Krooninen sairaus

tiivistelmä

tuumorinekroositekijä-sukuinen apoptoosia indusoiva ligandi (TRAIL) indusoi apoptoosia erilaisissa syöpäsolulinjoissa, joilla on vähän tai ei lainkaan vaikutusta normaaleihin soluihin. Kuitenkin sen vaikutus on vähäinen, sillä joidenkin syöpien kuten haimasyöpä osoittavat de novo vastustuskyvyn polku aiheuttamaa apoptoosia. Tässä tutkimuksessa me raportoimme, että GSK-3-inhibitioon käyttäen farmakologisen aineen AR-18, parannettu TRAIL herkkyys eri haiman ja eturauhassyöpäsolulinjoissa. Tämä herkistyminen havaittiin olevan kaspaasiriippuvaisen, ja sekä farmakologisen ja geneettisen knock-down GSK-3-isoformit johti apoptoottisia ominaisuuksia, kuten on esitetty pilkkomalla PARP ja kaspaasi-3. Kohonneita reaktiivisia hapen välituotteiden ja häiritseminen mitokondrion kalvon potentiaalia viittaavat mitokondrioiden vahvistus lenkki TRAIL: n indusoiman apoptoosin, kun GSK-3 eston. Yhdenmukainen tämän yliekspressio anti-apoptoottiset mitokondrioiden tavoitteita, kuten Bcl-XL, Mcl-1, ja Bcl-2 pelastettiin PANC-1 ja PPC-1 solujen TRAIL herkistymistä. Kuitenkin, yli-ilmentyminen kaspaasi-8-inhibiittorin CrmA esti myös stabiloivaa vaikutusta GSK-3-estäjällä, mikä viittaa siihen, ylimääräinen rooli GSK-3, joka estää kuoleman reseptori signalointia. Akuutti hoito hiirillä, PANC-1-ksenografteissa yhdistelmä AR-18 ja TRAIL johti myös merkittävään kasvuun apoptoosin, mitattuna kaspaasi-3 pilkkominen. Herkistyminen TRAIL tapahtunut kasvusta huolimatta β-kateniinin johtuen GSK-3 esto, mikä viittaa siihen, että lähestymistapa voi olla tehokas jopa syövät väärin säädeltyyn β-kateniinin. Nämä tulokset viittaavat siihen, että GSK-3-inhibiittorit saattavat olla tehokkaasti yhdistää TRAIL hoitoon haimasyöpä.

Citation: Mamaghani S, Simpson CD, Cao PM, Cheung M, Chow S, Bandarchi B, et ai. (2012) glykogeenisyntaasikinaasi- 3 esto herkistää haimasyöpäsoluissa Trail indusoiman apoptoosin. PLoS ONE 7 (7): e41102. doi: 10,1371 /journal.pone.0041102

Editor: Shawn B. Bratton, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 02 joulukuu 2011; Hyväksytty: 21 kesäkuu 2012 Julkaistu: 19 heinäkuu 2012

Copyright: © 2012 Mamaghani et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Rahoitus oli antamat Campbell Family Institute for Cancer Research. Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Rekombinantti ihmisen Apo2L /TRAIL oli lahja Genentech, South San Francisco, CA. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

ulkoista apoptoosireitin alkaa sitova kuoleman reseptorin ligandeja kuten Fas-ligandin, kasvain necrosis factor-α (TNF-α), ja tuumorinekroositekijä-sukuinen apoptoosia indusoiva ligandi (TRAIL), kuolemaan reseptoreihin, aktivoivat useita signaaleja, jotka voivat johtaa kahteen erilliseen, mutta toisiinsa, tilaa apoptoosin induktion. Joissakin tapauksissa aktivaatio kuoleman reseptori 4 (DR-4), ja kuolema reseptori-5 (DR-5) johtaa rekrytointia sovittimen proteiinien muodostamiseksi kuolemaa indusoiva signalointikompleksiin (DISC), ja sen jälkeen aktivointi initiaattorin kaspaasit-8 tai -10 on riittävä aktivoimaan efektori kaspaasit-3, -6 ja -7, ja apoptoosin tulokset [1]. Kuitenkin sitoutuminen TRAIL DR-4 tai DR-5 ja kaspaasien aktivaatio-8 tai -10 ovat usein riittämättömät apoptoosin indusoimiseksi, ja vaatii vapauttamaan mitokondrioiden välittäjäaineiden, kuten sytokromi C: täydentää syöttämällä indusoivan signaalin [2]. Tämä rajat puhua välillä ulkoisten ja sisäisten apoptoosin reitit vaatii kaspaasin 8 -välitteisen pilkkomisen Bcl-2-perheen jäsen Bid [2], [3]. Katkaistun Bid (tBid) toimii esto mekanismi inhiboiden anti-apoptoottisten Bcl-2-proteiinien, kuten Bcl-2, Mcl-1, n ja Bcl-XL, mikä mitokondriot-solukuolema [3].

