Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

KRAS, BRAF

ja

PIK3CA

mutaatiot havaitaan usein kolorektaalisyövässä (CRC). Erityisesti

KRAS

mutaatiot ovat vahvoja ennustavat kliinisiä tuloksia EGFR kohdistettujen hoitojen, kuten setuksimabin ja panitumumabia metastaattisessa kolorektaalisyövässä (metastasoituneen kolorektaalisyövän). Mutaatiota analyysi, nykyinen menetelmät ovat aikaa vieviä, eikä se ole helposti saatavilla kaikille onkologit ja patologian. Olemme kehittäneet uuden, yksinkertainen, herkkä ja täysin automatisoitu molekyylidiagnoositekniikoiden järjestelmä (AMDS) varten Vierianalytiikka (Poct). Kirjoittajat raportoivat tuloksista vertailun tutkimuksen välillä AMDS ja suoralla sekvensoinnilla (DS) havaitsemisessa

KRAS, BRAF

ja

PI3KCA

somaattisia mutaatioita.

Menetelmät /Principal löytää

DNA uutettiin siivu joko jäädytettynä (n = 89) tai formaliinilla kiinnitetyille ja parafiiniin upotetut (FFPE) CRC kudosta (n = 70), ja käytettiin sitten mutaatio analyysiä AMDS ja DS . Kaikki mutaatiot (n = 41 mm jäädytetty ja 27 kesken FFPE näytettä) havaitaan DS oli myös onnistuneesti (100%) havaitsee AMDS. Kuitenkin 8 jäädytetty ja 6 FFPE näytteiden havaitaan villityypin DS analyysissä näytettiin mutanttien AMDS analyysiin. Kloonaamalla-sekvensointi määrityksiä, nämä ristiriitainen näytteet vahvistettiin totta mutantteja. Yksi näyte oli samanaikaista ”hot spot” mutaatioita

KRAS

ja

PIK3CA

, ja kloonaus määritys comfirmed että E542K ja E545K eivät olleet samassa alleeli. Genotyping puhelun hinnat DS oli 100,0% (89/89) ja 74,3% (52/70) pakastettuina ja FFPE näytteiden osalta, että ensimmäinen yritys; katsoo, että on AMDS oli 100,0% sekä näytejoukoille. Automaattiseen DNA: n uutto ja mutaation havaitseminen AMDS, pakastetut kudokset (n = 41) olivat onnistuneesti havaita kaikki mutaatiot 70 minuuttia.

Johtopäätökset /merkitys

AMDS on ylivoimainen herkkyys ja tarkkuus yli DS, ja on paljon helpompi toteuttaa kuin tavanomaiset työvoimavaltaista manuaalinen mutaation analyysi. AMDS on hyvät mahdollisuudet Poct laitteita mutaation analyysi.

Citation: Kitano S, Myers J, Nakamura J, Yamane A, Yamashita M, Nakayama M, et al. (2013) romaani Fully Automated Molecular Diagnostic System (AMDS) ja peräsuolen syöpään Mutation Detection. PLoS ONE 8 (5): e62989. doi: 10,1371 /journal.pone.0062989

Editor: Anthony WI. Lo, Kiinan University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 8. tammikuuta 2013 Hyväksytty: 27 maaliskuu 2013; Julkaistu: 09 toukokuu 2013

Copyright: © 2013 Kitano et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus rahoittivat kirjoittajien yritys (TOPPAN PRINTING CO., LTD.). Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tämä Tutkimusta rahoittivat kirjoittajien yritys (TOPPAN PRINTING CO., LTD. ). Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Ihmisen

KRAS

-onkogeeni mutatoitunut yli 30% CRC, ja yli 3000 pisteen mutaatioita on raportoitu tähän mennessä [1]. Yleisimmät muutokset havaitaan kodonissa 12 (~82% kaikista raportoiduista

KRAS

mutaatioita) ja kodonissa 13 (on noin 17%), jotka molemmat ovat eksonissa 2

KRAS

geeni [2] ja näyttävät olevan tärkeä rooli etenemistä CRC [3].

BRAF

koodaa seriini /thereonine kinaasi, joka aktivoi RAS-MAPK-reitin, ja sen mutaatio on havaittu 4-15% CRC.

PIK3CA

koodaa katalyyttisen alayksikön p110 alfa PI3K [4], ja mutatoitu PIK3CA stimuloi AKT reitin ja edistää solujen kasvua eri syövissä, mukaan lukien CRC [5].

PIK3CA

mutaatioita on kuvattu 10% -30% CRC [6], ja niihin liittyy

KRAS

mutaatio. On ollut raportin, että läsnäolo mutaatioiden

PIK3CA

,

KRAS

tai

BRAF

CRC osoitti huonompi potilaiden hoitotuloksiin [7], ja potilailla, joille tehdään hoitavasta resektio CRC,

PIK3CA

mutaatio liittyy lyhyempi syöpää erityisiä selviytymisen [8]. Kuitenkin haittavaikutus

PIK3CA

mutaatio voidaan mahdollisesti rajoittaa potilaisiin, joiden

KRAS

villityypin kasvaimia [8].

