Krooninen sairaus

tiivistelmä

Krysotiililla on yksi kuudesta asbestityypit, ja se on ainoa, joka voi vielä kaupallistaa monissa maissa. Altistuminen muunlaisia ​​asbestia on liittynyt vakavia sairauksia, kuten keuhkokarsinoomia ja keuhkopussin mesotelioomatapausten. Yhdistyksen krysotiilin altistuksen tauti on kiistanalainen. Kuitenkin

in vitro

tutkimukset osoittavat mutageenista potentiaalia krysotiili, joka voi aiheuttaa DNA: n ja soluvaurioita. Tässä työssä pyrittiin analysoimaan muutoksia keuhkojen pienisoluisen karsinooman viljelmät kuluttua 48 h krysotiilin altistumisen jälkeen 2, 4 ja 8 päivää elpymisen kuidun viljelyalusta. Jotkut muutokset, kuten aneuploidi solujen muodostumista, lisääntynyt solujen määrä G2 /M vaiheessa ja solujen moninapainen mitoosin havaittiin jopa 8 päivän kuluttua elpymisen. Läsnäolo krysotiilikuitujen soluviljelmissä havaittiin ja solujen morfologia havaittiin laserkeilauksen konfokaalimikroskopialla. Kun 4 ja 8 päivää elpymisen, vain muutaman krysotiilille fragmentit olivat läsnä joissakin soluissa, ja solujen morfologia oli samanlainen kuin kontrolli soluja. Transfektoitu GFP-merkittyjä α-tubuliinin plasmidi käsiteltiin krysotiiliasbestille 24 tai 48 tuntia ja solut moninapainen mitoosin havainnoitiin nopeutus mikroskoopilla. Kohtalot näitä soluja perustettiin: kertyminen metafaasissa, solukuoleman, etenemisensä M vaihe tuottaa enemmän kuin kaksi tytärsoluksi tai solufuusio telofaasin aikana hitaasti liikkuvista tai sytokineesiin. Jotkut niistä liittyivät muodostumista aneuploidi solujen tai solujen epänormaali määrä sentrosomien.

Citation: Cortez BDA, Quassollo G, Caceres A Machado-Santelli GM (2011) kohtaloa Krysotiililla aiheuttama Moninapainen mitoosin ja aneuploidi väestö viljellyissä Keuhkosyöpä solut. PLoS ONE 6 (4): e18600. doi: 10,1371 /journal.pone.0018600

Editor: Robert Qi, Hong Kong University of Science and Technology, Hong Kong

vastaanotettu: 30 marraskuu 2010; Hyväksytty: 07 maaliskuu 2011; Julkaistu: 05 huhtikuu 2011

Copyright: © 2011 Cortez et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Fundação de Amparo Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP, ja Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq, Brasilia ja avustuksia Agencia Córdoba Ciencia ja MINCyT (PICT 815 ja PME), Argentiina. BAC oli kaveri Red de MacroUniversidades de America Latina y el Caribe aikana oleskeluaan Argentiinassa. GQ on tohtorin stipendiaatille FONCyT (Argentiina). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Asbesti on silikaatti mineraali jaettu kahteen pääryhmään – kiemurtelee ja amphiboles. Amfiboliryhmään kuituja käytettiin yleisesti kaupallisissa sovelluksissa kunnes yhdistys amfiboli altistuksen useita vakavia sairauksia, kuten asbestoosi, keuhkoputken syöpä ja pahanlaatuinen mesoteliooma keuhkopussin ja vatsakalvon [1], [2]. Nykyisin amfiboli kuituja ei voida käyttää monissa maissa ja on korvattu krysotiili, kiemurteleva asbestia, joka pidetään vähemmän haitallisia ihmisten terveydelle.

Krysotiililla muodostuu kaareva silken kuituja, joiden pieni poikkileikkaus (80 130 Å), ja putkimainen rakenne. Sen poistuminen keuhkokudoksesta on nopeampi kuin amfiboli kuituja, ja krysotiilille ei kerry keuhkoissa vuoksi järjestelyihin pirstoutuminen kuitujen pätkiä [3].

johtavien mekanismien kehittämiseen sairauksia, kuten karsinoomat ja mesotelioomatapausten jälkeen asbestille altistumisen ei ymmärretä hyvin. Kuitenkin mutageenisia ja sytotoksisia vaikutuksia asbestia on osoitettu tutkimuksissa, joissa käytettiin viljellyissä soluissa alttiina erilaisille asbestikuitujen pituus vaihtelee 1 tunnista 72 tuntiin.

altistaminen viljeltyjen solujen asbestille johtaa muodostumiseen oxyradicals ja vapaita radikaaleja, jotka vahingoittavat DNA [4], [5], [6]. On osoitettu, että altistuminen viljeltyjen solujen krysotiilille voi aiheuttaa kaksinkertaisen säikeen katkoksia DNA kuluttua 3 ja 24 h [7], [8] ja voi myös aiheuttaa kromosominvälinen poistot ja DNA mutaatiot [9]. Krysotiili aiheuttama DNA-vaurioita voi laukaista apoptoosin erilaisissa solutyypeissä seuraavat 3-4 tuntia altistuksen [8], [10].

