Krooninen sairaus

tiivistelmä

On hyvin tunnettua, että hypoksia-indusoituvaa 1 alfa (HIF-1α) on osallisena syövän etäpesäkkeiden, kemoterapiaa ja huono ennuste. Olemme aikaisemmin havainneet, että deferoksamiini, hypoksian jäljittelevää ainetta, indusoi epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) kolorektaalisyövässä. Siksi täällä selvitimme uuden molekyylimekanismiksi HIF-1α edistää EMT ja syövän etäpesäkkeiden sitoutumalla ZEB1. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että yli-ilmentyminen HIF-1α kanssa adenovirusinfektion edistetään EMT, soluinvaasiota ja muuttoliike

in vitro

ja

in vivo

. Molekyylitasolla, HIF-1α suoraan sitovia proksimaaliseen edistäjä ZEB1 kautta hypoksiavaste elementti (HRE) sivustoja mikä lisää transactivity ja ilmaus ZEB1. Lisäksi esto ZEB1 pystyi kumota HIF-1α aiheuttama EMT ja solujen invaasiota. HIF-1α-ilmentyminen korreloi voimakkaasti ilmaus ZEB1 normaalissa peräsuolen epiteelin, primaarinen ja metastaattinen CRC kudoksiin. Mielenkiintoista, molemmat HIF-1α ja ZEB1 olivat positiivisessa yhteydessä vimentiinista tärkeä mesenkymaaliset markkeri EMT, kun taas negatiivisesti yhteydessä E-kadheriinin ilmentymisen. Nämä havainnot viittaavat siihen, että HIF-1α parantaa EMT ja syövän etäpesäkkeiden sitoutumalla ZEB1 promoottorin CRC. HIF-1α ja ZEB1 ovat molemmat yleisesti pidetään kasvaimen aloittamista tekijöitä, mutta tuloksemme osoittavat, että ZEB1 on suora alavirtaan HIF-1α, mikä viittaa uusi molekyylimekanismiksi HIF-1α-asiakkuutta EMT ja syövän etäpesäkkeiden.

Citation: Zhang W, Shi X, Peng Y, Wu M, Zhang P, Xie R, et al. (2015) HIF-1α Edistää epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon ja metastaasin kautta suoraan asetukseen ZEB1 kolorektaalisyövässä. PLoS ONE 10 (6): e0129603. doi: 10,1371 /journal.pone.0129603

Academic Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, JAPAN

vastaanotettu: 03 helmikuu 2015; Hyväksytty: 11. toukokuuta 2015 Julkaistu: 09 kesäkuu 2015

Copyright: © 2015 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat käytettävissä paperin.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat National Natural Science Foundation of China (81172057, 81302159), presidentti Foundation of Nanfang Hospital, Southern Medical University (2012C003, 2012B009), ja korkean tason aihe vastaavia varoja Nanfang Hospital (G201227).

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon (EMT) on ratkaiseva tapahtuma syövän etäpesäkkeiden, jonka aikana polarisoituneet epiteelisolujen ovat taipuvaisia ​​saada tiettyjä merkkejä mesenkyymisolujen, sekä enemmän muuttoliike ja invasiivisia ominaisuuksia [1]. Molekyyli hallmarkers aikana EMT kuuluu alassäädetty epiteelin markkereita (esim E-kadheriinin, plakoglobin ja desmoplakin), säädelty mesenkymaaliset markkereita (esim vimentiinistä, N-kadheriinin ja α-sileän lihaksen aktiini) ja lisääntynyt ilmentymä transkriptiotekijöitä tällaisten kuten Snail, Slug, Twist, sinkki sormi E-box sitova homeobox 1 (ZEB1), ZEB2, ja /tai E47, joka voi sitoutua E-kadheriinipromoottorin ja estävät sen transkription aktiivisuutta ja ilmaisun [2]. On huomattava, että menetys tai alisäätely E-kadheriinin pidetään ensisijaisena ja tärkein askel EMT. E-kadheriinin voidaan vaientaa eri mekanismeilla kuten poikkeava metylaatio ja transkriptionaalinen tukahduttaminen. Niistä sen transkription sääntely on laajalti tutkittu eri pahanlaatuisia kasvaimia [3].

Hypoksia indusoituvat 1 alfa (HIF-1α) on raportoitu edistämään EMT on useita kasvaimia moduloimalla yhtä tai lisää EMT liittyvien geenien [4]. Transkriptiotekijänä, HIF-1α toimintaa säätelevään sen alavirran geenien kautta sitomalla hypoksiavaste elementti (HRE) niiden promoottorialueille. Esimerkiksi HIF-1α pystyy transaktivoimaan matriisiin metallopeptidaasi 9 (MMP-9) in rintasyövän [5]. Maksasolukarsinoomassa, se aktivoi Snail siten tukahduttaa E-kadheriinin ilmentymisen [6]. Lisäksi HIF-1α kilpailee transkriptiotekijä 4 (TCF4) suoraan sitoutumisen P-kateniinin siten parantaa EMT kolorektaalisyövässä [7]. Näin ollen on olemassa läheinen yhteys EMT ja HIF-1α ilmentyminen syövän kanssa mekanismeja ei tunneta.

