1% Triton X-100 PBS: ssä (10 min), ja inkuboitiin peräkkäin anti-fosfo cortactin (Millipore) tai anti-cortactin-vasta-ainetta (Santa Cruz) . Alexa Fluor 647 vuohen anti-kani-IgG: tä, (Life Technologies) käytettiin sekundaarisena vasta-aineena. Levyt asennetaan käyttäen fluoresenssia kiinnitysväliaine (Dako, Carpinteria, CA) ja tutkittiin Zeiss -konfokaalimikroskoopilla varustettu ZEN ohjelmisto (Carl Zeiss Microscopy, GmbH).

PTPB1B /PTPN1 aktiivisuusanalyysiä

HCT 116-solut kasvatettiin konfluenssiin asti ja käsiteltiin curcumin tai DMSO (ajoneuvo) media- 30 minuuttia. Solut pestiin PBS: llä ja lyysattiin RIPA-puskuri, sonikoitiin 5 sekuntia, sentrifugoitiin, ja määritettiin proteiinipitoisuus. PTPB1B Assay Kit saatiin Millipore ja käytetään mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

sekvensointi PTPN1 koodaavan alueen

Kokonais-RNA uutettiin HCT116, HT29, ja SW480-soluissa käyttämällä TRIZOL (Life Technologies ) mukaisesti valmistajan ohjeiden käänteistranskriptio käyttäen cDNA-synteesi kit (Quanta), ja monistettiin käyttäen eteenpäin-aluketta, 5′-ATGGAGATGGAAAAGGAGTTCG-3 ’ja reverse-aluke, 5′-CTATGTGTTGCTGTTGAACAGGA-3’ (joka perustuu Gene liittymistä NM_002827.2 ) ja

Pfu

Taq DNA-polymeraasia (Life Technologies). PCR-tuotteet puhdistettiin geelissä, subkloonattiin pGEM-T-Easy (Promega, CA) ja sekvensoitiin 5 ’ja 3’ päissä käyttämällä T7 ja SP6 sekvensointialukkeita.

Cell migraatiokokeessa

transwell migraatiomääritys suoritettiin kuten on raportoitu aiemmin [33] pienin muutoksin. Lyhyesti, TranswellTM kalvo (24-kuoppaiset insertin, huokoskoko 8 pm, polykarbonaatti, Corning Inc., NY) käytettiin määrittämään vaikutuksen kurkumiinista paksusuolen syövän solujen vaeltamiseen

in vitro

. Solut trypsinoitiin, pestiin, ja pidetään suspendoitiin väliaineessa ilman FBS. Alempiin kuoppiin kammioiden, maahanmuutto-asiakkuutta väliaineessa (10% FBS) lisättiin. Ylempi kuopat täytettiin seerumia soluja (20000 solua per kuoppa), joissakin tapauksissa, joka sisältää myös 25 uM curcumin. Sitten kammio laitettiin kostutetussa CO

2-inkubaattorissa. 12 tunnin kuluttua, määritykset lopetettiin poistamalla väliaineen ylä- kaivoja ja varovaisen poiston suodattimia. Suodattimet kiinnitettiin metanolilla lyhyt upotuksen ja soluja yläpuolen poistettiin pesemällä PBS: llä. Suodattimet värjättiin kristallivioletilla värjäytymistä (0,2%, w /v etanolilla 2%, tilavuus /tilavuus, 0,5 M Tris-HCl, pH 7,8) 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Värjättyjen solujen kerros huuhdeltiin perusteellisesti 0,5 M Tris-HCl (pH 7,8) kolme kertaa, suodattimet kuivattiin ilmassa, inkuboitiin 500 ul: SDS-liuosta (0,5% 50% etanolia, 50% 0,5 M Tris-HCl, pH 7,8 ) 60 min 37 ° C: ssa, ja luetaan 586 nm: ssä käyttäen spektrofotometriä (Molecular Devices, CA). Ad-CTTN transdusoidut solut, 24 h infektion jälkeen Ad-CTTN (10 MOI), solut trypsinoitiin, pestiin PBS: llä, ja lisättiin yläsivulle Transwell kammion, ja määritykset suoritettiin kuten edellä on kuvattu.