Setuksimabia ja panitumumabipitoisuus ovat tehokkaita kasvutekijän (EGFR) kohdennetut aineet metastasoituneen kolorektaalisyövän (metastasoitunutta kolorektaalisyöpää), mutta potilaat, joiden kasvaimet ovat

KRAS

mutaatioita lukuun G13D [9] uskotaan yleisesti ole hyötyä näistä aineista [10], [11]. Lisäksi mutaatiot

BRAF

ja

PIK3CA

on myös raportoitu vaikuttavan tehoon EGFR kohdistettujen aineet [12], [13]. Koska tärkeä arvo näiden mutaatioiden ennustaminen kliinistä tulosta metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilailla, nopea, luotettava ja herkkä menetelmä samanaikaisesti havaita ne olisivat välttämättömiä ilmoitti lääkehoidon. Toistaiseksi vaikka monet tekniikoita on kehitetty, ne rajoittavat monimutkainen menettely, korkeat kustannukset, matala läpimeno tai muita ongelmia. Esimerkiksi suora Sangerin sekvensoinnilla (DS) on nykyisin yhä pidetään kultakantaan havaitsemiseksi nämä mutaatiot. Kuitenkin DS menetelmä vaatii useita vaiheita, puuttuu kyky automaattiseen analyysiin. Se on myös pitkä käännettä-aika ja on yleinen suhteellisen kallista verrattuna muihin menetelmiin. Muita äskettäin kehitetty menetelmiä, kuten PCR liittyvien teknologioiden [14] – [17], sekvensointi alustojen [18], [19], ja muita menetelmiä, kuten HRM (High Resolution Sulamisanalyysi) [20] analysointi ovat herkempiä ja kätevämpää kuin DS , mutta ne ovat myös aikaa ja työlästä [21], ja ei ole helposti saatavilla useimpiin kliinikot usein vaaditaan, että kasvaimen näyte lähetetään referenssilaboratorioon, mahdollisesti tuloksena hoidon viiveitä.

Olemme kehittäneet täysin automatisoitu geneettinen analysaattori AMDS joka sisältää menetelmät DNA: n eristämiseksi /puhdistus, DNA (PCR), mutaation havaitsemisen Invader® kemia [22], [23], ja genotyyppi tulkinta. AMDS voi soittaa mutaation aseman automaattisesti 70 minuutin kuluttua näytteen lisäämisen (

esim.

Uutettu genomi-DNA: ta tai kudosnäytteessä homogenaattia) patruunan. Täällä me raportoimme toteutettavuustutkimuksen AMDS havaitsemiseksi somaattisten

KRAS

,

BRAF

ja

PI3KCA

mutaatioita CRC kudoksissa verrattuna DS kaksoissokkotutkimuksessa tavalla. Ensin arvioitiin herkkyys AMDS käyttäen titraus määrityksessä keinotekoisesti rakennettu plasmidi-DNA: ta. Kliininen suorituskyky Tutkimus suoritettiin sitten edelleen arvioida tarkkuutta, spesifisyys ja herkkyys järjestelmän verrattuna DS. Lisäksi kloonaus-sekvenssianalyysi suoritettiin validoimiseksi discordant mutaatiostatuksesta riippumatta välillä AMDS ja DS. Monipuolisuutta järjestelmän mutaatioiden tunnistamiseksi kudoksista erilaisilla fixatives (tuore ja FFPE) arvioitiin myös. Lisäksi testasimme kykyä järjestelmän täysin automatisoidusti: DNA louhinta mutaation havaitseminen käyttäen minimaalinen määrä ( 1 mg) jäädytettyä CRC kudosta.

Materiaalit ja menetelmät

Plasmidi-DNA

Tavoiteltu mutaatiot olivat 7 nonsynonymous pistemutaatioita (G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V ja G13D) eksonissa 2

KRAS

geeni, yksi synonyymi pistemutaatio (V600E) eksonissa 15

BRAF

geeni ja 5 nonsynonymous pistemutaatioiden eksoni 9 kierteisen domain (E542K, E545K, E545G) ja eksonin 20 kinaasidomeeni (H1047L, H1047R) on

PIK3CA

geeni, kaikki yhteiset mutaatioita ihmisen CRC. Nämä mutantit ja villi-tyypit amplifioitiin PCR-menetelmällä ja kloonattiin plasmidiin pCR®2.1 (Invitrogen, CA, USA), ja syntetisoitu mutantti ja villityypin malleja varmennettiin sekvensoimalla. Pituus kaikki plasmidi-DNA, mukaan lukien 300 ep kohdesekvenssi oli 4,2 kb. Syntetisoitu plasmidi-DNA suspendoitiin TE-puskuriin ja säilytettiin -20 ° C: ssa ennen käyttöä.