ZEB1 on ratkaiseva transkriptiotekijä EMT [8-10]. Kuitenkin yhdistyksen välillä HIF-1α ja ZEB1 on vähän tunnettu. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että HIF-1α yli-ilmentymisen aiheuttamaa EMT ja metastaattisen fenotyyppejä CRC. HIF-1α suoraan säännellä ZEB1 ilmaisun kautta hypoksiavaste elementti 3 (HRE-3), joka sijaitsee ZEB1 proksimaalisen promoottorin. Suppressio ZEB1 päinvastainen näistä vaikutuksista aiheuttamien HIF-1α overexpresssion. Ilmaisu profiilit HIF-1α, ZEB1 ja vimentiinistä olivat paljon samanlainen CRC potilailla, mikä oli vastapäätä E-kadheriinin ilmentymisen. Nämä tulokset osoittavat, että CRC etenemistä ja etäpesäkkeiden aiheuttama HIF-1α, välittyy suoraan sääntelyn ZEB1.

Materiaalit ja menetelmät

Solut ja kliinisissä näytteissä

CRC solulinjoja HT29 ja HCT116 pidettiin laboratoriossamme, edellyttäen, RPMI 1640 (GIBCO), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), kuten aiemmin on kuvattu [26]. Ihmisen CRC ja mukaan viereisten normaaleissa kudoksissa saatiin kymmenelle potilaalle CRC joille tehtiin kolonoskopia; ihmisen CRC ja vastaavan metastaattisen imusolmuke kudokset saatiin kolmekymmentä-kaksi CRC potilailla, joille tehtiin hemicolectomy vuonna Nanfang Hospital (Guangzhou, Kiina). Nämä henkilöt antoivat meille kirjallinen lupa (kuten hahmoteltu PLoS suostumuslomakkeessa) osallistumaan tähän tutkimukseen ja julkaisee nämä runko-osat. Tutkimuksissa käytetään ihmisen kudosta tarkistettiin ja hyväksyttiin komiteoiden Ethical Review of Research ihmiseen kohdistuvan in Nanfang Hospital, Southern Medical University (Luvan numero: NFYY-2012-75).

Rakentaminen ja tuotanto rekombinanttiadenovirussiirtogeenin

HIF-1α-ilmentävien plasmidi, pDC316-HIF-1α-EGFP, rakennettiin insertoimalla täyspitkän HIF-1α cDNA restriktiokohdat välillä Nhel: llä ja Notl endonukleaaseilla ja pDC316 ekspressiovektoriin, joka sisälsi EGFP (pDC316-EGFP). Stabiilia knockdovvn ZEB1, seuraavat sekvenssit kloonattiin pDC316-HIF-1α-EGFP. shZEB1 eteenpäin: 5′-GATCCCCAGATGATGAATGCGAGTCGttcaagagaTGACTCGCATTCATCATCTTTTTTGGAAA-3 ’ja shZEB1 reverse: 5′-AGCTTTTCCAAAAAAGATGATGAATGCGAGTCAtctcttgaaCGACTCGCATTCATCATCTGGG-3’, kuten aiemmin on kuvattu [8]. Molemmat plasmidit varmistettiin DNA-sekvensoinnilla.

Kaikki adenovirukset, mukaan lukien adenoviruksen 5 ekspressoivat HIF-1α (Ad5-HIF-1α), HIF-1α yli-ilmentymisen ja ZEB1 pudotus (Ad5-HIF-1α-shZEB1) ja ohjaus, Ad5-EGFP, luotiin käyttäen AdMax adenovirus pakkausjärjestelmän (Microbix Biosystems Inc., Ontario, Canada), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Suuren mittakaavan vahvistus edellä adenovirusvektoreiden tehtiin HEK293T-soluissa homologisen rekombinaation shuttle-plasmidiin (pDC316) ja runkoverkon plasmidi (pBHGlox_E1, 3Cre). Tiitterit puhdistettua virusten määritettiin standardin plakkia muodostavaa mukainen määritys valmistajan ohjeiden (Virapur, San Diego, CA).