TRAIL voi myös sitoa kaksi ei-funktionaaliset decoy-reseptorit, jolloin, apoptoosin induktio on estetty [1]. Tasapaino kuoleman asiakkuutta reseptoreihin ja harhamaalit reseptorit on ratkaisevin tekijä apoptoosin induktion kohdesoluissa [4]. Toisin kuin TNF-α ja Fas, TRAIL näyttää osoittamaan suurempaa spesifisyyttä apoptoosin kasvainsoluissa

in vivo

, jossa vastaavasti vähemmän myrkyllisyys isännälle [1], [4], [5], [ ,,,0],6]. Vaikka tarkkaa mekanismia kohdespesifisyyttä TRAIL ei tunneta, ei ole toksisuutta normaaleissa soluissa johtuu osittain alemman ilmentymisen syöttämällä reseptorien (DR-4: n ja DR-5) ja lisääntynyt ilmentyminen decoy-reseptorien pinnalla normaalit solut [4], [7]. Sen sijaan erilaisia ​​syöpiä osoittavat voimistunutta ilmentymistä DR-4: n ja -5-reseptoreihin, mikä tekee niistä alttiita perävaunu indusoiman apoptoosin [3]. Vaikka tuumorisidistä vaikutus TRAIL on lupaava, se on rajallinen vaikutus, ja monet kasvaimet ovat vastustuskykyisiä TRAIL [5], [8], [9], [10], [11].

Edellinen työ meidän laboratorio- ja muut ehdottavat, että NF-KB: n säätää positiivisesti glykogeenisyntaasikinaasi-3 (GSK-3), ja on mukana kemoterapia-vastus, syövän solujen eloonjäänti, kasvu ja etäpesäkkeiden [12], [13], [14]. GSK-3-inhibitioon indusoi anti-eloonjäämisen vaikutuksia haiman syöpäsoluissa, jotka liittyvät downregulation NF-KB: n aktiivisuutta ja vähentää ilmentymistä anti-apoptoottiset kohdegeenien, kuten XIAP, Bcl-XL, ja sykliini D1 [14].

GSK-3 voi myös suojata soluja TNF-α-välitteisen cytotoxity, mikä osoittaa, että GSK-3: lla on tehtävä estää kuoleman reseptori välitteistä apoptoosia [15], [16], [17]. Mielenkiintoista, estäviä vaikutuksia GSK-3 on laajennettu muihin kuolemareseptorien kuten TRAIL ja Fas [18], [19]. GSK-3 on todettu lisäävän TRAIL-indusoitua apoptoosia ihmisen hepatooma ja eturauhassyövän solulinjoissa [10], [20]. Aikana kokeissa kuvattu aikaisemman työn, todettiin, että GSK-3-inhibitioon estetty NF-KB: n aktivaatio TNF-α [14]. Koska NF-KB: n aktivaatio on aiemmin ehdottanut tukahduttaa TRAIL-indusoitua apoptoosia haiman syöpäsoluissa [21], tämä havainto ehdotettiin mahdollisuutta GSK-3 inhibitio herkistää haimasyövän ja TRAIL. Tässä raportissa, testasimme onko GSK-3 esto oli herkistävä vaikutus TRAIL: n indusoiman apoptoosin sekä

in vitro

käyttäen haima- ja eturauhassyöpä solulinjoissa ja

in vivo

käyttäen PANC-1 ksenografteja .

Materiaalit ja menetelmät

Cell Lines ja reagenssit

Haiman adenokarsinooma solulinjoja PANC-1 ja BxPC-3 (ATCC, Rockville, MD) ylläpidettiin kuten aiemmin on kuvattu [ ,,,0],14]. PPC-1 eturauhassyövän solulinjaa viljeltiin RPMI 1640, joka sisälsi 10% FBS: ää, 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä, 37 ° C: ssa ja 5% CO2 ilmassa.