CRC malli jakso

CRC kudosten jäädytettyjen näytteen kohdat (n = 89) ja FFPE näytteen osat ( n = 70) tässä tutkimuksessa käytetyt olivat Human Tissue Resource Center of Chicagon yliopistossa. Kaikki näytteet diagnosoitu paksusuolen tai peräsuolen syövän hematoksyliinillä ja eosiini tahra. Kaikki kudokset olivat ensisijainen CRC kudosta poistaa kirurgisesti ennen muita kliinisiä hoitoja. Kudokset viipaloitu kooltaan noin 1,0 cm

2 x 10 um mikrotomi. Viipaloitu osassa käytetyt näytteet tässä tutkimuksessa ei tehty käsin mikrodissektion (MMD). Ei muita tietoja, mukaan lukien demografiset ja kliiniset pyydettiin tietoja näiden näytteiden. Tutkimus on tarkistanut ja hyväksynyt Institutional Review Board of Chicagon yliopistossa.

AMDS

AMDS on täysin automatisoitu geneettinen analyyttinen järjestelmä, joka perustuu DNA-siru, joka on 23 reaktiokuoppia sisältäviä reagensseja PCR: ää ja Invader® määrityksissä (kuvio 1A ja 1 B). Kun käyttäjä lisää näytteen (kokoveri, puhdistettiin DNA: ta tai kudoshomogenaatin) on DNA: n puhdistus patruuna ja aloittaa liitetty ohjelmisto, AMDS toimii DNA: n eristämiseksi, siirtää DNA siru, suorittaa PCR ja Invader® määritys, lukee tulokset , ja näyttää päätellen johtaa noin 70 minuuttia. Pitoisuus virtaus mutaation havaitseminen on esitetty kuviossa 1C. Vaiheessa 1, DNA uutetaan ja puhdistetaan DNA-puhdistus patruuna; vaiheessa 2, puhdistettu DNA nestenäyte siirretään DNA-Chip; vaiheessa 3, InvaderPlus® (PCR ja Invader® reaktio jatkuvasti samassa putkessa) on suoritettu; viimeisessä vaiheessa, AMDS raportoi genotyypitys- tulos näytteen. InvaderPlus® suoritettiin seuraavissa olosuhteissa: n denaturoimiseksi 2 minuutin ajan 93 ° C: ssa, jota seurasi 30 tai 35 sykliä 31 sekuntia 93 ° C: ssa ja 16 sekuntia 66 ° C: ssa, ja Taq-polymeraasia deaktivointi 2 minuutin ajan 97 ° C: ssa , jota seurasi 10 minuutin signaalin havaitseminen 61 ° C: ssa. Fluoresenssi signaali FAM (Fluorescence aminoheksyyli) seurattiin kanavalla F1 520 nm eksitaatio 490 nm, ja fluoresenssi signaali RED (Redmond Red) seurattiin kanavalla F2 595 nm eksitaatio 580 nm.

(A), (B) AMDS järjestelmä (DNA-siru, DNA: n puhdistus patruuna ja suunnitella) (C) Pitoisuus virtausta AMDS. (D) periaate Invader® kemia (E) genotyypitys algoritmi AMDS. EP: Loppupiste aika, JP: päätellen vaiheessa aika, FNT: Fluoresenssi vahvuus Negative kynnyksen, F (EP): Fluoresenssin voimakkuus EP, F (JP): Fluoresenssin voimakkuus JP, SR: Signal suhde, RPT: Positiivinen suhde kynnys .

DNA-siru ja DNA puhdistus kasetti

Kaikki DNA-sirut ja DNA: n puhdistus patruunoita valmistettiin puhtaassa huoneessa tasolla ISO luokka 8. Tarvittavat reagenssit seosta (1,99 ui ) on DNA-siru, joka sisältää 0,1 ui 1 M MOPS-puskuria (pH 7,7) (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japani), 0,05 ui 10 mM kutakin deoksi- trifosfaatti (Roche, CA, USA), 0,96 ui 1 M trehaloosia (Hayashibara , Okayama, Japani) vesipitoinen liuos, 0,60 ui 20 x oligo sekoitus, 0,22 ui 5,0 U /ul Hawk Taq-polymeraasia (Roche, CA, USA), 0,04 ui 15000 U /ul klevaasi (Hologic, WI, USA) oli annostellaan ja kuivataan kuopissa DNA-siru. 20 x oligo seos valmistettiin 0,06 ui 100 uM forward-aluke, 0,06 ui 100 uM reverse-aluke, 0,06 ui 50 uM FAM-FRET (Fluoresenssiresonanssienergiasiirtoa) kasetti (Hologic, WI, USA), 0,06 ui 50 uM RED-FRET kasetti (Hologic, WI, USA), 0,06 ui DW (Tislattu vesi: Lonza, Basel-Stadt, Sveitsi), ja joukko 0,06 ui 10pM valtaavat oligonukleotidi plus 0,06 ui 100 uM alleelin koetin sekä villityypin ja mutantti tyyppi. Oligonukleotidisekvenssit käytettiin tässä tutkimuksessa on esitetty taulukossa S1.