Adenovirus-infektioita in vitro

HT29 ja HCT116-soluja kasvatettiin 80% konfluenssiin. Kun oli pesty fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), soluja inkuboitiin Ad5-EGFP: n ja Ad5-HIF-1α on MOI 0,1, 1, 10, 100 ja 1000, vastaavasti. Yhdeksänkymmentä minuuttia infektion jälkeen, virukset korvattiin säännöllisin kasvualustaa. 24 tai 48 tuntia infektion tehokkuus transduktion EGFP ilmentävien konstruktien havaittiin alle immunofluoresenssimikroskoopilla ja HIF-1α-ilmentyminen analysoitiin PCR: llä tai Western blot.

RT-PCR (RT-PCR) , Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qPCR) ja Western-blottaus-analyysi

Nämä määritykset tehtiin oleellisesti, kuten aikaisemmin on kuvattu [27-29]. Käytetyt alukkeet RT-PCR olivat seuraavat: HIF-1α sense: 5′-TCCATGTGACCATGAGGAAA-3 ’ja antisense: 5′-CCAAGCAGGTCATAGGTGGT-3’; käytetyt alukkeet qPCR olivat seuraavat: HIF-1α: 5’TTTTTCAAGCAGTAGGAATTGGA -3 ’(sense) ja 5′-GTGATGTAGTAGCTGCATGATCG -3′ (antisense); ZEB1: 5’-CCTGTCCATATTGTGATAGAGGC-3 ’(sense) ja 5′-ACCCAGACTGCGTCACATGT-3′ (antisense); glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH): 5’-GTCAACGGATTTGGTCGTATTG-3 ’(sense) ja 5′-CTCCTGGAAGATGGTGATGGG-3’ (antisense). Ensisijainen vasta, HIF-1α (Novus Biologicals, Littleton, CO), ZEB1 (Santa Cruz), E-kadheriinin (Santa Cruz), vimentiinistä (esilaimennettu, Abcam), Plakoglobin (Abcam), N-kadheriinin (Santa Cruz) ja GAPDH (Abcam) olivat kaikki kaupallisia tuotteita.

Migration, invaasio ja haavan paranemista määritykset

Päällystämätön Costar siirtoaltaat (Corning Costar Co., Corning, NY) käytettiin maahanmuuton määrityksiä ja Matrigel-pinnoitettu siirtoaltaat (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) käytettiin hyökkäystä määrityksissä. Solut seerumia yli yön ja sitten ympättiin ylempään kammioon seerumittomalla RPMI 1640-alustassa. RPMI 1640, johon oli lisätty 10% FBS: ää lisättiin alempaan kammioon. Solut, jotka olivat vaeltaneet ympäri siirtokuoppaan kalvon värjättiin ja määrällisesti. Haavan paranemista määrityksessä tyhjästä tehtiin koko yksisolukerroksen steriilin kärjen avulla. Kyky solujen siirtää tarkkailtiin eri aikapisteissä käyttämällä valomikroskoopilla.

Histologinen ja immunohistokemiallinen analyysi

hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 10% syöpäsolujen on positiivisesti stained pidettiin positiivisena. Kvantitatiivista analyysiä, suhde positiivisesti värjäytyneiden solujen kaikkien kasvainsolujen viidellä satunnaisesti alueilla 200-kertainen suurennus laskettiin. Kaikki histologiset arvioinnit mukaan lukien positiivisten solujen prosenttiosuuden tehtiin kaksoissokkotutkimuksessa tavalla kahdella patologit minimoimiseksi havaintoihin bias.

elektroforeettinen liikkuvuus Shift Assay (EMSA) B

EMSA suoritettiin käyttäen kaksijuosteinen oligonukleotidi, joka sisältää konsensus sitova sekvenssi HIF-1α kuten aikaisemmin on kuvattu [27, 28]. Seuraavat sekvenssit mielessä säikeet käytettiin sitoutumisen ja kilpailun määritykset: sekvenssejä, jotka sisältävät villityypin HRE (P1: 5′-GAGGCGTGGGACTGATGGTAGCC -3 ’, -521 ~ -517 nt, P2: 5′-GGGGGCGGACACGCGAGG -3′ -529 ~ – 525 nt; P3: 5’-CCGGTCGCCGCGTGTCCTCGCC -3 ’, -634 ~ -630 nt; P4: 5′-ATACTCCGGTCACGTTTCAGTTTTCTC -3’, -1347 ~ -1342 nt) ja mukaan mutantti HRE sekvenssit (P1-mut: 5 ’ – GAGGCACAGGACTGATGGTAGCC -3 ’, P2-mut: 5′-GGGGGCGGATGTGCGAGG -3’, P3-mut: 5’CCGGTCGCCGCACATCCTCGCC -3 ’ja P4-mut: 5’ATACTCCGGTTGTGTTTCAGTTTTCTC -3’). Nukleotidit olivat pää-leimattiin [γ-32P] ATP (PerkinElmer Life ja Analytical Sciences, Fremont, CA) ja T4-polynukleotidikinaasia (Promega). Tumauutteista infektoiduista soluista Ad5-HIF-1α-EGFP ja ohjaus- valmistettiin ja käytettiin EMTS kuten aiemmin on kuvattu [28]. Ja inkuboitiin 1 x sitomispuskurissa, joka sisälsi 2,5% glyserolia, 50 ng /ul poly (dl-dC), 5 mM MgCI2, 0,05% Nonidet P-40, ja 4 pmol biotiini-leimattu oligonukleotidi kokonaistilavuudessa 20 ui huoneen lämpötilassa 20 min. Sitoutunut seokset olivat fraktioidaan koon denaturoivassa 6% polyakryyliamidigeelissä 180 V 0,5 x TBE-puskurissa. Geeli kuivattiin tämän jälkeen ja autoradiografioitiin.

