Krooninen sairaus

tiivistelmä

kulutus sisältävien elintarvikkeiden resveratrolin tuottaa merkittäviä terveyshyötyjä. Resveratrol estää syöpää vähentämällä solujen lisääntymisen ja etäpesäkkeiden ja aiheuttamalla apoptoosin. Näitä toimia voitaisiin selittää sen kyky inhiboida (ERK-1/2), Akt ja tukahduttaa estrogeenin ja insuliinin kasvutekijän -1 (IGF-1) reseptori. Miten nämä prosessit ilmenevät osaksi antitumor toimia resveratrolin ei ole selvä. Käyttäen microarray-tutkimukset, osoitamme, että resveratroli vähensivät ilmentymistä eri eturauhasen-kasvaimeen liittyvän MikroRNA (MIRS), joka sisältää

miR-21

androgeeni-reseptorin negatiivinen ja erittäin aggressiivinen ihmisen eturauhasen syöpäsolujen, PC-3M-MM2. Tämä vaikutus resveratrolin nähtiin lisääntynyt solujen elinkykyä, muuttoliike ja invasiivisuus. Lisäksi resveratrolin lisääntynyt ilmentyminen tuumorisuppressorien, PDCD4 ja maspiini, joita säätelee negatiivisesti

miR-21

. Lyhyt häiritsevä (si) RNA vastaan ​​PDCD4 heikennettyjä resveratrol vaikutuksesta eturauhassyövän soluissa, ja samanlaisia ​​vaikutuksia havaittiin seuraavat yli ilmentyminen

miR-21

kanssa

pre-miR-21

oligonukleotideja. PC-3M-MM2-solut oli myös korkea fosfo-Akt (Pakt), jotka vähennetään sekä resveratrolin ja LY294002 (a PI3-kinaasi-inhibiittori).

MiR-21

ilmentymisen näissä soluissa näytti olevan riippuvainen Akt, kuten LY294002 vähensivät

miR-21

yhdessä samanaikaisesti kasvu PDCD4 ilmaisua. Nämä

in vitro

päätelmät toistamiseen tukevat vakavassa yhdistetyn immuunivajavaisiin (SCID) hiiren ksenograftimallissa eturauhassyöpää. Suun kautta resveratrol ei ainoastaan ​​inhiboi kasvaimen kasvua, mutta myös vähentynyt ilmaantuvuus ja metastaasien lukumäärän keuhkoleesioiden. Nämä kasvain- ja metastasoituneen-tukahduttava vaikutus resveratrolin liittyi alennettu

miR-21

ja Pakt, ja kohonnut PDCD4 tasolla. Vastaavia antituumorivaikutuksia resveratrolin havaittiin DU145 ja LNCaP-eturauhassyöpäsoluissa, jotka liittyvät tukahduttaminen Akt ja PDCD4, mutta riippumaton

miR-21

.Nämä tiedot viittaavat siihen, että resveratroli anti-kasvain toimia eturauhasen syöpä voitaisiin selittää osittain estämällä Akt /

miR-21

signalointireitistä.

Citation: Sheth S, Jajoo S, Kaur T, Mukherjea D, Sheehan K, Rybak LP , et ai. (2012) Resveratrol Vähentää Eturauhassyöpä Kasvua ja Metastasis estämällä Akt /MicroRNA-21 Pathway. PLoS ONE 7 (12): e51655. doi: 10,1371 /journal.pone.0051655

Editor: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 08 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 5. marraskuuta 2012 Julkaistu: 13 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Sheth et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat NIH Grant (R15CA135494), SIU School of Medicine Cancer Center Grant ja SIU School of Medicine huippuyksikkö Academic Medicine Award VR. SJ tukivat Yhdysvaltain puolustusministeriön Grant (PC100127). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Useat luonnontuotteita, kuten kurkumiini, isoflavone, resveratroli ja epigallactocatechin-3-gallate (EGCG), osoittavat tehon kasvun kontrolloimisessa ja etäpesäkkeiden eri syöpiä [1]. Tutkimukset viittaavat siihen, että ravinnon saanti joidenkin tuotteiden voisi tukea syövän ehkäisyyn tai tehostavat standardin kemoterapeuttisten aineiden. Resveratrolin (trans-3, 4 ’, 5-trihydroksistilbeeni) on polyphenolic antioksidantti löytyy maapähkinöitä, viinirypäleitä ja punaviiniä [2], [3], jolla on huomattavia terveysvaikutuksia [4]. Tämä yhdiste on osoittanut suotuisia vaikutuksia kokeellisessa syövän malleissa, joissa se tukahduttaa aloittamista, edistäminen ja etenemistä kasvaimia [5]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osallisina aktivointi apoptoottisen reitin mekanismina osuus anti-kasvain hyödyt resveratrol. Esimerkiksi, resveratroli inhiboi solun proliferaatiota ja indusoi apoptoosia ihmisen eturauhasen karsi- DU145-soluissa [6] ja akuutti lymfaattinen leukemia-solut [7]. Resveratrol tuottaa myös solusyklin pidätyksen PC3 ja DU145 androgen-tunteeton soluissa [8]. Kun siirtogeeniset adenokarsinooma Mouse Prostate (TRAMP) hiirimallissa resveratrolin on osoitettu saavan aikaan sen kasvaimen vastaisen toiminnan lisäämällä ilmentymistä estrogeenireseptori-β ja vähentämällä insuliinin kasvutekijä-1 (IGF-1) ja solunulkoisen signaalin säännelty kinaasi 1 /2 (ERK1 /2) fosforylaatio [9]. Jälkimmäinen toimet resveratrolin voitaisiin tuottaa sen kyky toimia agonistina /antagonisti estrogeenireseptoreihin eturauhassyövän soluissa [10].

