Krooninen sairaus

tiivistelmä

Midkine (MDK) on hepariinia sitova kasvutekijä, joka ilmentyy voimakkaasti monissa pahanlaatuisia kasvaimia, mukaan lukien keuhkosyövässä. MDK aktivoi PI3K koulutusjakso ja indusoi anti-apoptoottista aktiivisuutta, puolestaan ​​parantaa selviytymisen kasvaimia. Siksi esto MDK pidetään mahdollisena strategia syövän hoidossa. Tässä tutkimuksessa osoitamme, uusi pienimolekyylinen yhdiste (iMDK), joka kohdistuu MDK. iMDK inhiboi solun kasvua MDK-positiivisia H441 keuhkoadenokarsinooma solut, jotka satama onkogeenisen

KRAS

mutaatio ja H520 okasolusyöpä keuhkosyövän soluja, jotka molemmat ovat erilaisia ​​untreatable keuhkosyöpään. Kuitenkin, iMDK ei vähentänyt solujen elinkelpoisuutta MDK-negatiivisten A549 keuhko adenokarsinoomasolua tai normaalin ihmisen keuhkojen fibroblasti (NHLF) solut osoittaa sen erityispiirteet. iMDK tukahdutti endogeenisen ilmentymisen MDK, mutta ei muiden kasvutekijöiden, kuten PTN tai VEGF: ää. iMDK tukahdutti kasvua H441 soluissa inhiboimalla PI3K reitti ja apoptoosin indusointi. Systeeminen anto iMDK merkittävästi esti kasvaimen kasvua vierassiirrännänmallissa hiirimallissa

in vivo

. Esto MDK kanssa iMDK tarjoaa potentiaalisen terapeuttisen lähestymistavan keuhko- syövistä, jotka ohjaavat MDK.

Citation: Hao H, Maeda Y, Fukazawa T, Yamatsuji T, Takaoka M, Bao XH, et ai . (2013) esto Growth Factor MDK /Midkine jonka Novel pienmolekyyliyhdisteen Kohtele ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 8 (8): e71093. doi: 10,1371 /journal.pone.0071093

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japani

vastaanotettu: 23 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 25 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 16 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Hao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Institutes of Health (NIH) avustukset JAW (https://report.nih.gov/index.aspx, lupanumeroon: HL095580, HL108907, HL110964), opetus-, tiede- ja kulttuuri, Japani, ja YN (https://www.jsps.go.jp/english/index.html myöntää numero: 23591950) ja University of Cincinnati Postdoctoral Fellow tutkimusohjelma YM. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Dr. MN on työntekijä kaupallinen yhtiö ”SBI Pharmaceuticals Co., Ltd ”. Kuitenkin SBI Pharmaceuticals Co., Ltd ei rahoittaa tätä tutkimusta eikä ole olemassa patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Työllisyys SBI Pharmaceuticals Co., Ltd. ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syöpään liittyvää kuolleisuutta maailmanlaajuisesti [1,2]. Tavanomaiset solunsalpaajahoitojen kohdistaa keuhkosyövän soluja vaan myös normaalia jakautuvat solut. Tällä hetkellä selviytyminen seuraavia tavanomaisia ​​kemoterapia keuhkojen adenokarsinooma (yleisin keuhkosyövän) säädetään alle vuoden elinajan mediaani diagnoosin aikana [3]. Molecular reittiin erityisiä hoitoja keuhkojen adenokarsinooma, esimerkiksi kohdentamalla mutantti

EGFR

tai

ALK

fuusioita, rajoittaa ei-kasvain myrkyllisyys ja pidentää elinaika verrattuna tavanomaiseen kemoterapiaan, [4] – [6 ]. Ei ole kuitenkaan mitään molekyylirakennetta suunnattu hoito mutantti

KRAS

ajettavat keuhkoadenokarsinooma, yleisin tyyppi keuhkoadenokarsinooma Kaukasian väestöstä. Lisäksi tehokas molekyylirakennetta suunnattu hoitoja on kehitetty adenokarsinoomat, mutta ei okasolusyöpää. Näin ollen, erityisiä hoitoja, jotka kohdistuvat eri keuhkosyövän tyyppejä tarvitaan kipeästi [7] – [9].