kemiallinen synteesi biotinyloidun curcumin

Reaktiot suoritettiin käyttäen liekki-kuivatuissa lasiastioissa positiivisessa paineessa argon. Vetistyvä liuottimet siirrettiin

kautta

Uunissa kuivattuun ruiskua tai kanyyli. Kaikki reagenssit ja liuottimet olivat kaupallisesti saatavilla ja niitä käytettiin vastaanotetussa muodossa. Liuokset konsentroitiin

vakuumissa

pyöröhaihdutinta käyttäen. Analyyttinen ohutkerroskromatografia (TLC) suoritettiin ennalta päällystetty silikageeli 60 F-254 lasilevyjen. TLC visualisoinnin tarvitaan käyttäen jodia kammioon, UV-valo, ja /tai PMA-liuosta (5 g fosfomolybdeenihapon, 100 ml 95% EtOH) värjäystä. Flash ja vakavuuden kromatografia suoritettiin käyttäen silikageeliä 60 (230-400 mesh). Sulamispisteet ovat korjaamattomia. Ydinmagneettisen resonanssin (NMR) Kokeet suoritettiin 500 MHz-spektrometrillä. NMR-spektrit referenssinä CD

3OD (3,31 ppm, 49,0 ppm). Massaspektrometria suoritettiin käyttäen ESI Bruker Daltonics MALDI TOF väline.

N- (13-amino-4,7,10-trioxatridecanyl) biotinamide (2).

lämmintä biotiinia (0,24 g, 1,0 mmol) ja

N

-hydroxysuccinamide (0,12 g, 1,0 mmol) DMF: ssä (8 ml), lisättiin DCC: tä (0,26 g, 1,3 mmol) ja reaktioseosta sekoitettiin yön yli huoneen lämpötila. Kiinteät aineet poistettiin suodattamalla, pestiin DMF: llä (2 ml), ja suodos (-10 ml), lisättiin tipoittain sekoitettuun liuokseen, jossa oli 4,7,10-trioksa-1,13-tridecanediamine (2,20 g, 10,0 mmol, 2,2 ml) DMF: ssa (20 ml). 3 tunnin jälkeen liuotin poistettiin alennetussa paineessa. Saatu öljy trituroitiin eetterin kanssa (50 ml), ja seosta sekoitettiin 30 minuuttia. Kiinteä aine kerättiin suodattamalla, ja sille suoritettiin flash-pylväskromatografia silikageelillä (50 g). Eluointi metanoli /EtOAc: llä (04:01), jolloin saatiin 2 (0,38 g, 0,85 mmol, 85% kahdessa vaiheessa) värittömänä kiinteänä aineena, sp 104-106 ° C, R

f

0,36 ( MeOH /EtOAc /aq. NH

4OH 08:02:01). Tunniste

1 H ja

13C NMR-spektrit olivat kanssa julkaistujen tietojen [34].

5,21-Dioxo-25-((3aS,4S,6aR)-2-oxohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)-10,13,16-trioxa-6,20-diazapentacosan-1-oic Happo (3).

Liuokseen, jossa oli 2 (0,38 g, 0,85 mmol) metanolissa (4 ml), lisättiin glutaarihapon anhydridiä (0,12 g, 1,02 mmol) ja seosta sekoitettiin yön yli. Liuotin poistettiin alennetussa paineessa ja jäännös suoritettiin flash-pylväskromatografia silikageelillä (50 g). Eluointi CH

2CI

2 (200 ml) ja sen jälkeen CH

2CI

2 /MeOH (05:01) tuotti 3 (0,40 g, 0,71 mmol, 84%) valkoisena kiinteänä aineena, sp 124-126 ° C, R

f

0,42 (CH

2CI

2 /MeOH 01:01).