Mikrotumat havaitaan myös, kun krysotiilille hoidon [11]. Nämä kromatiinin elimet, jotka sisältävät acentric kromosomi fragmenttia tai kokonaisen kromosomin joka irrottaa metafaasivaiheen levy, voidaan generoida jälkeen kromosomin hajoamista ja mitoosi häiriöitä, kuten moninapaista karat. Siksi tiedot viittaavat siihen, että krysotiilin voivat aiheuttaa DNA säikeen katkoksia ja häiritä mitoosi karat.

Cell cycle häiriöt soluissa alttiina krysotiilille tutkittiin virtaussytometrialla, ja monimutkaisia ​​muutoksia havaittiin. Solut käsiteltiin krysotiiliasbestille varten 4-48 tuntia osoitti G2 /M säilyttäminen ja määrän väheneminen S-vaiheessa olevien solujen, jonka tunnuksena BrdU [12].

Mitoottista jako seuraava asbestille altistumisen havaittiin myös nopeutus ja konfokaalimikroskopialla. Joitakin muutoksia havaittiin, kuten vikoja karan muodostumiseen ja epäonnistuminen sytokineesiin läsnäollessa sisäistetty kuituja. Nämä kokeet osoittavat, että pitkiä kuituja voidaan välissä tytärsolut telofaasin aikana hitaasti liikkuvista ja johtaa sytokineesi vika, tuottaa monitumaisia ​​ja aneuploidi soluihin [13], [14]. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin soluissa, jotka altistettiin hiilinanoputkia. Nämä solut osoittivat häiriöistä sentrosomien ja mitoosi karat, mikä viittaa siihen, että nanoputket voivat häiritä mikrotubulusten ja moottori proteiinit [15].

aneuploidi solut ominaista epänormaali DNA sisällön takia lasku tai nousu kokonaisia ​​kromosomeja tai osaa kromosomeja, ja suurin osa kiinteiden kasvainten sisältävät aneuploidi soluja [16], [17], [18]. Aneuploidy voi johtua virheitä solusyklin virheet mitoosi tarkistuspisteitä, jotka mahdollistavat DNA-vaurioita tai replikaation virheiden välitetään tytärsoluihin, virheitä kromosomi eriytymistä ja sytokineesi, mikä voi johtua sentrosomimäärän vahvistusta ja muodostumista moninapaista karat [19 ].

vuonna 1914 Boveri mainittu aneuploidiaa syynä syövän, mutta myöhemmin löytö onkogeenien ja tuumorisuppressorigeeneille johtanut uuden teorian, jossa mutaatioiden sellaisista geeneistä oli syynä pahanlaatuisiin [20]. Keskustelua on jatkunut, ja nykyään aneuploidiaa katsotaan olevan osallisena syövän etenemiseen, poistaminen tai aloittamista [21], [22], [23]. On kuitenkin selvää, että aneuploidia- voi mutaatioita, jotka aiheuttavat pahanlaatuisiksi ja johtavat geneettinen epävakaus [24].

Tämä työ keskittyy muodostumista aneuploidi solujen altistuksen jälkeen kolmella eri pitoisuuksia krysotiilikuitujen , jota seurasi pitkä palautumisaika kuitu-väliaineessa. Analysoimme myös solusyklin häiriöitä, jotka voivat olla mukana aneuploidi solujen muodostumista, vertaamalla muutoksia löytyy normaaleissa ja syöpäsoluja altistetaan krysotiilin. Moninapainen mitoosien myös seurata määrittämään kohtalot näiden solujen ja niiden osuutta aneuploidi solujen muodostumista.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

HK2 soluja (solulinjassa perustettu ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä) [25] ja VERO-soluja (epiteelin, joka on peräisin apinan munuaisen – ATCC CCL-81) viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen Minimum Essential Medium (Sigma), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, kosteutetussa ilmakehässä 5% CO2, 37 ° C: ssa.