Midkine (MDK) on hepariinia sitova kasvutekijä, joka ilmentyy erittäin monissa pahanlaatuisia kasvaimia, mukaan lukien keuhkot, ruokatorven, mahan, paksusuolen, hepatosellulaarinen, rinta-, munuais- ja haimakarsinooma [10] – [15]. MDK sitoutuu useita kalvoreseptoreihin, ALK, syndecans, PTP ja LRP, ja sen jälkeen aktivoi PI3 kinaasi (PI3K) ja MAP-kinaasin polkuja. Nämä kaksi väyliä indusoi solujen lisääntymistä ja parantaa angiogeenisten ja anti-apoptoottinen toiminta [16], [17]. Inhibitio

MDK

siRNA estää solujen syöpäsolujen kasvua, jotka ilmentävät MDK [18], mikä osoittaa, että MDK voi olla potentiaalinen kohde keuhkosyövän hoidossa. Koska hiiret, joilta puuttuu

Mdk

geeni ovat elinkelpoisia [19], kohdistaminen MDK on houkutteleva terapeuttinen lähestymistapa, koska sen esto ei todennäköisesti ole systeemisiä haitallisia vaikutuksia. Tunnustamista mahdollista roolia MDK väylän syövän hoidossa onkin tehostanut tunnistaa MDK estäjiä. Matsui et ai. tunnistettu synteettisiä peptidejä ja yhdisteitä, jotka estävät MDK välittämiä solun muuttoliike

in vitro

; kuitenkin, nämä osoittautuivat olevan voimakkaita ja ei ole kliinistä hyötyä [20].

Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tunnistaneet alhaisen molekyylipainon yhdiste (iMDK), joka vaimentaa endogeenisen MDK ilmaisua. iMDK esti kasvua MDK ilmentävien H441 keuhkoadenokarsinooma solut, jotka satama onkogeenisessä

KRAS

mutaatio ja H520 okasolusyöpä keuhkosyöpäsoluissa

in vitro

. Lisäksi iMDK tukahdutti keuhko kasvaimen kasvua ja solukuolema estämällä PI3 kinaasireittiä ja aiheuttamaan apoptoosin vierassiirrännänmallissa hiirimallissa johdettu H441 keuhkoadenokarsinooma soluja. Kohdistaminen ilmaus MDK tarjoaa uuden terapeuttisen lähestymistavan hoitoon MDK-ilmentävien ei-pienisoluinen keuhkosyöpä.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit

3- [2 – (4-fluoribentsyyli) imidatso [2,1-beta] [1], [3] tiatsol-6-yyli] -2H-kromen-2-oni (jäljempänä iMDK) hankittiin ChemDiv (San Diego, CA) liuotettiin DMSO: ssa. PD0325901 (a MEK estäjä) saatiin signalinginhibitors.com (Wedel, Schleswig Holstein, Saksa).

Solulinjat ja viljelyolosuhteet

Ihmisen keuhkojen adenokarsinoomasolua H322, H358, H441 ja A549 ja ihmisen keuhkojen levyepiteelikarsinooma solujen H520 saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA) ja niitä kasvatettiin RPMI 1640: ssä (H322, H358, H520), tai korkean glukoosin Dulbeccon Modified Eagle Medium (H441, A549-soluja), jota oli täydennetty 10 % lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia. Ihmisen pahanlaatuinen mesoteliooma solujen ACC-MESO-1 (MESO-1) on saatu JCRB Cell Bank (Osaka, Japani) ja ihmisen keuhkojen levyepiteelikarsinooma solujen SQ5 ystävällisesti tarjoamia Dr. Kiura Katsuyuki (Department of Hematology, Oncology, ja Respiratory Medicine, Okayama University Graduate School of Medicine, hammaslääketieteen ja Pharmaceutical Sciences, Okayama, Japani) [21] kasvatettiin RPMI 1640 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia. Ihmisen normaalien keuhkojen fibroblasteista NHLF saadut solut Clonetics (San Diego, CA) kasvatettiin runsaasti glukoosia Dulbeccon modifioitua Eaglen väliaineessa. Kaikkia solulinjoja viljeltiin 5% CO

2 37 ° C: ssa.