Rekombinantti ihmisen Apo2L /TRAIL oli lahja Genentech, South San Francisco CA. Yleinen kaspaasiestäjä z-VAD-fmk oli Alexis-Enzo Life Sciences, Inc. Plymouth Meeting, PA.

Stable transfektoinneilla

yli-ilmentymisen tutkimukset, pcDNA3.1-Myc, jotka sisälsivät anti -apoptotic markkerit: Bcl-2, Bcl-x L, CrmA ja MCL-1 sisältävät pcDNA3.1-His-tag-konstrukti on käytetty (Sidnet, Toronto, Kanada).

PANC-1 ja PPC-1-soluissa transfektoitiin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja 0,95 ug /kuoppa DNA: ta. Transfektantit valittiin G418 14 päivää tuottaa vakaa kloonien kuten aiemmin on kuvattu [22]. Toimivuus ilmennettyjen proteiinien varmistettiin käyttämällä staurosporiinille apoptoosin induktion määritys [23].

proliferaatiomääritystä

Annosvasteinen vaikutusta AR-A014418 (AR-18) (mukautettu syntetisoitu, Toronto Research Chemicals Inc., North York, Ontario, Canada), TRAIL (rh-TRAIL, R 0,05.

Tulokset

GSK-3 esto herkistää perävaunu Kestää haimasyöpäsoluissa apoptoosiin

hoito PANC-1 ja BxPC-3-solujen kanssa AR-18 (25 ja 50 uM) tai DMSO: ssa 24 tuntia, minkä jälkeen lisättiin TRAILin (5, 10, 20, 40 ng /ml) vielä 24 tunnin ajan osoitti, että hoito molemmilla lääkkeillä johtaa ja konsentraatiosta riippuvaisen kasvun inhibition määritettynä SRB-määritys, vaikka PANC-1-solut olivat suhteellisen resistenttejä TRAIL (kuvio 1). Huomattavasti suurempi toksisuus havaittiin molemmissa solulinjoissa, kun näiden kahden yhdistelmä aineista, ja tämä vaikutus on erittäin synergistinen, kun analysoitiin kuten aiemmin on kuvattu [14] (for BxPC-3, p = 0,0002 yhdistelmää käyttämällä 40 ng /ml TRAIL ja 50 uM AR-18 ja p 0,005 kaikille jäljellä annostelusta, sillä PANC-1, p 0,005 kaikille annostelusta paitsi 25 uM AR-18 yhdistettynä 5 ja 10 ng /ml TRAIL mikä ei ollut merkittävä) (Kuva 1 ja taulukko S1). Vaikutus oli todettavissa esikäsittely 50 uM AR-18, mikä viittaa siihen, että synergistinen vaikutus riippuu siitä, missä määrin GSK-3 eston sijaan TRAIL keskittyminen.

PANC-1 (A) ja BxPC- 3 (B) käsiteltiin TRAIL jälkeen 24 h ennen altistusta AR-18 ilmoitettuina pitoisuuksina, ja mitattiin solujen lisääntyminen SRB-määrityksellä. Kukin pylväsdiagrammi merkitsee tarkoittaa kolmesta erillisestä kokeesta kuusi rinnakkaista. Virhepalkit = ± SEM.

immunoblot-analyysi PARP pilkkominen solulysaateissa uutettu PANC-1 ja BxPC-3-soluja käsiteltiin 25 uM AR-18, 10 ng /ml TRAIL, tai yhdistelmä osoittivat, että vaikka ei ollut havaittavissa PARP lohkaisu käyttämällä AR-18 yksinään, yhdistetty hoito TRAIL tehostaa merkittävästi PARP pilkkominen molemmissa solulinjoissa. Yhdenmukainen havaitut vaikutukset SRB-määrityksessä BxPC-3-solut osoittivat herkkyyttä TRAIL perustuu PARP pilkkominen, kun taas PANC-1 solut olivat resistenttejä.