Krysotiililla hoito

Krysotiililla 5R (Quebec Standard) saatu SAMA Mineração de AMIANTO Ltda (Minaçu, GO, Brasilia) ystävällisesti toimittanut Dr. Flavia M. Cassiola. Kuidut pestiin vesijohtovedellä ja aktivoidaan sonikoimalla kontrolloidussa pH: ssa (7,4), kuten muualla on kuvattu [26]. Hoitoon solut entsymaattisesti poistettiin pulloista ja maljattiin 35 mm halkaisijaltaan ruokia (2,10

5 solua /malja). 24 tunnin kuluttua viljelmän elatusaine vaihdettiin 2 ml: aan tuoretta kasvualustaa krysotiilikuitujen on approksimoitu lopulliseen konsentraatioon 250 ug /ml, 125 ug /ml tai 62,5 ug /ml, on alempi kuin useimmat

in vivo

tutkimuksissa (10-17 mg /m

3). Kuidut ollut kosketuksissa solujen kanssa ajaksi 24 h tai 48 h, jonka jälkeen väliaine vaihdettiin. Jälkeen jaksoina 2, 4 tai 8 päivää normaaleissa väliaineessa solut pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBSA) ja kiinteitä. Aikana kaikki hoidon elatusaine täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, ja vaihdetaan joka 2 päivä aikana toipumisaika.

DNA: n kvantifiointiin

ydinvoiman DNA-pitoisuus krysotiilin käsiteltyjen ja kontrolli HK2 solujen kvantifioitiin kuva-analyysi ohjelmiston CIRES (Cell Image Retrieval ja arviointijärjestelmä-Kontron Eletronik) asennettu Axioskop (Zeiss). Analyysiä varten, tumat värjättiin Feulgen reaktio [16]. Krysotiili käsittelyt tehtiin käyttäen kolmea eri kuitujen pitoisuudet (250 ug /ml, 125 ug /ml, 62,5 ug /ml), ja sen jälkeen 48 h hoidon käytettiin kolmea eri aikoina elpymisen kuidun viljelyalusta: 2, 4 ja 8 päivää. Neljäsataa ytimiä mononucleated, binucleated ja monitumaiset olivat itsenäisesti analysoitiin ohjaus ja krysotiilille käsiteltyjä soluja. Kasvainsolujen yleensä geneettiset muutokset ja useimmat niistä ovat hyperdiploid. Koska HK2 on

in vitro

vakiintuneesta solulinjasta, diploidinen ryhmä määriteltiin huippu G0 /G1 histogrammit ja tetraploidi ryhmä määritettiin kaksinkertaisella DNA sisällöstä.

virtaussytometria

solusykli analysoitiin virtaussytometrialla käyttäen Guava System. Analysoitiin ohjaus ja krysotiiliasbestin (125 ug /ml) käsiteltyjä soluja 48 h ja talteen normaalissa alustassa 2, 4 ja 8 päivää. Analyysiä varten solut käsiteltiin trypsiinillä, niitä pyöritetään (1000 rpm 10 min), pestiin PBSA ja kiinnitettiin metanoli: PBSA (3:01) 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Sitten solut sentrifugoitiin, pestiin PBSA ja inkuboitiin liuoksen kanssa, jossa oli 200 ui PBSA: ta, 20 ui RNaasi ja 20 ui propidiumjodidia 1 h. Se analysoitiin 5000 solusta jokaista koetilalle.

Immunoflurescence: mitoosi-indeksi, Cell morfologia ja läsnäolo Kuidut

HK2 soluja käsiteltiin 125 ug /ml krysotiilin 24 tunnin ja 48 tunnin ja myös käsiteltiin 48 tuntia ja otettiin talteen 2, 4 ja 8 päivää normaalissa väliaineessa; ja VERO-soluja käsiteltiin 125 μ /ml krysotiilin 48 tuntia ja otettiin talteen tavanomaisessa väliaineessa 24 tunnin ajan. Ohjaus ja käsiteltiin solut kiinnitettiin formaldehydillä 3,7% 30 minuuttia ja käsiteltiin Triton X-100 0,1% 10 min. Sitten solut toimitettiin Immunofluoresenssi-α ja β-tubuliinia vasta-aineita (Sigma, laimennettu 1:200), ja toisen vasta-aineen anti-hiiri-CY5 (Invitrogen, laimennettu 1:200). Tämän jälkeen solut käsiteltiin RNaasi 30 minuutin ajan, tumat värjättiin propidiumjodidilla ja aktiinifilamenttien FITC-phalloidin. Solun morfologia ja läsnäolo krysotiilikuitujen kuvioitiin laserkeilauksen konfokaalimikroskopiaa (LSM 510, Carl Zeiss). Näitä valmisteita käytettiin myös määrittämään läsnäolo Mikrotumaisten, monitumaisia ​​ja mitoottiset solut: valmisteiden havaittiin fluoresenssimikroskopialla. Ainakin 1000 solua /slide ja 100 mitoosi solut laskettiin kolmessa eri dioja testi- ja kontrolli.

