Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Vaikka viimeaikaiset edistysaskeleet kiertävä DNA-analyysi mahdollistavat ennustamisessa kasvain genomien noninvasive keinoin, osa haasteista odottaa edelleen, jotka rajoittavat laajamittaisen käyttöönoton cfDNA syöpädiagnostiikassa. Analysoimme tilan kaksi parasta tunnettu peräsuolen syöpä (CRC) geneettiset ja epigeneettiset muutoksia kohortin CRC potilaiden, ja sitten verrataan sitä, missä määrin nämä kaksi kuvioita siirtyä kudoksesta plasman parantamiseksi ymmärrystä biologian moduloimiseksi vastaavuutta välillä kudosten ja plasman metylaation ja mutaatio profiileja.

Methods

plasma ja kasvainten kudokset kerättiin 85 potilasta (69 ± 14 vuotta, 56 miestä).

KRAS

ja

SEPT9

tila arvioitiin alleelin tulenkestävä mutaatio järjestelmä kvantitatiivinen PCR ja kvantitatiivinen metylaatiospesifistä PCR, vastaavasti. Kuusi yleisimpiä pistemutaatiot kodonissa 12 ja 13 tutkittiin

KRAS

analyysi.

Tulokset

KRAS

mutaatioita ja

SEPT9

promoottori metylaatio oli läsnä 34% (29/85) ja 82% (70/85) primaarituumorin kudosnäytteistä. Sekä geneettiset ja epigeneettiset analyysit cfDNA paljasti suuren yleistä vastaavuutta ja spesifisyys verrattuna kasvaimeen kudosta analyysit. Joilla oli sekä geneettisiä ja epigeneettiset muutokset kudosnäytteiden (31,8%, 27/85) katsottiin jatkotutkimuksiin. Mediaani metylaatio hinnat kasvainkudoksissa ja plasmanäytteet oli 64,5% (12,2-99,8%) ja 14,5% (0-45,5%), vastaavasti. Mediaani

KRAS

mutaatio kuormitus (yhteensopivaksi mutaatiot) oli 33,6% (1,8-86,3%) kudoksissa ja 2,9% (0-17,3) Plasmanäytteissä. Plasma /kudos (p /t) suhde

SEPT9

metylaatio oli merkittävästi suurempi kuin p /t suhde on

KRAS

mutaatio kuormitus, erityisesti varhaisessa vaiheessa syöpiä (p = 0,0108) .

Johtopäätös

tämän tutkimuksen tulokset osoittavat poikkeavia nopeudella epigenetic vs. geneettisiä muutoksia siirtymässä kudosta plasmasta. Monet tekijät voivat vaikuttaa mutaatio cfDNA analyysi, mukaan lukien sekä läsnäolo kasvain klonaalisen heterogeenisyys ja tiukka lokerointi

KRAS

mutaatio profiilin. Tässä tutkimuksessa korostetaan ottaen huomioon muutoksen luonne, kun analysoidaan kasvain- cfDNA.

Citation: Danese E, Minicozzi AM, Benati M, Montagnana M, Paviati E, Salvagno GL, et ai. (2015) vertailu Geneettiset ja Epigeneettiset Muutokset primaarikasvainten ja osuvan plasmanäytteistä Potilaat, joilla on peräsuolen syövän. PLoS ONE 10 (5): e0126417. doi: 10,1371 /journal.pone.0126417

Academic Editor: Anthony W. I. Katso, Queen Mary Hospital, HONGKONG

vastaanotettu: 11 helmikuu 2015; Hyväksytty: 01 huhtikuu 2015; Julkaistu: 06 toukokuu 2015

Copyright: © 2015 Danese et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

rahoitus: kirjoittajat eivät tuki ja rahoitus raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Evidence että kasvain geneettisen ja epigeneettiset muutokset voidaan havaita verenkierrossa DNA: ta plasmasta syöpäpotilaiden on osoittanut lupaus parantaa varhaisen diagnoosin, ennustettavuutta sekä tautien seurantaa. Keskeisenä tavoitteena hyödyntää solun vapaa DNA biomarkkerina liittyy hoitokäytännön optimointi, henkilökohtainen lääketiede kehitys ja elämänlaatu parantamisen takia minimaalinen invasiivisuus veren testaus. Kuitenkin todentaminen todellinen kliinisen voimassaolon eri soluttoman DNA (cfDNA) muutokset putatiivisiksi syöpä biomarkkereita kliinisessä käytännössä on edelleen haastava [1]. Johtava ongelma tällä hetkellä edustaa se, että kiertävä DNA-fragmentit kuljettaa kasvaimen spesifisiä muutoksia ovat vaihteleva ja yleensä pieni murto-osa kokonaismäärästä kiertävän DNA, mikä tuottaa korkean vaihtelua viskositeettiluku oli vuosina muutos malleja havaittavissa kudoksen primaarikasvainten ja vastaavat plasmassa.

vaikuttavia tekijöitä määrällinen sekä laadullinen muutokset cfDNA suhteessa kudoksiin syöpäpotilaiden on monia, ja ei ole vielä täysin tutkittu tähän mennessä. Kuitenkin pyrkimykset viime vuosikymmenen aikana on johtanut merkittäviä edistysaskeleita.