immunoblottianalyysi

Solut hajotettiin jääkylmässä M-PER hajotuspuskuria ostetaan Thermo Fisher Scientific ( Rockford, IL). Solulysaatit kirkastettiin sentrifugoimalla (20 min, 15000 x g 4 ° C: ssa), ja proteiinikonsentraatio määritettiin käyttäen BCA-proteiinimäärityksellä (Thermo Scientific, Rockford, IL). Yhtä suuret määrät proteiinia, erotettiin SDS-PAGE-geelissä. Geeli siirrettiin elektroforeettisesti Hybond PVDF siirto kalvo (GE Healthcare Ltd, Piscataway, NJ) ja niitä inkuboitiin ensisijaisen ja toissijaisen vasta-aineet mukaan SuperSignal

® West Pico kemiluminesenssi-protokollaa (Pierce, Rockford, IL). Spesifistä vasta-ainetta β-aktiini-vasta-aine saatiin Sigma (St. Louis, MO), ja vasta-aine, joka on spesifinen ihmisen MDK ja PTN (Pleiotrophin) saatiin Abcam (Cambridge, UK). Spesifistä vasta-ainetta kaspaasi-3, PI3 kinaasi p85, fosforyloitu-PI3K p85 (Tyr458) /p55 (Tyr199), AKT, fosforyloitu-AKT (Ser473), ERK1 /2, fosforyloitua-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), p38MAPK, fosforyloitua-p38 MAPK (Thr180 /yr182), Bad, XIAP, surviviini saatiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Spesifistä vasta-ainetta VEGF ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Toissijainen piparjuuriperoksidaasikonjugoitua vasta-aineet on saatu Jackson Immunoresearch Laboratories (West Grove, PA).

siRNA estoa MDK

. H441-solut maljattiin 12-kuoppalevylle tiheyteen 1 x 10

5 per kuoppa ja viljeltiin yön yli 37 ° C: ssa. Seuraavana päivänä 100 pmol kahta eri siRNA: iden kohdistaminen MDK (D-003677-02-0050 ja D-003677-03-0050) tai nontargeting siRNA (Thermo Scientific) transfektoitiin käyttäen 2 pl Lipofectamine 2000 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA ) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Inkubointiaika transfektioreagensseja oli 24 tuntia, jona aikana elatusaine korvattiin tuoreella säännöllisesti väliainetta. Solut kerättiin 48 tuntia transfektion jälkeen ja immunoblottauksella ja solujen kasvua määrityksissä.

solunelinkykyisyysmääritys

H441-solut, A549-solut, H520-solut, HEK293-solut ja NHLF-soluja maljattiin 24-kuoppalevyille tiheydellä 1 x 10

5-soluja ja viljeltiin 37 ° C: ssa 24 tunnin ajan. Väliaine poistettiin imemällä ja korvattiin tuoreella viljelyalustalla, joka sisälsi iMDK liuotettiin DMSO: iin (10, 50, 100, 500 nmol /l). Pelkän DMSO: ta käytettiin kontrollina. Soluja käsiteltiin 48 tunnin ajan ja otettiin talteen trypsinoimalla. Elävät solut arvioitiin trypaanisiniekskluusiolla ja WST-1 määrityksissä (Roche Molecular Biochemicals, Laval, Quebec, Kanada) mukaan valmistajan protokollaa. Rekombinantti MDK ostettiin R 0,05 (#) tai p 0,01 (*).

Tulokset

esto MDK vähentää elinkelpoisuus H441 keuhkojen adenokarsinoomasolua

Jotta löytää NSCLC solulinja, joka on riippuvainen MDK solujen kasvulle, arvioimme endogeenisen ilmentymisen MDK proteiinin neljässä eri NSCLC solu l ines ja NHLF (Normal Human Lung Fibroblast) soluja. HEK293 sikiön munuaisen soluja käytettiin positiivisena kontrollina MDK ekspressiota. Kuten kuviossa 1A on esitetty, MDK havaittiin HEK293-soluissa, H441 keuhkoadenokarsinooma soluja ja H520 ihmisen keuhkojen okasolusyöpä soluissa, mutta ei A549, H322 ja H358 keuhkoadenokarsinooma soluja, SQ5 keuhkojen okasolusyöpä soluja tai MESO-1 pahanlaatuinen mesoteliooma solut . MDK ei ilmentyy normaaleissa NHLF soluissa. H441 solulinja on peräisin ei-pienisoluisen keuhkosyövän keuhkojen kasvain, joka on