Voit testata, jos TRAIL herkistymistä haimasyöpäsoluissa GSK-3 inhibitio on kaspaasiriippuvaisen, PANC-1 ja BxPC-3-soluja käsiteltiin 25 uM AR-18 ja /tai 10 ng /ml TRAIL: n läsnä ollessa yleisen kaspaasi-inhibiittori z-VAD-fmk. Kuten kuvassa 2B, vaikka z-VAD itse tuottanut joitakin myrkyllisiä vaikutuksia, mutta se merkittävästi pelasti molemmat solulinjat AR-18 plus TRAIL yhdistelmä. Lisäksi TRAIL oli kaspaasiriippuvaisen vaikutus BxPC-3, mutta ei PANC-1-soluissa, sopusoinnussa niiden suurempi TRAIL herkkyys näkyy SRB-määritystä. Kuten nähdään kuviossa 2B, osittainen pelastus AR-18 esiintyi z-VAD-fmk, mikä viittaa siihen, että inhiboiva vaikutus GSK3: inhibition ovat jossain määrin, kaspaasiriippuvaisen. Nämä tiedot osoittavat, että TRAIL herkistymistä GSK-3 inhibitio liittyy kaspaasi aktivaation.

(A) BxPC-3 ja PANC-1-soluja käsiteltiin AR-18, yhdessä tai ilman TRAIL: ssa 24 tuntia ja analysoitiin varten PARP pilkkominen. (B) BxPC-3 (vasemmalla) ja PANC-1 (oikea) soluja käsiteltiin AR-18 (25 uM), TRAIL (10 ng /ml), z-VAD-fmk 50 uM, tai joka esitetään ja SRB määritys kuluttua 22 h inkubaation. Kukin pylväsdiagrammi merkitsee tarkoittaa kolmen kokeen kuusi rinnakkaista. virhepalkkeja = ± SEM. * P 0,005, ** p 0,0001.

Effects of Genetic knockdovvn GSK-3 TRAIL herkistyminen haimasyöpäsoluissa

Voit testata, jos TRAIL-herkistävä vaikutus AR-18 johtui GSK-3 inhibition, ja testata toiminnallinen redundanssia GSK-3-isoformit, tutkimme seuraavaksi ekspressiotasot katkaistun PARP ja pilkottiin kaspaasi-3 solulysaateista peräisin PANC-1-soluja transfektoitiin ohimenevästi siRNA kohdistettu GSK-3α, β, tai molempia, kun läsnä on tai ei ole 10 ng /ml TRAIL. Solut, jotka on transfektoitu salattu siRNA tai ei saanut hoitoa, käytettiin negatiivisina kontrolleina, kun taas solut, joita käsiteltiin AR-18 yksinään tai yhdessä TRAIL pidettiin positiivisena kontrollina. Immunoblottaus osoitti 80% vähennys kokonaisproteiinia kunkin isoformin (kuva 3) vastauksena 3-päivän inkubointi siRNA vastaan ​​GSK-3 isoformit jos verrataan käsittelemättömään tai salattu käsiteltyihin soluihin. Käsittely TRAIL (10 ng /ml) yksinään oli vähäinen vaikutus apoptoosin mitattuna PARP tai kaspaasi-3 pilkkominen, kun taas ohimenevä knockdovvn GSK-3 α tai p-isoformien yksinään ei ollut merkittäviä vaikutuksia. Yhdistelmä TRAIL GSK-3β geneettisen pudotus, sitä vastoin huomattavasti parannettu PARP ja kaspaasi-3 pilkkominen verrattuna käsittelemättömään, yhden hoitoja tai salattu siRNA. GSK-3α knockdovvn yhdistettynä TRAILin aiheuttama vähäisiä vaikutuksia PARP ja kaspaasi-3 pilkkominen, mutta samanaikainen knockdown kanssa GSK-3 on merkittävä vaikutus, joka oli verrattavissa AR-18 (kuva 3). Nämä tulokset tukevat sitä ajatusta, että GSK-3 eston vastaa TRAIL herkistävät vaikutukset AR-18, ja edelleen viittaavat siihen, että GSK-3β on entistä tärkeämpi rooli. Kuitenkin rooli GSK-3α on vähemmän selvä, koska emme pystyneet saavuttamaan yhtä naistaintumisprosenttia kuin GSK-3β.