Prekliiniset tutkimukset osoittavat hyödyllisestä toiminnasta resveratrolin ehkäisyssä ja hoidossa syövän, jossa muutama liittyviä sivuvaikutuksia. Kymmenen vuoden epidemiologinen tutkimus osoitti yli 50% pienempi rintasyövän riskiä naisilla, jotka nautittuina resveratroli kuluttamalla viinirypäleet mutta ei viinistä [11]. Useat faasin I ja faasin II kliinisissä kokeissa ovat parhaillaan käynnissä, resveratrol National Institute of Health (http: /clinicaltrials.gov). Esimerkiksi resveratrol tutkitaan parhaillaan faasin I tutkimuksissa vastaan ​​Wnt väylän paksusuolensyöpä. Resveratrol on myös käytetään vaiheen II kokeissa lymfoomapotilailla [12].

tehoa luonnontuotteita, kuten resveratroli, voi selittyä ainakin osittain kautta sääntelyn MikroRNA (miRNA) [ ,,,0],13]. MiRNA ovat pieniä ei-koodaavat RNA: t, jotka säätelevät koodaavat RNA: t at transkription jälkeisellä tasolla [14]. Useat viimeaikaiset raportit sotkea miRNA kasvun ja etäpesäkkeiden eri syöpiä [15], [16]. Up-regulation

asennuspalveli-

21 on havaittu useissa syövistä [14], mukaan lukien eturauhassyöpä [17], [18], [19], mikä viittaa siihen, että tämä miRNA voisi toimia biomarkkerina näitä syöpiä. Useat tutkimukset ovat sekaantuneet

miR-21

kasvaimen synnyssä. Esimerkiksi

miR-21

säätelee kasvua rintasyövän soluja (MCF7)

in vitro

ja vierassiirrännänmallissa hiirimallissa [20]. Nämä tutkijat myöhemmin osoitti, että

miR-21

säännellyn rintasyövän etäpesäke mukaan alaspäin säätelemällä tuumorisuppressorigeeneille, kuten ohjelmoidun solukuoleman 4 (PDCD4) ja maspiini [21].

MiR-21

on myös liitetty leviämisen ja etäpesäkkeiden hepatosellulaaristen syöpäsolujen vähentämällä fosfataasin ja tensin homologin poistetaan kromosomissa 10 (PTEN) [22]. Lisäksi

miR-21

säätelee paksusuolensyöpä intravasation ja etäpesäke paksusuolensyöpä kohdistamalla PDCD4 untuvatuotteen sääntelyä [23]. Viimeaikaiset raportit ovat myös tunnistettu luun morfogeneettinen proteiini-reseptori II (BMPRII) [24] ja Lucine runsaasti toista (in FLII) vuorovaikutuksessa proteiini 1 (LRRFIP1) [25] kohteina

miR-21

. Inhibitio

miR-21

lisääntynyt apopotosis ihmisen glioblastooma-solujen [26], mikä viittaa anti-apoptoottisen roolin tämän miRNA. Anti-apoptoottisen roolin

miR-21

on myös syynä induktioon antiapoptoottisten Bcl-2-proteiinia [20] ja mahdollisesti aktivaation tumatekijä (NF) -κB [27].

tässä tutkimuksessa osoitetaan, että resveratroli vähentää elinkelpoisuus ja invasiivisuus PC-3M-MM2-soluille ja kasvaimen kasvua vierassiirrekokeissa hiirimallissa estämällä

miR-21

ilme. Tämä toiminta välittyy estämällä Akt, ylävirran säätelijä

miR-21

geeni.

MTS-määritys suoritettiin PC-3M-MM2-solut vehikkeliä tai erilaisia ​​pitoisuuksia resveratrolin ( 5-100 uM) 72 h, joka osoitti, että resveratroli vähensi annosriippuvaisesti solujen elinkykyä.

B,

Vähennys solujen elinvoimaisuuden resveratroli oli aikariippuvainen että resveratroli-käsiteltyjen ryhmien (25 ja 50 uM) verrattuna ajoneuvoon.