KRAS

mutaatio. Aktivoidut

RAS

on yleisin mutaatio liittyy keuhkojen adenokarsinooman valkoihoisesta väestöstä ja tehokkaita hoitoja tähän tautiin ei vielä ole tunnistettu [24]. Sen määrittämiseksi, onko H441-solut ovat riippuvaisia ​​MDK solujen elinkelpoisuuden, me esti MDK käyttämällä siRNA ja tutkittiin solujen kasvua läsnä ja poissa ollessa MDK. Kuten kuviossa 1B, 48 tuntia transfektion jälkeen, kaksi erilaista MDK siRNA tukahdutettiin MDK in H441-soluissa verrattuna ei-kohdistaminen siRNA. Kasvun inhibitio oli huomattavasti indusoitiin tukahduttaminen MDK (p 0,01; kuvio 1C). Nämä tulokset osoittavat, että kohdistaminen MDK on tehokas strategia tukahduttaa solujen kasvua MDK-ilmentävien ei-pienisoluinen keuhkosyöpä.

MDK havaittiin HEK293-soluissa, H441 keuhkoadenokarsinooma soluja ja H520 ihmisen keuhkojen okasolusyöpä soluja mutta ei muunlaisia ​​soluja kuten NHLF (Normal Human Lung Fibroblast) soluja. Proteiinin ilmentyminen MDK ja μ-aktiini vahvistettiin immunoblottauksella, kuten on kuvattu menetelmät. A. MDK tukahdutettiin kaksi erilaista MDK siRNA (MDK siRNA1 ja MDK siRNA2) in H441-soluissa. Proteiinin ilmentyminen varmistettiin immunoblottauksella kuvatulla A. B. Kasvun estäminen in H441-soluissa, kun MDK geenien lisääntyi merkittävästi. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin trypaanisinieksluusiolla määritys Menetelmät kuvatulla tavalla. Tilastollinen merkittävyys määritettiin p 0,01 (*).

iMDK estää endogeenisen MDK ilmentyminen H441 keuhkojen adenokarsinoomasolua

Jotta löytää terapeuttista yhdistettä, joka estää MDK ilmaisua, me ensimmäinen kehitti MDK reportterisolulinjaa transfektoimalla HEK293 kanssa MDK promoottori-fuusioituneet lusiferaarikonstrukti. Käytimme tätä muunnettu solulinja seuloa 44.000 yhdisteiden Drug Discovery Center yliopiston Cincinnati. Lusiferaasi-aktiivisuuden selville käytettiin tunnistamaan MDK-inhibiittorit. Tässä seulonnassa, olemme tunnistaneet yhdiste (3- [2- (4-fluoribentsyyli) imidatso [2,1-beta] [1], [3] tiatsol-6-yyli] -2H-kromen-2-oni; jäljempänä iMDK, kuvio 2A), joka toistettavasti inhiboi endogeenisen MDK-proteiinin EXPRE ssion. Olemme arvioitiin tehokkuus iMDK sen kyky spesifisesti inhiboimaan ekspressiota MDK on H441-soluissa. Kuten on esitetty kuviossa 2B, iMDK esti endogeenisen MDK annoksesta riippuvalla tavalla, mutta ei estänyt PTN (Pleiotrophin), jolla on suuri homologia MDK [17]. Eikä iMDK estää toista kasvutekijä, VEGF, vuonna H441 keuhkoadenokarsinooma soluja 48 tunnin kuluttua altistuksesta.

. Rakenne iMDK (3- [2- (4-fluoribentsyyli) imidatso [2,1-beta] [1], [3] tiatsol-6-yyli] -2H-kromen-2-oni). B. MDK mutta ei PTN tai VEGF tukahdutettiin iMDK annosriippuvaisesti in H441-soluissa 48 tunnin kuluttua hoidon. Immunoblot-analyysi suoritettiin, kuten on kuvattu menetelmät.