Arvioimalla mety-

PCDH10

geenin kudoksen ja plasman sairastavien potilaiden peräsuolen syöpä (CRC) olemme hiljattain osoittaneet että metylaatio korko havaittu plasmassa lisääntyi tiiviimmän metylaation nopeudella kasvainkudoksissa vain alkuvaiheen syöpien, kun taas tämä korrelaatio oli ilmeisesti kadonnut pitkälle edenneitä syöpiä. Lisäksi osoitimme, että aste cfDNA metylaation liittyi joitakin ominaisuuksia cfDNA, kuten sen pitoisuus ja eheys, ja että nämä korrelaatiot vaihtelivat suunnan ja voimakkuuden rinnan kasvain vaiheessa [2].

vuonna kahden viime vuoden aikana kaksi riippumatonta tutkimusryhmää osoitti, että mahdollisuus havaita kasvain erityisiä cfDNA plasmassa CRC potilaiden riippuu pitkälti herkkyys PCR-tekniikkaan perustuva menetelmä lyhyen mutatoitujen sekvenssien [3-5], jolloin korostetaan minimoida määrityksessä pituus analysoitaessa hyvin hajanainen cfDNA, kuten asettamisessa syöpäpotilaita.

kasvaimensisäisenä heterogeenisyys ja klonaalisen evoluutio aikana eteneminen ovat kysymyksiä monimutkaistaa käyttöä cfDNA nestemäisinä koepala syövän, koska molemmat tekijät tuottaa huomattavaa erot suhteessa ja rakenteessa poikkeamia havaittavissa primaarikasvaimen ja kiertävä DNA [6,7].

tämän todisteita, erilaiset tekniset ja biologiset näkökohdat tulee huomioida analysoitaessa muuttujan välistä yhdenmukaisuutta kudoksen ja plasman muutoksia syöpäpotilailla, eikä vähiten sen perustana olevaa muutoksia.

sekä epigeneettisellä ja geneettiset muutokset ovat tunnettuja poikkeavuuksien osallisena peräsuolen syövän synnyn. Koska niiden valtava potentiaali biomarkkereina CRC diagnoosi, lavastus, ennusteen ja hoitovasteen niitä on laajalti tutkittu viime vuosikymmenellä. Kuitenkin kriittinen vertailu vähään kudosten ja cfDNA puuttuu. Siksi tämä Tutkimuksen tarkoituksena oli analysoida tilan kaksi parasta tunnettu geneettiset ja epigeneettiset korjauksilla CRC (eli

KRAS

mutaatio ja

SEPT9

promoottori metylaatio) kohortin CRC potilaita, parantaakseen ymmärrystä biologisten näkökohtien moduloiva välistä yhdenmukaisuutta kudosten ja plasman metylaation ja mutaatio profiileja. Sitten, vertasimme myös, missä määrin geneettinen ja epigeneettiset kuviot siirtyä kudoksesta plasman.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat ja näytteet

Tutkimus ryhmä koostui 85 peräkkäisen leikkauspotilaiden CRC yliopistollisessa sairaalassa Veronan (Italia) välillä tammikuussa 2010 ja joulukuussa 2010 Verinäytteitä kerättiin ennen kirurgista resektiota. Kasvaimen näytteet saatiin kirurgian aikana, pakastettiin välittömästi nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Histologinen diagnoosi ja kasvainten vaiheessa arvioitiin mukaan vuoden 2000 Maailman terveysjärjestö (WHO) luokitusjärjestelmä kasvainten ruoansulatuskanavan ja amerikkalaisen sekakomitean Cancer (AJCC) pysähdyspaikan järjestelmä, vastaavasti [8]. Vain primaarisessa peräsuolen adenokarsinooman käsittelemättömät kanssa neoadjuvant radio-kemoterapian mukana tutkimuksessa. Tutkittavat antoivat kirjallisen suostumuksen on ilmoittautunut tässä tutkimuksessa. Tutkimuksen hyväksyi paikallinen eettinen komitea (Department of Life ja Reproduction Sciences, University of Verona) ja suoritetaan sopusoinnussa Helsingin julistuksen vuoden 1975 Clinical tiedot on saatu potilastietoja.

