Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

MikroRNA (miRNA) ovat pieniä sääntelyyn RNA: ita, jotka osallistuvat syöpä synnyssä ja ovat viime aikoina osoittanut lupaus kuin veripohjaisten biomarkkerit syövän havaitsemiseen. Epiteelin munasarjasyöpä on tappava tauti, jolle parantaa tuloksia voitaisiin saavuttaa onnistunut varhaisen havaitsemisen ja ymmärryksen lisääntyessä molekyylitason patogeneesin joka johtaa parempaan hoitoja. Kriittinen askel kohti näitä tavoitteita on luoda kattava näkemys miRNA ilmaistaan ​​epiteelin munasarjasyövän kudoksiin sekä normaaleissa munasarjojen pinnan epiteelisolujen.

Menetelmät

Käytimme massiivisesti rinnakkaisen pyrosekvensointi (ts ”454 sekvensointi”) löytää ja luonnehtia uusia ja tunnettuja miRNA ilmaistu primääriviljelmien normaalin ihmisen munasarjan pintaepiteelissä (letku) sekä kudoksissa kolmesta yleisimmistä histotypes munasarjasyöpä. Syvä sekvensointi pienten RNA cDNA-kirjastojen peräisin normaalista HOSE ja munasarjasyöpä näytteet tuottivat yhteensä 738710 laadukkaita järjestyksessä lukee, tuottaa digitaalisten profiilit miRNA ilmaisua. Expression profiilit 498 aikaisemmin selityksin miRNA rajattiin ja löysimme kuusi novel miRNA ja 39 ehdokasta miRNA. Joukko 124 miRNA oli ilmennetty eri normaaleissa verrattuna syöpänäytteissä ja 38 miRNA oli ilmennetty eri puolilla histologinen alatyyppejä munasarjasyöpä. Taqman qRT-PCR suoritetaan osajoukko miRNA vahvistetut tulokset sekvensointilaatuinen tutkimuksella.

Johtopäätökset

Tämä raportti laajenee ruumis miRNA tiedetään ilmaistaan ​​epiteelin munasarjasyövän ja tarjoaa hyödyllinen resurssi tulevissa tutkimuksissa roolin miRNA synnyssä ja varhainen havaitseminen munasarjasyöpään.

Citation: Wyman SK, Parkin RK, Mitchell PS, Fritz BR, O’Briant K, Godwin AK, et al . (2009) ohjelmistoon MikroRNA vuonna Epiteelin munasarjasyöpä määritettynä Next Generation sekvensointi Small RNA cDNA-kirjastojen. PLoS ONE 4 (4): e5311. doi: 10,1371 /journal.pone.0005311

Editor: Sudhansu Kumar Dey, Cincinnati Lasten Research Foundation, Yhdysvallat

vastaanotettu: 23 marraskuu 2008; Hyväksytty: 07 helmikuu 2009; Julkaistu 23. huhtikuuta 2009

Copyright: © 2009 Wyman et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kustannus sekvensoinnin osittain vastattavaksi Roche. Tutkimus tukivat osittain munasarjasyöpä SPORE Fox Chase Cancer Center (P50 CA083638), Tyynenmeren Munasarjojen Cancer Research Consortium Munasarjojen SPORE (P50 CA83636 NU ja MT), Kromosomi Metabolism Training Grant 5 T32 CA09657-16 (ja SKW ), apurahan päässä Merck Research Laboratories (SKW) ja Fred Hutchinson Cancer Research Center ja Kanarian Foundation rahoitusta (New Development varat MT). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: M. Tewari on maksettu jäsen Scientific Advisory Board of Combimatrix, Inc.

Johdanto

epiteelikasvaimet munasarjasyöpä on johtava syy Gynekologiasairauksien syöpään liittyvistä kuolemantapauksista Yhdysvalloissa [1], jossa myöhäisen vaiheen diagnoosit, joilla on 30% viiden vuoden eloonjäämisaste [2]. Eloonjäämisluvut voitaisiin parantaa paremmin ymmärtämään molekyylitason patogeneesin, jotka voivat johtaa kehitystä parempia hoitomuotoja kehitettäessä, sekä aiemmin havaita taudin kirurgisesti parannettavissa. Kun havaitaan vaiheessa, jossa tauti rajoittuu munasarjasta, esimerkiksi viiden vuoden eloonjäämisprosentti kasvaa 80%. Kliinisesti tehokkaita biomarkkereita varhaisia ​​munasarjasyövän voisi parantaa huomattavasti eloonjäämisluvuissa ja munasarjasyövän biomarkkereiden löytö on tärkeä alue jatkuvan tutkimuksen [3].