Nukleiinihappo puhdistettiin käyttämällä DNA: n puhdistus patruunan, joka sisältää lasisuodattimella. DNA adsorboidaan sili- läsnä ollessa kaotrooppisen suolan [24], [25]. Jälkeen puhdistusprosessi, 270 ui DNA-näytettä, joka sisälsi MgCl

2 (6,25 mM) ja NaCl (15 mM) injisoitiin DNA-sirulle.

Periaate on InvaderPlus® määritys mutaatio Detection

InvaderPlus® on Invader® kemiaa-pohjainen (kuvio 1 D) mutaation havaitseminen määritys, jossa PCR ja Invader reaktio suoritetaan peräkkäin yhdessä putkessa. PCR-vahvistamisen jälkeen vaiheessa DNA-polymeraasi on lämpöinaktivoitua, ja Invader® reaktio havaitsee mutaatio PCR-tuotteen. Tunkeutuvat oligo nukleotidin ja alleelin koetin sitoutuvat PCR-tuotteen, jotka muodostavat invasiivisen katkaisun rakenteen (1). Jos sekvenssi alleelin koetin on täysin sovitettu PCR-tuote, Cleavase® leikkaa koetin aiheuttaa vapauttaa varren. Vapautunut varsi sitoutuu komplementaarisen sekvenssin FRET-kasetin. Lopuksi, Cleavase® leikkaa FRET kasetti, ja erottaa fluoresenssiväri nukleotidi (F) jäljellä FRET kasetti, joka sisältää sammuttajaa (Q) 3′-päähän. Nämä reaktiot ovat pyöräilin, ja aiheuttaa signaalin vahvistus. Päinvastoin, kun sekvenssi koetin on yhden pohja epäsuhta kanssa PCR-tuotteen 5’pää jossa hyökkääviä oligo nukleotidin ja alleeli koetin olla yksi pohja päällekkäistä rakennetta, Cleavase® voi leikata alleelin anturi. Tämän seurauksena, sen seurauksena reaktio ei tapahdu, ja FRET kasetti on ehjä (2). Kaksi FRET kasetteja erottaa käyttämällä erilaisia ​​fluoresoivia väriaineita.

Algoritmi genotyypin

Periaate ja vuokaavion genotyypitys AMDS esitetään kuvassa 1E. Kun Invader® määritys on valmis, genotyypitys ohjelmisto vertaa loisteputki signaalinvoimakkuus EP (päätepiste aikaa) kuvataan F (EP), ja FNT (fluoresoiva vahvuus negatiivinen kynnys). Jos F (EP) on alle FNT, näytettä pidetään negatiivisena (

e, g

, näyte D) mutaation. Jos F (EP) on vähintään FNT, niin sen signaalin suhde (SR), joka on ilmaistu seuraavalla yhtälöllä, lasketaan.

SR edustaa reaktiota tehokkuutta Invader® määrityksessä. Jos SR näytteestä on suurempi kuin RPT (Ratio Positive Threshold), näyte pitää positiivisina tietyn mutaation (

esim

. Näyte A ja B), mutta jos ei, näytettä pidetään negatiivisena (

esim

näyte C). Jokainen RPT kaikille mutaatioiden havaittu tässä kliinisessä tutkimuksessa määriteltiin 5% mutantti 95% villin tyypin seos-DNA (taulukko S2.).

Direct Sequencing (DS) B

DS seuraavia alukkeita käytettiin monistamaan

KRAS

geeni: 5′-GAATGGTCCTGCACCAGTAA-3 ’(F: Forward-aluke), 5′-GTGTGACATGTTCTAATATA GTCA-3’ (R: Reverse-aluke),

BRAF

geeni: 5′-TGCTTGCTCTGATAGGAAAATG-3 ’(F), 5′-AGCATCTCAGGGCCAAAAAT-3’ (R) ja

PIK3CA

geeni: 5′-ATGATGCTTGGCTCTGG AAT-3 ’(F), 5 ”-GGTCTTTGCCTGCTGAGAGT-3 ’(R). Pituus kunkin PCR-tuote

KRAS

: 214 emäsparia,

BRAF

: 228 emäsparia,

PIK3CA

EX9: 269 emäsparia ja

PIK3CA

EX20: 273 bp. PCR-tuotteet olivat sykli-sekvensoitiin käyttämällä Big dye terminator v1.1 /3,0 syklisekvensointireagenssipakkausta (Life Technologies, CA, USA) mukaisesti valmistajan ohjeen. Sekvenssi reaktiot alistettiin sitten elektroforeesi Applied Biosystems 3730 × l DNA Analyzer (Life Technologies, CA, USA).