iMDK estää solujen elinkelpoisuuden MDK-ilmentävien ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solut

edelleen tehokkuuden määrittämiseksi ja spesifisyys iMDK tukahduttamaan MDK-ilmentäviä tuumorisoluja, käsittelimme molemmat MDK-positiivisia ja MDK-negatiivisten solujen iMDK ja arvioitu solujen elinkykyä. MDK ilmentyy HEK293 alkion munuaissoluissa, H441 keuhkoadenokarsinooma solujen ja H520 keuhkojen levyepiteelikarsinooma soluissa, mutta ei A549 keuhkokarsinooma-soluja tai ei-transformoidut NHLF-soluja (kuvio 1A). Nämä viisi solulinjoja käsiteltiin eri iMDK pitoisuudet (0-500 nM), ja solujen elinkyky arvioitiin 48 tunnin kuluttua hoidosta. Kasvun esto iMDK oli annoksesta riippuen indusoidaan MDK-positiivisten HEK293, H441 ja H520-soluissa, mutta ei MDK-negatiivinen A549-solut tai ei-transformoidut NHLF soluissa (kuvio 3A, S1). Morfologisesti, kasvun tukahduttaminen H441-solujen oli annoksesta riippuen havaittu 48 tunnin hoidon jälkeen iMDK (kuvio 3B). Tukahduttaminen solukasvun iMDK osittain estetty esikäsittely rekombinantti MDK (25 nM) MDK-positiivisten H441-solut; kuitenkin, esikäsittely rekombinantti MDK ei merkittävästi muuttanut solujen kasvua MDK-negatiivinen A549-solut (kuvio S2). Tämä havainto viittaa siihen, että estävä vaikutus solujen kasvuun iMDK välittyy ainakin osittain estämällä MDK ilmentymisen.

B. Kasvun esto iMDK nostettiin MDK-positiivisten HEK293, H441 ja H520-soluissa, mutta ei MDK-negatiivinen A549-solut tai normaali NHLF soluissa 48 tunnin kuluttua hoidon. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin trypaanisinieksluusiolla määritys Menetelmät kuvatulla tavalla. Tilastollinen merkitsevyys määritettiin p 0,01 (*). Annoksesta riippuvaa kasvun esto iMDK havaittiin morfologisesti vuonna H441 keuhkoadenokarsinooma soluja. On esitetty vaiheittain kontrasti fotomikrograafeja H441-solujen 48 tunnin kuluttua iMDK hoidon (asteikko bar esittää 100 um).

iMDK indusoi apoptoosia H441 keuhkojen adenokarsinoomasolua

Jotta ymmärtää mekanismi, jolla iMDK estää niiden kasvun H441-solujen, arvioimme solut apoptoosin suhteen 48 tuntia hoidon jälkeen iMDK. Kuten kuvassa 4A on esitetty, erittäin tiivistettyä ja osittain hajanaista tumat havaittiin H441-soluissa, mutta ei normaaleissa NHLF-soluissa sen jälkeen, kun hoidon iMDK, mikä osoittaa, että iMDK indusoi apoptoosin MDK-ilmentävien H441-soluissa. TUNEL-positiiviset solut myös merkittävästi lisääntynyt H441-soluissa tunnin kuluttua iMDK hoidon annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 4B), joka edelleen vahvistaa apoptoosin induktio iMDK. Kuten on esitetty kuviossa 4C, pilkottu muotoja kaspaasi-3, merkkiaine apoptoosin indusoitiin iMDK jopa alimmilla konsentraatioilla (5 nM) H441-soluissa 48 tunnin käsittelyn jälkeen. sub-G

0 /G

1 DNA-pitoisuus H441-solujen suuresti kasvoi 1,24% (DMSO-ohjaimessa) 37.00% (10 nM) ja 60,91% (25 nM) 72 tunnin kuluttua hoidon iMDK. Kuitenkin osa-G

0G

1 DNA-pitoisuus NHLF solujen minimaalisesti kasvoi 0,32% (DMSO-kontrollin) ja 0,52% (10 nM) ja 1,51% (25 nM), sen jälkeen, kun hoidon iMDK (kuvio 4D) . Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että iMDK selektiivisesti indusoi apoptoosia MDK-ilmentävät H441 keuhkoadenokarsinooma soluissa, mutta ei normaaleissa NHLF-soluissa, jotka eivät ilmennä MDK.