Generation raportin plasmideista, ohimenevä transfektio ja lusiferaasianalyysissä

tuottaminen Villityypin ja mutantti reportterirakenteet suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [29]. 567 bp ZEB1 promoottorin fragmentti, joka sisältää HRE-3-elementti kloonattiin pGL3-vektorin tuottaa villityypin reportteri-konstrukti, nimetään pluc-567. Mutaation HRE-3-motiiveja (pluc-567-mut) vietiin pluc-567 lusiferaarikonstrukti kanssa QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jalla, CA, USA). Molemmat konstruktit varmistettiin sekvensoimalla. Solut infektoitiin Ad5-EGFP tai Ad5-HIF-1α: ssa 48 tuntia, jota seuraa transfektio pluc-567 tai pluc-567-mut ja PRL-CMV (

Renilla

lusiferaasi). Transaktivointimääritys potentiaali testattiin Dual-Glo lusiferaasimäärityssysteamiä (Promega, Madison, WI, USA) mittaamalla lusiferaasin aktiivisuuden jälkeen 48 h.

Nude hiiret ja etäpesäkkeiden määritys

Tämä eläin koe oli toteutetaan noudattaen täysin suosituksia opas IACUC (Institutional Animal Care ja käyttö komitea), ja protokolla hyväksyi valiokunnan Ethics eläinkokeiden Nanfang Hospital (Luvan numero: NFYY-2013-56) . Kaikki leikkauksia tehtiin natrium- pentobarbitaalianestesiassa, ja yritettiin minimoida kärsimyksen. Leikkauksen jälkeen, kaikki nude-hiiriä lopetettiin natriumpentobarbitaalia anestesian. Kuuden viikon ikäisiä naaraspuolisia BALB /c-nude-hiiriä hankittiin Guangdongin maakunnan Experimental Animal Center (Guangzhou, Kiina) ja satunnaisesti neljään ryhmään (Ad5-EGFP: N = 8, Ad5-HIF-1α: N = 12; Ad5- HIF-1α-shRNA: N = 5, Ad5-HIF-1α-shZEB1: N = 5), ennen injektiota. Eläimille tehtiin osaksi intraperitoneaalinen anestesia, jossa on 40 mg /kg amobarbitaali Natriumin. Kun hiiret syvästi nukutetaan, pieni pitkittäinen vasemman kyljen yläosasta tehtiin viilto ja perna varovasti alttiina. Yhden suspendoidut solut (1,5 x 106 solua /hiiri) injektoitiin 70 ui PBS: ää, alle perna kapseli. Poistamisen jälkeen neulan, pistoskohdan painettiin aseptisella puuvilla sienellä vuotojen estämiseksi. Sen jälkeen, perna palautetaan vatsaonteloon ja periotneium ja vatsan ommeltiin silkillä [30-32]. Hiiret tapettiin, kun 5 viikkoa, mahdollisuus etäpesäkkeiden analysoitiin ja metastaasien kerättiin H 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

HIF-1α yliekspressio indusoi EMT in vitro

Saadaksesi paremman tartunnan tehoa adenovirusten CRC syöpäsolulinjoissa, HT29 ja HCT116 solut ensin transdusoitiin adenovirus 5 ilmentävät tehostetun vihreän fluoresoivan proteiinin (Ad5-EGFP) tai Ad5-HIF-1α-EGFP on tartunnan kerta- (MOI) 10, 100 ja 1000, vastaavasti, jossa kirjatut vaikutukset mikroskoopilla 48 tuntia (kuvio 1A). Lähes 100% soluista ilmaistaan ​​EGFP kanssa MOI 100, joka oli paljon samanlainen kuin MOI 1000. RT-PCR: llä (kuvio 1 B vasemmalla) ja Western blot (kuvio 1B oikealla) tulokset vahvistivat huomattava lisääntyminen, HIF-1α ilmentymisen . Sama vaikutus havaittiin HCT116-soluissa (tietoja ei ole esitetty). Siksi MOI 100 tehtiin kaikissa seuraavissa kokeissa.

