Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Keuhkosyöpä on johtava syy syövän kuoleman maailmassa, ja yli 90% keuhkosyövässä ovat tupakansavun liittyviä. Nykyinen hoitovaihtoehdot ovat riittämättömiä, koska molekyylitasolla savukkeen aiheuttama keuhkosyöpä hyvin huonosti.

Menetelmät /Principal Havainnot

Tässä osoitamme, että ihmisen ensisijainen tai kuolemattomaksi keuhkoputken epiteelisolujen altistuvat tupakansavun kahdeksan päivän viljelyn lisääntyvät nopeasti, näyttää ankkurista riippumaton kasvu, ja muodostaa kasvaimia nude-hiirissä. Käyttämällä tätä mallia alkuvaiheessa savun aiheuttama kasvainten synnyssä, selvitimme molekyylimuutokset johtavat keuhkosyöpä. Havaitsimme, että alkion signalointireittejä välittämiä Hedgehog ja Wnt aktivoituvat savusta. Farmakologinen esto näistä reiteistä estetty transformoidun fenotyypin.

Johtopäätökset /merkitys

Nämä kokeet tarjota mallin, jossa alkuvaiheessa savun aiheuttama tuumorigeneesiä voidaan esiin, ja pitäisi sallia meitä tunnistamaan molekyylitason muutoksia ajo tätä prosessia. Tähän mennessä saadut tulokset osoittavat, että savu aiheuttama keuhkokasvaimia ohjaavat aktivoituminen kaksi alkion säätelyreittejä Hedgehog (Hh) ja Wnt. Tämänhetkisen ja kehittyvien huumeiden saatavuuden estävän Hh ja Wnt signalointi, on mahdollista, että ymmärrys roolin Hh ja Wnt keuhkosyövässä synnyssä johtaa uusien hoitomuotojen kehittämiseen.

Citation: Lemjabbar-Alaoui H, Dasari V, Sidhu SS, Mengistab A, Finkbeiner W, Gallup M, et al. (2006) Wnt ja Hedgehog ovat kriittiset välittäjäaineita tupakansavun aiheuttaman Lung Cancer. PLoS ONE 1 (1): E93. doi: 10,1371 /journal.pone.0000093

Academic Editor: Carl-Philipp Heisenberg, Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics, Saksa

vastaanotettu: 04 lokakuu 2006; Hyväksytty: 09 marraskuu 2006; Julkaistu: 20 joulukuu 2006

Copyright: © 2006 Lemjabbar-Alaoui et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia R01 HL075602 ja P01 HL024136 National Institutes of Health.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

The World Health Organization raportoi, että noin 1,25 miljardia ihmistä tupakoi päivittäin [1] ja että tupakointi aiheuttaa noin 10 miljoonaa kuolemaa vuodessa vuoteen 2030 mennessä [2]. Noin neljännes näistä kuolemista on keuhkosyöpä. Molekyyli patogeneesi keuhkosyöpä on edelleen epäselvä, mutta kun ymmärtää, voisi avata tien hoitoja.

Useita lähestymistapoja on käytetty arvioimaan molekyylitason patogeneesin tupakansavun aiheuttaman keuhkosyövän [3]. Eräs lähestymistapa käyttää eläinmalleissa, joissa hiiret altistetaan savulle päivittäin viidestä kymmeneen kuukauteen (katso katsaus [4]. Vaikka kasvaimia kehittyy hiirillä, perustavaa laatua vaiheet kasvainten synnyssä on jo tapahtunut ja kasvaimia näyttää lukuisia geneettisiä poikkeavuuksia. Lisäksi ei eläinlajit tupakoi tapa ihmiset tehdä. Jyrsijät, esimerkiksi, ovat velvoittanut nenä breathers, tuloksena on hyvin erilainen malli suodatuksen hiukkasten sieraimiin ja ylähengitysteiden kyseisestä tuottama suun hengitys (eli tupakoinnin ihmisellä). Näin ollen nämä

in vivo

eläinkokeissa säätää epätäydellinen malleja ihmisten altistumista. Muut tutkimukset ovat arvioineet yksittäisten maksujen erityisiä savun komponentteja, joita arvellaan vaikuttavan tupakan syövän synnyn (esim 4- (methylnitrosamino) – 1- (3-pyridyyli) -1-butanonia (NNK), [5], [6] ja bentso (a) pyreenin [7]. Tämä lähestymistapa on ongelmallinen, koska luontainen monimutkaisuus tupakansavun. Näin ollen on todennäköistä, että biologinen vaste monimutkainen seos, kuten tupakansavu ei ole vain summa useita itsenäisiä toksisuuksien.