MikroRNA (miRNA) ovat luokan pieni (~22 nt) ei-koodaavat RNA-molekyylejä, jotka toimivat transkription jälkeen säätelemään geenin ilmentymistä [4]. MikroRNA peräisin hiusneula-RNA esiasteista, joita käsitellään tuottaa sekä toiminnalliset kypsä miRNA ja miRNA ”tähti muoto” samanlaisten pituus johdettu vastakkaisen juosteen hiusneula. MicroRNA-välitteisen modulaatio biologisten järjestelmien on havaittu olevan levoton useita sairauksia [5], mukaan lukien syövän [6] – [8]. Expression malleja miRNA korreloi kudoksen alkuperästä [8], [9], ennuste [10], [11] ja kliinisen syövän käyttäytymismalleja [12], joten miRNA arvokkaita kudospohjaisia ​​biomarkkerit. Lisäksi me ja muut ovat äskettäin osoittaneet, että kasvain- miRNA päästä verenkiertoon at mitattavia määriä, mikä osoittaa, että miRNA vapautuu kasvain kudos muodostavat tehokkaan uuden luokan veripohjaisten, vähän invasiivisia biomarkkereita syövän havaitsemiseen [13] – [16] . Sinänsä on voimakkaan sysäyksen kattavan analyysin miRNA ohjelmistoon ilmaistaan ​​epiteelin munasarjasyöpä.

Useat viimeaikaiset raportit ovat alkaneet luonnehtia miRNA ilmentymistä munasarjasyöpään käyttämällä mikrosiruja täplikäs koettimina vaihteleva määrä tunnettu miRNA [17] – [20]. Vaikka nämä ovat uraauurtava tutkimuksia, niillä on myös rajoituksia. Tärkein näistä on, että kaikki taulukot raportoitu tähän mennessä on epätäydellinen kattavuus tiedossa miRNA. Niistä 959 miRNA ja tähti muotoja läsnä miRBase (release 12,0) [21], [22], useimmat microarray alustoille sovellettu mennessä määritys vain muutama sata miRNA, kattavin taulukoiden määrityksiin 470 miRNA ja tähti muotoja. Lisäksi mikrosirujen lähestyy ainoa toimenpide aiemmin tunnistettu miRNA ja eivät kykene löytämään ja profiloida uusia miRNA. Tämä on tärkeä ero esitä koska useat raportit viittaavat siihen, että merkittävä määrä miRNA, erityisesti niistä, jotka saattavat olla solutyyppispesifisten ilmentymisessä, voidaan vielä löydetty [23], [24]. Lopuksi, koska pieni koko miRNA ja haasteista yhdenmukaisten hybridisaatio-olosuhteiden poikki koko miRNA microarray, on mahdollisuuksia ristihybridisaation miRNA jotka ovat erittäin liittyvät peräkkäin, joten se joskus mahdotonta lopullisesti erottaa miRNA poikkea yksi tai kaksi nukleotidin.

voittamiseksi liittyvät rajoitukset microarray tutkimuksia, käytimme ”seuraavan sukupolven” sekvensointitekniikan (erityisesti massiivisesti rinnakkaisen pyrosekvensointi käyttäen 454 Life Sciences platform) pienten RNA cDNA-kirjastojen kattavammin luonnehtia miRNA ilmentyminen munasarjan epiteelin syövän, sekä primaarisissa viljelmissä normaalin munasarjan pintaepiteelisolujen. Tämä lähestymistapa, joka perustuu 5 ’ja 3’ universaali linkkeri ligaation /RT-PCR ja laskenta järjestyksessä lukee saatu selvä miRNA, voivat teoriassa kaapata kaikki miRNA läsnä RNA-näytteet (mukaan lukien ne uusien sekvenssi) ja mahdollistaa tarkat tunnistaminen miRNA, vaikka eroavat vain yhden nukleotidin. Me tuotti yhteensä 738710 järjestyksessä lukee neljä pientä RNA cDNA-kirjastojen edustaa normaalia ensisijainen ihmisen munasarjan pintaepiteelissä (HOSE) kulttuurien ja kolme yhteistä epiteelin munasarjasyöpä alatyyppejä (vakavien, kirkas solu ja endomet-). Ohessa kuvataan tulokset tätä työtä, mukaan lukien tunnistaminen ja profilointi sekä aiemmin selityksin ja uusia miRNA ilmaistu munasarjasyöpä.