DNA eristys plasmasta ja kudosnäytteet

otettiin verinäytteet 7 ml EDTA-putkiin ja käsitellään 1 tunnin kuluessa keräyksen jälkeen. Sen jälkeen kun kahden sentrifugoimalla (800 g 10 minuutin ajan sentrifugoimalla, mitä seuraa erottaminen ja toinen 1600 g: ssa 10 min sentrifugoinnin), plasma erotettiin, säilytettiin alikvootteina ja pakastettiin -80 ° C: ssa, kunnes käsittely. DNA uutettiin plasmasta ja tuore kudosleikkeiden käyttäen QIAamp DNA Veri midi kit ja Gentra Purgene Kit (Qiagen, Hilden, Saksa), tässä järjestyksessä.

cfDNA keskittyminen ja Integrity index

cfDNA pirstoutuminen arvioitiin laskemalla DNA eheys indeksin kuten aiemmin on kuvattu [2]. Lyhyesti, se on määritetty laskemalla suhde suurempi (247 bp) verrattuna lyhyempi (115 bp) tavoitteet konsensussekvenssin ihmisen ALU toistaa. ALU-qPCR tulos saatiin ALU115 alukkeita käytettiin myös määrittämään kokonais-DNA.

metylointi PCR (MSP) B

puhdistettu genomi-DNA on uutettu kudoksista ja plasma saatettiin bisulfiittikäsittelyn ja DNA puhdistuksella käyttäen Epitect bisulfiittimodifiointi (Qiagen, Hilden, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Yksityiskohtainen protokolla on aikaisemmin raportoitu muualla [2].

bisulfiittimodifiointi modifioitua DNA: ta käytettiin templaattina Real-Time PCR käyttämällä SYBR green-pohjainen kvantitatiivinen MSP. Alukkeet MSP suunniteltiin nimenomaan monistamaan joko bisulfiitti-herkkä, metyloitumattomia säie tai bisulfiitin kestävä, metyloituja osio

SEPT9

geenin promoottorialue. Web-pohjainen ohjelmisto MethPrimer (https://itsa.ucsf.edu/urolab/MethPrimer) käytettiin valita tietyn CpG-saarekkeen, joka äskettäin löydetty kaikkein alttiimpia metylaation muutoksiin adenooma-karsinooma-sekvenssin [9] .

sekvenssit alukesarjat olivat seuraavat:

M-Fo: TTATTATGTCGGATTTCGCGGTTAAC

M-Rev: AAAATCCTCTCCAACACGTCCG

U- Fo: TAGTTATTATGTTGGATTTTGTGGTTAATG

U- Re: CAAAATCCTCTCCAACACATCCAC (M: metyloitu, U: metyloitumaton).

CpGenome Universal metyloidut DNA (Chemicon, Millipore Billerica, MA, USA) käytettiin 100% metyloitua (positiivinen ) ohjaus, kun taas DNA: ta perifeerisen veren mononukleaaristen solujen normaalien yksilöiden käytettiin metyloimattomia (negatiivinen) kontrolli.

PCR-reaktioseos valmistettiin lopulliseen tilavuuteen 20 ui, joka koostuu seuraavista pitoisuudet: 0,375 uM eteenpäin ja reverse-alukkeita, 250 uM kutakin dNTP: tä (GE Healthcare, Little Chalfont, UK), 1 x HotStart Buffer (Qiagen), 2,5 mM MgCI2: ta, 1,5 yksikköä HotStart-polymeraasia (Qiagen), 2 uM SYTO 9 (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA), ja 1 x ROX viite väriaine (Invitrogen), 3 ui bisulfiitti-modifioitua DNA: ta.

PCR-monistus suoritettiin precycling lämpöaktivaatiolla DNA-polymeraasi 95 ° C: ssa 10 minuutin ajan , jota seurasi 40 sykliä denaturointi 95 ° C 30 sekuntia, pariutuminen 64 ° C: ssa 30 sekunnin ajan ja pidennys 72 ° C: ssa 30 sekunnin ajan. ABI Prism 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems-Foster City, CA, USA) käytettiin.

PCR-tuote ajettiin 2% agaroosigeelissä vahvistaa tuotteen koon ja spesifisyys PCR, ja sitten näkyviksi UV-valossa. Bändi 110 bp pidettiin diagnostisia metylaatiostatuksen, kun taas bändi 114 bp pidettiin diagnostista unmethylation tila.

