Krooninen sairaus

tiivistelmä

Altered ilmentymistä ja toimintaa lektiinin kaltainen hapettunut LDL-reseptori-1 (LOX-1) on liitetty useita sairauksia, kuten endoteelin toimintahäiriö, ateroskleroosi ja lihavuus. Näissä patologioita, oxLDLssä /LOX-1 aktivoi signalointireitteihin, jotka edistävät solujen lisääntymistä, solun liikkuvuus ja angiogeneesiä. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että

OLR

1 mRNA yli-ilmaistaan ​​vaiheen III ja IV ihmisen eturauhasen adenokarsinoomia. Kuitenkin toiminta LOX-1 eturauhassyövässä angiogeneesin on vielä määrittämättä. Tavoitteena oli analysoida osuus oxLDL ja LOX-1 tuumoriangiogeneesissa käyttäen C4-2 syöpäsolujen. Analysoimme ilmentymisen angiogeneesiä molekyylejä ja angiogeneesiä eturauhassyöpään tuumoriksenografteja käyttäen eturauhassyövän solumalleja yliekspressioon tai knockdovvn LOX-1-reseptori. Tuloksemme osoittavat, että aktivointi LOX-1 käyttäen oxLDL lisää solujen lisääntymistä, ja ilmaisu pro-angiogeenisten molekyylien VEGF, MMP-2, ja MMP-9: n annoksesta riippuvalla tavalla. Huomattavasti, nämä vaikutukset estää, C4-2 eturauhassyövän malliin LOX-1 ilmentymisen joka pudotettiin. Angiogeeninen vaikutus LOX-1 aktivoitiin oxLDLssä osoitettiin edelleen käyttäen aortan rengas määritys ja ksenograftimallia kasvaimen kasvun korioallantoiskalvoon kanan alkioita. Tämän vuoksi ehdotamme, että LOX-1 aktivaatio oxLDLssä on tärkeä tapahtuma, joka vahvistaa kasvaimen angiogeneesiä ihmisen eturauhasen syöpäsoluja.

Citation: González-Chavarría I, Cerro RP, Parra NP, Sandoval FA, Zuñiga FA, Omazábal VA, et ai. (2014) lektiini-Like Hapettunut LDL-reseptori-1 Onko Enhancer tuumoriangiogeneesin Human Prostate Cancer Cells. PLoS ONE 9 (8): e106219. doi: 10,1371 /journal.pone.0106219

Editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 07 helmikuu 2014; Hyväksytty: 29 heinäkuu 2014; Julkaistu: 29 elokuu 2014

Copyright: © 2014 González-Chavarría et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Fondecyt Grant 1121159, CONICYT, Chile. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

lektiininkaltainen hapettuneen LDL-reseptori-1 (LOX-1) on jäsen sieppaajareseptori perhe [1], joka välittää tunnustamista ja sisäistämisen hapettuneen LDL (ox-LDL) [2 ]. LOX-1 ekspressoituu pääasiassa endoteelisoluissa, vaikka tämä reseptori löytyy myös monissa muissa solutyypeissä, kuten monosyytit, cardiomiocytes, adiposyyttien, verihiutaleet, makrofagit ja sileän lihaksen soluissa [3]. Muuttunut ilmentyminen ja toiminta LOX-1-reseptori on liitetty tauteihin, kuten endoteelin toimintahäiriö, ateroskleroosi, lihavuus, ja viime aikoina myös kasvaimen kehittymisen [4] – [6]. Aktivointi LOX-1 oxLDL ihmisen endoteelisoluissa indusoi adheesiomolekyylien ilmentymistä; tulehdusta signalointireittien; ja pro-angiogeenisten proteiinien, kuten metalloproteinaasi-2 ja 9 (MMP-2 ja MMP-9), angiotensiini II (Ang II) ja verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) [7] – [10]. Angiogeneesi on fysiologinen prosessi, joka määrittää muodostuu uusia verisuonia ennestään aluksia [11]. Sitä pidetään normaali ilmiö alkionkehityksen aikana, organismin kasvun ja haavan paranemista [12]. Kuitenkin angiogeneesi on myös keskeinen prosessin kehittymistä ja etenemistä useita kasvaimia [13]. Tuumoriangiogeneesissa säätelee tasapaino pro- ja anti-angiogeenisten molekyylien vapautuu kasvainsolujen ja kasvaimen stroomasolujen kuten fibroblastit ja makrofagit, jotka määräävät päälle- tuumoriangiogeneesin [14], [15]. Geeni ilmentyminen kasvaimen angiogeneesi säätelee lisäksi vastauksena useisiin ärsykkeisiin, kuten hypoksia, oksidatiivista stressiä ja tulehdusta. Tässä yhteydessä ärsykkeiden välillä ja pro-angiogeenisen proteiinin ekspressiota, VEGF: n on havaittu olevan merkittävä tekijä kasvaimen angiogeneesissä [16], [17]. Hypoksia, sytokiinieritystä ja oksidatiivisen stressin kasvainsoluissa lisäävät VEGF: n ilmentymistä, mikä indusoimaan kasvaimen angiogeneesiä [18].