1H-NMR (500 MHz, CD

3OD) δ 1,44 (2, m), 1,56-1,70 (4, m), 1,70-1,78 (6, m), 1,88 (2, kvintetti,

J

= 7,5 Hz), 2,18-2,25 (4, m), 2,32 (2, m), 2,70 (2, m), 2,93 (2, dd,

J

= 8 Hz, 5 Hz), 3,19-3,21 (2, m), 3,25 (4, t,

J

= 7 Hz), 3,52 (4, m), 3,59 (5, m), 3,64 (5, m) , 4,30 (1, m), 4,49 (1, m);

13C-NMR (125 MHz, CD

3OD) δ 22,3, 26,8, 29,5, 29,7, 30,4, 34,2, 36,1, 36,8, 37,8, 41,0, 56,9, 61,26, 63,3, 69,9 (2), 71,2, 71,5 , 166,1, 175,2, 175,9, 176,8; HRMS (MALDI TOF) laskettu C

25H

45N

4O

8S 561,2952, havaittu 561.2930.

4-((1E,6E)-7-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)-3,5-dioxohepata-1,6-dien-1-yl)-2-methoxyphenyl-5,21-dioxo-25-((3aS,4S,6aR)-2-oxohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-10,13,16-trioxa-6,20-diazapentacosan-1-oate (4).

Liuokseen, jossa oli 3 (100 mg, 0,18 mmol) DMF: ssä (2 ml), lisättiin

N

-hydroxysuccinamide (21 mg, 0,18 mmol) ja sen jälkeen DCC: tä ( 48 mg, 0,23 mmol) ja reaktioseosta sekoitettiin yön yli huoneenlämpötilassa. Kiinteät aineet poistettiin suodattamalla, pestiin DMF: llä (2 ml), ja suodos (~ 4 ml), lisättiin tipoittain sekoitettuun liuokseen, jossa oli curcumin (330 mg, 0,89 mmol) ja trietyyliamiinia (45 mg, 0,44 mmol, 62 ui) DMF: ssa (10 ml). Reaktioseos sekoitettiin yön yli huoneenlämpötilassa ja haihtuvat aineet poistettiin alennetussa paineessa. Jäännökselle suoritettiin flash-pylväskromatografia silikageelillä (75 g). Eluoimalla

2CI

2 (200 ml) ja CH

2CI

2 /MeOH (50:1, 200 ml) antoi curcumin. Eluoimalla edelleen CH

2CI

2 /MeOH (20:1), ja poistamalla sen jälkeen liuottimet, saatiin 4 tumman keltaisena kumina, joka liuotettiin 20% asetonitriili vedessä, ja liuos pakastekuivattiin. Biotinyloitu curcumin johdannainen 4 (78 mg, 0,085 mmol, 48% saanto kahden vaiheen) saatiin pörröinen tumman keltainen kiinteä aine, R

f

0,68 (CH

2CI

2 /MeOH 05:01). ESI-MS: 911,2 (M + H

+). Tunniste

1 H-NMR-spektri oli kanssa julkaistujen tietojen [35].

Tilastollinen

Parittomia Studentin t-testiä käytettiin tilastollista analyysiä kaikkialla.

Tulokset

pTyr

421cortactin ilmentyminen lisääntyy perusterveydenhuollossa paksusuolensyöpä kudoksiin

yli-ilmentyminen cortactin on todettu invasiivisia syöpiä, mukaan lukien glioblastooma, melanooma, rintasyöpä, ja pään ja niskan levy- karsinoomat, seurauksena on EMS1 geenimonistus [36]. Tässä tutkimuksessa selvitettiin cortactin ilmentymisen paksusuolen syöpä. Ensin analysoidaan cortactin mRNA: n ekspression 81 jäädytetty paksusuolen kudosnäytteitä, johon kuului 37 normaaleissa kudoksissa, 5 hyvänlaatuinen, ja 39 pahanlaatuisia kasvaimia, kvantitatiivisen RT-PCR. Koolontuumoreissa ja viereisten normaaleissa kudoksissa havaittu eroa cortactin mRNA ilmaisu (kuvio 1A). Olemme havainneet merkitsevää eroa CTTN mRNA: n ilmentymisen normaaleissa kudoksissa ja paksusuolen kasvaimen näytteet (kuvio 1B). Seuraavaksi tutkimme 19 pareittain paksusuolen kasvaimen yksilöitä varten cortactin proteiinin ilmentymistä Western blot. 14/19 (73%) osoitti kohonneet pTyr