KRAS-mutaatio analyysi

DNA uutetaan kudoksesta ja plasmanäytteistä oli alistetaan alleelin tulenkestävä mutaatio järjestelmä qPCR (ARMS-qPCR) havaitsemiseksi kuusi yleisimmistä mutaatiot kodoneissa 12 ja 13

KRAS

geeni (G12A, G12D, G12V, G12S, G12C, ja G13A ). DNA monistettiin 25 pl reaktioseoksessa, joka sisältää 0,25 uM kutakin monistusalukkeen, 200 uM kutakin dNTP: tä (GE Healthcare, Little Chalfont, UK), 1 x HotStart Buffer (Qiagen, Hilden, Saksa), 2 mM MgCI

2, 2 yksikköä HotStart polymeraasia (Qiagen, Hilden, Saksa), 2 uM SYTO 9 (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA), 1 x ROX viite väriaine (Invitrogen) ja 25 ng DNA: ta. Alukesekvenssejä on aiemmin kuvattu muualla [10], lukuun ottamatta yhteisen käänteinen aluke, joka on suunniteltu uudelleen lyhentämiseksi amplikoneista molempien kodonin 12 (90 bp) ja kodonin 13 (85 emäsparia) (alunperin 149 ja 144 emäsparin pituinen). Saatu sekvenssi oli seuraava: TGTTGGATCATATTCGTCCACA.

PCR-monistus suoritettiin precycling lämpöaktivaatiolla DNA-polymeraasi 95 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 40 sykliä denaturointi 95 ° C: ssa 30 sekuntia, pariutuminen 64 ° C: ssa 30 sekuntia ja ekstensio 72 ° C: ssa 30 sekunnin ajan, ja ABI Prism 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems-Foster City, CA, USA). PCR-tuote on muuntunut näytteitä ajettiin 2% agaroosigeelissä vahvistaa läsnäolo erityisiä bändejä.

kvantitatiivinen analyysi ja analyyttinen suorituskyky

Kynnyssyklit (Ct) käytettiin laskettaessa metylaatio korko ja mutaatio kuormitus kussakin näytteessä, seuraavalla kaavalla:% = 100 /[1 + 2 {Ct

met /mut-Ct

tyydyttämättömiä /WT}] [2,11]. Ctmet ja Ctunmet tarkoittavat kynnys jaksoa spesifinen metyloitu ja metyloitumaton valtiot, kun taas Mut ja WT viittaavat mutatoitunut ja villityypin alleelit, vastaavasti. Osuudet (%) metylaation korko tai mutaatio kuorma havaittu plasmassa verrattuna havaitaan kudoksista ilmaistiin plasma /kudos-suhde (p /t suhde).

mediaani vähintään kahden kaksoiskappaleanalyysiä mittausta laskettiin jokaisesta näytteestä, ja sitten käytetään tilastollisiin analyyseihin. Ennalta määritelty laatukriteerit asetettiin niin, että mittauksia Ct-arvot ovat yli 38 sykliä ulkopuolelle.

Koska on havaittu, että herkkyys cfDNA määrityksiä voidaan lisätä lyhentämällä koko amplikonien [5,6] alukkeet molemmille analyysit suunniteltu mahdollistamaan monistamisen tuotteiden pienempi kuin 120 emäsparia. Sisäiset määrityksen epätarkkuuden varten metylaation testi oli 9%. Alempi havaitsemisraja metyloitua DNA varten MSP määritykset (arvioitiin käyttäen sarjalaimennoksia Universal Metyloidut DNA) oli 1,5%.

määrityksen sisäinen epätarkkuuden varten

KRAS

analyysien vaihteli 2% ja 8%, riippuen mutaatio. Solulinja DNA lisäaineita sisältävän mutaation kiinnostuksen kohteena normaalin DNA tausta käytettiin arvioimaan havaitsemisraja ja vahvistetaan samalla instrumentti kulkee toimia positiivisina verrokkeina. Analyyttinen herkkyys ARMS-qPCR oli alle 2%, kuten aiemmin raportoitu [12].