iMDK annoksesta riippuvalla kasvoi apoptoosin H441-soluissa, mutta ei normaaleissa NHLF solut . Soluja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla iMDK 72 tunnin ajan ja värjättiin sitten Hoechst 33342 väriainetta ja analysoitiin fluoresenssimikroskoopilla Menetelmät kuvatulla tavalla (asteikko bar esittää 50 um). Apoptoosi indusoitiin H441-soluissa 48 tunnin kuluttua iMDK hoidon pitoisuutena 25 nM (ylempi paneeli, Mittakaavapalkki osoittaa 200 pm). TUNEL-positiiviset solut kasvoivat iMDK hoito annoksesta riippuvalla tavalla (alapaneeli). TUNEL värjäys suoritettiin, kuten on kuvattu menetelmät. Tilastollinen merkittävyys määritettiin p 0,05 (#). A. Pilkottua kaspaasi-3, apoptoosin markkeri, korotettiin H441-soluissa iMDK hoitoa. H441-soluja käsiteltiin 48 tunnin ajan iMDK ilmoitettuina pitoisuuksina ja sadonkorjuun immunoblottausanalyysillä Menetelmät kuvatulla tavalla. D. iMDK aiheuttama Saharan G

0 /G

1 DNA sisällön H441-soluissa. Soluja käsiteltiin iMDK 72 tunnin ajan ja DNA-pitoisuus mitattiin propidiumjodidia tahra ja virtaussytometria-analyysi, kuten on kuvattu menetelmät.

iMDK vaimentaa PI3K ja indusoi apoptoottisen reittejä H441 keuhkoadenokarsinooma solut

PI3K on kasvaimien syntyyn liittyvien aktivoimalla AKT, mikä puolestaan ​​lisää antiapoptoottisia tekijät, kuten XIAP ja surviviinin, ja vähentää proapoptoottinen tekijä BAD [25] – [27]. Koska MDK aktivoi PI3K [16], [28], pyrimme määrittämään, onko PI3K reitti tukahdutettiin iMDK-välitteisen MDK inhibitio H441-soluissa. Fosforylaatiota PI3K ja AKT hiljennettiin iMDK in annoksesta (kuvio 5A) ja ajasta riippuvaisella tavalla (kuvio 5B), mikä osoittaa, että PI3K /AKT reitin estyy iMDK. Antiapoptooppinen tekijät, XIAP ja surviviini, vähenivät kun taas pro-apoptoottinen tekijä, BAD, aiheutettiin iMDK annoksesta ja ajasta riippuvalla tavalla (kuva 5), ​​mikä osoittaa, että apoptoottinen reitin indusoidaan iMDK. MDK tunnetaan myös aktivoida ERK (a MAPK) normaaleissa ei-tuumorigeenisiä soluja [16], [28]; kuitenkin, ERK ja p38MAPK eivät inhiboi iMDK vuonna H441 keuhkoadenokarsinooma soluja (kuvio S3). Nämä tulokset osoittavat, että iMDK vaimentaa PI3K /AKT-reitin, mutta ei MAPK-reitin ja puolestaan ​​aiheuttaa apoptoosin H441-soluissa.

. Annosriippuvaisesti, fosforylaatio PI3K ja AKT ja surviviinin ilmentymiseen ja XIAP, anti-apoptoottisia tekijöitä, jotka vähentynyt, kun taas ekspressiota BAD, pro-apoptoottisen tekijän, lisättiin 48 tunnin kuluttua hoidon iMDK. Esitetty on immunoblottaus suoritetaan, kuten on kuvattu menetelmät. B. Time riippuvaa, fosforylaatio PI3K ja AKT ja surviviinin ilmentymiseen ja XIAP oli vähentynyt, kun taas ilmentyminen BAD lisättiin käsittelemällä iMDK pitoisuutena 50 nM. Immunoblottaus suoritettiin, kuten on kuvattu menetelmät.

iMDK estää keuhkojen kasvaimen kasvun ja indusoi apoptoosia ksenografti hiirimallissa

Sen määrittämiseksi, onko systeeminen anto iMDK estää kasvaimen kasvua

in vivo

, iMDK (9 mg /kg) injektoitiin intraperitoneaalisesti joko 3 tai 5 kertaa viikossa nude-hiirillä, joilla on ksenograftien peräisin H441 keuhkoadenokarsinooma soluja 14 päivää tuumorin istuttamisen jälkeen. Lung tuumoriksenografteja jatkui kontrolliryhmässä (DMSO käsitelty) ryhmän, kun keuhkojen kasvaimen kasvua pidätettiin iMDK hoidetuissa ryhmissä. Tilavuus kasvainten iMDK-käsitellyssä ryhmässä oli merkittävästi pienempi kuin kontrolliryhmän (kuvio 6A ja 6B). MDK ja fosforyloitu PI3K havaittiin keuhkojen kasvainten verrokkihiirten mutta ei iMDK-käsitellyissä hiirissä (kuvio 6C), mikä on yhdenmukaista