PANC-1-soluja esikäsiteltiin käyttämällä AR-18 tai siRNA molempia vastaan isomuotoja GSK-3, ja altistetaan sitten TRAIL. Immunoblottausmääritys vahvistaa onnistuneen knockdovvn GSK3α ja β. Tämä lisännyt pilkkominen PARP ja kaspaasi-3 altistuksen jälkeen TRAIL. Scr: Salatut ei-spesifisiä siRNA.

TRAIL Herkistyminen kun GSK-3 esto johon liittyy mitokondrioissa

Death reseptorin signalointi käynnistää kaskadin tapahtumia, joka johtaa aktivointi efektori caspase- 3 ja apoptoosin induktion [6]. Kuitenkin joissakin soluissa kaspaasi-3 aktivaatio vaatii signaalin vahvistus kautta Bid pilkkominen ja mitokondriot aktivointi [2], [6]. Tämä puolestaan ​​johtaa epätasapainoinen fysiologinen tila mitokondrioiden mikä lisää sukupolven reaktiivisten hapen välituotteiden ja häiriön mitokondrion kalvon potentiaalia [24]. Testaamiseksi osallistumista mitokondrioiden aikana TRAIL herkistymistä AR-18, virtaussytometria käytettiin mittaamaan mitokondrion kalvon potentiaali (ΔΨm) ja ROI sukupolvi. Yhdistelmä TRAIL ja AR-18 indusoi muodostumista heterogeenisia PANC-1 ja BxPC-3-soluja, jotka oli ominaisuudet lisääntynyt ROI sukupolven menetys ΔΨm, ja PI otto, verrattuna käsittelemättömään kontrolliin tai yhden hoitoja (kuvio 4) . Yhdenmukainen tulokset SRB-määritystä ja PARP pilkkominen, AR-18 käsittely ei aiheuttanut apoptoottisia ominaisuuksia tahansa testatuista solulinjoista. Hoito TRAIL yksinään tuottanut joitakin menetys ΔΨm ja kasvoi ROI BxPC-3, mutta ei PANC-1-solut, vaikka tämä vaikutus ei ollut yhtä laajaa kuin yhdistelmähoitoa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että TRAIL herkistymistä GSK-3 inhibitio liittyy mitokondrioiden.

PANC-1 ja BxPC-3-solut olivat käsittelemättömiä tai niitä inkuboitiin AR-18 (25 uM), TRAIL (10 ng /ml), tai niiden yhdistelmän: ssa 24 tuntia, ja sitten analysoitiin virtaussytometrialla. Pistetiheys kuvaajia propidiumjodidin (PI) oton vs ΔΨm osoittavat, että menetys ΔΨm edeltää PI ottoa. TRAIL indusoi menetys ΔΨm in BxPC-3, mutta ei PANC-1, mikä on yhdenmukaista niiden suurempi herkkyys havaita käyttämällä SRB-määritystä (kuvio 1). Yhdistetty hoito TRAILin ja AR18 selvästi herkistyneet molemmissa solulinjoissa menetykseen ΔΨm, ja tämä liittyi lisääntynyt ROI sukupolvi ja menetys ulos kalvon eheyden.

molekyylimekanismeihin TRAIL herkistymistä GSK-3 esto

tutkimiseksi edelleen mekanismeja TRAIL herkistymistä GSK-3 inhibition, käytimme PPC-1 eturauhasen yliekspressoivan syöpäsolun Bcl-2, Bcl-XL, ja Mcl-1 estää mitokondrion reitin tai sytokiinivasteeseen muokkaaja A (CrmA) estää kuoleman reseptorin reitin kaspaasin aktivaation. Arviointi villityypin PPC-1-soluissa käyttämällä SRB ja virtaussytometria määritykset osoittivat, että lääkeyhdistelmä on tehokkaampi kuin yksittäisillä aineilla (kuvio S1). Seuraavaksi arvioidaan vaikutukset anti-apoptoottisten proteiinien herkkyys TRAIL ja AR-18. PPC-1-solut yli-ilmentävät CrmA, Mcl-1, Bcl-XL, ja Bcl-2 osoitti merkittävästi solujen lisääntymisen tehostuneen hoidon jälkeen TRAIL + AR-18 yhdistelmä, verrattuna soluihin, joita ei ole yli-ilmentävät mitä tahansa anti-apoptoottiset markkerit (kuvio 5A) .