Toinen lähestymistapa on poimia komponenttien savu pääsee savukkeista kuplittamalla läpi vesiliuoksena. Tällaiset valmisteet, joita kutsutaan savukkeen savu-uutteen (CSE), on laajalti käytetty raaka-aineena eri järjestelmissä [8], [9]. Tärkeää on, CSE sisältää suurimman yhdisteiden hengitettynä tupakoitsijoita. Siten käyttö tämäntyyppisen savua valmisteen kulttuuri on tärkeä ja hyödyllinen malli arviointia varten tupakansavun myrkyllisyyden.

Tässä tutkimuksessa olemme kehittäneet

in vitro

malli arvioimaan fenotyyppisen muutokset savun aiheuttama kasvainten synnyssä, joka on nopea, helppo ja toistettavissa määritys, jossa kasvatettiin keuhkoputkien epiteelisolujen altistetaan CSE.

tulokset

Krooninen savu altistuminen aiheuttaa fenotyyppisiä muutoksia ominaisuus kasvainsolujen

ensimmäinen jäljitteli Jatkuvasta tupakansavun altistumisen toistuvasti käsittelemällä ei-syöpä ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen BEAS-2B soluihin [10] kanssa CSE kulttuuriin. Käsittelimme BEAS-2B soluja 0-8 päivää kanssa CSE seuraa toipumisaika kolmen viikon. CSE indusoi aikariippuvainen myrkyllisyys BEAS-2B-soluja (kuvio 1A). Meillä syntyy seitsemän solupopulaatioiden, nimetty B1, B2, B3, B5, B6, B7 ja B8, joista kukin edustaa soluja, jotka pysyivät elinkelpoinen, kun määritetty altistuksen ajankohtana päivinä. B0 solut edustavat käsittelemättömiä soluja. Solu populaatioita, jotka syntyivät muutaman soluista, jotka selvisivät myrkyllisen savun vaikutukset altistumisen 8 päivää (B8 solut) hankittu fenotyypin muutoksia, jotka sisältyvät solujen lisääntymisen tehostuneen (kuvio 1 B), ja lyhyempiä kaksinkertaistaa kertaa.

Krooninen savua altistuminen aiheuttaa myrkyllisyys ja muutokset liittyy solujen transformaatio. V: Toksisuus aiheuttama savu altistumista. Esitetty viljellään BEAS-2B-soluissa, sen jälkeen 0, 4 ja 8 päivää kasvun elatusaineessa, joka sisälsi savu-uutteen. B: Proliferaatiomääritys Solulinjoihin viljeltiin 1-5 päivää, johdettu CSE-alttiina solujen 4 ajankohtina (0,3,7 ja 8 päivää). Virhe palkit kuvaavat ± SEM. * P 0,001. C: Cell-alustan adheesiomäärityksiä muoville, istukan kollageenin ja fibronektiinin käyttäen viljeltyjä BEAS-2B soluissa, kun määritetty aika pisteen päivän kasvun väliaineessa, joka sisältää savu-uutetta. Analyysit analysoitiin 60 minuutin kuluttua viljelmässä. Virhe pylväät edustavat s.e.m. n = 4 * P 0,001. D: Cell maahanmuutto määrityksiä käyttäen pysyvien solulinjojen 24 tunnin jälkeen viljelmässä. Virhe palkit kuvaavat ± SEM. n = 4 * P 0,001. E: Aktiinisytoskeletonin solulinjojen B0 ja B8 kuvattiin fluoresenssimikroskopialla käyttämällä Alexa Fluor 594 phalloidin. Mittaviivat edustaa 20 um.

CSE-altistuneet solut osoittivat laski solu-alustaan ​​tarttumista (kuvio 1 C), lisääntynyt solujen vaeltamiseen (kuvio 1 D) ja muuttunut morfologia ja solun tukirangan rakennetta. B8 solut monipuolisemman ja lisäsi yhdistäminen ja osoitti muuttunut jakelun aktiini rasitukseen liittyviä säikeitä kun värjättiin Alexa Fluor 594-konjugoidulla phalloidin verrattuna vanhempien kollegansa (B0) (kuvio 1 E). Muutoksia havaittiin myös B6 ja B7, mutta ei soluja käsitellään lyhyempiä aikoja. Yhdenmukainen nämä tiedot, RNA-analyysi PCR, vertaamalla B8 ja niiden vanhempien vastine B0, osoitti geenien aktivaation, jotka ohjaavat solujen lisääntymistä, kuten sykliini D1 ja c-myc (Kuva S1).