aikaintervallitallennuksen Microscopy

HK2 transfektoitiin GFP-tagget alfa-tubuliinin plasmidin jotta seuranta mikrotubulushaarojen mitoosin aikana. Transfektio suoritettiin Lipofectamine 2000 Invitrogen) noudattamalla valmistajan protokollaa. 24 tunnin kuluttua transfektion väliaine vaihdettiin väliaine krysotiilikuitujen. Solut pysyivät kuiduilla 24 tai 48 tuntia, ja sitten noudatettava nopeutus pyörivän kiekon konfokaalimikroskopia käyttäen DSU X-81 käänteismikroskooppi (Olympus), joissa on MT20 valaistus ja OSIS hankinta järjestelmät, CCD-kamera (Hamamatsu, ORCA AG), ja kuumennuskammion (Harvard Apparatus). Cell asetettiin erityistä kammiot, jotka sisältävät 2 ml tallennusväline (5% Hanksin tasapainotettua suolaliuosta, 0,5% glukoosia, 1% naudan sikiön seerumia, 20 mM Hepesiä ja 2 mM Glutamax, pH 7,3), ja kuvata kanssa DSU järjestelmän avulla 60x 1,42 NA immersioöljyobjektiivilinssillä. Maksimaalinen projektiokuvia saatiin ja käsiteltiin käyttäen Metamorph ohjelmiston ja Adobe Photoshop.

Tilastolliset analyysit

Tulokset analysoitiin χ2 testi ja P 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

Krysotiililla pitoisuudesta riippuvainen aneuploidiaa seuraava elpyminen kuitu väliaineessa

Viljellyt HK2 soluja käsiteltiin kolmella eri pitoisuuksia krysotiili, ja sitten annettiin toipua kuitu-väliaineessa 2, 4 ja 8 päivää. Nuclear DNA-pitoisuus kvantifioitiin kuva-analyysi ja tumat ryhmitelty seuraaviin viiteen luokkaan: hypodiploid (DNA-pitoisuutta ≤1.49 C), diploidi (DNA-pitoisuus 1,5 C ja 2,39 C), hyperdiploid (DNA-pitoisuus välillä 2,4 C ja 3,59 C) , tetraploidi (DNA-pitoisuus välillä 3.6C ja 5.1c) ja hypertetraploid (DNA-pitoisuus 5.1c) (taulukko 1).

Krysotiililla hoito johti pitoisuudesta riippuvaa muodostumista hypertetraploid ytimet (myös nimeltään aneuploidi ytimiä). 48 tunnin kuluttua krysotiilin hoidon jälkeen 2 päivää elpyminen fiber-väliaineessa, aneuploidian mitattiin. Käsitellyissä soluissa korkein krysotiilia pitoisuus (250 ug /ml), 7% soluista oli aneuploidi, kun taas käsiteltiin välituotteen pitoisuus krysotiilin (125 ug /ml) näytetään 4,5% aneuploidiaa; alin krysotiiliasbestille pitoisuus (62,5 ug /ml), mikä johti 3,5%: aneuploidian, joka oli suurempi kuin aneuploidian kontrollisoluissa (0,25%). Kun analysoidaan jälkeen palautumisen hidastumista, taajuus aneuploidi ytimien kasvoi ja oli 10,5% soluista käsiteltiin 250 ug /ml krysotiilin seurasi 8 päivää elpymisen. Solut, joita käsiteltiin 125 ug /ml ja 62,5 ug /ml krysotiilin ja annettiin toipua 8päivä esitetty aneuploidia on 5,9% ja 4,67% vastaavasti (taulukko 1, Fig. 1).

Nuclear DNA-pitoisuus HK2 ohjaus ja krysotiilille (250 ug /ml, 125 ug /ml tai 62,5 ug /ml) hoidettujen solut (48 h) annettiin talteen kuitu-väliaineessa 2, 4 tai 8 päivää kvantitoitiin, ja ytimet, joissa DNA-pitoisuus 5,1 C katsottiin aneuploidi. Prosenttiosuudet esitetty ovat tausta (prosenttiosuus aneuploidiaan valvonnan soluissa, 0,25%) – vähennetään. Krysotiili hoito johti aneuploidia- että jatkunut 8 päivän kuluttua elpymisen (P 0,001).

48 tunnin kuluttua krysotiilin altistuksen jälkeen 2 päivää elpyminen, aneuploidi väestö koostuu pääasiassa bi ja Monitumaisia solut. Kuitenkin, kun palautumisen kertaa kuidun väliaineessa (4 ja 8 päivää), aneuploidi ytimet olivat enimmäkseen mononukleaarisissa soluissa (taulukko 2).

Cell cycle muutoksia sen jälkeen, kun krysotiilille hoidon

solusykli in HK2 ohjaus soluissa ja soluissa käsitelty krysotiiliasbestille 48 tuntia sen jälkeen 2, 4 ja 8 päivää elpyminen kuitua väliaineessa analysoitiin virtaussytometrialla. Käsittelyt tehtiin vain yksi krysotiilille konsentraatio (125 ug /ml).