Methods

Lisätietoja koskien soluviljelmässä, RNA: n eristys, pieni RNA cDNA-kirjaston rakentaminen, massiivisesti rinnakkaisen sekvensointi, laskennallinen putki kuvaus ja miRNA TaqMan kvantitatiivinen Käänteiskopiointia polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR) annetaan yksityiskohtaisesti täydentävillä menetelmillä S1 ja [23].

Soluviljely ja kliinisen aineet

normaali ihmisen primaaristen munasarjojen pinnan epiteelisolujen (letku) solut saatiin normaalista munasarjat postmenopausaalisilla naisilla käyttämällä muunnelmaa tekniikkaa on aiemmin kuvattu [25]. Kaikissa tapauksissa, yksilöt otettiin normaalista-näkymästä munasarjojen pinnan epiteeli, joka vahvistettiin seuraavat histopatologinen tarkastelun. HOSE näytteet saatiin alla protokolla, joka hyväksyttiin Research arviointikomiteaan ja sisäinen Review Board Fox Chase Cancer Center potilailta, joille suoritetaan kliinisesti osoitettu leikkaus (joko ennalta ehkäisevää riskien vähentäminen salpingo ja munasarjan poisto tai koko vatsan kohdunpoisto kahdenvälisten salpingo-oopherectomy) ja joka toimitti kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen kudosten ei tarvita diagnoosia voidaan käyttää tutkimukseen. Ensisijainen HOSE-soluja viljeltiin käyttäen julkaisuissa [26] 37 ° C: ssa 5% CO

2.

Munasarjasyöpä pikajäädytettiin yksilöitä vastaavat vaiheen III /IV epiteelin munasarjasyöpä (19 seroosinen, neljä selkeää solu- ja 10 endomet-) sisälsi 70% pahanlaatuisia epiteelin soluihin arvioituna patologi tarkastelu viereisen värjättyä kudoksen osassa. Munasarjasyöpä näytteet saatiin Tyynenmeren Munasarjojen Cancer Research Consortium Repository. Näytteet kerättiin alla protokolla hyväksymä Fred Hutchinson Cancer Research Centerissä Institutional Review Board ja saatiin potilaista, jotka olivat antaneet kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen kudosten ei vaadita kliinisen hoidon tarkoituksiin käytettäväksi tutkimukseen.

RNA ja miRNA kirjasto valmistelu

Normaali ensisijainen LETKU viljelmät (passage 4-7) hajotettiin 600 ul Mirvana Lysis /Binding puskuria (Ambion, Inc., Austin, TX). Tuumorinäytteet (-100 mg kukin) homogenoitiin Qiagen Tissuelyser 600 ui Mirvana lyysis /sitoutumispuskuri. Kokonais-RNA eristettiin molemmista näytteestä tyyppeihin käyttäen Mirvana ™ miRNA eristyspakkausta (Ambion) kohti valmistajan protokollaa. RNA snap-jäädytetty kasvaimet (19 seroosinen, neljä selkeää solu ja 10 endomet- kasvaimia, vastaavasti) yhdistettiin mukaan histologinen alatyyppi. MicroRNA kloonaus suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [27], (https://web.wi.mit.edu/bartel/pub/protocols/miRNACloningUpdate0705.pdf) ja muutostöissä vahvistus vaiheet näytteiden valmistamiseksi massiivisesti rinnakkaisia ​​sekvensointi 454 Life Sciences.

Custom bioinformatiikan data-analyysi putki

Jalostus ja merkinnästä sekvenssit identiteettiin perustuvat tunnettuihin transkriboidaan RNA: t tai uusina miRNA suoritettiin käyttämällä mukautettua bioinformatiikan putki kuvattu yksityiskohtaisesti täydentävä Methods S1 .

mittaus miRNA tasot RNA kliinisistä näytteistä käyttäen TaqMan® qRT-PCR-määrityksissä

Yhteensä RNA käänteiskopioitiin ja valmistellaan qRT-PCR käyttäen TaqMan® miRNA Reverse Transcription Kit ja miRNA erityisiä varsi-silmukka-alukkeita (Applied Biosystems, Inc.), kuten aiemmin on kuvattu [23]. Aineisto analysoitiin SDS Suhteellinen kvantifiointitietokoneohjelmaa versio 2.2.2 (Applied Biosystems, Inc.), jossa automaattinen Ct puitteet määrittämällä lähtötilanteen ja kynnys Ct määrittämiseen.