Krooninen savu altistuminen aiheuttaa ankkurointi riippumattaman solujen kasvua ja kasvaimen muodostumista nude-hiirissä

Koska morfologiset kasvua, tarttuvuus ja muuttoliikkeen muutokset tuottama krooninen altistuminen CSE oli muistuttavat fenotyyppien ominaisuus onkogeenisesti transformoitujen solujen, me seuraavaksi kysytään CSE-käsiteltyjen solut kykenivät kiinnittymisestä riippumattoman kasvun viljelemällä niitä pehmeässä agarissa. Olemme keskittyneet B8 soluja, jotka oli pisin altistuminen CSE. 10 päivällä, pesäkkeet CSE-altistuneet solut muodostivat pehmeässä agarissa, vahvistaa ankkurista riippumaton kasvu, kun taas B0 solut eivät muodostaneet pesäkkeitä (kuvio 2A).

Krooninen savu altistuminen aiheuttaa kasvua pehmeässä agarissa ja kasvainten muodostumisen nude-hiirissä. V: Anchorage itsenäisyys määritettiin kyky CSE-altistuneet solut voivat kasvaa pehmeässä agarissa. B0 tai B8 soluja (1 x 10

3) kasvatettiin pehmeässä agarissa 15 päivää ennen valokuvausta. Kvantifiointi pesäkkeiden näkyy oikealla. Tulokset edustavat 5 kokeiluja. B: kasvainmuodostusta nude-hiirissä, 4 viikkoa istuttamisen jälkeen B0 tai B8 soluja. Nuolet osoittavat suuri kasvain massat muodostetaan hiirissä injektoitiin B8 soluihin. C: § edustavan kasvaimen hiiren inokuloitu B8 solut värjättiin H ja E. D: Kuvia pehmytagar joissa käytetään HBE soluja jälkeen ei savua altistuksen (P0) tai talteen HBE soluja 8 päivän kuluttua CSE altistuksen (P8) . Kvantifiointi pesäkkeiden näkyy oikealla. Tulokset edustavat 5 kokeiluja. E: kasvainmuodostusta nude-hiirissä, 4 viikkoa istuttamisen jälkeen P0 ja P8 soluja. Nuolet osoittavat suuri kasvain massat muodostetaan hiirissä injektoitiin P8 soluihin. F: § edustavan kasvaimen hiiren inokuloitu P8 solut värjättiin H ja E. Mittaviivat edustaa 50 um.

Seuraava istutettu B0 tai CSE-käsitelty (B1-B8) solujen immuunivajaisiin hiiriin (nude), voiko onkogeenisel- muutos eteni aina kasvainten muodostumiseen. Kasvaimia ei muodostu myöskään 3 kuukautta nude-hiiriä, joihin injektoitiin kontrolli-soluja (B0), tai B1-B7-solujen (tuloksia ei ole esitetty) (n = 5 kussakin solulinja). Kuitenkin kaikki hiiret (n = 5), istutettiin B8 solujen kehittänyt tuumoreita, joiden latenssi ajan noin 4 viikkoa, mikä osoittaa korkea tehokkuus hiiren tuumorigeenisyyden (kuvio 2B). Histologinen luonnehdinta vahvisti, että B8 solut muodostivat karsinoomat. Kasvaimet olivat koostuu vaihtelevasti kokoinen pesiä polyhedraalisen soluja, jotka oli yhdistetty ohuilla strooman säikeitä. Nämä kasvainsolut olivat kohtalaisen pleiomorphic muotoja pyöreästä venyttää. Tumat näkyvä ja usein useita. Mitoosi lukuja selvästi nähtävissä (kuvio 2C). Perustimme neljä kasvainsolulinjoissa päässä B8 kasvaimia kuvatulla Materiaalit ja menetelmät. Kun nämä solut ympättiin nude-hiiriin, ne muodostivat kasvaimia injektoitiin sivusto, jossa on lyhyempi latenssi (1-2 viikkoa) kuin vanhempien solut (tuloksia ei ole esitetty).

savu altistuminen aiheuttaa muutosta ihmisen ensisijainen epiteelisolujen solut

Koska BEAS-2B on SV40-kuolemattomaksi keuhkoputken epiteelisolujen linja, me kysyi onko savun aiheuttamat muutokset havaitaan BEAS-2B soluja voitaisiin jäljentää ensisijainen ihmisen keuhkoputken epiteelisoluissa (HBE). CSE altistumisen seurauksena nopea muutos primaarisissa HBE-soluissa vahvisti molemmat

in vivo

ja kulttuurin kokeiluja. Me eristetty solulinjoja HBE altistua savulle varten 0-8 päivää ja nimetty ne P0-P8. P8 solut hankittu kyky kasvaa pehmeässä agarissa, kun taas valottamattomat ohjaus solut eivät (kuvio 2D). P8 soluja, mutta ei niiden vanhempien kollegansa P0, osoitti geenien aktivaation, jotka ohjaavat solujen lisääntymistä, kuten sykliini D1 ja c-myc (Kuva S1). Tärkeää on, kahdeksan päivän altistumisen CSE oli riittävä tuottamaan pahanlaatuinen transformaatio HBE solujen P8 solut muodostivat kasvaimia paljaissa hiirissä 5 viikkoa ymppäyksen jälkeen, kun taas valottamattomat P0 kontrollisolut eivät (kuvio 2E ja 2F). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että CSE voi muuttaa ei-syöpä ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen syöpä fenotyypin.