PPC-1 (A) ja PANC-1 (B), stabiilien kloonien transfektoitiin Bcl-2, Bcl-x L, CrmA ja MCL-1, joka sisältää pcDNA3.1-His-tag-konstrukti hoidettiin yhdistelmä AR-18 (50 uM) ja TRAIL (10 ng /ml) 24 tuntia. Tulokset ilmaistaan ​​solujen elinkelpoisuus mitattiin SRB-määrityksellä. Kukin kuvaaja merkitsee tarkoittaa kolmen kokeen kuusi rinnakkaista. Virhepalkit = ± SEM.

Samanlaisia ​​tuloksia saatiin käyttämällä PPC-1-soluissa, yli-ilmentyminen CrmA ja Bcl-2: PANC-1-soluissa suojattu TRAIL + AR-18 yhdistelmä, vaikka oli eroja suhteellisen vaikutukset Bcl-2-perheen jäsenten ja vaikutukset Bcl-XL ei tilastollisesti merkitsevä PANC-1-soluissa. Suojaava vaikutus yli-ilmentävät CrmA, joka toimii tukahduttaa kuolema reseptorin kaspaasin aktivaatio, viittaa siihen mahdollisuuteen, että GSK-3 esto saattaa herkistää trail kautta parantamiseen initiaattorin kaspaasien kuten kaspaasi-8, sekä kautta anti-apoptoottiset kuten Bcl- 2 ja Mcl-1 haiman syöpäsoluja. Kuitenkin lisätoimia tarvittaisiin perustaa tähän.

AR-18 herkistää PANC-1-solujen TRAIL

in vivo

Jotta voidaan tutkia vaikutusta lyhyellä aikavälillä altistuminen yhdistelmä AR-18 ja TRAIL on apoptoosin in PANC-1 ksenograftikasvaimissa, me ensin, että suurin annos AR-18 siedetty SCID käyttämä laboratoriossamme oli 20 mg /kg, kahdesti vuorokaudessa intraperitoneaalisesti injektio (ip). SCID-uroshiirissä, joissa PANC-1 -ksenografteja jaettu neljään eri hoitoryhmään ja käsiteltiin i.p. injektion DMSO tai AR-18 (20 mg /kg; 12 tunnin välein 2 päivää), jota seurasi i.p. injektio TRAIL (25 mg /kg) 24 tunnin kuluessa sen jälkeen, kun viimeinen AR-18-annos. 24 tuntia viimeisen käsittelyn jälkeen hiiret tapettiin ja kasvaimet korjattu (kuvio 6A).

(A) Kaaviokuva

in vivo

hoitokäytäntö. (B) β-kateniinin ilmentymistä kvantitoitiin käyttäen densitometrisesti ja tuloksena olevat arvot normalisoitiin vastaan ​​α-tubuliinin. Studentin t-testi osoitti, että yhdistelmä vs ohjaus: p = 0,0012, ja AR-18 vs ohjaus: p 0,0001. (C) kvantifiointi apoptoosin kasvaimen näytteissä käyttäen H- pisteet. Lohkaista kaspaasi-3-stained kalvot (kuten on esitetty kuviossa S2) pisteytettiin Värjäytymisen intensiteetti (I) sekä positiivisten solujen prosenttiosuus vastaavalle tahra (H = I x P). Tulokset parittomia Studentin t-testiä (n = 5 kussakin hoitoryhmässä) ovat seuraavat: TRAIL kontrolliryhmään verrattuna (p = 0,0002), yhdistelmä vs kontrolli (p = 0,0004), yhdistelmä vs TRAIL (p = 0,0261), yhdistelmä vs AR -18 (p = 0.0035). (D) arviointi eläimen painoa hoidon aikana.

Koska lukema varten farmakodynaamisia vaikutuksia AR-18, mittasimme taso β-kateniinin, joka säätelee GSK-3 kautta Wnt-reitin. Oli merkittävä (p 0,0001) kasvavan β-kateniinin tasoja verrattuna DMSO käsiteltyjen näytteiden hoidon jälkeen AR18 (kuvio 6B), mikä viittaa siihen, että GSK-3 esto onnistuttiin vuonna PANC-1 -ksenografteja. Yllättäen tasot β-kateniinin lisättiin merkittävästi TRAIL käsitellyissä hiirissä. Tämä näyttää olevan uusi havainto, jonka merkitys on tällä hetkellä epävarma. Lisäksi molempia huumeita huomattavasti β-kateniinin tasoja verrattuna DMSO valvontaa, mutta arvot eivät olleet merkittävästi korkeampia kuin AR-18 yksinään.