Tulokset

Katsaus pieniä RNA cDNA-kirjastojen ja 454 sekvensointi

Small RNA cDNA-kirjastot konstruoitiin RNA-näytettä altaat eristetty primääriviljelmien histologisesti normaalin ensisijaisen letku (

n

= 4) ja epiteelin munasarjasyöpä yksilöitä vakavien ( OSC,

n

= 19), kirkas cell (OCC,

n

= 4) ja endomet- (OEC,

n

= 10) histologialtaan. Tuumorinäytteet valittiin sisältää vähintään 70% pahanlaatuisten epiteelisolujen. Kokonais-RNA fraktioitiin koon kautta polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja pieniä RNA: ita, jotka vastaavat molekyyli- paino kypsä miRNA väestöstä (18-24 nt fraktio) geeli uutettiin ja prosessoitiin käänteistranskriptio ja PCR-monistusta luoda cDNA-kirjastojen (kuvio 1A). Massiivisesti rinnakkaisen pyrosekvensointi käyttäen 454 Life Sciences ”alustan syntyy 80501 normaalia HOSE lukee, 273739 OSC lukee, 292942 OCC lukee, ja 91528 OEC lukee (kuvio 1 B). Nämä vastasivat 10544 HOSE, 26849 OSC, 37792 OCC ja 13134 OEC ei-tarpeeton sekvenssit. Suurempi määrä lukee vastaavat serous ja selkeä solujen näytteitä johtui syvemmän sekvensointi (eli suurempi osa sekvensointi levyn käytetty) kuin mihinkään tiettyyn vaihteluista aikana kirjaston valmistelua.

. Pieni RNA: t eristettiin normaalista ensisijainen HOSE kulttuureissa ja vakavien (OSC), kirkas solu (OCC) ja endomet- (OEC) munasarjasyöpä kudoksiin. Seuraavat 5 ’ja 3’ linkkeri ligaation, RT-PCR suoritettiin tuottaa neljä riippumatonta cDNA-kirjastot pieniä RNA: ita, joita sitten käytetään templaatteina massiivisesti rinnakkaisia ​​pyrosekvensointi (454 sekvensointi).

B

. Kuvaus vaiheiden tietojen analysoinnin putki. Ensimmäinen vaihe tietojen analyysi oli poistamista sekvenssejä, jotka vastaavat 18 nt ja 24 nt RNA markkereita, jotka oli terästetty osaksi kokonais-RNA ennen geelielektroforeesilla. Prosenttiosuus kokonaismäärästä lukee HOSE, OSC, OCC ja OEC aineistot luokiteltu nimetty ryhmiin ja suodattaa pois jokaisessa vaiheessa on lueteltu taulukossa oikealla. Alareunassa taulukon määrä ”ainutlaatuinen sekvenssit” edustaa ei-tarpeeton johdetut sekvenssit sen jälkeen romahtaa useita lukee identtisiä sekvenssin. Jotkut kanoninen sekvenssit kartta useamman kuin yhden lokuksessa genomissa. Vuoden loppuun analyysin, 199 sekvenssit yhteensä 215 lukee ja kartoitus 568 loci tapasimme kriteerit kanoninen hiusneula johdettuja sekvenssejä yhdistetystä aineistoja.

Sequence Aineisto käsiteltiin käyttämällä mukautettuja laskennallisen putki (kuviot 1B, S1 ja taulukko S1). Alkuvaiheet putkilinjan tunnistettu sekvenssi vastaa tietokantoihin aiemmin selityksin RNA: iden (esim tunnetaan miRNA, muut ei-koodaavan RNA: t, RNA: iden) ja erittäin toistuvia jaksoelementin. Jäljellä sekvenssit käsiteltiin tunnistaa uusia miRNA (kuva S1, yksityiskohtia laskennallisen putkilinjan annetaan Täydentävä Methods S1). Seuraavissa kappaleissa, me käsittelemme yksityiskohtaisesti sekvenssit vastaavat tunnettuihin miRNA ja tunnistaminen romaani miRNA.