C,

resveratrolin (25 ja 50 uM) lisäsi apoptoosin PC-3M-MM2 solujen aikariippuvainen tavalla määritettynä anneksiini V-FITC ja PI värjäystä.

D,

Resveratrol (25 uM) lisäsi apoptoosin PC-3M-MM2-solut, määritettynä TUNEL määrityksessä. Soluja käsiteltiin resveratrolin 24 tuntia ja käytetään TUNEL määrityksissä, kuten on kuvattu menetelmät. DAPI värjäys saatiin selville solutumien. Kuvat ovat näytetään. Mittakaava edustaa 100 um.

E,

Pylväsgrafiikka osoittavat prosenttia apoptoottisten solujen läsnä ollessa 25 uM resveratrolin esitetty

D

. Tiedot osoittavat, keskiarvo ± SEM vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen. Asteriski (*) tarkoittaa tilastollisesti merkitsevää eroa (p 0,05) ajoneuvon käsiteltyjä soluja.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki eläinkokeet suoritettiin mukaisesti National Institutes of Health eläinten käyttöä suuntaviivat ja protokolla hyväksymä Southern Illinois University School of Medicine Laboratory animal Care ja käyttö komitea.

Haavan paranemista määritykset suoritettiin soluilla vehikkeliä tai resveratrolin (25 ja 50 uM) 24 tuntia. Resveratroli estivät merkittävästi solujen kulkeutumista osaksi hiertyneelle alueilla, kuten on osoitettu kaksoisnuolia

(A) B ja baarissa kaaviossa

(B)

.

C, D,

Modified Boyden invaasio kammion testi osoitti, että resveratrolin (25 ja 50 uM) hoitoa 24 tuntia esti merkittävästi PC-3M-MM2 soluinvaasiota osoittamalla tavalla punaisella nuolella

(C)

. Edustavat kuvat invasiivisen solua per hoitoryhmä on esitetty. Tiedot esitetään pylväsdiagrammi

(B, D) B on keskiarvo ± SEM ainakin 3 itsenäisen kokeen. Tähdellä (*) tarkoittaa tilastollisesti merkitsevää eroa (p 0,05) ajoneuvon käsiteltyjä soluja.

MicroRNA geenijärjestelyillä profiili geenien säätelee resveratrol. PC-3M-MM2-soluja käsiteltiin ajoneuvon tai resveratrolin (25 uM) 24 tunnin ajan, minkä jälkeen kokonais-RNA eristettiin. Näytteet alistettiin sitten microarray-analyysin havaitsemiseksi näiden

MIRS

, joiden tiedetään säännellään eturauhassyöpä [19] käyttäen Affymetrix geenisirua (katso menetelmät). Paneelit vertailla

miRNA

profiilia ajoneuvojen ja resveratrolin käsiteltyjen PC-3M-MM2-solut. Intensiteetti punainen ja vihreä väri osoittaa laajuuden ylä- ja alas-säätely

miRNA,

vastaavasti. Samanlaisia ​​tutkimuksia suoritettiin kolmen riippumattoman näytettä kutakin hoitoryhmässä. Korkeimmat havaittu muutosta varten

miR-21

kuten.

B,

resveratrolin laskee

miR-21

tasojen annoksesta riippuvalla tavalla. PC-3M-MM2-soluja käsiteltiin ajoneuvon tai resveratrolin (5-100 uM) 24 tunnin ajan, minkä jälkeen kokonais-RNA eristettiin ja

miR-21

tasot havaittiin kvantitatiivisella RT-PCR: llä käyttäen TaqMan® miRNA määritys.

C, D,

Resveratroli lisää tasoja PDCD4 ja maspiini annoksesta riippuvalla tavalla. PC-3M-MM2-soluja käsiteltiin joko vehikkelillä tai resveratrolin (5-100 uM) 24 tunnin ajan, minkä jälkeen kokosolulysaateille valmistettiin Western blot havaitsemiseksi PDCD4 ja maspiini, vastaavasti.

E,

Resveratrol lisääntynyt PDCD4 lusiferaasiaktiivisuus. Plasmidi, joka sisälsi PDCD4 3 ’UTR lisätään alavirtaan lusiferaasia koodaavan sekvenssin transfektoitiin PC-3M-MM2-solut 48 tuntia. Solut käsiteltiin sitten resveratrolin (25 uM) 24 tunnin ajan, minkä jälkeen solulysaatit valmistettiin ja alistettiin lusiferaasianalyysissä. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen. Tähdellä (*) tarkoittaa tilastollisesti merkitsevää eroa (p 0,05) ajoneuvon käsiteltyjä soluja.