Cell cycle tapahtuma luokiteltiin hypodiploid /apoptoottisia, G1, S, G2 /M, ja hypertetraploid soluja. Samoin kuin kokeissa DNA: n kvantifiointiin, diploidinen ryhmä määräytyy piikin G0 /G1 solujen histogrammien.

histogrammit, ensimmäinen merkittävä krysotiilille aiheuttaman muutoksen solukierron lisääntyi in hypodiploid /apoptoottisen solujen muodostumista. Kuitenkin taajuus näiden solujen väheni sen jälkeen, kun pitkän elpyminen, saavuttaa ohjaus-arvo sen jälkeen, kun 8 päivä toipumisen (taulukko 3).

Krysotiili-käsitellyt solut osoittivat 12% pienempi määrä G1 soluja verrattuna kontrollisoluihin, ja osoitti myös 5% suurempi määrä G2 /M-soluja kuin ei verrokkisoluissa (taulukko 3). Nämä erot tapahtui riippumatta keston toipumisaika, ja olivat korostuneempia pitkäkestoisessa elpymistä. Kun solujen määrä S-vaiheessa arvioitiin, mitään eroa ei havaittu ohjaus ja krysotiilille-käsitellyt solut (Fig. 2, A).

Solut, jotka käsitelty krysotiilille ja annettiin palautua 2, 4 tai 8 päivää kuitu-väliaineessa analysoitiin virtaussytometrialla ja immunofluoresenssilla. A) Histogrammit lineaarinen (punainen) ja log (värillinen) skaalautuu virtaussytometrialla osoittavat vaikutukset chysotile on solusyklin, erityisesti kasvu määrän G2 /M ja hypertetraploid soluja; B) krysotiiliasbestille-käsiteltyjen solujen talteen 2 ja 4 päivää osoittavat kasvua solujen lukumäärä metafaasissa ja vähentää solujen anafaasia ja telophase verrattuna kontrollisolujen (P 0,01: ssa 48 tuntia ja P 0,001 4 päivää) .

Mitoosi indeksi ohjaus ja krysotiiliasbesti käsiteltyjen HK2 solut kvantifioitiin käyttäen immunofluoresenssilla. Analyysi mitoosi-indeksi osoitti, että solujen kokonaismäärässä M vaiheessa oli samanlainen kontrolli- ja krysotiilille käsiteltyjä soluja. Kuitenkin ohjaus solujen määrä solujen anafaasia ja telophase oli suurempi kuin solujen lukumäärä metafaasissa, kun taas 48 tunnin kuluttua krysotiilin käsittely ja sen jälkeen 2-4 päivää elpymisen, solujen lukumäärä metafaasissa oli suurempi kuin solujen määrä Anaphase ja telophase. Kun 8 päivää elpyminen, solujen lukumäärä metafaasissa oli samanlainen krysotiili käsiteltyjen ja kontrolli-soluissa (kuvio. 2, B).

HK2 ja VERO solujen morfologia ja läsnäolo krysotiilikuitujen

Ohjaus ja krysotiilille käsiteltyjen HK2 solut analysoitiin laserkeilauksen konfokaalimikroskopiaa, kun immunofluoresenssivärjäyksessä merkintöjä mikrotubulusten, aktiinisäikeiden ja ytimet. Krysotiilikuitujen visualisoitiin niiden autofluorisaatiota (katso yksityiskohdat [13]). Läsnäolo monitumaisia ​​ja mikrotumaisten solujen epänormaalia mitoosin ja kuidut analysoitiin ja kvantitoitiin.

jälkeen 24 tunnin ja 48 tunnin krysotiilin hoito, pitkät kuidut havaittiin vuorovaikutuksessa HK2 solun pinnalla ja aktiinisäikeiden; joitakin pieniä kuitufragmentteja havaittiin myös solujen sisällä (Fig. 3, A). Muutoksia soluviljelmässä havaittiin, kuten suurempi määrä kahden- ja monen ytimiä mikrotumaisten ja apoptoottisten solujen. Solujen lukumäärä kanssa moninapaista mitoosia myös kasvoi ja oli 7,23% kaikista jakautuvien solujen kuluttua 48 h krysotiilin altistumisen (hallita 2,37% kaikista solunjakautumisten olivat moninapaista) (Fig. 3, B).

Cells käsiteltiin immunofluoresenssilla visualisoida ytimien aktiinisäikeiden ja mikrotubuluksia, ja krysotiilikuitujen havaittiin niiden autofluoresenssia. A) Konfokaaliset kuvia HK2 käsiteltyjen solujen krysotiiliasbestille 24 h tai 48 h osoittavat pitkiä, paksuja kuituja vuorovaikutuksessa solujen ja moninapainen mitoosin; B) muutokset solun morfologiassa analysoitiin, ja sen jälkeen 24 h tai 48 h krysotiiliasbesti hoidon määrä binucleated ja monitumaiset solut kasvoivat sekä määrä mikrotumaisten solujen, apoptoottisten solujen ja solujen moninapainen mitoosin (P 0,001) .