Titraus Study käyttäen plasmidi-DNA: n ja genomisen DNA: n

arvioimiseksi mutaation havaitseminen herkkyys AMDS, titraus tutkimus plasmidi-DNA suoritettiin. Titraus näytteitä (määrä plasmidi-DNA: 1 fg /kuoppa, 10 fg /kuoppa ja 100 fg /kuoppa) valmistettiin, kuten on esitetty kuviossa 2A. Näyte sisälsivät 30 ui plasmidi-DNA: ta, 12 ui 500 mM NaCl, 18 ui 100 mM MgCl

2, ja 240 ui D.W. Kukin plasmidi-DNA-näyte sisältää 100 ng /kuoppa lohen kivesten yksijuosteista DNA: ta (Sigma-Aldrich, MO, USA). Myös osuus takaisin maahan signaali tarkistettiin Novagen® ihmisen naisen genomista DNA (EMD biosiences, CA, USA) (1 ng /kuoppa, 10 ng /kuoppa ja 100 ng /kuoppa).

(A ) Plasmidi-DNA titraus tutkimus. Plasmidi-DNA rakennettiin yhteensä 13 eri mutanttien ja 6 villityypin (

KRAS

: 1,

BRAF

: 1,

PIK3CA

: 2). (B) Clinical suorituskykyä tutkimuksessa. 70 FFPE viipaloitu kudosten ja 89 Jäädytetyt viipaloitu kudoksista testattiin. Genomi-DNA uutettiin FFPE viipaloitu kudoksesta Epicentre® QuickExtract ™. Genominen DNA puhdistettiin jäädytetyistä viipaloitu kudoksesta QIAamp® DNA Micro kit. Lisäksi, kuten ympäröimänä pisteviivat, noin 1 mg jäädytettyä viipaloitu kudosta homogenisoitiin ja käytettiin täysin automatisoitua mutaation analyysi. (C) titraus tutkimus

KRAS

G13D mutaation havaitsemista DS. Elektrofe- otettiin eri mutantti-villi sekoitus plasmidi-DNA (10 fg /reaktio). (D) titraus tutkimus

KRAS

G13D mutaation havaitsemista AMDS. Kaavio näyttää sulautunut InvaderPlus® reaktio tiedot (n = 3) eri mutantti-villi seosta

KRAS

G13D havaitsemista AMDS (◊; mt 100%, ○; mt 50%, △; mt 25% , Υ; mt 5%, *; mt 1%, +, 0,5% ja x; mt 0%). Määrä plasmidi-DNA oli 10 fg /hyvin. (E) Elektroferogrammin eteen- ja taaksepäin analyysi samasta näytteestä (ID = 56754). (F) InvaderPlus® reaktio näytteen (ID = 56754) mukaan AMDS.

Kliininen tehokkuus Study

kokeelliset kliinisen suorituskyvyn tutkimuksen AMDS on esitetty kuvassa 2B . Genominen DNA jäädytetty näyte kohdat (n = 89), uutettiin ja puhdistettiin QIAmp® DNA Micro (Qiagen, CA, USA), ja säädettiin 10 ng /ul. Näyte ladattiin DNA-siru sisälsi 30 ui 10 ng /ul genomista DNA: ta, 12 ui 500 mM NaCl ja 18 ui 100 mM MgCI

2, ja 240 ui D.W. Genominen DNA FFPE kohdat (n = 70) eristettiin käyttäen QuickExtract ™ FFPE DNA Extraction Kit [Epicentre® (an Illumina® yhtiö), WI, USA] mukaan valmistajan ohjeiden ja valmistettiin × 50 laimennosnäytteessä. Lastaus näyte DNA-siru sisälsi 30 ui uutettua DNA: ta (x 50 laimennus), 12 ui 500 mM NaCl, 18 ui 100 mM MgCI

2, 240 ui DW

Kloonaus analyysi

kloonaus analyysi suoritettiin näytteistä (n = 14), joka oli ristiriitainen mutaatiostatuksesta riippumatta välillä AMDS ja DS. Aseta pituudet PCR tuotteet olivat 214 bp (

KRAS

), 228 emäsparia (

BRAF

), 269 emäsparia (

PIK3CA

EX9) ja 273 emäsparin (

PIK3CA

EX20). Alukesekvenssit on esitetty taulukossa S3. PCR-tuotteet valmistettiin käyttäen GoTaq® DNA-polymeraasia ja PrimeSTAR® GXL DNA-polymeraasia. PCR-tuotteet digestoitiin restriktio- entsyymillä, ja fragmentit insertoitiin pUC118: aan /HincII ja pMD19 /EcoRV. Lisätään kloonit tunnistettiin sinivalkovalikoinnilla seulonta. Plasmidi-DNA monistettiin VAKU TempliPhi DNA Amplification Kit (GE Healthcare, Buckinghamshire, Englanti). DS suoritettiin Applied Biosystems 3730 × l DNA Analyzer.