CSE indusoi Wnt ja Hedgehog signalointireittien

tutkimme seuraavaksi mahdollisia molekyylitason mekanismit siirtymisen kasvaimen kasvua aiheuttama altistuminen CSE. Sopimaton uudelleen aktivoituminen alkion signalointireittien aikuisten solujen, kuten Wnt [11], Hedgehog [12] ja Notch [13], voi tarjota voima kasvaimen kasvua. Siksi me testattiin Wnt, Hedgehog ja Notch aktiivisuus käyttämällä lusiferaasia Toimittajat reagoivat transkriptiotekijät edustavat distaalisen efektorihaaran kunkin koulutusjakson, työllistää TOPFLASH, Gli-lusiferaasi ja Hes-lusiferaasi toimittajille vastaavasti.

Huomasimme, että suuruus TOPFLASH reportteri lisääntyi progressiivisesti savulla altistuminen 1-8 päivää (kuvio 3A), jossa B8 solujen osoittaa 25-kertainen induktio verrattuna B0 soluihin. Gli-lusiferaasireportteri aktiivisuus kasvoi myös pitkäaikainen altistuminen aikaa CSE, jossa B8 solujen antamalla 7-kertaiseksi induktio yli B0 soluja (kuvio 3B). Sen sijaan, CSE-altistus ei ollut vaikutusta Hes1-lusiferaasiaktiivisuutta (kuvio 3C), mikä osoittaa, että Notch jaksoa ei aktivoida CSE-altistetuissa soluissa.

Krooninen savu altistuminen aiheuttaa Wnt ja Hedgehog signalointireitteihin : Wnt signalointi määritys savun alttiina Beas-2b solupopulaatioiden transfektion jälkeen TOPFLASH /FOPFLASH lusiferaasireportterilla konstruktioita. B: Beas-2b-solut transfektoitiin Gli-TK tai TK yksin määritystä Hh-signalointia. C: Notch signalointi määritystä Beas-2b-soluissa käyttäen HES lusiferaasireportterilla. D, E ja F: Sama kuin A, B ja C, käyttäen HBE solupopulaatioiden. Virhe palkit kuvaavat ± SEM. n = 6 * P 0,001.

Nämä kuviot reportteri aktiivisuutta myös monistaa kokeisiin suoritettiin ensisijainen HBE solujen altistuvat CSE. Molemmat TOPFLASH (kuva 3D) ja Gli (kuvio 3E) reportteri lisääntyi progressiivisesti savulla altistuminen P1 P8, kun taas ei havaittu merkittäviä eroja havaittiin HES-1 lusiferaasiaktiivisuutta (kuvio 3F).

Varmista, että reportteriaktiivisuutta heijastuu lisääntynyt Wnt signalointia tutkimme subsellulaariseen sijainti β-kateniinin. Yhdenmukainen aktivoidun Wnt /β-kateniinin reitin, havaitsimme ydin- kertymistä β-kateniinin B8 ja P8 solujen immunosolukemiallisella (kuvio 4A ja B). Lisäksi immunosolukemiallisella oli ilmeistä, että Gli1 siirtämisellä on tumien B8 ja P8-solut, jotka osoittavat Hh-reitin aktivaatio (kuvio 4C ja D).

Wnt ja Hedgehog signalointi liittyvät fenotyyppisiä muutoksia, jotka indusoitiin krooninen tupakansavulle altistamista. V: Immunovärjäys osoittaa kohonnut β-kateniinin (vihreä) tumassa B8 solujen verrattuna B0 soluihin ja B: tumassa P8 solujen verrattuna P0. C: Immunovärjäys osoittaa lisääntyneen ilmentymisen Gli (punainen) tumassa B8 solujen verrattuna B0 soluihin ja D: in P8 soluissa verrattuna P0. Scale palkki edustaa 20 um.