MicroRNA profilointiin: aiemmin selityksineen miRNA.

ottelut tunnettuihin miRNA vuonna miRBase (release 12,0 ) [21], [22] edusti 68-73%: n lukee, riippuen aineisto (kuvio 1 B ja taulukko S1) ja vastasi yhteensä 498 tunnettuja miRNA (mukaan lukien tähti muodot). Kloonauksen taajuus yksittäisten miRNA, ilmaistuna osa yhteensä lukee saadaan tietystä näytteestä, voidaan käyttää vertaamaan suhteellisen ilmentymisen miRNA näytteiden välillä [28] – [30]. Maailmanlaajuinen yhteenvedon meidän 454 sekvensointi aineistot on esitetty kuvassa 2, joka kuvaa suhteellista ekspressiota miRNA normaalin ensisijainen HOSE ja syöpäkudoksessa aineistot (

), sekä näiden kolmen epiteelin munasarjojen alatyyppiä (

B

). Kaikkein ilmentyvät eri miRNA (ts ≥4 kertamuutosta) näkyvät punaisina pisteinä. On huomattava, vaikka ei ole odottamatonta, että munasarjasyöpä histologiset alatyypin miRNA-profiilit olivat eri normaalista letku (

) kuin ne olivat toisistaan ​​(

B

). Taulukkomenetelmä 454 sekvensointi tietoja miRNA runsaus kaikissa aineistoja sekä miRNA nimet ja runsaus suhteet kaikkien pareittain vertailut näytetyypeillä, annetaan kokonaisuudessaan taulukossa S2.

Aineistot verrataan pareittain, piirtämällä log of osa koko lukee tietyn miRNA tietyllä aineisto vastaan ​​sen vastaava arvo toiseen aineisto. Kunkin koealan vain miRNA jotka sekvensoitiin molempiin aineistot piirretään; miRNA että sekvensoitiin vain toinen aineistoja ei ole esitetty. Ylärivi (

), vertaa munasarjasyöpä aineistoja (OSC, OCC ja OEC) normaaliin ensisijainen HOSE viljelmiä; alarivin (

B

), vertaa munasarjakasvain histologisia alatyyppejä toisiinsa. Punaisia ​​pisteitä merkitsevät miRNA, joka oli kertamuutos ≥4.

päällekkäisyys eri tavalla ilmaistuna miRNA välillä alatyyppien visualisoida Venn kaaviot kuviossa 3, joka myös sisältää miRNA jätetty kuviosta 2, koska nolla lukee joko normaali letku tai munasarjasyöpä näytteitä. Risteyksestä kolmen ryhmien Venn kaaviot, on ilmeistä, että monissa tapauksissa miRNA ekspressoituu differentiaalisesti munasarjasyöpä suhteessa normaaliin HOSE osoittavat samaa mallia ero ilmentymisen riippumatta histologisen alatyypin. Taulukko S3 tarjoaa täyden nimilista yksittäisten miRNA ja ilmaisun suhteen ja

P

-arvot varten vertailujen yhteenvetona kuviossa 3.

Venn kaaviot kuvaavat numerot miRNA differentiaalisesti ilmaistut munasarjasyövän histologista alatyyppejä suhteessa normaaliin ensisijainen ihmisen munasarjan pintaepiteelissä (HOSE) viljelmät. Kriteerit miRNA kun ilmennetty eri määriteltiin taitettava muutos ≥4 kanssa Fisherin testiä

P

-arvo 5,0 x 10

-6 varten miRNA, joka oli havaittavissa ilmentymistä sekä HOSE ja munasarjojen syöpä näytteitä, tai Fisherin tarkkaa testiä

P

-arvo 5,0 x 10

-6 yksin tapauksissa, joissa kertamuutosta arvo oli määrittelemätön johtuu nolla lukee tietyn miRNA joko HOSE tai munasarjasyöpä vertailunäyte. Kaikkiaan 74 yliekspressoitujen miRNA (

paneeli A

) ja 49 alle ilmaisi miRNA (

Paneeli B

) munasarjasyövän suhteen normaaliin HOSE tunnistettiin. MikroRNA jotka havaittiin olevan johdonmukaisesti yliekspressoitu tai johdonmukaisesti alle ilmaistu kaikilla kolmella munasarjasyövän histologisten alatyyppien on luetteloitu nimen.