Tilastollinen

Normaalius jakelu tarkastettiin kanssa Shapiro-Wilk testi ja jatkuvia muuttujia ilmoitettiin mediaani (alue) tai keskiarvo ± SD, tarvittaessa. Tilastolliset analyysit ja piirtämisen tietojen suoritettiin käyttämällä GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA). Diagnostinen suorituskyky cfDNA analyysin verrattiin kasvaimen kudoksen analyysi (nykyinen kultakanta) sen herkkyyden ja spesifisyyden erottamaan mutatoitunut /hypermetyloitunut ja mutatoitunut /metyloitumattomien yksilöitä. Ennustavan positiivinen ja negatiivinen ennustearvo laskettiin myös Fisherin tarkka testi. Nopeus vastaavuutta välillä kudoksen ja plasman profiileja määritettiin sopimuksen testi (ja arvot esitetään painotettu kappa (k) ± keskivirhe). Erot jatkuvia muuttujia analysoitiin käyttäen Mann-Whitneyn U-testiä. Korrelaatiot testattiin Spearmanin korrelaatio. Arvot p 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Viisikymmentä kuusi 85 potilasta aluksi arvioitiin niiden mahdollisten sisällyttämistä tutkimuksessa oli miehiä, loput naisia ​​(keski-ikä 69 ± 14 vuotta ). Kasvain vaiheessa jakauma oli seuraava: 15 potilasta olivat vaiheessa I (17,6%), 35 vaiheessa II (41%), 24 vaiheessa III (28,2%) ja loput 11 vaiheessa IV (12,9%). Kaksikymmentä yhdeksän 85 kasvain kudosnäytteistä (34%) olivat positiivisia yksi kuudesta

KRAS

mutaatioita että meillä on testattu. Näistä 22 tuumorikudokset osoittivat Hyväksytty mutaatioita Plasmanäytteissä. Kaiken cfDNA analyysi osoitti 89,4% (76/85) vastaavuutta varten

KRAS

tunnistus kasvaimeen kudoksen analyysi (k = 0,753 ± 0,077, p 0,0001). Oli yhdeksän ristiriitaisia ​​tuloksia joukossa 85 tutkitut näytteet. Viisi tulokset osoittivat WT genotyyppi

KRAS

-tested mutaatioiden cfDNA analyysi, kun taas kasvain kudos analyysi osoitti

KRAS

G13D-mutaatio (n = 2),

KRAS

G12D mutaatio (n = 2) tai

KRAS

G12V mutaatio (n = 1). Kaksi potilasta (sekä vaihe II) osoitti

KRAS

G12S ja G12A mutaation plasman analyysiä, mutta määritettiin WT kasvaimen-kudosta testaus. Lopulta kaksi potilasta (sekä kehittyneet metastaattinen CRC) näytteillä verraton mutaatioiden välillä kudoksen ja plasman.

SEPT9

promoottori metylaatio esiintyi 82,3% (70/85) primaarituumorin kudosnäytteiden . Analyysi osoitti 86% (73/85) yhteensopivuutta cfDNA analyysi (k = 0,630 ± 0,092, p 0,0001). Ristiriitainen tuloksia vain potilaiden käyttöön poikkeava metylaatio

SEPT9

kudosnäytteistä ja metyloitumattomat plasmanäytteiden (n = 12).

Jakelu positiiviset ja negatiiviset näytteet kudos ja plasma on esitetty taulukossa 1, yhdessä analyyttistä suorituskykyä cfDNA analyysien.

Kun poissulkeminen kaksi potilasta eri

KRAS

genotyypin kudosten ja plasma, 27 potilasta (81,5% miehiä) näytetään sekä geneettiset ja epigeneettiset muutokset kudosnäytteiden (31,8%, 27/85) katsottiin edelleen kvantitatiivisia analyyseja. Näillä potilailla määrä välistä yhdenmukaisuutta kudoksen ja plasman oli 93% (25/27) varten epigeneettiset muutos ja 81% (22/27) ja

KRAS

mutaatio analyysin (ts, kaksi cfDNA näytteet olivat kielteisiä ja metyloinnin

SEPT9

ja viisi olivat negatiivisia, kun läsnä on

KRAS

mutaatioita). Niistä eri KRAS-mutaatiot, jotka olemme testattu, G12V korvaaminen oli kaikkein edustaa (n = 11), minkä jälkeen G12D (n = 7) ja G13D (n = 7). Lopuksi yksi näyte osoitti G12A mutaatio, kun taas G12S löytyi toiseen. Kaiken kaikkiaan 74% ja 26% mutaatio Kohteet sijaitsivat kodoneissa 12 ja 13, vastaavasti.

Mediaani

SEPT9

metylaatio hinnat kasvainkudoksissa ja plasmanäytteet oli 64,5% (12,2-99,9 %) ja 14,5% (0-45,5%), vastaavasti. Mediaani

KRAS

mutaatio kuormitus oli 33,6% (1,8-86,3%) kudoksissa ja 2,9% (0-17,3%) Plasmanäytteissä. Määrällistä tietoa sekä geneettisiä ja epigeneettiset muutokset mukaan eri kliinisen patologisten ominaisuudet on esitetty yhteenvetona taulukossa 2. Mitään merkitseviä löydettiin sukupuoli, primäärikasvain päällä ja erilaistumista asema sekä kasvain kudosten ja plasmanäytteiden. Mitä patologinen vaiheessa luokittelun, mediaani metylointi nopeudella

SEPT9

oli merkitsevästi korkeampi myöhäisvaiheen syöpä kudoksiin kuin alkuvaiheessa kudoksiin. Tilastollisesti merkittävää korrelaatiota ei havaittu välillä kudoksen ja plasman

SEPT9

metylaatio korko (r = 0,407, p = 0,035), kun taas ei assosioitunut kudoksen ja plasman

KRAS

mutaatio kuormitus (r = 0,092, p = 0,651).