Koska Wnt ja Hh reitit ovat tärkeitä alkion ja kantasolujen kehittämiseen, kysyimme, onko alkion markkereita otettiin uudelleen sen jälkeen, kun kroonista CSE altistumista. Varsinkin CSE-transformoidut HBE ja BEAS-2B solut ilmensivät kaksi kantasolu-markkereita, Stellar ja Oct4 [14] (kuva S2). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että krooninen CSE altistuminen indusoi alkion Wnt ja Hh signalointireittien samalla, että solut saavat kyvyn kasvaa pehmeässä agarissa ja muodostaa kasvaimia nude-hiirissä.

estäjät Wnt ja Hh vaikuttaa transformaation CSE

vieressä käytettiin estäjät onko nämä aktivoituvat signalointireittejä vastasivat toiminnalliset muutokset CSE transformoitujen keuhkoputken solujen. Hh-reitin-spesifinen estäjä, syklopamiinilla merkittävästi tukahdutti kyky B8 ja P8-solut muodostavat pesäkkeitä pehmeässä agarissa (kuvio 5A ja B). Sulindaakki, joka on Wnt reittiin erityisiä estäjä, vähensi myös pesäkkeiden muodostumista, mutta oli hieman vähemmän tehokas kuin syklopamiinihoidon. Sitä vastoin, tomatidine, inaktiivinen syklopamiini analoginen, NS-398 (COX-2-esto) ja GSI (voimakas Notch estäjä) ei ollut vaikutusta.

estäjät Hh ja Wnt signalointia estetty ankkurista riippumaton kasvu ja solujen liikakasvuun CSE alttiina solujen. V: Kyky kroonisten savua altistuneet solut (B8), tai B: (P8), kasvaa pehmeässä agarissa 15 päivää määritettiin hoidon jälkeen tomatidine syklopamiini, sulindaakki, NS398, GSI tai ajoneuvon ohjaus. Kvantifiointi pesäkkeiden näkyy oikealla. Tulokset edustavat 5 kokeiluja. C: B0 ja B8 viljelmässä hoidon jälkeen tomatidine, syklopamiini, sulindaakilla tai ajoneuvon ohjaus.

hoito B0 solujen yksikerrosviljelmässä syklopamiinilla tai sulindaakki ei muuttanut muutoksia solutiheyden tai morfologiaan kuluttua 6 päivän viljelyn verrattuna kontrolleihin, jotka sisälsivät käsittelemättömiä soluja tai käsitelty tomatidine, NS- 398 tai GSI (kuvio 5C). Sen sijaan havaitsimme selvä vähentäminen solutiheyden B8 käsitellyissä soluissa syklopamiinilla tai sulindaakki, verrattuna käsittelemättömiin soluihin tai solut, joita käsiteltiin tomatidine. Solut, jotka käsitelty NS-398 tai GSI (tietoja ei esitetty) olivat ennallaan. Valtaosa syklopamiinilla käsiteltyjen B8 solut irrotettiin viljelylevyssä hoitojakson aikana, ja muutama jäljellä solut näyttivät aplastinen, eli jossa ei ole kasvua tai muutosta rakenteeseen. Siten ankkurointi itsenäinen ja yksikerroksista kasvua CSE-transformoitujen solujen edellyttää Hh-reitin ja vähemmässä määrin Wnt-reitin. Voit selvittää vaikutusmekanismia Wnt ja Hh-reitin inhibiittorit, arvioimme leviämisen, elinkelpoisuuden ja apoptoosin (kuvio S3 ja S4). Käyttämällä BrdU ja solujen elinkelpoisuuden määritykset mitata soluproliferaation ja anneksiini määrityksiä arvioida apoptoosin, huomasimme, että kumpikaan syklopamiini eikä Sulindaakilla tuotettu muutoksia B0 soluissa. Kuitenkin syklopamiini indusoi merkitty apoptoosin B8 soluissa, joka liittyy merkittävä väheneminen solujen lisääntymisen. Sulindaakilla indusoi vaatimaton, mutta merkittävää kasvua B8 apoptoosia (vaikkakin vähemmän kuin syklopamiinia) ja vähentää solujen lisääntymistä. Ohjaus hoitoja ohjaus alustalla, joka sisälsi tomatidine tai DMSO yksin olivat ilman vaikutusta. Nämä tulokset vahvistavat tätä päätelmää aktivointi alkion polkuja Wnt ja Hh, mutta ei Notch, ovat merkittävä tekijä leviämisen ja selviytymistä CSE-transformoitujen solujen.

Lisäksi hoito joko syklopamiinia tai sulindaakki poistettava transkription aktiivisuus Wnt-reitin määrittää TOPFLASH aktiivisuus B8-soluissa (kuvio 6A), mutta ei ollut vaikutusta in B0-soluissa. Tomatidine käsiteltyjä soluja ei osoittanut merkittäviä muutoksia TOPFLASH aktiivisuuden verrattuna käsittelemättömiin soluihin. Tärkeää on, vaikka syklopamiinihoidon aiheutti merkittävä väheneminen Hh-reitin transkription aktiivisuutta mitattuna Gli-lusiferaasin aktiivisuuden B8 soluissa, sulindaakki eteen vaikutusta TOPFLASH aktiivisuutta (kuvio 6B). Kumpikaan lääke vaikuttaa B0 soluja. Nämä tiedot viittaavat siihen, että Hh-reitin voi toimia ylävirtaan Wnt väylän B8 soluissa.