Cell Culture

erittäin invasiivinen, androgeeni-riippumaton ihmisen eturauhasen karsinooma PC-3M-MM2 solut saatiin Dr. Kounosuke Watabe (SIU School of Medicine, Springfield, IL). Tämä solulinja on peräisin luusta metastaattisen soluviljelmistä sisäisen sydämen injektiot PC-3M-MM1 soluja nude-hiirissä [28]. PC-3M-MM1 solut puolestaan ​​olivat peräisin PC-3M soluihin [28], jotka ovat aggressiivinen variantti PC-3-solujen [29]. Muut eturauhassyövän solulinjoissa, DU145 ja LNCaP, ystävällisesti toimitti tri Daotai Nie (SIU School of Medicine, Springfield, IL). Kaikkia solulinjoja viljeltiin RPMI 1640 media (Gibco, Grand Island, NY) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA), 50 yksikköä /ml penisilliiniä ja 25 ug /ml streptomysiiniä (Invitrogen, Carlsbad, CA ). Soluja kasvatettiin 37 ° C: ssa, kun läsnä oli 5% CO

2 ja 95% ilmassa. Kaikki kokeet suoritettiin täydellisessä materiaalille konfluentteja yksisolukerroksia, ellei toisin mainita.

A,

Western blot kokosolulysaateista PC-3M-MM2-solut transfektoitiin joko hajotus- tai PDCD4 siRNA (10 nM) 48 tuntia osoitti alas-säätely PDCD4 tasoja ja vasteen heikkenemisen resveratrolin (25 uM). Solut altistettiin resveratrol 24 h kuluttua siRNA transfektion.

B,

PDCD4 siRNA (10 nM) vähensi merkittävästi kykyä resveratrolin (25 uM) estämään PC-3M-MM2-solujen elinkelpoisuus määritettynä MTS-määrityksellä. 24 tunnin kuluttua siRNA transfektion jälkeen solut ympättiin 96-kuoppaiselle levylle ja altistettiin resveratrol 72 tuntia.

C,

PDCD4 siRNA osittain kääntää kyky resveratrolin apoptoosin indusoimiseksi PC-3M-MM2-solut. Apoptoosi määritys suoritettiin anneksiini V-FITC: llä värjäyksen jälkeen 48 h resveratrolin (25 uM) hoidon jälkeen, 24 h siRNA transfektion.

D, E,

PDCD4 siRNA (10 nM) esti kyky resveratrolin (25 uM) estämään migraation PC-3M-MM2 solujen haavan paranemista määrityksessä osoituksena kaksoisnuolia

(D )

. Solut transfektoitiin 24 tuntia, minkä jälkeen haava on luotu ja kuvat otettiin ajankohtana 0 h. Soluja käsiteltiin sitten resveratrolin 24 tuntia ja kuvat on otettu uudelleen. Kuvat ovat näytetään. Tiedot

(D) B esitetään pylväsdiagrammi in

(E)

.

F,

PDCD4 siRNA (10 nM) käänteinen resveratroli inhiboivan vaikutuksen PC-3M-MM2 soluinvaasiota muutettuna Boyden hyökkäystä kammion määrityksessä. Solut transfektoitiin pulloihin 24 tuntia ennen kylvö ne ylimmässä osastossa. Tiedot osoittavat, keskiarvo ± SEM vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen. (*), (**) Ja (***) osoittavat tilastollisesti merkitsevää eroa (p 0,05) salatulta siRNA, mistä resveratroli + ryntäily siRNA ja PDCD4 siRNA hoitoryhmissä, vastaavasti.

solut transfektoidaan

pre-miR-21

(30 nM) osoittivat kohonneet

miR-21

. Solut transfektoitiin

pre-miR-21

sekvenssi 48 tuntia ja sitten määrittämiseen käytetty

miR-21

tasoja kvantitatiivisella RT-PCR: llä käyttäen TaqMan® miRNA määritystä. Ohjaus solut transfektoitiin salattu

pre-miR.

B,

Pre-miR-21

(30 nM) transfektion vähensi tasot PDCD4 ja heikennettyjä vastaus resveratrolin (25 uM 24 h), kuten määritettiin Western blotting.

C,

Pre-miR-21

(30 nM) käänteinen resveratroli inhiboivan vaikutuksen PC-3M-MM2 soluinvaasiota muutettuna Boyden hyökkäystä kammion määrityksessä.

D, E,

Haavan paranemista määritys osoittaa käänteinen resveratrolin inhiboivan vaikutuksen PC-3M-MM2 solumigraatio by

pre-miR-21

(30 nM). Kuvat ovat näytetään. Data bar kuvaajat esitetään keskiarvona ± SEM vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen. Tähdellä (*), (**) ja (***) osoittavat tilastollisesti merkitsevää eroa (p 0,05) salatulta hoidettuun kontrolliryhmään, resveratroli + scramble

pre-miR

ja

pre-asennuspalveli- 21

transfektoituja PC-3M-MM2-soluissa, vastaavasti.

reagenssit

resveratrolin ja LY294002 ostettiin Sigma Chemical, Co (St. Louis, MO).