48 tunnin kuluttua krysotiilin käsittely ja sen jälkeen samanlainen toipumisaika, monitumaiset solut, epänormaalia mitoosin ja pitkä ja pieni krysotiilikuitujen sisällä soluja havaittiin (Fig. 4, A). Lisäksi analyysi osoitti, että solujen annettiin toipua pitkiä aikoja sisälsi vähemmän kuituja; krysotiilikuitujen ja pienten kuitujen fragmentit havaittiin perinuclear alueen soluissa, sen jälkeen 4 päivää elpymisen, kun taas sen jälkeen, kun 8 päivää elpymisen ei ollut pitkiä kuituja ja pieniä fragmentteja kuitujen solujen (Fig. 4, A). 4 päivän kuluttua elpymisen määrä bi /monitumaisten solujen vähentynyt, mutta se oli edelleen korkeampi kuin verrokeilla soluissa, mutta numerot solujen moninapaista mitoosin ja mikrotumaisten lisättiin (Fig. 4, B). Sen jälkeen, kun 8 päivää elpymisen, solun morfologia krysotiiliasbesti-käsitellyissä soluissa muistutti kontrollisoluja, jotka koostuvat mononucleated soluja, kaksisuuntaisessa mitoosin ja muutaman mikrotumaisia ​​ja apoptoottisten solujen. Solujen lukumäärä on moninapainen mitoosin vähenikin että solujen annettiin toipua neljä päivää; kuitenkin, että krysotiili käsiteltyjä soluja oli enemmän tapauksia moninapaista mitoosin kuin oli kontrolliryhmässä soluissa (kuvio. 4, B).

Solut tutkittiin käyttämällä immunofluoresenssilla visualisoida ytimien aktiinisäikeiden ja mikrotubulushaarojen ja krysotiilikuitujen havaittiin niiden autofluoresenssia. A) Konfokaalinen kuvia valvonta- HK2 soluja ja soluja käsiteltiin krysotiilille 48 tuntia ja annettiin toipua 2 päivää, 4 päivää tai 8 päivää, osoittavat solujen morfologia ja läsnäolo krysotiilikuitujen. 2 päivän kuluttua parantumisesta, pitkien kuitujen havaittiin olevan vuorovaikutuksessa solujen pinnalla; kuitenkin, kun 4 ja 8 päivää elpyminen, vain kuitufragmentteja havaittiin; B) muutokset solun morfologiassa kvantitoitiin, ja sen jälkeen 48 h krysotiilin hoitoa ja 4 päivän elpyminen määrä bi /monitumaisten solujen ja apoptoottisten solujen vähentynyt, mutta oli edelleen korkeampi kuin kontrolleilla (P = 0,30 bi /monitumaisten jälkeen 4 päivää ja P = 0,05 apoptoottisia soluja). Määrä mikrotumaisten solujen krysotiilille-hoidetussa ryhmässä säilyi suurempi kuin kontrolliryhmän (P 0,001 jälkeen 4 päivää), ja solujen määrä moninapaista mitoosin oli suurin (P 0,001). Kun 8 päivää elpyminen, solujen määrä moninapaista mitoosi soluissa oli suurempi kuin verrokeilla soluissa (P = 0,02).

Voit selvittää normaalit solut samalla vastata krysotiilille viljelmät VERO soluissa altistettiin krysotiilikuitujen 48 tuntia ja annettiin toipua 24 tuntia kuitu-väliaineessa, ja sitten niitä käsitellään käyttäen immunofluoresenssilla analysoida solujen morfologia. Ohjaus solut koostui pääasiassa mononucleated soluja (99,29%), joilla on harvinainen mikrotumaisia ​​solujen (1,55%) ja ei epänormaalia mitoosin. Sen jälkeen krysotiili hoito, bi /monitumaiset ja mikrotumaisten soluja, havaittiin suurempi määrä kuin verrokeilla soluissa (6,34% ja 3,89% vastaavasti), ja moninapainen mitoosin ja sytokineesiin johtivat kolmeen tytär soluja havaittiin myös (7,18% kaikista solunjakautumisten) ( Fig. 5, A ja B).

Solut tutkittiin käyttäen toimitettu immunofluoresenssilla visualisoida ytimien aktiinisäikeiden ja mikrotubuluksia, ja krysotiilikuitujen havaittiin niiden autofluoresenssia. A) Konfokaalinen kuvia valvonnan soluja ja soluja käsiteltiin krysotiilille 48 tuntia ja annettiin toipua 24 tuntia, joka osoittaa solujen morfologia ja läsnäolo krysotiilikuitujen. Talteenoton jälkeen, pitkien kuitujen havaittiin olevan vuorovaikutuksessa solujen kanssa, ja monitumaiset solut, Mikrotumaisten solut ja solut moninapainen mitoosin havaittu; B) muutokset solun morfologiassa kvantitoitiin ja krysotiilille hoito johti lisääntyneisiin mikrotumaisten solujen bi /monitumaiset solut, apoptoottiset solut ja solujen moninapainen mitoosin (P 0,001).