esto Wnt ja Hedgehog signalointi pienentää kasvaimen kokoa nude-hiirissä V: Vaikutus Wnt ja Hh-inhibiittoreiden vaikutusta Wnt signalointia B0 vs . B8-soluihin käyttäen TOPFLASH /FOPFLASH lusiferaasireportterilla konstrukteja. B: Vaikutus Wnt ja Hh estäjien on Hh-signalointi B0 vs. B8 transfektoitujen solujen Gli-TK tai TK yksin. C: Havainnollinen kasvaimet irrotettiin hiirissä ei käsittelyä (Con) tai 15 päivän kuluttua hoidon lääkkeitä ilmoitettu. Kuvaajat osoittavat vertailu kasvaimen tilavuus (cm

3) ja paino (g). Veh on ajoneuvo yksin. Virhe palkit kuvaavat ± SEM. n = 5 * P 0,001. D: H ja E värjäys edustajan kasvainten muodostettu hiirissä injektoitiin B8 soluja ja lääkkeillä kuten.

CSE-käsiteltyjen HBE soluista osoitti myös valotusajan riippuvaa aktivointi Hh ja Wnt signalointireitteihin reportterigeenin määritykset (kuvio 3) ja ydin- kertyminen β-kateniinin ja Gli1 (kuvio 4). Jälleen inhibiittorit Hh ja Wnt signalointia, mutta ei Notch signalointi-inhibiittorit (kuvio 5B ja kuvio S5) esti niiden kiinnittymisestä riippumatonta kasvua ja solujen hyperproliferaatio. Nämä tulokset osoittavat, että transformoidun fenotyypin savun transformoitujen ensisijainen HBE soluja on myös Hh ja Wnt signalointia riippuvainen.

Hoito estäjiä Wnt ja Hedgehog polkuja vähentää kasvainten kasvua, jotka johtuvat savun transformoidut keuhkoputken epiteelisolujen hiirissä

jälkeen määritetään, jos estävä Wnt ja Hh polkuja vaikuttaisi

in vivo

tuumorien kasvun aiheuttama CSE-transformoidut solut. Nude-hiiriin, joilla on todettu ihonalainen ksenograftikasvaimissa peräisin B8 solut osoittivat 80% ja 92%: n lasku kasvaimen massan ja tilavuuden osalta sen jälkeen, kun 15 päivää on syklopamiinihoidon verrattuna hoitamattomaan verrokkiryhmään ja ajoneuvon käsitellyssä ryhmässä (kuvio 6C). Samoin, havaitsimme 53% ja 72%: n lasku kasvaimen massan ja tilavuuden vastaavasti sulindaakki-käsitellyissä eläimissä verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin. Lisäksi samanaikainen hoito sulindaakki ja syklopamiinia (molemmat estäjiä käytettiin puolet pitoisuuden käytettiin edellisissä kokeissa), johti huomattavasti suurempi vähennys CSE transformoitujen solujen lisääntymistä, verrattuna yhden hoitoihin kunkin inhibiittorin (kuva S6). Histologinen analyysit korjatun kasvainten paljasti fibrotic rappeutumista kasvaimia sekä syklopamiinilla ja sulindaakkia testiryhmään (kuvio 6D). Nämä kasvaimet osoittivat löysä epiteelin aggregaatteja, joiden suuri määrä välissä mesenchyme. Kasvaimet alkaen käsittelemättömiä kontrolleja tai ajoneuvon hoidettujen eläinten paljasti tiiviiksi massaksi epiteelisolujen. Nämä kokeet osoittivat, että alkion signalointireittejä Hh ja Wnt vaikuttavat merkittävästi lisääntymistä, eloonjääntiä ja kasvainten muodostumisen CSE-transformoitujen BEAS-2B-soluja.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että krooninen altistuminen tupakansavulle purkaa helposti voi vahingoittaa keuhkojen epiteelisolujen asiakkuutta hyperplasic kasvu, pahanlaatuinen solujen transformaatio ja syövän syntymistä. Tuloksemme osoittavat, että ensisijainen ihmisen keuhkoputken epiteelisoluissa ja SV40-ikuisti BEAS-2B solujen elossa 8 päivää toistuvan CSE altistuksen ovat varustettuja fenotyyppisiä muutoksia, jotka ovat ominaisia ​​syövän syntyyn: muutoksen kasvukinetiikat, lisääntynyt solujen lisääntymisen, laski solu-alustaan ​​tarttumista , lisääntynyt liikkuvuus aktiivisuus ankkurista riippumattomaan kasvuun, ja ennen kaikkea, kyky tuottaa kasvaimia paljaissa hiirissä. Osoitamme ensimmäistä kertaa, että krooninen CSE altistuminen voi tehokkaasti muuntaa ei-syöpä ensisijainen ja ikuisti ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen

in vitro

osaksi syöpä fenotyyppi. Tämä lähestymistapa tarjoaa uuden työkalun tutkia kehittämiseen keuhkotuumoreiden.