(A) HT29-solut transdusoitiin Ad5-HIF-1α on ilmoitettu MOI-arvot 48 tunnin ajan. Fluoresenssin intensiteetti ja kirkkaan kentän samalla alueella havaittiin alkuperäisessä suurennos kuin 100X. (B) mRNA: n (vasemmalla) ja proteiini (oikealla) ilmaisuja HIF-1α havaittiin käyttämällä RT-PCR: ää ja western blot, vastaavasti. GAPDH: ta käytettiin lastaus ohjaus. (C) Solumorfologia villityyppisen HT29 tai HT29 transdusoitu ilmoitettu adenovirukset (Original suurennos = 400X). (D) Western blot-analyysi HIF-1α, E-kadheriinin, Plakoglobin, vimentiinistä ja N-kadheriinin adenovirusta-tartunnan HT29 ja HCT116-soluissa. GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. (E) Taita muutos hyökkäyksen ja maahanmuuton osoitettu soluissa. Kvantifiointi tulokset näytettiin baarissa kuvaajan keskiarvoja ± SD. *

P

0,05. (F) Haavan paranemista määrityksessä. Yksisolukerrokset raaputettiin pipetin kärjen ja kuvat otettiin 0, 24 ja 48 tunnin kuluttua haavan muodostumisen. *

P

0.05.

Mielenkiintoista, kun tarkkailemalla adenovirus-tartunnan saaneiden solujen, löysimme HT29-Ad5-HIF-1α-solut olivat paljon kara-muotoinen, kuten fibrobalsts verrattuna villityypin HT29 jotka olivat kierroksen hyvin solu-solu-adheesion (kuvio 1C). Edellä siirtyminen solun morfologia todella oli sama kuin muutos EMT prosessissa. Siksi me seuraavaksi havaitaan ilmauksia EMT markkereita ja totesi, että E-kadheriinin ja Plakoglobin kaksi tärkeää epiteelin merkkiaineita EMT, oli merkittävästi vaimentua Ad5-HIF-1α-tartunnan HT29 ja HCT116-soluissa verrattuna niiden valvontaa soluihin. Päinvastoin, mesenkymaaliset molekyylit, vimentiinistä ja N-kadheriinin oli kasvanut selvästi sen jälkeen, kun Ad5-HIF-1α-EGFP-infektion (kuvio 1 D). Lisäksi kasvu invaasiota ja muuttoliike (ratkaisevan piirteet EMT fenotyyppi) Molempien solulinjojen HIF-1α yliekspressio havaittiin myös (kuvio 1 E). Johdonmukaisesti, haavan paranemista määrityksessä osoitti, että leveys HT29-Ad5-HIF-1α solut olivat paljon kapeampi kuin että HT29-Ad5-EGFP solujen ilmoitettuina ajankohtina tontteja, vastaavasti (kuvio 1 F). Edellä esitetyt havainnot viittaavat siihen, että HIF-1α yliekspressio indusoi EMT ja edistää hyökkäyksen ja muuttoliike CRC solulinjoissa.

HIF-1α yliekspressio edistää etäpesäke in vivo

vaikutuksen arvioimiseksi HIF-1α yliekspressio syövän etäpesäkkeiden

in vivo

, HT29-solut transdusoitiin Ad5-HIF-1α-EGFP tai Ad5-EGFP, vastaavasti, MOI-arvolla 100. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia myöhemmin, yhden solun suspensioita kerättiin ja injektoitiin BALB /c-nude-hiiriin kautta subsplenic menetelmällä. Kuten kuvassa 2A, useita maksansisäisen kasvaimen kyhmyjä oli helppo tarkastettiin törkeästi Ad5-HIF-1α-EGFP-pistetään ryhmä, kun taas vähemmän tai ei ollenkaan kyhmyt löytyivät ohjaus hiirillä. Vahvista yllä eroa, tutkimme H 0,05. (D) vahvistus yli-ilmentymisen HIF-1α peräisin etäpesäkenystyröiden hiirillä ruiskutetaan Ad5-HIF-1α by qPCR, verrattuna ruiskutetaan ohjaus viruksia.