Time- lapse Microscopy: kohtalot epänormaali mitoosi-solujen ja muodostumista useiden sentrosomien

aikaväli pyörivän kiekon konfokaalimikroskopialla, HK2 solut transfektoitiin GFP-merkittyjä α-tubuliinin. Kukin transfektoitujen solujen havaittiin ajaksi 2-3 h. Kun säätökennoa metafaasissa todettiin, se edennyt Anaphase ja saavutti telophase 30 100 minuuttia. Kaikki osastot havaitut valvonnan solut kaksisuuntainen (Fig. 6, A). Sitä vastoin, kun krysotiili käsiteltyjä soluja havaittiin, noin 40% metafaasien oli moninapaisen. Analyysi kohtalo 30 näiden solujen osoittanut eri malleja; kukin niistä havaittiin ainakin kaksi kertaa.

Solut transfektoidaan GFP-merkittyjä α-tubuliinin hoidettiin krysotiiliasbestille 24 tai 48 tuntia ja sitten noudatettava nopeutus pyörivän kiekon konfokaalimikroskopia. Solut metafaasissa havaittiin 2-3 tuntia. A) aikasarjoja maksimaalinen projektio kuvat osoittavat kaksinapaisen mitoosia, joka syntyy vain kaksi tytärsoluksi kuluttua 1 h kontrolliviljelmään; B) aikasarja maksimaalisen projektiokuvia osoittavat kolminapaisena mitoosia peräisin krysotiiliasbestille saaneista kulttuuri, joka ei edennyt läpi M vaihe; C) aikasarja maksimaalisen projektiokuvia osoittaa krysotiiliasbestille käsiteltyä solu, joka järjestettiin kara navoista kolminapainen muodin ja eteni Anaphase ja telophase tuottaa kolme tytärsoluksi; D) aikasarja maksimaalisen projektio kuvat osoittavat sytokineesiin on krysotiiliasbestille saaneilla solu, joka tuottaa kolme tytär solua, joka hankki interphase morfologia; E) aikasarja maksimaalisen projektiokuvia on krysotiilin käsitellyn solu, joka tuli Anaphase tuottaa neljä tytärsoluksi; kuitenkin, solut yhdistettiin telofaasin aikana hitaasti liikkuvista ja muodostivat vain kaksi tytärsoluksi.

Noin puolet solujen moninapainen metafaasissa ei edetä Anaphase havaintojakson aikana, jäljellä metafaasissa pseudo-kaksisuuntainen, kolminapainen tai quadripolar karan (Fig. 6, B). Näissä tapauksissa mikrotubulusten olivat dynaaminen ja kara pylväät olivat dynaamisempi kun ryhmitelty pseudo-bipolar karat. Solut moninapainen metafaasissa tehtiin myös solukuolemaa, mistä on osoituksena vuoto sytoplasmassa havaittiin läpivalaisu kanava.

Jotkut solujen moninapainen metafaasissa jälkeen krysotiili hoidon myös edennyt Anaphase, telophase ja sytokineesiin. Kolminapainen metafaasien syntyy kolme tytärsoluksi yhdistää kaksi midbodies mikrotubulusten organisaatio samankaltainen kuin valvonta-soluissa (kuvio. 6, C). Kolme tytärsolut pysyneet erotettu ja hankki interphase morfologia 100 minuutin kuluttua alun sytokineesi (Fig. 6, D), tai fuusioitunut aikana sytokineesi. Näissä tapauksissa kaksi kolmesta tytär solut sulatettua ja liittyy solujen väliseen sillan kahden rakenteita mikrotubulusten. Solu fuusio tapahtui myös telofaasin aikana hitaasti liikkuvista kunnes solujen välistä siltaa muodostumista, joten kaksi tytär solut yhdistää vain yksi keskiosalla (Fig. 6, E).

muodostuminen moninapaista karat tai useampia sentrosomien ei havaittu mitoosin aikana; kaikki esiintymät metafaasivaiheeseen olivat epänormaali alusta lähtien havainnon. Siten interphase solujen havaittiin tunnistaa muutoksia, jotka voivat liittyä sentrosomimäärän vahvistus, joka oli vastuussa muodostumista moninapaisen karat myöhemmässä M vaihe.

Solut interfaasivaiheessa kaksi sentrosomien havaittiin, ja sentrosomien lähestyivät toisiaan sen sijaan, että siirryttäessä ristiriidassa keskenään. Lisäksi, mikrotubulusverkoston näiden solujen pysyi samanlainen välifaasi soluja ja eivät muodosta karat. Toinen tilanne, joka havaittiin sen jälkeen kun krysotiiliasbesti hoito oli läsnä interphase kaksi sentrosomimäärän kaltaisia ​​elimiä – rakenteet sijaitsevat perinuclear alueella solun jossa mikrotubulusten keskitettiin. Nämä rakenteet näyttivät muodostuu hyvin pieniä pisteitä, jotka siirretään kaikissa tallennuksen aikana. Myös solu pysyi interfaasivaiheessa ja ei edetä M vaiheeseen (Fig. 7, A).