Pre-miR-21

oligonukleotidi,

ennalta miR

negatiivinen kontrolli, PDCD4 siRNA ja negatiivisen kontrollin siRNA ostettiin Ambion (Houston, TX). Anti-PDCD4 vasta-aine oli peräisin Epitomics, Inc (Burlingame, CA), kun taas, vasta-aineita fosfo-Akt ostettiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Vasta-aineet maspiini ja Akt ostettiin Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, CA) ja anti-β-aktiini-vasta ostettiin Sigma Chemical, Co. Kaikkien reagenssien ja tarvikkeiden olivat parasta saatavilla asteen ja ostettiin tavanomaisista lähteistä.

resveratrolin estää Akt-fosforylaation annoksesta riippuvalla tavalla. PC-3M-MM2-solut altistettiin ajoneuvoon tai resveratrolin erilaisten annos- ten (5-100 uM) 24 tunnin ajan ja kokosolulysaateista valmistetaan näitä soluja käytettiin Western-blottauksella.

B,

esto Akt fosforylaation LY294002. PC-3M-MM2-soluja käsiteltiin LY294002 (10 uM), joka on PI3-kinaasi-inhibiittori, 24 h ja käyttää Western blotting arvioida Akt aktivointia.

C,

Akt esto pienentää

miR-21

tasot määritettynä microRNA erilaisia ​​analyysi. PC-3M-MM2-soluja käsiteltiin ajoneuvon tai LY294002 (10 uM) 24 tunnin ajan, minkä jälkeen kokonais-RNA eristettiin. RNA-näytteet altistettiin sitten microarray-analyysi

Mirs

.

Mirs

joiden tiedetään säänneltävä eturauhassyöpä [19] on esitetty käyttämällä Affymetrix geenin siru. Paneelit vertailla

miRNA

profiilia ajoneuvojen ja LY294002 käsiteltyjen PC-3M-MM2-solut. Intensiteetti punainen ja vihreä väri osoittaa laajuuden ylä- ja alas-säätely

miRNA

, vastaavasti. Samanlaisia ​​tutkimuksia suoritettiin kolmen riippumattoman näytettä kutakin hoitoryhmissä.

D,

LY294002 lisääntynyt PDCD4 tasoilla. PC-3M-MM2-solut altistettiin LY294002 (10 uM) 24 tunnin ajan ja käytettiin Western-blottauksella.

E,

LY294002 lisääntynyt PDCD4-lusiferaasiaktiivisuus. Plasmidi, joka sisälsi PDCD4 3′-UTR alavirtaan lusiferaasigeenin koodaava sekvenssi transfektoitiin PC-3M-MM2-solut 48 tuntia. Solut käsiteltiin sitten LY294002 (10 uM) 24 tunnin ajan, minkä jälkeen solulysaatit valmistettiin ja alistettiin lusiferaasianalyysissä. Tiedot pylväsdiagrammi on esitetty keskiarvona ± SEM vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen. Tähdellä (*) osoittavat tilastollisesti merkitsevä ero (p 0,05) ajoneuvon käsiteltyjä soluja.

PC-3M-MM2-soluja käsiteltiin ajoneuvon tai LY294002 (10 uM) 72 tunnin ajan, ja solujen elinkyky määritettiin MTS-määrityksellä.

B,

LY294002 (10 uM) hoitoa 48 tuntia aiheutti apoptoosia PC-3M-MM2-solut määritettynä anneksiini V-FITC ja PI virheitä, jotka kvantitoitiin käyttäen virtaussytometria.

C,

LY294002 (10 uM) lisäsi apoptoosin PC-3M-MM2-solut, määritettynä TUNEL määrityksessä. Soluja käsiteltiin LY294002: ssa 24 tuntia ja sitten käytetään TUNEL-määritys, kuten on kuvattu menetelmät. DAPI värjäys saatiin selville solutumien. Kuvat ovat näytetään. Mittakaava on 100 pm. Pylväsdiagrammi

(D) B esittää prosenttia apoptoottisten solujen läsnä ollessa 10 uM LY294002.

E, F,

LY294002 (10 uM) altistus 24 tuntia vähensi migraation PC-3M-MM2-solut, määritettynä haavan paranemista määrityksessä. Kuvat ovat näytetään.