suoraan verrata miRNA ilmaisun välillä munasarjasyövän histologisten alatyyppien johtamalla lauseke suhdeluvut kunkin miRNA perustuu murto runsaus arvoihin. Merkittävyys arvioitiin käyttämällä Fisherin testiä. Kymmenen miRNA ilmennetty eri kussakin pairwise vertailujen munasarjasyövän histologisten alatyyppien ovat taulukossa S4 (tuloksia kaikille miRNA annetaan kokonaisuudessaan taulukossa S2). Kaikkein histologinen alatyyppi-spesifisen miRNA ovat miR-449A (serous-specific), miR-499-5p /miR-375 /miR196a /miR-196b /miR-182 (endomet–spesifinen) ja miR-486-5p /miR -144 /miR-30a /miR-199-5p (kirkas soluspesifisestä).

validointi 454 sekvensointi miRNA ilmaisun tuloksia qRT-PCR.

Käytimme kaupallisesti saatavissa miRNA TaqMan qRT -PCR määritykset itsenäisenä vahvistuksen miRNA differentiaalikaavojen tunnistaa 454 sekvensoinnilla. MicroRNA TaqMan qRT-PCR määritykset suoritettiin näytteen 38 tiedossa miRNA jotka valittiin perustuvat ali- tai ilmentymisen suhteen ensisijainen normaali HOSE tai perustuen differentiaalikaavojen eri alatyyppiä munasarjasyöpä (laskettu 454 sekvensointi data). Taqman tehtiin alikvootteja saman RNA-allasta käytetään sekvensointiin. Kolmekymmentä kuusi 38 ilmentyvät eri miRNA tutkittiin TaqMan qRT-PCR: llä osoitti yhdenmukaisia ​​tuloksia, jotka on saatu 454-sekvensoinnilla (kuviot 4 ja 5, A, B, C). Kahdeksasta miRNA tunnistaa 454 sekvensoinnilla voidaan yliekspressoitu munasarjasyöpää suhteessa tavanomaiseen HOSE ryhmä (kuvio 4A), kaikki kahdeksan osoitti yli-ilmentyminen serous ja selkeä syöpä alatyyppiä, mitattuna käyttäen TaqMan qRT-PCR, kun taas kuusi kahdeksasta osoitti johdonmukaisia ​​tuloksia endomet- syövän alatyypin (MIRS-126 *, – 142-3p, 195, 200a, 200b, 200c, 338-3p, 378 *). Yhdeksän miRNA oli alle ilmaistaan ​​munasarjasyöpään suhteessa normaaliin letku (kuva 4B), jossa kaikki alalajit osoittavat yhdenmukaisia ​​tuloksia mitattuna TaqMan qRT-PCR. Oli kuusi miRNA jotka olivat havaittavissa (nolla lukee) normaalissa LETKU kulttuureissa (kuvio 4C), mutta oli havaittavissa ilmentymistä OEC, OSC ja /tai OCC vuonna 454 sekvensointi tietoja, jotka niinikään kohonneen ilmentymistä munasarjan histologinen alatyyppi näytteitä versus normaali ensisijainen HOSE tutkittaessa TaqMan qRT-PCR (kuvio 4C).

kuvaajat näyttää miRNA Taqman qRT-PCR tulokset näytteenotto miRNA tunnistaa 454 sekvensoinnilla olevan yli-ilmentynyt (

paneelissa A

) tai alle ilmaistuna (

paneeli B

) munasarjasyövän suhteessa normaaliin letku. Suhteellinen ilmentyminen saatuja arvoja 454 sekvensointi näkyvät vasemmalla segmentin kunkin kaavion vertailua. Suhteellinen ilmentyminen arvoja miRNA vuonna endomet- (OEC, mustat palkit), vakavien (OSC, valkoiset pylväät) ja selkeä solujen (OCC, harmaat palkit) syöpiä on kuvattu. MikroRNA, joita ei havaittu normaalissa letku 454 sekvensoinnin mutta havaittiin munasarjasyövän on esitetty

Paneeli C

, jossa miRNA: t on järjestetty laskevassa lauseke (joka vastaa nouseva sykli kynnys, Ct) normaalissa letku. 454 sekvensointi data annetaan mitattuna osuus kaikista lukee kussakin näytteessä. UD, jota ei havaita miRNA TaqMan qRT-PCR.

kuvaajat näyttää Taqman qRT-PCR tulokset miRNA ilmentyvät eri välillä munasarjasyöpä alatyyppejä, jossa 454 sekvensointilaatuinen johdettu data annetaan vertailua vasemmassa segmentissä kunkin kaavion. Suhteellinen ilmentyminen arvoja miRNA nimenomaan yliekspressoitu endomet- (

paneeli A

, OEC, mustat palkit), vakavien (

Paneeli B

, OSC, valkoiset pylväät) ja selkeä solujen (

paneeli C

, OCC, harmaat pylväät) syöpiä on kuvattu. UD, jota ei havaita miRNA TaqMan qRT-PCR: llä.