Muutokset, jotka voisivat liittyä epänormaalin määrän sentrosomien havaittiin HK2 soluissa käsitelty krysotiiliasbestille 24 tai 48 h. A) aikasarjoja kuvat osoittavat solun kaksi sentrosomimäärän samoin rakenteita, jotka eivät edenneet M vaiheen odotetulla solu, jossa on kaksi sentrosomien; B) aikasarjan kuvat osoittavat kaksi interphase solua toisiinsa liittyneistä solujen välinen silta ilman keskiosalla organisaatio. Solut lähestyi toisiaan aikana havainto, heijastaa regression sytokineesin.

Toinen mekanismi, joka vastaa muodostumista ylimääräistä sentrosomien soluissa on sytokineesiin vika. Tämä prosessi kestää liian kauan noudatettava aikana viiveen kokeita teimme. Kuitenkin interphase solut toisiinsa liittyneistä solujen välinen silta ilman keskiosalla mikroputkiorganisaatiota havaittiin, ja solut lähestyivät toisiaan havainnointijakson aikana (Fig. 7, B).

Keskustelu

Krysotiililla on katsotaan vähemmän haitallisia ihmisten terveydelle kuin toiset asbestityypit, koska puute vahvan yhteyden krysotiili kuidun altistumisen ja kehittäminen karsinoomien ja mesotelioomatapausten. Kuitenkin jotkut tutkimukset osoittavat, että mahdollisuus krysotiilin aiheuttaa DNA-vaurioita ja solujen muutoksia

in vitro

, ja keuhkojen vammat

in vivo

. Tässä työssä analysoitiin solu- muutoksiin liittyvät aneuploidian ja solusyklin häiriöitä, ja todentaa jotka muutokset itsepintaisesti kulttuuri jälkeen 2, 4 ja 8 päivää elpymisen fiber-väliaineessa. Myös muutokset solun morfologiassa liittyivät läsnäolo kuitujen kulttuurin ensimmäisten 24 tunnin ja 48 tunnin krysotiilin hoidon ja myös sen jälkeen pitkään elpymistä. Analysoimme myös moninapaista mitoosin ja sentrosomimäärän vahvistus, jotka ovat lisäominaisuuksia krysotiilin hoitoa, jotka liittyvät läheisesti aneuploidia.

analyysi HK2 solujen konfokaalimikroskopiaa reveled että krysotiilikuitujen eivät säilyneet soluviljelmässä 8 päivän kuluttua elpymisen, ja 4 päivän kuluttua elpymisen vain palasia ja pieniä kuituja olivat läsnä perinuclear alueella soluissa. Myös sen jälkeen, 4 ja 8 päivää elpymisen, solujen morfologia muistutti ohjaus solujen suhteen läsnäolo bi /monitumaisia ​​ja Mikrotumaisten soluja. Kuitenkin aneuploidi väestö itsepintaisesti soluviljelmässä jälkeen 4 ja 8 päivää elpymisen fiber-väliaineessa, ja prosenttiosuudet aneuploidi ytimien oli aina noin 10% koko väestöstä. Toimittamat tiedot DNA: n kvantifiointiin osoitti myös, että aneuploidi ytimet olivat enimmäkseen mononucleated soluissa jälkeen 4 ja 8 päivää elpyminen, kun taas ensimmäisen päivän elpyminen aneuploidi ytimet olivat bi /monitumaisiksi soluja. Kaikki nämä havainnot ovat yhtä mieltä tietojen virtaussytometrialla, joka osoitti, että krysotiilin käsiteltyjen HK2 solut osoittivat lisääntynyttä hipertetraploidy jopa 8 päivän kuluttua elpymisen.

Läsnäolo aneuploidi solujen on seurausta krysotiilin hoidon havaittiin 48 tunnin kuluttua altistumisen, joka ei poistu 72 h elpymisen käsittelyn jälkeen [11], [13]. Nämä solut saattavat liittyä syövän kehitykseen, koska menetys tai voitto yhdestä kromosomi – tai sen osa – voi mutaatioita tarvitaan pahanlaatuisiin. Osoitamme tässä tutkimuksessa, että induktio aneuploidian soluissa on krysotiiliasbestille pitoisuudesta riippuvainen, ja kuten edellä on kuvattu, että prosenttiosuus aneuploidi solujen pysyivät korkeina verrattuna säätökennoja jälkeen jopa 8 päivää elpymisen kuidun viljelyalusta.