Yhdistelmähoito Lisäykset lohkaista kaspaasi-3

in vivo

H-pisteet mittaukset pilkotun kaspaasi-3 osoitti, että TRAIL yksinään aiheuttaneet merkittäviä (p = 0,0002) apoptoosin induktion in PANC-1 kasvaimet (kuvio 6C ja kuvio S2), kun taas AR-18 kuin ainoana lääkkeenä oli merkityksetön vaikutus. Kuitenkin yhdistelmä AR-18 ja TRAIL osoitti suurempaa vaikutusta apoptoosin verrattuna yhden hoitojen tai DMSO käsiteltyihin kontrolleihin: yhdistelmä vs. kontrolli (p = 0,0004), yhdistelmä vs. TRAIL (p = 0,0261), yhdistelmä vs. AR-18 (p = 0.0035). Tutkia kaikki mahdolliset myrkylliset vaikutukset saavilla eläimillä 20 mg /kg AR-18 yksinään tai yhdessä TRAIL, maksa ja munuaiset olivat formaliini kiinteiden, parafiiniin ja leikkeet värjättiin H & E-ja halkaistut kaspaasi-3. Ei selvää morfologisia muutoksia vamman lukien nekroosin tai apoptoosin nähtiin. Kehon paino eläinten mitattiin päivittäin aikana tämän akuutin annostelun kokeessa ei näy merkittäviä eroja hoitoryhmien, paitsi että eläimet, jotka saivat TRAIL yksinään säilyttivät painaa verrattuna DMSO-kontrollin (kuvio 6D).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa esitetään mahdollisia herkistää haiman syövistä TRAIL GSK-3 eston. Ensin havaitsimme TRAIL herkistymistä kautta GSK-3 eston sekä eturauhasen ja haimasyöpä solulinjoissa. Toiseksi prosessi TRAIL herkistyminen osoitettiin olevan kaspaasiriippuvaisen. Kolmanneksi, geneettinen knockdovvn GSK-3 käyttäen isoformispesifisiä siRNA oli yhtä tehokas TRAIL-herkistymistä oli pienmolekyylisalpaaja- AR-18. Neljänneksi GSK-3-estäjän aiheuttama TRAIL herkistyminen liitettiin mitokondrion kalvon potentiaalia liittyy lisääntynyt ROI sukupolvi. Viidenneksi, yli-ilmentyminen tutkimukset haimasyöpäsoluissa osoitti, että molemmat kaspaasi-8 (CrmA) ja NF-KB-riippuvaista mitokondrion proteiinit (Bcl-2, ja Mcl-1) olivat mukana prosessissa TRAIL herkistymistä. Käyttö TRAIL yhdessä GSK-3 esto on merkitystä hoitoon haimasyövän koska nämä kasvaimet ovat tiheä K-ras ja p53 mutaatioita, jotka todennäköisesti edistävät niiden vastustuskyky standardin aineiden [27], [28], kun taas TRAIL herkkyys on raportoitu olevan p53-riippumatonta ja TRAIL on tehokas kasvainten kanssa inaktiivinen p53 [29]. Lisäksi, aktivoimalla K-ras-mutaatioita on raportoitu herkistää syöpäsolut TRAIL-indusoidun apoptoosin [30], [31].

testattiin ensin TRAIL herkistymistä ilmiö ja optimoitu myös tutkimus, jossa käytettiin eturauhasen syöpäsoluja, koska edellisen proof of concept näissä syövissä [20]. Mielenkiintoista on, että vaikka ei ollut eroja TRAIL herkkyyden välillä testattujen solulinjojen, ja PANC-1 on kaikkein TRAIL resistenttejä, yhdessä GSK-3 tukahduttaminen jos yhdenmukainen ja erittäin merkittävä herkistyminen TRAIL kaikissa testatuissa solulinjoissa. Tämä herkistyminen näytti olevan riippuvainen tasosta GSK-3 eston sijasta TRAIL keskittyminen.

Aikaisemmat tutkimukset johtuvan TRAIL vastus haimasyövän solujen yli-ilmentyminen X-kromosomiin liittyvä estäjä apoptoosin (XIAP ) [32]. Volger

et al.