421 cortactin ja yhteensä cortactin (Fig. 1 C, vasen paneeli), 2/19 näytteet osoittivat vähentynyttä ilmentymistä molempien muotojen (pTyr

421 ja koko) ja cortactin ja 3/19 ei osoittanut muutosta (dataa ei esitetty). Immunohistokemiallinen analyysi kudosmatriisien 6 normaalia kohdat ja 18 paksusuolen kasvaimen kohdat osoittivat voimakasta kalvon värjäys pTyr

421 cortactin ja yhteensä cortactin on 13/18 kasvaimen näytteissä verrattuna normaaliin kudosleikkeiden, esimerkkinä on esitetty. 1D. Tutkimme myös cortactin fosforylaation Tyr

482 ja Tyr

470 paksusuolen kasvain näytteissä. Olemme havainneet, että 50% analysoiduista pahanlaatuisten kudosten, oli lisääntynyt ilmentyminen pTyr

482 verrattuna verrokkeihin (tuloksia ei ole esitetty). Kuitenkin fosforylaatio tällä sivustolla eivät vaikuttaneet curcumin vuonna HCT116-soluissa (ei esitetty), ja koska Oser et al [37]. osoittivat, että pTyr

482 ei edistä sääntelyn määrä ilmaisia ​​piikkilanka päättyy invadopodia, emme jatkaa tämän sivuston eteenpäin. Emme pystyneet luotettavasti ekspression analysoimiseksi pTyr

470 Tuumorinäytteet tahansa kaupallisesti saatavia vasta-aineita.

(A) Totaali-RNA uutettiin jäädytetyistä näytteistä normaalin ja kasvaimen kudokset ja cortactin mRNA-ekspressio määritettiin käyttämällä kvantitatiivista RT-PCR. Laatikko kuvaajat kuvaavat suhteellisia määriä cortactin normalisoituna GAPDH normaaleissa ja tuumorikudoksissa (n = 37 normaalille näytteitä, n = 44 kasvainten näytettä). (B) DNA-geeli-analyysi PCR-tuotteiden saatujen qPCR analyysi (tyypillinen 37 normaaleissa kudoksissa, 5 hyvänlaatuiset kasvaimet, ja 39 pahanlaatuisia kasvaimia). (C) Kudos lysaatit pareittain (N-normaali, M-pahanlaatuisten) paksusuolen näytteet valmistettiin samalla kasvainnäytteet kuin (A) analysoitiin ilmentymisen pTyr

421-cortactin (pTyr

421 -CTTN) ja yhteensä cortactin Western-blottauksella. Edustavia Tulokset esitetään kolmen pareittain. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. (D) edustaja pTyr

421-cortactin ja yhteensä cortactin immunovärjäys paksusuolen kasvain yksilöitä. Tissue array, joka sisältää joukon paksusuolikarsinoomat värjättiin pTyr

421-CTTN ja yhteensä cortactin. Värjäytyminen oli lähinnä sytoplasmisen täydellistä cortactin, kun taas pTyr

421-CTTN osoittaa kasvoi värjäytymisen intensiteetti solukalvon.