Kasvaimen eteneminen tapahtuu yleensä ajallisesti ja paikallisesti limitysvaiheissa, joka koostuu syöpää edeltäviin liikakasvun, dysplasia, karsinooma

in situ

, ja invasiivisia syöpä [15]. Savun vaikutukset altistumisen esiintyy myös vaiheittain. Kun savu altistuminen ensin nähdä hyperproliferaatio keuhkojen soluja. Aikaisemmissa työtä me todettu, että tämä soluhyperplasiaa oli aikaansaama savu aiheuttama aktivointi kasvutekijän reseptori [16]. Tuloksena keuhko soluhyperplasiaa on haitallista, koska additiotuotteiden aiheuttama savu karsinogeenien tuottaa mutaatioita aikana DNA: n replikaatiota. Olemme myös havainneet, varhaisen induktion ilmentymisen onkoproteiini Bcl2, anti-apoptoottisen proteiinin, joka säätelee solujen eloonjäämistä (julkaisematon havainto). Yhdessä nämä tiedot dokumentoitu savun aiheuttama muutos normaalien keuhkoputken epiteelisolujen tuumorigeenisiä soluja järjestelmässämme.

Aberrant aktivoituminen kehitykselliset polut Hh ja Wnt on liitetty syövän kasvua [11], [17 ]. Keuhkoissa, nämä reitit pelata monitahoinen rooli; niiden aktivointi on kriittinen keuhkojen kehitykseen, kun taas niiden purkamista voi johtaa tulehdussairaudet kuten keuhkofibroosia ja syöpä muutosta. β-kateniinin on keskeinen toimija Wnt koulutusjakson, lähettävät Wnt signaaleja tumaan ja kriittisesti myötävaikuttaa kasvaimien syntyyn aktivoimalla onkogeenien (esim sykliini D1 ja c-myc) tai oman satunnaista mutaatiota (tarkistetaan [18]. Tärkeää Wnt /β-kateniinin komponentit ovat usein mutatoitunut tai yli-ilmennetään keuhkosyövän soluja ja niiden esto indusoi apoptoosia näissä soluissa [19], [20].

Aiemmat tutkimukset osoittivat, että akuutti hengitysteiden epiteelin palautuminen johtaa laajaa aktivointi ja intraepiteelinen Hh signalointi, kuten on esitetty selvästi ekspression sekä Hh-ligandien ja Gli transkriptiotekijä, joka on efektori komponentti Hh-signaloinnin nisäkkäissä [11]. ihmisissä, pienisoluinen keuhkosyöpä, tappava hengitysteiden pahanlaatuisuuteen liittyy voimakkaasti tupakansavun altistumisen, riippuu aktivointi Sonic Hh-reitin [11]. Tämä toteutustapa aktivoituu myös ihmisen keuhkojen levyepiteelikarsinooma karsinoomat ja jotkut keuhkojen adenokarsinooman aiheuttaman tupakansavun altistus [12], [21].

Tuloksemme osoittavat, että CSE altistuminen aktivoi Wnt /β-kateniinin ja Hh signalointi keuhkoputken epiteelisoluissa. Lisäksi stimulaatio näistä reiteistä samaan aikaan kuin vaihe, kun solut saavat kyvyn kasvaa pehmeällä agarilla ja muodostaa kasvaimia karvattomissa hiirissä. Hoito Näiden transformoitujen solujen Hh tai Wnt estäjät estetty pesäkkeiden muodostumisen pehmeässä agarissa, ja hiiret inokuloitiin savun transformoidut solut osoittivat rappeutumista kasvaimia käsiteltiin joko näistä estäjiä. Nämä tulokset viittaavat siihen, että Wnt /β-kateniinin ja Hh polkuja olla kausaalinen rooli aloittamisen, huolto-, leviämisen ja selviytyminen CSE-transformoitujen epiteelisolujen.

Meidän tutkimukset, Wnt-reitin aktivaatio näyttää ennen Hh reitin aktivointi aikana krooninen CSE altistuksen päätellyt havaintojen syklopamiinihoidon vähensi voimakkaasti Wnt signalointi aktiivisuutta näissä soluissa, mutta käsittely sulindaakilla ei vaikuttanut Hh signalointia. Lisäksi Hh reitti näyttää olla suhteellisesti vahvempi asema kuin Wnt signalointia ylläpito solujen lisääntymisen ja solujen eloonjäämistä CSE-transformoiduissa soluissa.