Muita analyysit suoritettiin p /t suhde on

KRAS

mutaatio kuormitus ja

SEPT9

metylaatio korko, tunnistaa mahdolliset erot geneettisen ja epigeneettiset verran siirtymistä kudoksesta plasman. P /t suhde

SEPT9

metylaatio oli merkittävästi suurempi kuin p /t suhde

KRAS

mutaatio kuorman (24,2% vs. 7,9%, p = 0,0228), molemmat parametrit osoittavat laaja kirjo arvo (0-72,9% varten

SEPT9

p /t-suhteen ja 0-62,6% ja

KRAS

p /t suhde). Tämä havainto johtui lähes kokonaan suuri ristiriita geneettisten ja epigeneettiset p /t suhteet havaittavissa alkuvaiheen syöpien (p = 0,0108), koska ero pitkälle syöpiä ei ollut enää merkitsevä (p = 0,6806) (kuvio 1). Pitoisuus cfDNA alkuvaiheessa CRC potilasta (mediaani 30,6 ng /ml, 4,6-66,8) oli alhaisempi kuin pitkälle edenneessä vaiheessa potilailla (80,2 ng /ml, 31,0-195,0, p = 0,0001). CfDNA todettiin myös olevan hajanaisempi (eheys indeksi: 0,36, 0.0.7-0.85 vs 0,63, ,33-,95; p = 0,0163). Mitään merkittävää esiintynyt eroja cfDNA parametrien ja geneettisiä tai epigeneettiset muutokset, lukuun ottamatta heikko korrelaatio cfDNA eheys indeksin ja

KRAS

mutaatio kuorma pitkälle edenneitä syöpiä (r = 0,572, p = 0,040).

keskustelu

Vaikka käyttö cfDNA mahdollisina korvike syövän genomi on alun perin ehdotettu yli 30 vuotta sitten [13], ja rooli nestettä koepala on arvioitu sen ennakoivaa ja prognostiset arvo useissa asetuksia lupaavia tuloksia, cfDNA-pohjainen syöpä testejä ei ole kehitetty kliiniseen käyttöön toistaiseksi.

pirstoutuneisuus yhdistettynä alhainen veren pitoisuuden tekevät cfDNA haastava analyytille teknisen näkökulmasta. Lisäksi vielä epävarma kinetiikka kasvaimeen liittyvien cfDNA verenkiertoon vapauttamisen ja geneettinen koostumus muuttuu aikana etenemisen sekä vaikuttaa siihen, että cfDNA ”kova lukea” analyyttiin, jopa biologinen näkökulmasta.

tulokset tutkimuksessamme muu kuin vahvistetaan, että neste koepala ennustaa muutoksia kasvaimen kudokset, ovat sopusoinnussa hypoteesin, että jotkut erot voivat olla joukossa nopeus, jolla geneettisiä ja epigeneettiset muutokset siirtyä kudoksesta plasman.

jotta tulokset vähemmän alttiita teknisiä häiriöitä ja tehdä geneettiset ja epigeneettiset luotettavia ja niiden suoraan vertailukelpoisia, otimme useita menetelmiin keinoihin muokattu tuoreita julkaisuja. Ensimmäinen analyysi tehtiin plasman koska tämä biologinen matriisi edustaa parempi lähde cfDNA kuin seerumin [1, 6]. Sitten käytimme suhteellisen lyhyessä amplikonien sekä määrityksen, ja tämä johtui siitä, että kun fragmentin pituus voi vaikuttaa herkkyyteen havaita mutaatio ja metylaatio [5, 14, 15]. Olemme myös varmoja korkean herkkyyden epigeneettiset määrityksen kohdistamalla tiettyyn CpG-saarekkeen, jota on viime aikoina näyttää korkeimman alttiutta metylaation muutoksiin adenooma-karsinooma-sekvenssin [9]. Lopuksi, mukaan American Society for Clinical Oncology ja National Kattava Cancer Network (NCCN), korkean tason havaitseminen määrä on saatu

KRAS

mutaatio analyysiin kohdistamalla kuormittajat kodonissa 12 ja 13, jotka ovat tiedossa sen osuus on noin 95% kaikista mutaatioista [16].