Osoitti, että esto XIAP herkistyneet haimasyöpäsoluissa Trail indusoiman apoptoosin sekä

in vitro

ja

in vivo

[33]. Muut tutkimukset ovat korostaneet roolia NF-KB: vastustuskyvyn TRAIL kautta ylösajon estäjien apoptoosin kuten XIAP, Bcl-2, Bcl-XL, ja Mcl-1 [21], [34], [35], [ ,,,0],36], [37]. GSK-3-inhibitioon downregulates ekspressiotason näiden NF-KB: n kohdegeenien [14], [38], ja se voi myös estää kuoleman reseptori reitin [15], mikä viittaa siihen, että GSK-3-inhibitioon saattaisi herkistää syöpäsolut TRAIL-käsittely läpi useita mekanismeja .

mukaisesti edellisen havainnon, että GSK-3 voi estää kuoleman reseptori signalointi ylävirtaan kaspaasin 8 [15], CrmA- yliekspressio pelastettu TRAIL + AR18 yhdistelmä. Vaikka viittaavia ylimääräinen rooli GSK-3 kuoleman reseptorin signalointi, lisäkokeita tarvittaisiin vahvistamaan. Olemme myös löytäneet pilkkominen kaspaasi-3 ja PARP soluissa herkistynyt TRAIL joko AR-18 tai geneettinen knockdovvn GSK-3-isoformeja. Mielenkiintoista, vaikutus GSK-3β in TRAIL: n indusoiman apoptoosin oli merkittävämpi kuin GSK-3α, vaikka intensiteetti kaksinkertainen isoformin Knockdown oli merkittävästi parannettu verrattuna GSK-3β yksin, ja oli verrattavissa tilanteisiin, joissa AR-18. Nämä tulokset olivat samanlaisia ​​kuin edellisessä raportissa osoittaa, että geneettiset salpaus GSK-3β ja kaksinkertainen knockdown GSK-3-isoformit ovat suhteellisesti tehokkaampia kuin GSK-3α tukahduttamaan NF-KB: n aktiivisuuden [14]. Kuitenkin, että ei muodollisesti Näissä kokeissa tutkittuja ja vaatisivat lisätutkimuksia.

Useat NF-KB kohdeproteiinit estävät mitokondrioiden koulutusjakson, ja siksi kysyi AR-18 + TRAIL yhdistelmä häiritsee mitokondrioiden toimintaan . Löysimme parannettu vapautuminen ROI yhdessä vähentynyt mitokondrion kalvon potentiaalia soluissa käsitelty TRAIL + GSK-3-estäjällä, mikä viittaa siihen, mitokondrioita. Vaikka sukupolven ROI efektorina mekanismi aikana lääkkeen aiheuttama apoptoosin syöpäsoluissa on tunnettu [39], tuloksemme ovat kiinnostavia, koska ne ehdottavat yhdyssiteenä TRAIL herkistymistä GSK-3 eston ja mitokondrioiden Hengitysketjun. Tällainen vaikutus on aiemmin havaittu tutkimuksessa Jung

et al

. Käyttäen curcumin herkistää munuaissyöpäsoluissa Trail [40]. Curcumin hoito tehostetun ROI sukupolven TRAILin herkistyneet soluissa. Lisäksi meillä on myös havaittu kasvua DR-5 ilmentymistä ROI riippuvaisella tavalla [40]. Samanlaisia ​​tuloksia on aiemmin raportoitu ihmisen astrosyyteistä korostaen ROI riippuvainen säätely TRAIL kuolemareseptorien [41]. Lohkaisu kaspaasi-3 havaittiin tutkimuksessamme saattavat edelleen vaikuttaa ROI tuotantoa, koska aktivoitu kaspaasi-3 voi aiheuttaa palautetta silmukka mitokondrioiden Hengitysketjun [42]. Olipa nousu ROI sukupolven haiman syöpäsoluissa on ratkaiseva syy TRAIL herkistymisen jälkeen GSK-3 esto, tai se generoidaan sivustakatsojavaikutus apoptoosin suorittamisen, on syytä vielä tarkastella. On myös syytä huomata, että ROI sukupolvi voisi jälleen yhdistää NF-KB prosessin TRAIL herkistymistä GSK-3-inhibiittorit haimasyövän.