LOX-1: n on ehdotettu mahdolliseksi yhteyden, dyslipidemia, ja syöpä [19] . Johdonmukaisesti, kliinisten tilojen lihavuuden ja ateroskleroosi on yhdistetty kasvaimen etenemiseen ja etäpesäkkeiden eturauhassyövässä [20] – [22]. Potilaat diagnosoitu metabolinen oireyhtymä, krooninen tulehduksellinen sairauksien ja autoimmuunisairauksien olosuhteissa havaittiin huomattava määrä tapauksia ja aggressiivisuutta kasvainten kehittymiseen [23]. Todellakin, viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet lisääntynyttä ilmentymistä LOX-1 ihmisen eturauhasen adenokarsinooman vaiheiden III ja IV [5], jotka edellyttävät uusia vaskularisaation ja angiogeneesin paikallisen invaasion. Kuitenkin spesifinen vaikutus LOX-1 kasvaimen angiogeneesi ei ole vielä kuvattu.

Tämä työ osoittaa, että LOX-1 ja sen aktivoinnin avulla oxLDLssä aiheuttaa kasvaimen angiogeneesiä ja stimuloivat soluproliferaatiota eturauhasen syöpäsoluja. Erityisesti, me osoitamme, että aktivointi LOX-1 käyttäen oxLDL edistää solujen lisääntymistä, ja ilmaisu pro-angiogeenisten molekyylien VEGF, MMP-2, ja MMP-9: n annoksesta riippuvalla tavalla. Erityisesti nämä vaikutukset estää, C4-2 eturauhassyövän malliin LOX-1 ilmentymisen joka pudotettiin. Lisäksi angiogeeninen vaikutus LOX-1 aktivoidaan oxLDLssä osoitettiin käyttäen aortan rengas määritys ja ksenograftimallia kasvaimen kasvua pojan korioallantoiinikalvojen (CAM) kanan alkioita. Siksi ehdotamme, että LOX-1 aktivaatio oxLDL on merkitystä aktivaatioreitin tarvitaan angiogeenisten parantamiseksi kasvaimen kehittymisen ihmisen eturauhasen syöpäsolujen.

Tulokset

Generation eturauhassyövän solulinjoissa, jotka yliekspressoivat LOX-1 ja shRNA vastaan ​​olr1

C4-2 eturauhassyövän solulinjaa transdusoitiin lentiviruksen ekspressiovektorilla LvCW-LOX-1, joka koodaa

olr1

säätelyn alaisena sytomegaloviruksen promoottori (CMVP), ja eristettiin käyttäen rajoittavan laimennuksen kloonaus menetelmällä. Yli-ilmentymisen LOX-1 in C4-2-soluissa määritettiin käyttäen reaaliaikaista PCR, immunoblottauksen, ja immunofluoresenssilla. Seitsemän eri kloonien LOX-1 yliekspressio saatiin, ulos näistä, 3 kloonit valittiin jälkeen Western blot kokeita ja analysoidaan käyttäen reaaliaikaista PCR (Kuva. 1 A ja D). Valitun solun klooni C4-2 /​​LOX-1 (+) (klooni 5) oli 1,2 x 10

3-kertainen ilmaisun yli perustason LOX-1 mRNA-tasot natiivin C4-2 solulinjan tai C4-2 /GFP yli-ilmentymisen kontrolli. Lisäksi, LOX-1 yli-ilmentymisen tässä klooni immunolocalized solukalvon käyttäen konfokaalimikroskopialla (Fig. 1 F). Sen määrittämiseksi, ovatko yliekspressio välittämä lentiviraalinen hiukkasia vaikuttanut ekspressioon LOX-1, yli-ohjaus (C4-2 /​​GFP solut) tuotettiin. Emme havaittu merkittäviä muutoksia ilmentymistä LOX-1 Tässä ohjaus verrattuna natiivi C4-2-solulinjassa (kuvio. 1C ja F).

A) Western blot varten LOX-1 (40 kDa ) ilmentyminen ihmisen CaP klooneja yliekspressioon LOX-1. B) Western blot LOX-1 (40 kDa) ilmentyminen ihmisen eturauhassyövän solukloonien LOX-1 pudotus C) Reaaliaikainen PCR LOX-1 ilmentymisen kolme kloonia yliekspressioon LOX-1. D) Reaaliaikainen PCR LOX-1-ekspressio määritettiin kolme kloonia, jotka ilmentävät shRNA /LOX-1 (A), ja kolme kloonia, jotka ilmentävät shRNA /LOX-1 (B). Tulokset edustavat keskiarvo ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen suoritettiin kolmena rinnakkaisena, ja analysoitiin tilastollisesti käyttämällä yksisuuntaista varianssianalyysiä ja Dunnettin post-testissä; (***

p≤0.001

, **

p≤0.01

, *

p≤0.05

).