Tässä tutkimuksessa, joka on metylaatiospesifisen qPCR ja ARMS-qPCR perustuvia menetelmiä käytettiin

SEPT9

metylaatio ja

KRAS

mutaatio analyysejä, vastaavasti. Johtuen tärkeä tekninen kehitys, uudet menetelmät, kuten digitaalinen PCR [17], Inteplex qPCR [14] säteilevä tekniikkaa [18], MethyLightTM kvantitatiivinen tai MethyLightTM digitaalinen PCR [19] ja uusi syvä sekvenssit lähestymistapoja [20] ovat nyt saatavilla, mikä mahdollistaa absoluuttisia mutantti tai denaturoitua alleeleissa hyvin matalilla taajuuksilla ja pienemmillä epätarkkuus kuin raportoitu tässä. Kuitenkin määrityksiä että me tässä tutkimuksessa käytetyt ovat laajemmin saatavilla kliinisissä laboratorioissa, ja on ominaista optimaalinen herkkyys, joka pystyy havaitsemaan vähintään 2% muutos normaalissa taustalla [21]. Vielä tärkeämpää on, analyyttistä suorituskykyä geneettisten ja epigeneettiset määrityksissä olivat hyvin samanlaiset kannalta herkkyys ja tarkkuus, mikä mahdollistaa suoran vertailun tietoja eri muutoksia.

ensimmäinen osa tutkimuksesta, suoritetaan koko kohortin 85 CRC potilaiden merkittävästi vahvisti aikaisemmat näyttöä siitä, että analyysi

KRAS

ja

SEPT9

plasmassa voidaan nähdä luotettava vaihtoehto kudokseen. Tilan

KRAS

käytetään yleisesti ennustavan markkerina vastaus vahvistetaan epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) estäjät johtuu siitä, että mutantti

KRAS

liittyy vastustuskykyä EGFR monoklonaalinen vasta-immunoterapia, kuten centuximab tai panitumumabipitoisuus [22,23]. Toisaalta, poikkeava metylaatio promoottorialueen

SEPT9

geeni on vakuuttavasti ehdotettu herkkä ja spesifinen biomarkkeri aikaisin ei-invasiivisia diagnoosi CRC [24].

seuraavat ehdotukset äskettäin ehdottama Wasserkort ja coauthors [9], ja tästä syystä kohdennettava tiettyyn CpG saari promoottori

SEPT9

geeni, löysimme erittäin suuri määrä hypermetylated kudosnäytteistä (82%), vielä enemmän kuin aiemmin raportoitu kirjallisuudessa (tavallisesti vaihtelee välillä 78 ja 81%) [25]. Saadut tulokset täsmäsi plasmanäytteistä paljasti suuren maailmanlaajuisen konkordanssin (86%) ja spesifisyys (100%) verrattuna kasvaimeen kudoksen analyysi. Samasta näytteestä,

KRAS

mutaatio havaittiin 34%: lla potilaista, linjassa saadut muissa ikäluokat Valikoitumattomien CRC potilaista [10,26]. Vastaava analyysi plasmanäytteistä paljasti myös korkea vastaavuustaulukkoa (89,4%) ja spesifisyys (93%) verrattuna kudokseen. Useimmissa tutkimuksissa verrataan seurausta cfDNA määrityksessä kasvaimeen kudoksen analyysi raportoitu paljon pienempi diagnostinen suorituskyky, jossa arvot spesifisyys jatkuvasti alhaisemmat kuin 80% [27-29]. Poikkeuksena ainoastaan ​​kaksi viimeaikaiset tutkimukset Raportoidut arvot spesifisyyden on välillä 95,3% [30] ja 98% [14].

toisessa osassa tutkimuksessa olemme analysoineet nopeudella välistä yhdenmukaisuutta kudoksen ja plasman mutaatio kuormitus ja metylaation korko, ja saadut tulokset kahdesta analyysistä verrattiin sitten. Alaryhmässä 27 potilasta kätkeminen kudosten geneettiset ja epigeneettiset muutokset,

KRAS

mutaatio kuormitus vaihteli 1,8%: sta 86,3% (lähes 48-kertaisesti), mikä osoittaa suurempaa yksilöiden välisiä heterogeenisyys kuin

SEPT9

metylaatio nopeudella, joka vaihteli 12,2%: sta 99,9% (eli noin 8-kertainen). Siirryttäessä kudoksesta plasman, viisi näytettä tuli WT mutaation aseman ja kaksi oli enää hypermetyloitunut. Aste metylaation siirtymässä kudoksesta plasman oli lähes 3 kertaa korkeampi kuin mutaation kuormitus saatiin vertaamalla kahden p /t suhde (24,2% vs. 7,9% p /t suhde on