Täysin automatisoitu somaattisista mutaatioista Detection by AMDS

Noin 1 mg jäädytettyjen näytteen kohdat (n = 41) homogenoitiin 20 sekuntia lasi homogenisaattorilla, ja 200 ui DW lisättiin. Homogenaatti siirrettiin DNA: n puhdistus patruuna AMDS, ja täysin automatisoitu mutaation havaitsemisen prosessi

KRAS

ja

PIK3CA

mutaatioita tehtiin. Pakastetut näytteet, jotka tunsivat

BRAF

V600E mutaatio eivät olleet mukana tässä tutkimuksessa, koska rajallinen määrä DNA.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi suoritettiin tilastollinen voima ja κ kerroin testit [26], joita käytettiin vertaamaan esiintyminen ja aste yhteneväinen havaitseminen

KRAS

,

BRAF

ja

PIK3CA

välillä DS ja AMDS.

tulokset

vertailu Mutation Detection herkkyys välillä aMDS ja DS plasmidi-DNA Titraus Study

arvioimiseksi herkkyyden aMDS, käytimme sarjalaimennettiin plasmidi-DNA, joka sisältää eri suhteissa mutanttien ja villityypin on

KRAS

,

BRAF

ja

PIK3CA

geenejä. Kun näyte sisälsi alle 25% mutantti-DNA-mutaatio huippu DS elektroferogrammi ei pystynyt voidaan erottaa taustasta (kuvio 2C). Sen sijaan AMDS selvästi havaita

KRAS

G13D mutaatiot 5%: n tasolla (maksimi 0,5%), kuten on esitetty kuviossa 2D.

vertailu herkkyys mutaatio Detection välillä AMDS ja DS Clinical Performance Study

mutaatio havaintokyvyn verrattiin välillä AMDS ja DS kahdet näytteitä; tuore kudokset (n = 89) ja FFPE näytteitä (n = 70) potilaista (n = 153) ja CRC. Pariksi jäädytetty ja FFPE näytteet olivat käytettävissä kuusi potilasta, ja loput näytteet olivat riippumattomia potilaille. Vertailu suoritettiin plasebokontrolloitu tavalla. Kuten on esitetty taulukossa 1-3, kaikilla

KRAS

,

BRAF

ja

PI3KCA

mutaatiot havaitaan DS joko jäädytettynä (kokonaismäärä mutaatio, n = 41, 46,0 %) tai FFPE (n = 27, 38,5%) näytteet olivat myös onnistuneesti (100%), havaitaan AMDS. Ei ollut näytteitä, jotka määritettiin mutanttien DS kun havaitaan villityypin in AMDS. Näytteissä havaitaan villin tyyppejä DS, kuitenkin, AMDS pystyi havaitsemaan muita mutanttien jäädytetty (n = 8, 9,0%) ja FFPE (n = 6, 8,6%) näytteistä. Kuten on esitetty taulukossa 4, mutaatiot sekä

KRAS

ja

PIK3CA

havaittiin AMDS 6 potilasta (6/153, 3,9%). Erityisesti näistä samanaikaiset mutaatioita, kaikki

PI3KCA

mutaatiot olivat nimenomaan E545K, kun taas

KRAS

mutaatioita monipuolinen.

Tulokset DS ja AMDS varten ristiriitainen esimerkiksi on esitetty kuviossa 2E ja 2F. Tämä näyte uskottavasti määritettiin mutantti mukaan DS vain eteenpäin pohjamaali analyysiin. Huonon sekvensointi signaali käänteisessä pohjamaali analyysi, tämä näyte pidettiin villityypin. Sen sijaan AMDS oli selvä mutaatio signaali. Kaikki muut ristiriitainen tulokset (8 jäädytetty kudos, 6 FFPE kudokset) oli hyvin samankaltainen (tuloksia ei ole esitetty).

validointi ristiriitainen Data kloonaamalla ja sekvensointi

Kaikki näytteet, jotka oli ristiriitainen mutaatiostatuksesta riippumatta välillä AMDS ja DS todensi kloonaamalla analyysi (kuvio 3A, B). Tarkkuus kloonausta myös arvioitiin virheprosentti (ER) määritelty taajuus pohjan muutoksia liitettävän alueen joukossa poimittuja pesäkkeitä seuraavan yhtälön; ER = määrä muutoksia /[(pituus insert) x (useita onnistuneita kloonin sekvenssin)] x 100. Analysoidut kloonattu alueet eivät ole innokkaina mutaation kuin kohdennettua pistettä. Siksi pohja muutokset alkaen konsensussekvenssistä katsottiin misreadings DNA-polymeraasin. ER PrimeSTAR® GXL (0,03-0,06%), joka on 3 ’→ 5’ ekso-nukleaasiaktiivisuus, oli huomattavasti pienempi kuin GoTaq® (0,16-0,29%). Taajuus Kaikkien mutaatioiden kohteita (kuvio 3A, B) oli huomattavasti korkeampi kuin ER (

p

= 1,04 x 10

-6), mikä osoittaa, että mutaatiot näissä näytteet olivat totta mutaatioita, ja ristiriita kahden menetelmän välillä johtui alhaisemmasta herkkyydestä DS. Tässä tutkimuksessa otoskoko kelpasi, koska suurta valtaa

KRAS

,

BRAF

ja

PIK3CA

mutaation havaitseminen (

P

= 0,96, 0,97 ja 0,94 vastaavasti) mukaan AMDS (taulukko 1-3). κ kerroin testit

KRAS

,

BRAF

ja

PIK3CA

(κ = 0,91, 0,67 ja 0,70 vastaavasti) mutaatioita osoitti vähäinen sattuma välillä AMDS ja DS.