in vitro

tutkimuksissa (kuvio 5). DNA: n fragmentoituminen havaittiin TUNEL värjäys saatiin aikaan tuumoreissa iMDK-käsiteltyjen hiirten, mutta ei näihin verrokkihiiristä (kuvio 6D), mikä osoittaa, että iMDK indusoi apoptoosia

in vivo

samoin. Erityisesti hoito iMDK ei vaikuttanut painon ja seerumin ASAT ja ALAT hiirillä (kuva S4), mikä viittaa siihen, että iMDK ei aiheuta systeemistä myrkyllisyyttä.

. Kasvainten tilavuus peräisin H441 keuhkoadenokarsinooma solut laskettiin käsittelyn jälkeen iMDK (9 mg /kg) ksenografti hiirimallissa. DMSO: ta käytettiin kontrolliryhmän. iMDK annettiin 3 kertaa /viikko tai 5 kertaa /viikko, kuten on esitetty. Kahdeksan hiirtä käytettiin jokaiseen ryhmään. Kasvaimen tilavuus seurattiin jokapäiväistä siirrostuksen jälkeen ja H441-soluja. Kasvaimen kasvun ilmaistaan ​​kasvaimen keskimääräinen tilavuus; palkit kuvaavat SD. Tilastollinen merkitsevyys määritettiin p 0,01 (*). B. Kuvassa on kuva ksenograftikasvaimissa peräisin H441-soluja, jotka leikataan Ksenograftikudoksista hiirillä 10 päivä käsittelyn jälkeen iMDK. Expression of MDK ja fosforylaation PI3K (pPI3K) pienensivät iMDK hoito ksenograftikasvaimissa. Expression of angiogeneesiä markkeri CD31 /PECAM-1 estyi iMDK vaikka ilmentyminen angiogeneesin kasvutekijän VEGF ei muuttunut. Immunohistokemia suoritettiin käyttäen ksenografti tuumorisektioiden Menetelmät kuvatulla tavalla. Ohjaus on peräisin DMSO saaneen ryhmän. (Asteikko bar esittää 100 um). iMDK aiheuttaman apoptoosin

in vivo

. TUNEL värjäys kanssa ksenograftikasvaimissa käsiteltiin DMSO (kontrolli) tai iMDK suoritettiin, kuten on kuvattu menetelmät (asteikko bar esittää 200 um).

Koska MDK tiedetään indusoivan angiogeneesiä [29], pyrimme myös angiogeneesin inhibitiota iMDK saattaa osittain osaltaan vähentää keuhkotuumoreiden

in vivo

. Kuten on esitetty kuviossa 6C, VEGF: n ilmentymistä, toisen angiogeneesiä kasvutekijä [30], ei muuttunut, mikä on yhdenmukaista

in vitro

tutkimuksessa (kuvio 2); kuitenkin, ilmaus CD31 /PECAM-1, angiogeneesin markkeri [30], pelkistettiin keuhkotuumoreissa käsitellään iMDK, mikä osoittaa, että iMDK estää angiogeneesin riippumatta VEGF ja vuorostaan ​​estää keuhkojen kasvaimien syntyyn

in vivo

. Nämä

in vivo

tulokset osoittavat, että iMDK on todennäköisesti lupaava terapeuttinen antituumorigeenistä /angiogeenisten huumeiden kohdistaminen MDK ilmentävä keuhkosyöpä ilman haittavaikutuksia.

Keskustelu

menestys pienten molekyylien erityisesti estämällä EGFR toiminnon mutantti

EGFR

ajettavat keuhkoadenokarsinooma on edistänyt molekyylitason täsmähoitoihin keuhkosyöpään [4], [5], [31], [32]. Toisaalta, kohdennettuja hoitoja mutantti

KRAS

ajettavat keuhkojen adenokarsinooma ja keuhkojen levyepiteelikarsinooma ei ole kehitetty muita kuin kemoterapian, jotka kohdistuvat sekä syöpäsolujen ja normaalien jakautuviin soluihin [7] – [9]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tunnistaneet pienmolekyyliyhdisteen iMDK, joka estää ilmentymisen MDK, kasvaimen edistävä kasvutekijä. iMDK esti PI3K /AKT-reitin ja tukahdutti

KRAS

-mutated keuhkoadenokarsinooma indusoimalla apoptoosin

in vitro

ja

in vivo

. iMDK ei heikentänyt kannattavuutta normaalien lisääntyvien NHLF soluissa. Edelleen, ei ole selvää systeemistä toksisuutta havaittiin iMDK-käsitellyissä hiirissä, mikä tukee mahdollisen käyttökelpoisuuden iMDK terapiassa MDK-riippuvaisten keuhkoadenokarsinooma.