LOX- 1 pudotus on C4-2-soluissa saatiin aikaan käyttämällä shRNA mRNA: ta vastaan, jota koodaa

olr1

geenin. C4-2-solut transdusoitiin lentivirusvektoreita ilmentämiseen kunkin shRNA (LvV-U6 /

OLR

1) sekvenssin,

olr1

valvonnassa U6-promoottori. Transdusoidut solut eristettiin käyttäen rajoittavaa laimennusta kloonaus menetelmällä, ja LOX-1 down-ilmentyminen analysoitiin käyttämällä reaaliaikaisella PCR: llä, immunoblottaus, ja immunofluoresenssilla (Fig. 1). Kaksi eri shRNA sekvenssit, shRNA-A ja shRNA-B, analysoitiin. Kolme eri klooneja shRNA-A ja shRNA-B LOX-1 knockdown saatiin. Valittu shRNA-B klooni laski LOX-1 ilmentymisen 98%, verrattuna pohjapinta LOX-1 mRNA-tasot natiivin C4-2 solulinjan tai C4-2 /​​LvEmpty Knockdown ohjaus solulinja (Fig. 1 B-E). Lisäksi alas-ilmentymistä LOX-1 tässä klooni varmistettiin immunohistokemiallisesti (kuvio. 1 F). Sen määrittämiseksi, oliko knockdown välittämä lentiviraalinen hiukkasia vaikuttanut ekspressioon LOX-1 knockdown ohjaus (C4-2 /​​LvEmpty) tuli. Emme havainneet merkittäviä muutoksia ilmentymistä LOX-1 Tässä ohjaus verrattuna natiivi C4-2-solulinjassa (kuvio. 1C ja F).

eturauhassyövän solumalleja saatu, eli C4-2 /LOX-1 (+) [klooni 5], C4-2 /​​LOX-1 (-) [klooni shRNA-B1] ja natiivi C4-2 solulinjaa, käytettiin malleina kaikissa määrityksissä suoritettiin tässä työssä.

oxLDLssä ei ole sytotoksisuutta vaikutuksia eturauhassyövän solumalleissa

lähtien hapettumisen natiivin LDL normolipemic potilaan saimme osa keskitasoa hapettuneen LDL (oxLDL), joka tarkistettiin sukupolven konjugoitujen dieenien ja natriumboraattipuskurissa elektroforeesi 1%: isessa (Fig. 2A). Sen määrittämiseksi, oliko oxLDLssä saadun oli joitakin solumyrkkyvaikutuksessa Inkuboimme eturauhassyövän solumalleja kanssa oxLDL (25-150 ug /ml) 12 tunnin aikana. Tuloksemme osoittivat mitään sytotoksisia vaikutuksia oxLDL millään eturauhassoluhomoge- malleja Pitoisuusalueen analysoitiin (Fig. 2B). Olemme kuitenkin havaittu merkittävä kasvu soluproliferaatiota C4-2, C4-2 /​​GFP, C4-2 /​​LvEmpty ja C4-2 /​​LOX-1 (+) solujen malleja kaikille oxLDL pitoisuuksia käytetään, verrattuna samaan käsittelemättömään eturauhasen syöpäsolun malleja. Lisäksi merkittävä kasvu solujen lisääntymisen havaittiin C4-2 /​​LOX-1 (+) verrattuna C4-2, tai yli-ilmentyminen ja knockdown ohjaa kaikkia oxLDLssä pitoisuudet analysoitiin. Kuitenkin proliferatiivinen vaikutus oli täysin estää, C4-2 /​​LOX-1 (-) solumallin, kaikkien pitoisuudet analysoitiin (Fig. 2B).

A) oxLDLssä saatu ihmisen plasmasta hapetettiin 7 uM CuSO

4, seurattiin spektrofotometrillä λ 243 nm ja elektroforeesilla 1% agaroosigeeleillä kanssa natriumboraattipuskurissa. B) Sytotoksisuusmääritvs eturauhassyövän solu mallit käsiteltiin 25, 50 ja 100 ug /ml oxLDL 12 tunnin aikana. Tulokset edustavat keskiarvo ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen suoritettiin kolmena kappaleena ja tilastollisesti analysoitiin käyttäen yksisuuntaista ANOVA ja Dunnettin testin jälkeen (* tai #

p≤0.05

).

Euroopan oxLDLssä ligandin kasvattaa lauseke pro-angiogeenisten markkereita

eturauhassyövän C4-2 solulinja inkuboitiin kasvavien pitoisuuksien kanssa oxLDL (25, 50, 100 ug /ml) 12 tunnin aikana, ja ilmaisu pro-angiogeenisten markkereita VEGF MMP-2 ja MMP-9 analysoitiin käyttämällä reaaliaikaisella PCR: llä. Tulokset osoittavat merkittävää kasvua VEGF: n ilmentymistä, MMP-2 ja MMP-9, verrannollinen oxLDL pitoisuuksia käytetään, vastaavaan 3,5-, 2,5- ja 3-kertainen, kun 100 ug /ml oxLDL oli käyttää. Lisäksi LOX-1-ekspressio on myös suhteellisesti kasvanut pitoisuudet oxLDL käytetään, joka esittää 3-kertainen kasvu 100 ug /ml: lla (Fig. 3).