G,

LY294002 (10 uM) altistus 24 tunnin vähensi invasiivisuus PC-3M-MM2-solut, määritettynä muutettu Boyden kammion määritystä. Tiedot pylväsnäyttöä esitetään keskiarvona ± SEM vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen. Tähdellä (*) tarkoittaa tilastollisesti merkitsevää eroa (p 0,05) ajoneuvon käsiteltyjä soluja.

resveratrolin tukahdutti kasvaimen kasvun

in vivo

. Kaksitoista SCID-hiiret jaetaan tasan kahteen hoidon ryhmät-ajoneuvo ja resveratrolin (20 mg /kg kehon painoa). Lääkkeitä annettiin suun kautta letkuruokinnalla joka toinen päivä, kunnes tutkimuksen loppuun. Luciferase-merkitty PC-3M-MM2-solut (1 x 10

6) injektoitiin kyljen alueella kunkin hiiren päivänä 8 (nuoli) resveratrolin hoidon ja seurataan sitten kasvaimen kasvua. Resveratrol hoidetut hiiret osoittivat tukahdutti kasvaimen kasvun

(A) B, vähentynyt lusiferaasisignaaliin

(B, C) B, ja pienemmät kasvaimet

(D)

. Kuvat ovat näkyvät

(B) B ja

(D) B, kun taas histogrammit

(C) B ja

(D) B edustavat keskiarvoa ± SEM kuusi hiirtä kustakin hoitoryhmässä.

E,

Kasvaimet eristetty resveratroli-käsitellyistä hiiristä osoitti alhaisempia

miR-21

määritettynä Taqman® määrityksessä.

F,

Resveratroli säätelee ilmentymistä Pakt ja PDCD4 kasvainkudoksessa. Eristetty kasvaimia ajoneuvo- ja resveratrolin käsitellyillä hiirillä leikeltiin immunohistokemiallista värjäystä varten Pakt ja PDCD4. Mittakaava on 50 pm. Tähdellä (*) tarkoittaa tilastollisesti merkitsevää eroa (p 0,05) ajoneuvon-käsitellyistä hiiristä.

SCID-hiiriä käsiteltiin joko vehikkelillä (n = 4) tai resveratrolin (20 mg /kg) (n = 6) suun kautta letkulla, joka toinen päivä, kunnes loppuun tutkimuksen, alkaen yksi viikko ennen suonensisäisten PC-3M-MM2-solut (1 x 10

6), iv häntälaskimon kautta. Hiiret käsiteltiin resveratrolin osoitti merkittävästi vähentää määrää etäpesäkeleesioita (nuoli). Edustavat kuvat keuhkot yhdestä hiiren kohti hoitoryhmässä on esitetty.

solunelinkykyisyysmääritys (MTS-määritys) B

In vitro

PC-3M-MM2 soluproliferaatiota suoritettiin käyttämällä CellTiter 96® vesikerros Solution Cell Proliferation Assay Kit (Promega, Madison, WI), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, 2500 solua kuoppaa kohti ympättiin 96-kuoppalevylle. Sen jälkeen, kun vastaavat käsittelyt, solujen annettiin kasvaa 72 tuntia. 72 tunnin jälkeen, 20 ui CellTiter 96 vesifaasi Ratkaisu reagenssia lisättiin kuhunkin kuoppaan 100 ui kokonaistilavuudessa media. Soluja inkuboitiin 3-4 h, ja absorbanssi kirjattiin 490 nm: ssä käyttäen ELISA-levylukijaa. Absorbanssi on suoraan verrannollinen elävien solujen lukumäärään ja ilmaistaan ​​prosentteina suhteessa ajoneuvon käsiteltyjä soluja.

Apoptosis Detection Flow Cytometry

solukuolemaa apoptoosin välityk- määritettiin käyttäen FITC -AnnexinV Apoptosis havaitseminen kit (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) ja kvantifioitiin virtaussytometrialla, kuten on kuvattu aiemmin [30]. Lyhyesti, lopussa hoidon ajan, PC-3M-MM2-solut pestiin kerran fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja kerättiin 0,5% trypsiiniä /EDTA-liuosta 37 ° C: ssa, sentrifugoitiin 220 x

g

5 min ja sitten heti suspendoitiin uudelleen fysiologiseen puskuriin (1 x) annetaan sarjasta. -Soluja (1 x 10

5 solua /500 ui) jälkeen pidettiin pimeässä 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa 5 ui sekä propidiumjodidia ja FITC konjugoitua anneksiini V, minkä jälkeen näytteet analysoitiin välittömästi BD Biosciences

FACSCalibur

-virtaussytometrissä (San Jose, CA). Tulokset mittaamaan CellQuest- ohjelmistoa (BD Biosciences, San Jose, CA).

Apoptosis Detection TUNEL Pitoisuus

solukuolematasot apoptoosin PC-3M-MM2-solut havaittiin TUNEL määritys käyttäen Fluoreseiini FragELTM DNA pirstoutuminen havaitseminen kit (EMD Biosciences). Lyhyesti, yksikerroksiset PC-3M-MM2-soluja viljeltiin lasipeitinlevyille. Lopussa hoidon, solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä. Sitten solut

permeabilisoiduissa

käyttämällä proteinaasi K (1:100 laimennus) (mukana pakkauksessa) 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Lopussa inkuboinnin jälkeen solut huuhdeltiin 1X Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa (TBS). Minkä jälkeen ne inkuboitiin 1 X TdT tasapainotuspuskurilla 10-30 min. Inkuboinnin jälkeen oli ohi, 60 ui TdT merkintöjä Reaktioseos applikoitiin kunkin peitelasi ja pantiin kosteutetussa kammiossa ja inkuboitiin 1-1,5 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Seuraavaksi solut huuhdeltiin kahdesti 1 x TBS. Sisältävien solujen lasipeitinlevyjä asennetaan käyttäen Fluoreseiini-FragELTM kiinnitysväliaineet. Ylimäärä kiinnitysväliaineet pyyhittiin pois ja reunat suljettiin käyttäen kynsilakka. Objektilasit Sitten kuvattiin käyttäen Olympus -konfokaalimikroskoopilla (Olympus America Inc., Melville, NY).