Viisitoista miRNA tunnistetaan 454 sekvensoinnilla ekspressoitua eri puolilla munasarjasyöpä alatyyppejä (kuvio 5A, B, C) osoittivat samanlaisia ​​ilmentymiskuviot, kun kvantitoitiin qRT- PCR. Kahdeksan miRNA oli yli-ilmentynyt erityisesti endomet- munasarjasyöpä (kuvio 5A), neljä vakavien syöpä (kuvio 5B), ja kolme selkeästi solusyöpää (kuvio 5C) suhteessa muihin alatyyppeihin.

Analyysi sekvensointi data tunnistaa uusia hiusneula johdettu pieni RNA: iden.

Koska validoitu 454 sekvensoinnin tulokset vastaavat erilaiseen ekspressioon aiemmin selityksin miRNA, me vieressä kääntyi tunnistaminen romaani miRNA sekvenssit. Suodattamisen jälkeen vastaa aiemmin selityksin ominaisuuksia, kuten lähetti-RNA: t, tRNA ja muut tunnetut ei-koodaavan RNA: t, loput sekvenssit linjattu viitteen ihmisen genomin (NCBI Build 36.1) [31]. Sekvenssit tarvitaan vastaamaan ihmisen genomin täydellisesti tarkoitus toteuttaa edelleen ylimääräisiä laskennallisen analyysin, jossa ainoa poikkeus tähän on sekvenssejä, jotka osoittivat lisäämällä 1-3 ilman templaattia nukleotidia 3′. Näissä tapauksissa me leikataan ilman templaattia emäksiä alkuperäisestä sekvenssistä, ja sitä suoritettiin sitten edelleen analyysiä varten [32], [33].

tietojenkäsittely vaiheet kuvattu tähän mennessä tuotti 841 normaali HOSE, 2840 OSC , 11224 OCC, ja 1764 OEC ainutlaatuisia sekvenssejä, jotka vastaavat uusia pieniä RNA: ita. Nämä ainutlaatuiset sekvenssit vastasivat 1766 normaaliin HOSE, 5795 OSC, 19464 OCC ja 3301 OEC genomista loci jotka voivat tuottaa näitä pieniä RNA: ita (kuvio 1 B, taulukko S1). Tietojen analysointi putki ensi seulotaan nämä genomista loci (lisäksi 100 nukleotidin ylä- ja alavirtaan sivuavan sekvenssin) läsnäolo ennustetun hiusneula sekundaarirakenne laskemalla vapaa energia, muoto todennäköisyys (määritettynä RNAshapes ohjelmassa [34 ]) ja Randfold-laskettu [35]

P

-arvo ennustettujen toissijaisia ​​rakenteita. Yksityiskohtainen kuvaus hiusneula taitto kriteerien annetaan täydentävillä menetelmillä S1 ja [23]. Tämä johti 224 normaalissa HOSE, 511 OSC, 500 OCC, ja 247 OEC uusia pieniä RNA: t todettiin mahdollisesti peräisin esiaste hiusneularakenteen.

Jaksot kulkee edellä suodatuskriteerit neljästä aineistot yhdistettiin sitten ja lajiteltu suhteen kromosomi koordinoi ryhmiin jakamista 5 ’päissä. Jokaisesta näistä ryhmistä päätimme ”kanoninen” edustava sekvenssi että genominen locus. Kanoninen sekvenssit valittiin perustuu yhteiseen 5’, runsaus, ja jakson pituus kuten aiemmin on kuvattu [23] (lisätietoja annetaan Täydentävä Methods S1). Tämä prosessi jalostetaan edelleen datan yhdistetyn luettelon 199 ainutlaatuisia sekvenssejä (mahdollisesti peräisin 568 genomisesta loci), että me nimetty ”novel hiusneula johdettu pieniä RNA: iden”, josta tunnistimme uusia ja ehdokas miRNA.

tunnistaminen novel ja ehdokas miRNA.