suhteellinen kvantitointi LOX-1, VEGF, MMP -2, ja MMP-9: n ilmentyminen käyttämällä reaaliaikaisella PCR: llä ihmisen eturauhassyövän solulinja C4-2 inkuboitiin konsentraation kasvaessa oxLDL (25, 50, 100 ug /ml) 12 tunnin ajan. Tiedot edustavat keskiarvoa ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen suoritettiin kolmena rinnakkaisena, ja analysoitiin tilastollisesti käyttämällä yksisuuntaista varianssianalyysiä ja Dunnetin testin jälkeen; (***

p≤0.001

, **

p≤0.01

, *

p≤0.05

).

Lisääntynyt ilmentyminen pro-angiogeenisten markkereita eturauhassyöpäsoluissa vaatii aktivoinnin LOX-1 oxLDL

syöpäsolujen malleja C4-2 /​​LOX-1 (-) ja C4-2 /​​LOX-1 (+) inkuboitiin 100 ug /ml oxLDL 12 tunnin aikana, ja ilmentyminen angiogeneesiä markkereita (VEGF, MMP-2 ja MMP-9) analysoitiin. Expression of VEGF, MMP-2 ja MMP-9 C4-2 solulinjassa inkuboitiin oxLDL kasvoi merkittävästi (2-, 2- ja 2,5-kertaiseksi), verrattuna niihin C4-2-soluissa (kuvio. 4A ). Mielenkiintoista on, että ilmentyminen angiogeneesiä markkereita aiheuttama oxLDL, on estettävä C4-2 /​​LOX-1 (-) eturauhassyövän solu malli. Toisaalta, stimulaatio C4-2 /​​LOX-1 (+) ja oxLDL lisäsi merkittävästi ekspressiota kaikkien angiogeneesiä merkkiaineita analysoitiin (VEGF: n ja MMP-2, 2-kertainen; MMP-9 3-kertainen), verrattuna niihin C4-2 soluihin. VEGF: n ilmentymistä, MMP-2, ja MMP-9: C4-2 /​​LOX-1 (+) solujen oli myös merkitsevästi lisääntynyt (1.6-, 1,5- ja 1,4-kertaiseksi), jopa ilman oxLDL stimulaatio, ja laski 20%, 50%, ja 20% vuonna C4-2 /​​LOX-1 (-) solut, verrattuna endogeenisen ekspression C4-2 solulinjassa ilman oxLDL stimulaatiota (Fig. 4A).

C4-2, C4-2 /​​LOX-1 (-), ja C4-2 LOX-1 (+) ihmisen eturauhassyövän solumalleja inkuboitiin kanssa tai ilman oxLDLssä [100 ug /ml] 12 tuntia. A) suhteellinen kvantitointi VEGF, MMP-2, ja MMP-9: n ilmentyminen analysoitiin käyttämällä reaaliaikaisella PCR: llä. Tulokset edustavat keskiarvo ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen suoritettiin kolmena kappaleena ja analysoitiin tilastollisesti käyttämällä yksisuuntaista varianssianalyysiä ja Dunnetin testin jälkeen; (***

p≤0.001

, **

p≤0.01

, *

p≤0.05

). B) Western blot VEGF lauseke (30 kDa). C) Tsymogrammi MMP-2 (72 kDa pro-muodossa; 64 kDa aktiivinen-muoto) ja MMP-9 (92 kDa pro-muodossa; 84 kDa aktiivinen-muoto) toiminta kunnostetussa alustassa.

Esikäsitelty väliaine eturauhasen syöpäsolujen malleja inkuboitiin oxLDL [100 ug /ml], kerättiin ja väkevöitiin. Myöhemmin VEGF ilmentyminen arvioitiin immunoblottaus, ja MMP-2 ja MMP-9 analysoitiin symografialla. Tuloksemme syytteeseen että VEGF ekspressio lisääntyi C4-2 soluja inkuboitiin oxLDLssä, kun verrataan C4-2 soluja ilman oxLDLssä, kun taas VEGF: n ilmentymistä estyi vuonna C4-2 /​​LOX-1 (-) soluja inkuboitiin oxLDLssä [ ,,,0],100 ug /ml]. Lisäksi VEGF: n ekspressio lisääntyi C4-2 /​​LOX-1 (+) solujen o ilman oxLDL hoitoa (Fig. 3B). Analyysi metalloproteinaasiaktiivisuus osoittivat lisäys gelatinaasimäärityksellä MMP-2 ja MMP-9 vakioitu liuos C4-2 soluista inkuboitiin oxLDLssä, ja esti kunnostetussa alustassa alkaen C4-2 /​​LOX-1 (-) solut inkuboitiin oxLDL. Lisäksi LOX-1 yli-ilmentymisen C4-2 /​​LOX-1 (+) solut osoittivat lisääntynyttä aktiivisuutta MMP-2 ja MMP-9 kanssa tai ilman oxLDL stimulaatio (Fig. 4C).