Modified haavanparantumis- Pitoisuus

Yhtä suuret määrät soluja maljattiin kuhunkin kuoppaan kahdentoista hyvin soluviljelylevyille. Sen jälkeen, kun solut saavuttivat 70%: sta 80% konfluenssiin, linja oli naarmuuntunut keskellä hyvin käyttäen pipetin kärkeä luoda haavan. Differential häiriöitä kontrasti (DIC) kuvia hiertyneelle alueen kolme sattumanvaraisesti kenttää per kuoppa vangiksi konfokaalimikroskopiaa heti paljaaksitulo (aika, 0 h). Sitten soluja käsiteltiin erilaisilla reagensseilla ja inkuboitiin vielä 24 tuntia, ja kuvat jälleen muistiin. Kvantitoimiseksi, pinta-ala sulkemisen haavan mitataan paljaaksi ulkopuolelle ja normalisoitu ajoneuvon-käsiteltyihin kontrolleihin. Tutkia vaikutuksia PDCD4 siRNA ja

pre-miR-21

haavan paranemista PC-3M-MM2-solut, solut transfektoitiin PDCD4 siRNA,

pre-miR-21

ja niiden negatiivisten kontrollien 24 tuntia, minkä jälkeen haavan luotiin ja kuvat otettiin ajankohtana 0 h.

Modified Boyden Invasion jaosto Pitoisuus

kyky eturauhasen syöpäsolujen kulkeutua Matrigel pinnoitettu kalvojen mitattiin käyttämällä 24-kuoppaista BD BioCoat matrigeelin invaasiota kammiot (BD Biosciences, San Jose, CA). PC-3M-MM2-solut (5 x 10

4) suspendoitiin elatusaineet ilman seerumia ja ympättiin päällä osastoon hyökkäystä kammion seuraa kunkin hoitoja. Täydellinen media lisättiin alaosaan. Lopussa 24 tuntia, solun insertit poistettiin, ja solut pyyhittiin huolellisesti yläpinnasta kalvon pumpulipuikolla. Invasiivisen solut pohjaan kiinnittyneet pintaan kalvon värjättiin 100% metanolia ja 1% toluidiinisininen, vastaavasti. Kuvat on otettu valomikroskoopilla käyttämällä 20x tavoite. Kokonaismäärä tunkeutuneet solujen käsin laskettiin neljällä satunnaisesti valittua kenttää per hoitoa kohden insertti. Tutkia vaikutuksia PDCD4 siRNA ja

pre-miR-21

, PC-3M-MM2-solut transfektoitiin PDCD4 siRNA,

pre-miR-21

ja niiden negatiivisten kontrollien 24 h ennen kylvö ne päälle lokero.

Western Blot analyysi

lopussa hoidon, PC-3M-MM2-solut pestiin jääkylmällä 1 x PBS ja homogenoitiin käyttäen sonikaattorilla jääkylmään liuottava puskuriin, joka sisälsi 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2: a ja 1 mM EDTA: n läsnä ollessa proteaasi-inhibiittorien seos (Sigma) ja fosfataasi-inhibiittorin 1 (1:100) (Sigma). Koko-solu-lysaatit käytettiin sitten western-blottauksella, kuten on kuvattu aiemmin [31]. Lyhyesti, proteiinipitoisuus määritettiin Bradfordin menetelmällä ja yhtä suuri määrä proteiinia kustakin näytteestä sekoitettiin liukenemisen puskurilla (20% SDS, 1 M Tris, 20% glyserolia ja puristusrullan bromifenolisinistä) ja kuumennettiin vesihauteessa 95 ° C: ssa 5 min. Sitten näytteet SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Proteiinit siirrettiin nitroselluloosakalvoille, estetty liuoksessa, joka sisälsi 10X PBS, 10 mM EDTA, 20%: Triton X-100 ja 5% vähärasvaista rasvaton maito 1 h, ja sitten inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli primaarisen vasta-aineen. Kolmen pesun jälkeen blokkausliuoksessa (blotto), blotteja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-leimattujen lajien spesifisen IgG sekundääristä vasta-ainetta 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa, pestiin kolme kertaa 1 x TBS, joka sisälsi 1% Tween 20: tä. Tätä seurasi kolme pesua 1 x TBS, ilman Tween 20 blot käsiteltiin ECL plus-reagenssia (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) ja visualisoitiin veloitetaan kytketty laite LAS 4000 (Fujifilm North America Corporation, Valhalla, NY). Densitometrinen analyysi nauhojen suoritettiin käyttäen MultiGauge version 2.0 ohjelmisto. Yksittäiset bändit normalisoitiin joko Total-Akt tai β-aktiini suhteena kohdeproteiinin. Tämä oli vielä normalisoitu kuin% valvonnan ottamalla arvot ohjauksen 100%.