MDK tiedetään aktivoida paitsi PI3K /AKT-reitin, mutta myös MAPK väylän ensisijainen hermosolujen kulttuuri [16] ja sydänlihaksen [28]; kuitenkin, tutkimuksessamme iMDK esti vain PI3K koulutusjakso muttei MAPK-reitin, ja itse aktivoida MAPK väylän H441 keuhkoadenokarsinooma soluja (kuvio S3). Mekanismi, jolla iMDK estää vain PI3K reitti, mutta ei MAPK-reitti on tuntematon. Säätely on MAPK-reitin voi olla korvaavia aktivoitua sen downregulation PI3K väylän H441-soluissa. Hoito H441-solujen kanssa MAPK-inhibiittori (PD0325901) tai PI3K /AKT-estäjällä (LY294002) ei vaikuttanut ekspressioon MDK (kuvio S5 ja tietoja ei ole esitetty), mikä viittaa siihen, että suppressio MDK mukaan iMDK ei välittyy MAPK ja PI3K /AKT reittejä.

koska MDK ilmenee vahvasti hepatosellulaarinen, mahalaukun, peräsuolen ja eturauhasen syöpiä [17], MDK estäjä iMDK voi olla käyttökelpoinen hoidettaessa muita kuin keuhkokasvainten samoin. Lisäksi, MDK ilmentyminen liittyy erilaisia ​​tulehduksellisia sairauksia, mukaan lukien nivelreuma ja ateroskleroosi [19], [33].

Mdk

-knockout hiiret ovat vastustuskykyisiä kehittämiseen nivelreuman estämällä inflammatoristen leukosyyttimigraation ja osteoklastien [33]. Knockout-hiirillä on myös resistenttejä neointiman muodostumista, yhteinen piirre ateroskleroosin ja restenoosin [34]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että iMDK voivat olla käyttökelpoisia hoidettaessa näitä ei-tuumorigeenisiä sairauksia samoin.

Lisäksi iMDK tunnistimme toinen pieni molekyyli, yhdiste, joka tukahdutti myös ilmaus MDK. Toinen yhdiste on Cl sijasta F rakenteen iMDK molekyylin ja kohdistaa samanlainen annos vaikutuksen iMDK (tuloksia ei ole esitetty), mikä osoittaa, että iMDK voidaan rakenteellisesti modifioitu olevan tehokas ja turvallinen. Koska laajuus inhibitio

MDK

RNA oli pienempi kuin MDK-proteiinia (tuloksia ei ole esitetty), iMDK voi kohdistaa MDK-proteiinin suoraan. Biotiini-merkitty iMDK tai radioisotooppileimatun iMDK tarvitaan tunnistamaan molekyylejä tai tekijöitä, jotka suoraan yhdistävät iMDK, joka johtaa siihen, että sen mekanismin ymmärtäminen, (t), jolla iMDK estää ilmentymisen MDK.

Yhteenvetona, olemme selvittäneet, että MDK estäjä iMDK vaimentaa ei-pienisoluinen keuhkosyöpä ilmentävien MDK

in vitro

ja

in vivo

vahingoittamatta normaalit solut. Vaikka lisätutkimuksia tarvitaan, mukaan lukien tunnistaminen iMDK kohdistu suoraa, lisää rakenteellista muuttamista ja turvallisuuden validointi, iMDK näyttää olevan lupaava hoito

KRAS

mutantti keuhkojen adenokarsinooma ja okasolusyöpä ja mahdollisesti hoitoon muiden syöpien ja krooniset tulehdussairaudet.

tukeminen Information

Kuva S1.

kasvun esto iMDK nostettiin MDK ilmentäviä soluja. iMDK johtuvan kasvun inhibitio MDK-positiivisia H441 keuhkosyövän solut ja HEK293-alkion munuais- soluissa, mutta ei MDK-negatiivinen A549 keuhkokarsinooma soluja.