aktivointi LOX -1 mukaan oxLDLssä edistää sukupolven itää hiiren aortan renkaat

Analysoimme C4-2 malli soluja inkuboitiin oxLDLssä onko sukupolven endoteelin ituja voitaisiin tukea aortan rengas määrityksen mukaan ero eritystä pro-angiogeenisten markkereita. C4-2, C4-2 /​​LOX-1 (-) ja C4-2 /​​LOX-1 (+) solujen malleja inkuboitiin 100 ug /ml oxLDL 12 tunnin aikana, ja elatusaine kerättiin, konsentroitiin ja hoitoon hiiren aortan renkaat.

stimulaatio aortan renkaat vakioitua elatusainetta C4-2 ja C4-2 /​​LOX-1 (+) käsiteltyjä soluja oxLDL merkittävästi parannettu sukupolven ituja verrattuna käsittelemätön C4-2 solulinjassa. Kuitenkin erot aortan rengas versoa tuottamalla väliaine alkaen C4-2 /​​LOX-1 (-) tai ilman oxLDLssä stimulaatio, eivät olleet merkittäviä. Näin ollen, yli-ilmentyminen LOX-1 edistää ituja sukupolven kanssa tai ilman oxLDL stimulaatio (Fig. 5A).

A). Mikrovalokuvaus hiiren aortan renkaat ja kvantifiointiin ituja kohti renkaan inkuboitu kasvualusta eturauhassyöpään C4-2, C4-2 /​​LOX-1 (-), ja C4-2 LOX-1 (+) solut aikaisemmin stimuloidaan tai ilman oxLDLssä [100 ug /ml]. B) LOX-1 aktivaatio oxLDLssä edistää kasvaimen angiogeneesiä korkki ksenograftimalleissa siitä korioallantoiskalvoon kanan alkioita. Mikrovalokuvaus ja kvantifiointi kasvaimen verisuonten ksenografteissa on C4-2, C4-2 /​​LOX-1 (-), ja C4-2 LOX-1 (+) soluja, joita oli aikaisemmin inkuboitu kanssa tai ilman oxLDL [100 ug /ml], in kohdunkalvon kalvoja 10 päivän ikäisistä kanan alkioista. Tulokset edustavat keskiarvo ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen suoritettiin kolmena rinnakkaisena, ja analysoitiin tilastollisesti käyttäen yksisuuntaista varianssianalyysillä Dunnettin testin jälkeen (***

p≤0.001

, **

p≤0.01

, *

p≤0.05

).

aktivointi LOX-1 oxLDLssä edistää angiogeneesiä eturauhassyöpäsolu- ksenografteissa siitä korioallantoiskalvoon kanan alkioiden

angiogeneesiä tutkimuksia on korioallantoiskalvoon (CAM) kanan alkioiden, eturauhassyövän solukloonit C4-2, C4-2 /​​LOX-1 (-), ja C4-2 LOX-1 (+) esi-inkuboitiin oxLDL 100 ug /ml 2 tuntia. Noin 1 x 10

6 solua inokuloitiin sitten CAM 10 päivän ikäisistä kanan alkioista. Viisi päivää siirrostuksen jälkeen, kasvaimet poimittiin CAM ja missä määrin kasvaimen vaskularisaation analysoitiin. C4-2 soluja esi-inkuboitiin oxLDLssä kasvoi huomattavasti kasvaimen verisuonittumisen verrattuna käsittelemättömän C4-2 soluja. Edelleen, LOX-1 yli-ilmentymisen C4-2 /​​LOX-1 (+) solujen osoitti myös lisääntynyttä kasvaimen verisuonittumista, kun soluja inkuboitiin kanssa tai ilman oxLDL verrattuna käsittelemättömiin C4-2 soluja. Erityisesti, C4-2 /​​LOX-1 (-) solut, joita käsiteltiin oxLDL eivät osoittaneet merkittäviä eroja kasvaimen verisuonittumisen, verrattuna sekä C4-2 ja C4-2 /​​LOX-1 (-) käsittelemättömät solut (kuvio. 5B).

olr1

geeni on yli-ilmentynyt yleisillä array aineistoja alkaen metastaattinen eturauhassyöpä

kun tavoitteena onko havaitut vaikutukset tuumoriangiogeneesissa välittämiä oxLDLssä /LOX-1 in C4-2 eturauhasen syöpäsolujen ollut mitään kliinistä merkitystä potilailla, käytimme NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) tietokannasta, ilmentymisen

olr1

reseptorin GDS2545 aineisto, joka on eri eturauhassyövän etenemisen . Tämä tieto mahdollistaa vertaileva analyysi ihmisen metastaattisen eturauhassyövän kasvaimia, ensisijainen eturauhasen kasvaimia ja normaalin luovuttajan kudos. Tässä yhteydessä ilmaus