Oligonukleotidi ja lyhyt häiritseviä (si) RNA transfektoinneilla

Synthetic

pre-miR-21

(30 ng) (ID # PM10206, Ambion, Austin, TX), PDCD4 siRNA (10 ng) (siRNA ID # s223740, Ambion) ja niiden negatiivisia kontrolleja jaettiin osaksi PC-3M-MM2-soluihin käyttämällä Lipofectamine ™ RNAiMAX ( Life Technologies Corp., Carlsbad, CA) kohti valmistajan protokollaa. Lyhyesti, PC-3M-MM2-solut ympättiin 6-kuoppalevyille 30% konfluenssiin. Seuraavana päivänä, sopiva määrä

pre-miR-21

tai PDCD4 siRNA ja negatiiviset kontrollit laimennettiin 100 ul: aan seerumia ja inkuboitiin huoneenlämmössä 15-20 minuuttia 5 ui Lipofectamine ™ RNAiMAX transfektioreagenssia muodostumisen sallimiseksi transfektion komplekseja, jotka lisättiin soluviljelmiin, pyörittäen varovasti levyjä. Elatusaineet korvattiin tuoreella väliaineella 5-6 h ja soluja inkuboitiin 48 tuntia. Kaikki muut myöhemmät kokeissa noudatettiin samaa protokollaa, ellei toisin mainita.

RNA: n eristäminen, käänteistranskriptio ja TaqMan Real-Time PCR

eristäminen kokonais-RNA: PC-3M-MM2-solut ja tuumorikudoksissa suoritettiin käyttäen QIAzol Lysis Reagent (Qiagen, Valencia, CA) ohjeiden mukaisesti valmistaja.

MiR-21

cDNA tuotettu 200 ng kokonais-RNA, joka käänteiskopioitiin käyttämällä

HSA-miR-21

qRT-PCR set (Applied Biosystems, Foster City, CA) ja TaqMan ® MicroRNA Reverse Transcription (RT) kit (Applied Biosystems). Kukin RT-reaktio sisälsi 1X RT aluketta, 1 x RT-reaktiopuskuria, 0,15 ui 100 mM dNTP: itä, 50 U /ul MultiScribe RT-entsyymin ja 3,8 U /ul RNaasi-inhibiittoria. 15 ui reaktioseosta inkuboitiin sitten 30 min 16 ° C: ssa, 30 min 42 ° C: ssa, ja 5 min 85 ° C: ssa ja pidettiin sitten 4 ° C: ssa PCR-cycler. Reaaliaikaisen PCR suoritettiin Applied Biosystems StepOnePlus ™ Real-Time PCR System tavallisella Taqman® PCR Kit (Applied Biosystems) protokollaa. Lyhyesti, sen jälkeen, kun RT vaiheen, 2 ui RT-reaktiota yhdistettiin 1 ui 20X TaqMan® MicroRNA Assay (forward-aluke, käänteinen aluke ja koetin) ja 17 ui TaqMan® Universal PCR Master Mix 20 pl: n lopullisessa tilavuudessa. Reaktioita inkuboitiin 95 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 s ja 60 ° C 1 min. Kypsät

miR-21

ilmentyminen laskettiin 2

-ddC

t menetelmä suhteessa U6-snRNA ja ilmaistiin kertainen muutos. Kaikki TaqMan-PCR: t suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

mikrosiruanalyysi

miRNA microarray profilointi tehtiin käyttämällä Affymetrix GeneChip- miRNA v1 pakat (Santa Clara, CA) valmistajan suositteleman protokollan ja toteutettiin jonka CFG Microarray Core Facility (University at Albany, Rensselaer, NY). Lyhyesti, 500 ng kokonais-RNA soluista leimattiin polyA-polymeraasin lisäksi käyttämällä Genisphere FlashTag HSR kit (Genisphere, Hatfield, PA). RNA hybridisoitiin Affymetrix miRNA v1 array ja skannattu on GeneChip- Scanner 30007G suosittelemia myyjä. Raakadata tarkistettiin laadun avulla miRNA QC hyötyohjelmat (Affymetrix). Tarkempi analyysi tehtiin käyttämällä GeneSpring Gx v11.3. P-arvot 0,05 katsottiin tilastollisesti merkittäviksi. Kuten on esitetty kuviossa.