(A) kloonaus analyysitulos Frozen kudoksiin. (B) Kloonaus analyysitulos FFPE kudosten .; PCR suoritettiin jäädytettyä ID = 56756, ID = 63440 ja FFPE ID = 41947, ID = 7053306 näytteiden PrimeSTAR® GXL DNA-polymeraasilla. Muut näytteet suoritettiin PCR GoTaq® DNA-polymeraasia. Mahdolliset Mutaatiofrekvenssi näytteestä = (lukumäärä mutanttisekvenssi) /(useita onnistuneita järjestyksessä). Jos taajuus oli suurempi kuin ER, näyte pidettiin mutaatio positiivinen. Huomaa: Se ei ole vahvistettu, onko mutaatioaste näytteestä voitiin kvantitoida kloonausta analyysi. (C) Venn kaavio

KRAS

,

BRAF

ja

PIK3CA

mutaatioita. Tässä kaavio, nämä taajuudet mutaation ei lasketa näytteissä, mutta potilaille. 6 Näytteet otettiin samasta kudoksista ja varauduttu sekä jäädytettyjen ja FFPE siivu. AmdS analysoi näitä 6 näytteet osoittivat samat tulokset sekä Frozen ja FFPE siivu.

Kuva 3C on yhteenveto taajuudet mutaatioiden kaikilla potilailla (n = 153), joka perustuu AMDS havaitsemiseen. Mutaationopeudet on

KRAS

,

BRAF

ja

PIK3CA

oli 28,7% (44/153), 2,5% (4/153) ja 10,1% (16/153) vastaavasti. Taajuus rinnakkain elävien mutaatioiden

KRAS

tai

PIK3CA

oli 3,9% (6/153).

AMDS ja DS verrattiin niiden kestävyydestä mutaation tunnistus DNA-näytteistä valmistettu käyttäen erilaisia ​​menetelmiä. Qiagen kaupallinen DNA: n puhdistus Kit (QIAmp® DNA Micro Kit) käytettiin jäädytetty kudosten, ja muuta kaupallista DNA: n eristämiseksi pakki (Lyhyt ote ™) käytettiin FFPE kudoksiin. Genotyping puhelun hinnat DS oli 100,0% (89/89) ja 74,3% (52/70) pakastettuina ja FFPE näytteiden osalta, että ensimmäinen yritys; katsoo, että on AMDS oli 100,0% sekä näytejoukoille. Kuvio 4A esittää tapausta G13D mutaation havaitseminen, jossa näyte otettiin samasta potilaasta ja käsitellään sekä jäädytettyjen ja FFPE viipaleiksi. Vaikka jäädytetty näyte on selkeä elektroferogrammi, FFPE näyte osoitti meluisa signaaleja. Kahdeksantoista näytteet testattiin uudelleen DS, ja 10 näistä onnistunut. Kuitenkin 8 näytettä eivät voineet analysoida sekä eteen- että taaksepäin toistuvassa yrityksiä. Näistä 8 näytettä, 7 näytettä ei voitu analysoida

BRAF

mutaatioita, ja 1 näyte ei voitu analysoida sekä

KRAS

ja

PIK3CA

mutaatioita. Sen sijaan AMDS täydellisesti kutsutaan näiden otosten villityypin että

KRAS

,

BRAF

ja

PIK3CA

geenejä.

CRC kudoksista varauduttu sekä jäädytetty ja FFPE muodossa. Nämä näytteet analysoitiin sekä DS ja AMDS. DS epäonnistui soittaa genotyyppi FFPE kudoksen takia meluisa electrophenogram. Sama näyte uudelleen sekvensoitiin, ja kutsutaan

KRAS

villin tyypin. (B) AMDS analyysitulosten eri kokonaismäärään plasmidi-DNA. Solid symboleita (•; 100 fg /kuoppa, ▪; 10 fg /hyvin, ▴; 1fg /kuoppa) osoittavat signaalin näytteistä sisälsi 5% mutantin, ja tyhjät symbolit (○; 100 fg /kuoppa, □, 10 fg /hyvin, △; 1 fg /kuoppa) osoittavat g plasmidi-DNA karkeasti sisältävät 210 kappaletta. (C) AMDS analyysin tulokset eri määrä villityypin genomi-DNA: ta. (○; 100 ng /kuoppa, □, 10 ng /kuoppa, △, 1 ng /kuoppa).