OLR-1

havaittiin merkittävästi lisääntynyt ensisijainen eturauhasen kasvaimet ja metastaattinen eturauhas- kasvaimissa verrattuna normaaliin eturauhasen kudosta (Fig. 6).

ilmentymisen

olr1

eri vaiheissa eturauhassyövän kasvaimen etenemiseen määritettiin käyttäen julkista tietokantaa GDS2545 NCBI Gene Expression Omnibus (GEO). Tulokset edustavat keskiarvo ± keskivirhe ihmisen normaalia luovuttajan kudos n = 17, ensisijainen eturauhasen kasvaimia n = 64 ja metastaattinen eturauhas- kasvaimet n = 50, jotka analysoitiin tilastollisesti käyttämällä

t

testi (

* p≤0.05

).

keskustelu

tässä työssä osoitamme ensimmäistä kertaa, rooli LOX-1-reseptorin ja sen aktivoinnin avulla oxLDLssä, proliferaatioon ja angiogeneesiin ihmisen C4- 2 eturauhasen syöpäsoluja. Erityisesti, me osoitamme, että kasvu oxLDL pitoisuuksina edistää solujen lisääntymistä ja merkittävästi ja suhteellisesti kasvattaa ekspression angiogeneesiä markkereita VEGF, ja metalloproteinaasien MMP-2 ja MMP-9. Lisäksi solujen stimulaatio LOX-1 oxLDLssä myös lisääntynyt ilmentyminen LOX-1-reseptori, tuottaa positiivista palautetta silmukan lox-1 ilmentymisen.

yhdistys LOX-1 ja oxLDLssä tauteja , kuten endoteelin toimintahäiriö, ateroskleroosi, akuutti sydäninfarkti, aivohalvaus, diabetes, kohonnut verenpaine, metabolinen oireyhtymä ja lihavuus, on tutkittu laajalti [3], [5], [24]. Lihavuus, itsessään, on myös liitetty tärkeänä riskitekijänä ateroskleroosin, tyypin 2 diabetes ja syöpä, sekä muut sairaudet [25]. Kliiniset tutkimukset osoittavat yhdistyksen välillä korkea seerumin oxLDLssä pitoisuudet ja lisääntynyt riski sairastua paksusuolen syöpään [26]. Lisäksi oxLDL pitoisuuksia on myös osoitettu lisäävän lihavilla potilailla [27].

Yhdenmukaisesti näiden havaintojen aiemmissa raporteissa olivat osoittaneet, että liikalihavuus on liittyy lisääntynyt riski sairastua erittäin pahanlaatuisten ja metastaattinen eturauhassyöpä [21 ], [28]. Lisäksi, siirtogeenisiä Adenokarsinooma Mouse Prostate (TRAMP) hiirimallissa, ruokinta hiiret kanssa hypercaloric ruokavalio, lisää histologinen luokka eturauhasen kasvaimia, määrä etäpesäkkeiden, tuumorin massa, ja aste vaskularisaation, verrattuna että TRAMP hiiriä ruokittiin normaali ruokavalio [29].

on erityisen merkittävää suhdetta kolesterolin ja eturauhassyöpä, koska androgeenireseptorin ja muiden steroidihormonien syntetisoidaan kolesterolista, ja ovat tärkeitä, kehittäminen ja ylläpito eturauhassyövän [30]. Fysiologisissa olosuhteissa androgeenien ovat mukana hankinta toisen seksuaalista ominaisuuksia, kasvua ja normaalia kehitystä eturauhasen. Ne ovat kuitenkin myös liitetty syövän etenemisen eturauhassyöpä [31]. Näin ollen, monet eturauhasen syöpien tehonnut androgeenien, lisäys kolesterolin sisäänottoa, joka on ensisijainen substraatti androgeenisynteesin [31], [32]. Tässä suhteessa tärkein lähde kolesterolia kasvainsolujen on LDL, joka on pääasiassa endocyted, että LDL-reseptorien (LDLR) [33], [34]. Katsomme kuitenkin, että hapetin ja proinflammatoristen kasvain microenvironment runsaasti ROS [35] voitaisiin edistää LDL muutokseen, lipoperoksidaatiota [36], välttäen tunnustusta LDLR ja suosimalla sen otto scavenger reseptorit oxLDL. Tämän mukaan olemme analysoineet ilmentymisen scavengers reseptoreiden muunnetun lipoproteiinien ja ilmaisu LDL-reseptorin GDS2545 aineisto, joka on saatu julkisen tietokannan (GEO-profiili) [37]. Siinä, havaitsimme merkittävää kasvua ilmaus scavenger-reseptorien

olr1, huivi

ja

scarb1

ala-kasvaimia ja etäpesäkkeitä eturauhassyövän, ja merkittävä kasvu ekspression

CD36

ja

olr1

reseptorin eturauhassyöpä etäpesäkkeitä verrattuna normaaliin eturauhasen kudosta. Mielenkiintoista on, että ilmaus LDLR osoittivat merkittävää vähenemistä sen ilmentyminen tuumorimetastaasissa ja mitään merkittävää eroa ei havaittu ensisijainen eturauhasen kasvaimia ja normaalissa eturauhasessa (tuloksia ei ole esitetty).