Ristiriita muuttumattomina mRNA ilmaisun ja kohonneet koko ja fosforyloidun cortactin sulki pois mahdollisuus geenimonistuman ja esitetään mahdollisia posttranslational muutos (t) ja muutokset proteiini vakautta Kolorektaalituumorien.

muutokset solun pinnan biotinyloitu proteiineja jälkeen curcumin hoidon T84-soluissa

T84 koolonkarsinoomasoluissa on laajalti käytetty tutkimaan biogeneesin epiteelisolujen polariteetin [38] ja muodostavat hyvin polarisoitunut ja tiivis yksisolukerrokset kun viljellään puoliläpäisevä suodatin tuki. Ensin selvitettiin jakelun ja vaikutukset curcumin suurista kalvoon liittyvien proteiinien in T84 monolayers. Toistaa altistuminen suun kautta annettavien (tai ruokavalion) curcumin, solut käsiteltiin yhdisteellä tai DMSO (ajoneuvo) apikaalisella puolella. Apikaalisen kalvon ja kalvoon liittyvä Sitten proteiinit biotinyloitua, vedetään alas streptavidiinilla konjugoitujen agaroosia, ja analysoitiin LC-MS /MS: llä. Tulokset näistä kokeista on koottu kuvioon. 2. 56-proteiinit tunnistettiin LC-MS /MS: llä. 13/56 osoitti vähentynyt pinta- tai pinta-liittyvä ilmaus vaihtelee 20-80% vuonna curcumin käsiteltyjä soluja verrattuna DMSO-kontrollin (p 0.0001- p 0,05) (kuvio 2A). Vain yksi proteiini [isoformi 1 leusiinia runsaasti toisto (FLII) vuorovaikutuksessa proteiini 2, LRRFIP2) osoitti lisääntynyt ilmentyminen (dataa ei esitetty). Vaikka toiminta LRRFIP2 ei ole täysin selvä, yksi raportti on osoittanut, että sillä on tärkeä rooli aktivaattorina kanonisen Wnt-signalointireitin, yhdessä segmentissä polaarisuus proteiini epäsiisti homologi DVL-3, ylävirtaan β-kateniinin (CTNNB1) , mikä stabilointia jälkimmäisen [39]. Jotta Tässä tutkimuksessa olemme keskittyneet alentuneet cortactin vastauksena curcumin hoitoon, koska se on usein yli-ilmennetään syöpien ja se on raportoitu parantaa kasvaimen solujen vaeltamiseen ja invaasiota [40]. Kuva. 2B esittää downregulation cortactin kalvoon liittynyt proteiini fraktio curcumin käsiteltyjä soluja, havainto vahvistettiin western blottauksella käsitellyissä soluissa 50 uM on apikaalisella puolella 1-4 tuntia (Fig. 2C). Transferriini-reseptori (CD71), käytetään tässä kontrollina, ei havaittu muutosta, samanlainen kuin edellisessä raportissa [29].

(A) Taulukko 13 solukalvon liittyvien proteiinien tunnistetaan QTOF-MS /MS: merkitsevästi väheni T84 yksisolukerrokset käsitelty curcumin. Tiedot osoittavat keskimäärin ainutlaatuisia peptidejä tunnistettiin kolmesta eri kokeissa ± SD. (B) kvantitatiivinen analyysi cortactin ilmaisun T84 soluissa M /S. Spektri-arvot saatiin kolmesta eri kokeesta. Kvantifiointia tiedot cortactin proteiini peräisin M /S käyttäen Scaffold proteomiin (versio Scaffold_3.1.2). Tiedot ovat keskiarvoja ± SE, *

p

0,05 käsittelemättömiin soluihin verrattuna, Studentin t-testiä. (C) Vahvistus CTTN proteiinin ilmentymisen Western-blottauksella biotinyloidulla solupintaproteiini osa valmistetaan T84 soluista käsiteltiin DMSO (CTRL) tai 50pM curcumin 1-4 tuntia. CD71 (transferriinireseptori) käytettiin latauskontrollina. CTRL edustaa soluja, käsiteltiin DMSO: ssa 4 tuntia.

defosforylaatio pTyr

421-Cortactin by Curcumin

Yksi hyvin määritellyt mekanismin määrittämiseksi poikkeavaa kulkeutumista syöpäsolujen välittävät GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina. (B). (C). (D). Kuten on esitetty kuviossa.