HIF-1α säännelty ZEB1 ilme

sekä HIF-1α ja ZEB1 ovat sekaantuneet syövän etäpesäkkeiden ja EMT [4, 9, 11]. Seuraavaksi tutkimme, HIF-1α yliekspressio vaikuttanut ilmaus ZEB1. Itse asiassa, säätelyä mRNA: ta ja proteiinia tasot ZEB1 havaittiin mukana yli-ilmentyminen HIF-1α in HT29-soluissa, kuten on esitetty kuviossa 3A ja 3B. Lisäksi suuntauksia HIF-1α ja ZEB1 ilmentyminen CRC solulinjoissa (SW480, HCT116, HT29, LoVo ja DLD1) olivat melko samanlaisia ​​(kuvio 3C). Johdonmukaisesti, tämä havainto esiteltiin myös pariksi CRC yksilöiden ja viereisen normaalin paksusuolen epiteelin kudoksia, joita havaittiin Western blot ja IHC värjäytymistä (kuvio 3D 3E). Olemme myös havainneet, että tasot sekä proteiinit olivat paljon korkeammat kasvaimen kuin viereisillä normaaleissa kudoksissa. Vuonna solutasolla, sekä HIF-1α ja ZEB1 pääosin ilmaistu tumassa ja sytoplasmassa, erityisesti nucleus, jotka olivat teoreettisesti yhdenmukaisia ​​sijainti transkription tekijä. Ja myös, havainnot niiden kolokalisaation paljastavat, että HIF-1α saattavat vuorovaikutuksessa ZEB1 fyysisesti.

(A) Endogeeninen ekspressiotasot HIF-1α ja ZEB1 ilmoitettuina viisi solulinjat havaittiin qPCR kanssa GAPDH käytettiin sisäisen valvonnan. (B T: kasvain. Taso kunkin proteiinin normalisoitui vastaan ​​GAPDH. (E) edustaja kuvaa IHC värjäys ihmisen CRC formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut näytteet HIF-1α ja ZEB1. Vasen paneeli osoitti viereisen normaalin peräsuolen kudoksiin. Oikea paneeli osoitti CRC yksilöitä. Alkuperäinen suurennos, 200X.

asetukseen ZEB1 HIF-1α kautta HRE-3

Sen arvioimiseksi, ZEB1 säätelee suoraan HIF-1α, promoottorin sekvenssit ZEB1 analysoitiin kanssa bioinformatiikan menetelmiä. Huomasimme, että oli neljä potentiaalista HRE sivustoja proksimaalisen promoottorin (~ 3500 nt ylävirtaan; alun ATG määritellään 0) of ZEB1 geenin (kuvio 4A). Oli HRE-1 -517 ~ -521 nt; HRE-2 at -525 ~ -529 nt; HRE-3 at -630 ~ -634 nt ja HRE-4 -1342 ~ -1347 nt. Näiden pohjalta antureista P1, P2, P3 ja P4 kanssa villityypin ja mutantti HRE sivustoja suunniteltiin vastaavasti kuten on kuvattu menetelmiä ja materiaaleja. Tulokset EMSA määrityksen paljasti, että HIF-1α-sitova kasvatti merkittävästi inkuboinnin jälkeen ydinvoiman otteita HT29-Ad5-HIF-1α solujen HRE-3-sisältävä oligonukleotidi ZEB1 promoottorin (kuvio 4B). Oli kuitenkin vain hyvin viikon bändejä tai ei ollenkaan kaistan esitetty HT29-Ad5-HIF-1α soluja tai muita ohjaus solujen HRE-1, 2 tai 4 sisältävä oligonukleotidi (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi kilpailu HIF-1α-sitoutumisen leimaamattoman sisältäviä oligonukleotideja HRE-3 ja anturit, jotka sisältävät mutatoidun HRE-3 ei ilmennyt mitään HIF-1α-sidosnauhojen (kuvio 4B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että HIF-1α kykeni sitoutumaan ZEB1 promoottorin kautta HRE-3 päällä.

(A) Kaavamainen esitys proksimaalisen promoottorin (~ 3500 nt ylävirtaan) ja ZEB1 geenin. HRE: hypoksiavaste elementti. (B) Oligonukleotidit EMSA oli villityypin (kaista 1-3) ja mutantti (kaista 4-5) koetin 3 päässä ZEB1 promoottori, joka sisälsi konsensus HRE-3. Tumauutteita valmistettiin HT29-Ad5-HIF-1α (kaista 3 ja 5) tai kontrollisoluja (kaista 2 ja 4) inkuboitiin [γ-32P] ATP-leimatulla koettimella ennen elektroforeesia. Negatiivinen kontrolli suoritettiin villityypin koetin ilman tumauutteesta (kaista 1). (C) Kaaviokuva promoottorialueen ZEB1 ja raportti konstrukteja käytetään adenoviruksen-tartunnan kokeissa. Konstruktit sisälsivät villityypin (pluc567-wt) tai mutantti-(pluc567-mut) HRE-3 sijaitsee -634 ~ -630 nt ylävirtaan transkription aloituskohdasta ZEB1. (D) aktivointi plu567 tai pluc567-mut Ad5-HIF-1α- tai Ad5-EGFP-tartunnan HT29 (N = 3 rinnakkaista koetta). *,

#

P

0.05.