Kun tämä otetaan huomioon, korkeat pitoisuudet verenkierrossa LDL lihavilla potilailla, joilla on eturauhasen syöpä voisi edistää kasvaimen etenemistä läpi LOX-1 aktivaatio hapettamalla modifioitu LDL (oxLDL) syntyy hapettimen mikroympäristössä, läsnä eturauhasen kasvain strooman. Tässä suhteessa olemme tuottaneet keskitasoa hapettuneen LDL, jonka pitäisi olla edustava oxLDL läsnä kasvaimen mikroympäristössä. Tuloksemme osoittivat, että oxLDL käytettiin tässä tutkimuksessa ei ole sytotoksista vaikutusta mihinkään C4-2 syöpäsolujen malleja määritettiin. Tässä suhteessa on raportoitu, että oxLDL on ero sytotoksinen vaikutus riippuen solutyypistä. Syöpäsolut riviä K562 /AO2 (Leukemia) ja EC9706 (ruokatorven karsinooma) käsiteltiin oxLDLssä esittää korkeampaa solujen elinkelpoisuuden verrattuna rahtuakaan ei-kasvainsoluja, kuten HUVEC (ihmisen napalaskimon endoteelisolujen) [38].

Mielenkiintoista, havaitsimme merkittävän kasvun solujen lisääntymisen ja C4-2, C4-2 /​​GFP, C4-2 /​​LvEmpty ja C4-2 /​​LOX-1 (+) solujen malleja, koko alueella oxLDL pitoisuudet määritettiin verrattuna käsittelemättömiin solulinjoja. Myös C4-2 /​​LOX-1 (+) solujen malli oli suurempi lisääntymistä verrattuna kontrollisolujen malleja C4-2, C4-2 /​​GFP, ja C4-2 /​​LvEmpty, kaikki pitoisuudet määritettiin. Kuitenkin, proliferatiivinen vaikutus oxLDL on estettävä C4-2 /​​LOX-1 (-) solujen malli, joka osoittaa, että tämä vaikutus liittyy läheisesti aktivoinnin LOX-1-reseptorin oxLDL. Tässä mielessä, proliferatiivinen vaikutus edistää oxLDL /LOX-1 on kuvattu lihassoluissa, endoteelisoluissa ja hiljattain rintasyöpäsoluissa aktivaation kautta polkuja, jotka sisältävät p38 (MAPK), p44 /42 MAPK: n, ja NF-KB: kt [6 ], [39]. Kuitenkin proliferatiiviset vaikutukset syöpäsolujen ei vielä ole kuvattu.

In vitro

tutkimukset ovat osoittaneet, että oxLDL stimulaatio ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC: t) aktivoi ekspressiota LOX -1-reseptori, joka tuottaa yli-adheesiomolekyylien, tulehduksellinen proteiineja, ja MMP-2 ja MMP-9 metalloproteinaasien, [8], [40], [41]. Lisäksi endoteelisolujen naudan aortan käsiteltiin ox-LDL edistää hiussuonten muodostumista säädellään LOX-1, ja aktivointi NADPH-oksidaasin /MAPKinase /NF-kappa B: n, kasvun kanssa VEGF-ilmentymisen [9], [42]. Tuloksemme osoittivat, että VEGF: n ilmentymistä, ja aktivointi MMP-2 ja MMP-9, on tiiviisti välittyy oxLDL /LOX-1-C4-2 eturauhassyövän solulinjassa.

myös vahvistaa, käyttäen aortan rengas määritys ja kanan alkion CAM ksenograftimallia, että lisäys VEGF, MMP-2 ja MMP-9 ilmaisun välittämä LOX-1 /oxLDLssä on kasvainten angiogeeninen vaikutus sekä

in vivo

ja

ex vivo

C4-2 syöpäsolujen malleja. Tämä on yhdenmukaista aikaisempien

ex vivo

tutkimuksia, joissa angiogeneesiä tekijät, kuten angiotensiini II ei aiheuttanut kapillaarinen itää muodostumista aorttarenkaat eristetty

OLR-1 KO

hiirillä [10]. Samoin ablaatio

OLR-1

geeni merkittävästi pienensi suonikalvon uudissuonittumisen hiiren malleissa laserindusoidun vahinko [43]. Signalointi aiheuttama oxLDLssä /LOX-1 voi olla ratkaiseva rooli prosessissa tuumoriangiogeneesin koska mikroverisuonitiheys on tärkeä prognostinen indikaattori eturauhassyövässä, ja liittyy kliiniseen vaiheeseen, eteneminen, etäpesäkkeitä, ja eturauhassyöpä selviytymisen [44], [45].