Näin tietomme kannattavat hierarkkinen ja yhteisvaikutukset suhde Hh ja Wnt signaalireaktioteissä tupakansavun aiheuttaman keuhkosyöpä. Tämä poikkeaa tuoreessa raportissa, että Intian Hh antagonisoi Wnt signalointia erottamaan paksusuolen epiteelin ja paksusuolen syövän soluja [22]. Siten erilliset suhteet voivat olla välillä alkion etenemistapa erilaisia ​​kasvaimia.

Yksi tärkeä mutta ratkaisematon kysymys on, aktivointi näiden alkioiden reittejä riittää aiheuttamaan keuhkosyöpään kehitystä.

tulokset osoittavat, että Wnt -systeemi aktivoituu soluissa altistua savulle lyhyempiä aikoja (≥2 päivää) (kuvio 3A ja D). Kuitenkin vain 8 päivää savua altistuneet solut kykenivät kiinnityspisteen riippumattomaan kasvuun ja kasvainten muodostumiseen in vivo. Nämä tulokset osoittavat, että Wnt-reitin aktivaatio ei yksin riitä indusoimaan täyden pahanlaatuisiin normaalien keuhkojen solut. Tästä samaa mieltä, se on osoitettu, että Wnt polku on edistää tekijä ihmisen papilloomaviruksen (HPV) aiheuttama ihmisen keratinosyyttien pahanlaatuisiksi. Kuitenkin, tämä tutkimus osoitti myös, että aktivointi Wnt-reitin ilman HPV ei ollut riittävä aiheuttamaan pahanlaatuisiksi [23].

data osoittaa myös, että Hh aktivoituminen tapahtuu soluissa toistuvasti alttiina savua varten ≥ 7 päivää kuolemattomaksi BEAS2B soluissa ja ≥2 päivää ensisijainen HBE-soluissa (kuvio 3B ja E). Vaikka solujen lisääntymisen ja säilymisen näiden solujen tarvitaan Hh aktiivisuuden (tuloksia ei ole esitetty), ei ole kasvaimia syntyä myös sen jälkeen, kun 3 kuukautta nude-hiiriä, joihin injektoitiin B0-B7-solujen tai P0-P7-soluja (tietoja ei esitetty). Kuitenkin kaikki hiiret istutettu B8 tai P8 solujen kehittynyt kasvaimia. Nämä havainnot väittävät myös, että Hh aktivointi ei riitä aiheuttamaan täynnä pahanlaatuisiin keuhkojen soluja.

Yhdessä meidän havainnot viittaavat siihen, että vaikka aktivointi kanoninen Wnt ja Hh-reitin tarvitaan kasvaimien synnyn, muun savun aiheuttama genotyypin muutoksia on tehtävä myös syntynee koko pahanlaatuisiin keuhkojen soluja.

Lopuksi tuloksemme osoittavat, että CSE-transformoidut solut ilmentävät kantasolu-markkereita. Viimeaikaiset todisteet viittaavat siihen, että kantasolut voivat olla peräisin mutantti- soluja, jotka aiheuttavat kasvaimia ja ylläpitää niiden kasvua [24]. Kasvaimet voi syntyä ja kasvaa seurauksena muodostumista syövän kantasoluja, joka tosin voi käsittää vain vähemmistö solujen sisällä kasvain, voi kuitenkin olla kriittinen sen leviämistä. Tämä nostaa esiin mahdollisuuden, että CSE altistuminen voi kohdistaa kantasoluja tai aiheuttaa syövän kantasolujen muodostumista. Lisätutkimukset ovat tarpeen testata tätä hypoteesia.

Nämä havainnot esiin mahdollisuuden, että Wnt ja Hh-reitin inhibiittorit voivat olla pohjana uusille terapeuttisten hoitoon tupakoinnin aiheuttamien keuhkosyöpä.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen linja BEAS-2B (saatu ATCC) käytettiin näissä tutkimuksissa. Nämä solut ovat kiinnittymisestä riippuvaisia ​​ja ei-tuumorigeenisiä nude-hiirissä. BEAS-2B-soluja kehitettiin transformoimalla SV40: n suuren T-antigeenin. BEAS-2B-soluja ylläpidettiin RPMI 10% naudan sikiön seerumia ja 1% (v /v) 10000 yksikköä /ml penisilliiniä /streptomysiiniä atmosfäärissä, 5% CO

2 37 ° C: ssa.

Ensisijainen ihmisen keuhkoputken epiteelin (HBE) soluja käytettiin myös näissä tutkimuksissa. Me primaarinen (P0) viljelmiä kuin solut maljattiin suoraan eristämisen jälkeen. Keuhkoputken epiteelisolut eristettiin käyttäen aikaisemmin kuvattuja menetelmiä [25], [26].