Seuraavaksi määritti HIF-1α ilmentymisen vaikutus transkriptio aktiivisuuteen ZEB1. Tulosten perusteella EMSA, promoottorin sisältävä plasmidi HRE1-3 (pluc567) ja kohdennettu mutageneesi on HRE-3-plasmidi (pluc567-mut) tuotettiin ja transfektoitiin väliaikaisesti HT29-soluja, jotka oli esi-inkuboitiin Ad5-HIF -1α tai Ad5-EGFP 24 tuntia, Dual-lusiferaasianalyysissä osoitti aktiivisuutta pluc567 in HT29-Ad5-HIF-1α-solujen määrä nousi yli 5-kertainen verrattuna ohjaus soluihin, kun taas suurennus oli merkittävästi huonontunut kanssa pluc567-mut transfektion (kuvio 4C 4D). Nämä tulokset osoittivat, että HIF-1α aktivoidaan ZEB1 suoraan sitoutumalla HRE-3 sivuston ZEB1 proksimaalisen promoottorin.

ZEB1 on kriittinen HIF-1α aiheuttama EMT ja etäpesäkkeiden

havaitsemiseksi onko ZEB1 vaaditaan HIF-1α aiheuttama EMT ja metastaattisen fenotyypin, me tuotti plasmidin HIF-1α ilmentävien ja ZEB1 knockdown, ja sitten pakataan adenovirus (Ad5-HIF-1α-shZEB1). Koska endogeeninen taso ZEB1 vuonna HT29 oli paljon pienempi kuin vuonna HCT116-soluissa (kuvio 3C, oikealla), mikä oli sopusoinnussa niiden proteiinin tasot edellisessä data [12]. Siksi HCT116-soluja määrättiin suorittamaan kaikki ZEB1 pudotus kokeita.

In vitro

, HCT116-soluja transdusoitiin Ad5-HIF-1α-shZEB1 ja Ad5-HIF-1α, vastaavasti . Western blot, invaasio ja muuttoliike määritykset suoritettiin 48 tunnin kuluttua. Kuten on esitetty kuviossa 5A, E-kadheriinin ilmentyminen upregualted ja vimentiinin ilmentyminen säädeltiin johon liittyy knockdovvn ZEB1. Johdonmukaisesti, invaasio ja muuttoliike kapasiteettia pieneni 34% ja 45%, vastaavasti.

In vivo

, havaitsimme useita kasvaimen kyhmyjä pinnalle maksa H 5E).

(A) Western blot-analyysi ZEB1, E-kadheriinin ja vimentiinista in HCT116-Ad5-HIF-1α tai HCT116-HIF-1α-shZEB1 soluissa. GAPDH: ta käytettiin lastaus ohjaus. Invasion (B) ja muuttoliike (C) määritykset suoritettiin samassa kahdessa solulinjassa. Edustaja kuvat hyökkäsi solujen inserttejä siirtokuoppaan kammiot olivat esillä alkuperäinen suurennos = 200X. *

P

0,05. (D) edustaja valokuvaus- kuvia ja H 0.05.

Expression of HIF-1α, ZEB1, E-kadheriinin ja vimentiinista ala- ja metastaattinen CRC näytteet

arvioimiseksi välisiä suhteita HIF-1α, ZEB1 ja EMT avain markkereita kliinisissä kudoksissa, IHC värjäys suoritettiin 32 paria ensisijaisen CRC yksilöitä ja metastaattinen imusolmukkeesta (kuvio 6A). Keskimääräinen prosenttiosuus positiivisesti värjäytyneiden solujen kaikkien kasvainsolujen kussakin kudoksessa arvioitiin riippumattomasti kaksi tutkijaa, kuten on esitetty kohdassa materiaalit ja menetelmä. Huomasimme, että prosenttiosuudet sekä HIF-1α- ja ZEB1-positiivisten CRC solut olivat yli 65%, kun taas prosenttiosuus metastaattisessa imusolmuke nostettiin noin 86% ja HIF-1α ja 78% varten ZEB1 (kuvio 6B). Samalla, taso vimentiinista oli myös melko korkea sekä ensimmäisen ja metastaattinen kudoksia; vaikka ei ollut merkittävää eroa näiden kahden ryhmän välillä. E-kadheriinin, prosenttiosuus E-kadheriinin-positiivisia kasvainsoluja perusterveydenhuollossa CRC kudoksessa oli noin 29%, kun taas merkittävästi laski 12,7% metastaattisessa ryhmässä (kuvio 6B). Nämä tulokset tukevat havaintoja CRC solulinjat, HIF-1α-ilmentyminen positiivisessa yhteydessä ZEB1 ja vimentiinista, ja negatiivisesti yhteydessä E-kadheriinin ja HIF-1α ja ZEB1 voi osaltaan differentiaalisesti EMT ja etäpesäkkeiden.

kuvat ovat IHC (A) ja kvantifiointi positiivisia kasvainsoluja (B) sekä ensimmäisen CRC yksilöitä ja mukaan metastaattisen imusolmuke. Alkuperäinen suurennos, 200X. *

P

0,05 ja

#

P

0.05.