Yhteenvetona osoitamme suora suhde lihavuuden tekijöiden, kuten LOX-1 /oxLDLssä ja tehostamalla ilmentymisen lisääntymistä ja angiogeneesiä markkereita, joilla on biologinen vaikutus kasvaimen angiogeneesiin

ex vivo

ja

in vivo

in C4-2 eturauhassyövän solut malleja. Siksi ehdotamme, että LOX-1 voisi olla olennainen säädin eturauhasen syöpäsolujen, joilla on kyky parantaa tuumoriangiogeneesissa kohti maligniteetti ja etäpesäkkeiden lihavilla potilailla.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Ihmisen C4-2 eturauhassyöpä [46], [47] ja HEK-293 FT-soluja kasvatettiin RPMI 1640 ja DMEM-alustassa vastaavasti, jota oli täydennetty 2 mM L-glutamiinia (Hyclone), 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja 1% penisilliini streptomysiiniä (GIBCO).

Eläimet

Male BALB /c-hiiriä hankittiin Harlan Winkelmann GmbH (Borchen, Saksa) ja sijoitettu valvotuissa ja steriili ambient olosuhteissa. Neljä hiirtä (8-12 viikkoa vanhoja) käytettiin kokeissa.

Munat

Gallus gallus domesticus

saatiin ISP (Instituto de Salud Pública, Chile), pestiin 7 iM kuparisulfaattia ratkaisu estää sienikontaminaatio, ja inkuboitiin 37,5 ° C: ssa ja 80% suhteellisessa kosteudessa 10 päivää. Munat käännetään ajoittain automaattisella dual kääntölaite (GQF Hova Batorissa Manufacturing Co. USA) estämään tarttumista ja repeäminen CA-munankuoren. Alkiot ympättiin C4-2 soluja malleja inkuboitiin 37,5 ° C: ssa, 80%: n kosteudessa ja 5% CO

2 5 päivän ajan.

Kaikki tutkimukset, joissa kokeilu eläimet olivat suuntaviivojen mukaisesti ja suositukset NIH Guide for Care ja käyttö Laboratory Animals (nykyinen painos) ja seurasi politiikan ilmoitettu Chilen Biosafety Manual of CONICYT (kansallinen Science and Technology). Kokeelliset protokollat ​​laadittiin tekijät ja hyväksytty institutionaalisten eettinen komitea. Kaikissa tapauksissa valvonta eläinlääkintäviranomaisten alkaen School of Biological Sciences, Universidad de Concepción, Chile, oli taattu. Kun hiiriä käytetään tutkimukseen, niiden majoitus- yksittäisissä huoneissa ja asianmukaista ruokinta, vesi ja terveys seurannan pysyvästi säädetty. Eläimet lopetettiin oli inhimillisesti käsitellään. He joutuivat aluksi anesthetization ja kaliumkloridi injektio laskimoon välttää kärsimystä.

ox-LDL valmiste

verinäytteet (20 ml) saatiin neljä vapaaehtoista, jotka allekirjoittivat kirjallisen suostumuksen. Tämä pöytäkirja hyväksyttiin eettinen komitea Universidad de Concepción, Chile. Ihmisen LDL (1,019-1,063 g /ml) eristettiin veriplasman terveiden koehenkilöiden peräkkäisellä ultrasentrifugoinnilla 4 ° C: ssa. LDL dialysoitiin suodatettiin (0,45 um) LDL-puskuria (150 mmol /l NaCl: a, 0,24 mmol /l EDTA, pH 7,4), vaihdetaan kolmesti, 36 tuntia 4 ° C: ssa. Kun laaja dialyysi PBS: ää vastaan, ja 3 muutokset, 36 tuntia 4 ° C: ssa, hapettuneen LDL valmistettiin inkuboimalla puhdistettiin LDL 7 uM CuSO

4 3 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Muutos LDL seurattiin spektrofotometrisesti kautta sukupolven konjugoitujen dieenien on λ 243 nm, ja sitten elektroforeesilla 1% agaroosigeelissä natriumboraattipuskuriin toteutettiin määrittää muutoksen elektroforeettisen migraation oxLDL verrattuna LDL. Geeli värjättiin 0,25% Coomassie Blue R-250, 2 tunnin ajan, ja väri poistettiin 4 tunnin aikana käyttäen 5% MeOH, 7,5% HOAc, 87,5% H

2O. Bändit LDL ja oxLDL analysoitiin Odyssey CLX instrumentti (LI-COR, EEUU).

Sytotoksisuus arviointi

eturauhassyövän solumalleja inkuboitiin 25, 50, ja 100 ug /ml oxLDL 12 tunnin aikana. Tämän jälkeen väliaine poistettiin, viljelmät pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella, ja solujen elinkyky mitattiin inkuboimalla viljelmiä 10 mg /ml 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5- difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) 37 ° C: ssa 30 min, ja mittaamalla absorbanssi aallonpituudella 570 nm liukoiseksi soluissa käyttäen UV-näkyvä SPECTROstar

Nano

spektrometri (BMG LABTECH, Saksa).

lentivirusvektoreita, jotka ilmentävät ORL-1 tai shRNA vastaan ​​olr1

ihmisen LOX-1-sekvenssi kloonattiin lentiviruksen pLCW vektori, generoidaan pLCW-LOX-1-rakenne.