SEPT9

metylaatio korko ja

KRAS

mutaatio kuormitus, vastaavasti). Suostumuksella tuoreet raportit, tämä havainto saattaa selittyä kasvaimensisäisenä heterogeenisyys primaarikasvaimen, joka ensisijaisesti heikentää geneettinen pikemmin kuin epigeneettiset analyysi [7, 31]. Kuitenkin, koska havaittu poikkeama kahden p /t suhde on yksinomaan johtuu saadut tiedot varhaisessa vaiheessa syöpiä taas klonaalinen kehitys yleensä silloin, kun etäpesäke kehittyy, kasvain klonaalisuuden vain osittain selittää havainnot [32].

KRAS

analyysi, vertailukelpoisia arvoja mutaation kuorman saatiin varhaisen ja pitkälle edenneisiin syöpiin sekä kudoksen (26,9% vs. 34,7%) ja plasmanäytteet (1,9% vs. 4%), niin, että p /t analyysi ei paljasta merkittäviä eroja mukaan kasvaimen vaiheisiin (8,6% vs. 7,3%). Toisaalta tilastollinen merkitsevä ero havaittiin

SEPT9

metylointianalyysi välillä p /t suhde alussa ja pitkälle edenneitä syöpiä (33,8% vs. 19,0%, p = 0,0108). Tämä vaihtelu johtui yksinomaan poikkeamasta Metylointilaitteistoon korko havaittu kudoksissa (57,2% vs. 80,8%, p = 0,0009), koska ei havaittu mitään eroja Plasmanäytteissä (15,8% vs. 12,9% varhaisen vs pitkälle edennyt). Siten siirtymä DNA kätkeminen epigeneettiset muutos verenkiertoon alkuvaiheen syöpien on näennäisesti yhtenäisempi kuin siirtyminen DNA kätkeminen

KRAS

mutaatio. Mukaan uusimmilla kirjallisuudessa tietoja, tästä todisteita voidaan tulkita johtuvan eroista kudostyypeissä osallistuminen aiemmin havaittu CRC geneettiset ja epigeneettiset allekirjoitukset [33]. Erityisesti, kun taas

SEPT9

poikkeava metylaatio peräisin epiteelisoluissa ja on sitten nopeasti siirtyy stroomasolut [9],

KRAS

mutaatiot tunsivat epiteeli- laatikolla ei jaeta stroomasolut [ ,,,0],34]. Näin ollen molekyyli cross-talk välillä kasvain epiteelin ja strooman esiintyvät varten

SEPT9

epigeneettisellä muutos saattaa helpottaa siirtymistä poikkeavien DNA primäärikasvain kiertoon.

Lisäksi alhaisemmat aste mutaation kuorman suhteessa metylaation korko havaittu CRC kudoksissa (26,9% vs. 57,2% alkuvaiheen syöpien) saattanut vaikuttaa parantaa laimennusvaikutuksen villi tyyppihyväksynnän

KRAS

DNA verenkierrossa .

Yhteenvetona tulokset Tämän tutkimuksen vahvistavat, että cfDNA analyysi on sopiva strategia kattava analyysi kasvaimen geneettiset ja epigeneettiset profiilit, jopa käyttämällä rutiinimenetelmiä. Mikä tärkeintä, me edellyttäen ensimmäiset todisteet siitä, että maksua, johon kasvain peräisin cfDNA voidaan havaita verenkiertoon riippuu paitsi herkkyydestä käytettyjen menetelmien ja monimutkaisuus vapautumiskinetiikka, vaan myös laadusta yhden muutos. Aikana, jolle on ominaista lisääntyvä käyttö kattavan geeniekspressiotutkimuksissa kiinteiden kasvainten valaista monimutkaisuus kasvain kudosten ja heterogeenisyys solun fenotyyppejä, meidän tutkimuksessa korostetaan paremmin luonnehtia syöpään kohdennettujen geneettisten ja epigeneettiset allekirjoituksia mukaan eri kasvaimen osastoihin, niin että merkitystä ja kliinistä arvoa cfDNA arviointi voidaan lopulta parantaa.

lisävarmistusmenetelmää tutkimukset voivat tukevat hypoteesia jo ehdottanut joidenkin kirjoittajien mukaan analyysiin cfDNA on arvokas vaihtoehto kudoksen analyysiin, mutta ne voivat myös tulla ensimmäinen valinta sekä geneettisiä ja epigeneettiset kasvain luonnehdinta tarjoamalla parempaa yleistä muotokuva pahanlaatuisten sairauksien [5, 14, 29, 30].