Keskustelu

Yksi keskeisistä tavoista syövän hoidossa on ymmärrystä molekyylimekanismeja kasvaimien synnyn ja syövän etäpesäkkeiden. Tässä tutkimuksessa olemme paljasti, että ZEB1 on myötävirtaan kohde HIF-1α ja on kriittinen rooli EMT ja metastaattisen fenotyyppien aiheuttama yli-ilmentymisen HIF-1α. Ehdotamme, että HIF-1α suoraan sitoutuu edistäjä ZEB1 ja toimii sen kriittinen positiivisena säätelijänä, mikä edistää EMT ja syövän etäpesäkkeiden. Meidän havainnot paljastaa uuden mekanismin, jolla HIF-1α säätelee kasvaimen etenemistä ja invaasio.

HIF-1α ilmentyminen on yleisesti yliaktiivista paljon pahanlaatuisia kasvaimia, ja monet julkaisut ovat raportoineet läheinen korrelaatio HIF-1α ilme ja lisääntynyt aggressiivisuus ja suuremmat metastaattisen kapasiteetti munasarja-, rinta-, keuhko-, eturauhas-, paksusuoli- ja haiman karsinoomat [11-14]. Sillä molekyylitasolla, HIF-1α saa aikaan biologisen funktion kautta aktivoimalla kohdegeenien kuten Snail, Twist ja TCF3, jotka kaikki liittyvät EMT ja etäpesäkkeiden [15-18]. On kuitenkin tärkeää identiteetistä tuntemattomia tavoitteita ja paljastaa yhteyden HIF-1α aktivointia ja muut onkogeeni tai tuumorisuppressorit.

ZEB1, pro-metastaattinen transkriptiotekijä, on mukana syövän etenemisen ja etäpesäkkeiden [ ,,,0],19, 20]. Mekanistisesti, ektooppinen ilmentyminen ZEB1 riittää säätelevät vaimentaen E-kadheriinin ja aiheuttaa EMT rintasyövän sitoutumalla konservoituneen E-laatikot E-kadheriinin promoottori. Estyminen toiminta ZEB1 E-kadheriinin mikä edistää EMT havaitaan myös ksenograftimalleja CRC [8]. Lisäksi ZEB1 välittää klaudiini-1-säännelty muutoksia solujen invaasiota ja anoikis CRC [21]. Samanlaisia ​​ZEB1, etana ja Twist ovat myös tärkeitä EMT transkriptiotekijöiden hiljentämällä E-kadheriinin sitoutumalla E-box elementti E-kadheriinipromoottorin [22]. Snail on identifioitu HIF-1α kohdegeenin hiiren [23]; Twist on suoraan säätelee HIF-1α pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) [18, 24]. Toisin sanoen, ne myös sitä, että HIF-1α-reitin voi säädellä E-kadheriinin tukahduttaminen, oletettavasti kautta Snail tai Twist. Näin ollen, koska vastaavia kykyjä HIF-1α ja ZEB1 aiheuttaa EMT ja päällekkäisiä fenotyyppejä HIF-1α ja ZEB1 null hiirillä, on todennäköistä, että nämä kaksi geeniä sijaitsevat samaa reittiä säädellä syövän etäpesäkkeiden. Näin ollen, olemme arveltu, että saattaa olla vahva interaktiivinen yhteys ZEB1 ja HIF-1α. Todellakin, huomasimme, että HIF-1α kykeni sitoutumaan ZEB1 promoottori kautta HRE-3 ja säätää positiivisesti ZEB1 transactivity. Nämä havainnot viittaavat siihen, että Snail, Twist ja ZEB1, kolme suurta EMT viranomaisilla voi säädellä EMT ja etäpesäkkeiden joitakin hyvin samanlaisia ​​mekanismeja. Mielenkiintoista, Peinado ym raportoitu, että Snail, Slug, ZEB1 ja ZEB2 rekrytoida erityisiä kromatiiniin remodeling kompleksit tukee dynaaminen yhteys transkription repression ja epigeneettiset geenien hiljentäminen E-kadheriinin aikana kasvaimen etenemisen ja EMT [25].