luotettavuutta mutaation havaitsemisen monenlaisia ​​Näytepitoisuuksien testattiin myös AMDS. Kuvio 4B esittää tuloksen plasmidi-DNA kokeessa. 5% on mutantti-DNA-signaali oli selkeä erottaminen taustoja alueella 1 fg /kuoppa 100 fg /kuoppa koko plasmidi-DNA, mikä vastaa 10 kappaletta 1000 kopiota kohde-mutantti-DNA reaktiota kohden. Kopioluku 1 fg /kuoppa plasmidi-DNA: ta (210: sta) vastaa 0,63 ng /kuoppa genomista DNA: ta. Määrä genomista DNA: ta (uutettu jäädytetty kudos) käytettiin kliinisissä suorituskyvyn tutkimus oli 10 ng /kuoppa, ja joka kuuluu alueella edellä kokeen. Kuitenkin jotta voidaan tarkistaa taustan signaalitaso, lisäkokeita useita määriä ihmisen genomista DNA tehtiin. Kuva 4C osoittaa, että taustalla signaalit ovat vakaita ja lähes identtinen plasmidin DNA kokeessa (kuva 4B) varten on alueella 1 ng 100 ng kuoppaa kohti.

Toteutettavuustutkimus on täysin automatisoitu

KRAS

,

BRAF

ja

PIK3CA

mutaation havaitseminen AMDS

tässä kokeessa raakaa uuttamalla jäädytettyä kudosnäytteistä (n = 41) suoritettiin manuaalisella murskaus ja raaka homogenaatti käytettiin sitten näytteenä täysin automatisoitu mutaation analyysi AMDS.

tulokset täysin automatisoitu mutaatio analyysi olivat täysin yhtäpitävä edellisen kliinisen suorituskyvyn tutkimuksissa (taulukko 5). Lisäksi AMDS pystyi havaitsemaan kaikki mutantit (3/41), joka DS ei tunnistanut. Siten AMDS voisi tunnistaa kaikki

KRAS

(14/41, 34,1%) ja

PIK3CA

(8/41, 19,5%) mutaatioita jopa näistä homogenaatti näytteistä (~ 1 mg kudosta).

keskustelu

Tässä tutkimuksessa arvioitiin AMDS kahdessa sarjassa (Frozen ja FFPE) ensisijaisen CRC kudosten yhteensä 159 näytettä. Tuloksemme ehdotti AMDS on suurempi herkkyys ja monipuolisuutta kuin DS. Superior kyky järjestelmämme voi johtua suuren herkkyyden ( 0,5%) ja uskollisuutta Invader® kemian jotka sisältävät signaalin vahvistuksen ominaisuus [22], [23]. Tämä on erityisen tärkeää mutaation havaitsemiseen kun mutantti taso on erittäin alhainen. Tulokset on esitetty kuviossa 4B ja 4C ehdottaa AMDS voi säilyttää 5% mutaation havaitsemisen herkkyys hyvin laaja (100 omistaa) näytteen pitoisuus. Lisäksi Kotoura

et al

. aiemmin raportoitu, että PCR tehokkuus DS ja reaaliaikainen PCR-tekniikkaan perustuva määritys on FFPE-DNA-näytteet kärsimään DNA: n fragmentoituminen [27]. Kuten kuviossa 3 ja kuviossa 4A, tulokset mutaatio analyysin kautta AMDS tukivat kloonauksen tulosten ja AMDS osoitti merkitsevästi parempi DS sen herkkyyden yli monenlaisia ​​DNA määrälle erilaisia ​​kiinnitys kunnossa.

Lisäksi aMDS järjestelmä onnistunut täysin automatisoitu havaitseminen

KRAS

,

BRAF

ja

PIK3CA

mutaatiot homogenoitiin jäädytetty CRC näytteitä, mikä on edullista analysoida arvokkaita näytteitä kuten koepala kudoksiin. Mutaatio havaitseminen menettely AMDS on hyvin yksinkertainen eikä vaadi koemenetelmän ja kokemusta.

Yksi tärkeimmistä asioista on, että kloonaus analyysi, havaitsimme, että yleisesti käytetty kaupallinen Taq DNA-polymeraasi on not- niin alhainen ER, kun taas PrimeSTAR® GXL DNA-polymeraasin kanssa 3 ’→ 5’ ekso-nukleaasiaktiivisuus (oikoluku) on vähemmän ER. Siksi, kun erittäin suuri herkkyys vaaditaan määrityksessä, kuten mutaation havaitseminen soluttoman DNA verinäytteistä (seerumi tai plasma), hifi-DNA-polymeraasia voidaan käyttää.

arvioinnin tuloksena kliinistä CRC kudokset (n = 159) käyttämällä AMDS, mutaatio kuvioita havaittu omassa näytteet ovat hyvin sopusoinnussa mitä aikaisemmin raportoitu [28] – [30]. Havaitsimme hyvin mielenkiintoinen rinnakkaiselo eri mutaatioiden joukossa kolme geenejä. Esimerkiksi 6 ulos 153 näytettä (3,9%) hallussaan kaksinkertainen (yksi kolmen hengen) mutaatioita, joka tukee oletusta synergistisiä tumorigeneesin välillä

KRAS

ja

PIK3CA

[29], [31] . Lisäksi oli kaksi näytettä joilla oli molemmat

KRAS

G13D ja

PIK3CA

(E545K ja /tai E542K) mutaatioita.