sen määrittämiseksi, jotka sekvenssit nimetä uusia miRNA, me seulotaan joukko uusia hiusneula johdettujen pieni RNA: t käyttävät kriteerien kaltaisia ​​käytetään muissa viimeaikaisissa miRNA löytö tutkimuksissa [23], [33], [36]:

i

. pariksi ominaisuudet hiusneula,

ii

. läsnä useita lukee jakavat saman 5′-päähän,

iii

. Koska merkintä osoittaa ei-miRNA biogeneesin,

iv

. jaetun siemenen alueen tunnettu eläin miRNA ja

v

. esiintymisen turvallisuutta miRNA tähti muoto lukea (s). Mietimme myös phylogenetic sekvenssikonservoinnista kriteerinä; kuitenkaan tämä ei lisännyt merkittävästi analyysimme kuin yksikään uusi hiusneula johdettuja miRNA oli säilytetty yli kädellisiä. Tämä ei ole odottamatonta, koska useimmat evoluutiossa konservoituneita MikroRNA ovat todennäköisesti jo löydetty käyttäen laskennallisia lähestymistapoja seurannut suunnattu validointi kokeita.

Käyttämällä edellä mainitulla tunnistimme kuusi novel miRNA. Kaikki kuusi täyttänyt kriteerit

i

–

iii

ja kolme kuudesta ei täyttänyt

iv

ja kolme ei täyttänyt

v

(kuvio 6; yksityiskohtaisemmin on esitetty taulukossa S5). Lisäksi kartoitus uusia miRNA sekvenssit viittaus ihmisen genomin paljasti, että kolme kuudesta uusia miRNA ovat läsnä intronit muiden geenien (ja koodattu saman juosteen kuin vastaavat isäntägeenejä) (kuvio 6), aivan kuten monet aiemmin selityksin miRNA [37], [38]. Kaksi meidän uusia miRNA sijaitsevat selityksin toistoja, mutta on riittävän vahva todisteet siitä, että ne on tarkoitettu uusina. Konteksti ennustetun esiasteen rakenteen ja sekvenssin miRNA tähti muotoja vastaava uusi miRNA on kuvassa 6.

Oletetut toissijaisia ​​rakenteita kuusi romaani miRNA löydetty tässä tutkimuksessa esitetään. Novel miRNA sekvenssit esitetään punaisella ja tähti muotoja uusien miRNA näkyvät sinisenä (jos tunnistettu sekvensointialustamme data). Sekvenssit ovat uusia suhteen miRBase vapauttamaan 12.0 [21], [22]. Tunnisteet suluissa viittaavat miRNA tähti muotoja, joissa nämä yksilöitiin 454 sekvensointi tietoja. Vastaavat tiedot uusia miRNA annetaan alla olevassa taulukossa hiusneularakenteet.

Loput sekvenssit käsitti 181 hiusneula johdettuja pieniä RNA: iden (vastaten 550 genomista loci). Olemme pyrkineet valitsee tästä luettelosta lupaavimmat sekvenssit nimetä ”ehdokas miRNA”, joka voidaan todistaa myös tulevaisuudessa

bona fide

miRNA lisätodisteena kertyy. Ehdokas miRNA oli täytettävä kriteerit

i-iii

ja olla joitakin muotoa tukevaa näyttöä (eli jaetun siemenen alueen tunnetun miRNA). Tämä antoi meille mahdollisuuden hioa lopullisen luettelon 39 ehdokasta miRNA (mahdollisesti peräisin 50 genomisesta loci) (taulukko S5).

Keskustelu

Työ raportoitu tässä oli motivoitunut hypoteesi, että koko ohjelmistoon miRNA ilmaistuna munasarjasyöpä, mukaan lukien mahdollisesti kudos- ja syöpää erityisiä miRNA, ei ollut vielä selvitetty. Massiivisesti rinnakkaissekvensointijärjestelmät lähestymistavan ansiosta voimme olla kattavia (ts tunnistaminen ei ainoastaan ​​tunneta, mutta myös uusia miRNA), ja ”digitaalinen” tietojen luonteeseen sallineet puolikvantitatiivinen arvio suhteellisesta ekspressiotason monille miRNA. Tätä lähestymistapaa käyttäen huomasimme kuusi uutta ja 39 ehdokasta miRNA, ja rajattuja ekspressiokuviota 498 aiemmin selityksin miRNA normaalissa ensisijainen HOSE kulttuureissa ja epiteelin munasarjasyöpä kudoksiin. On huomattava, että neljästä julkaistu miRNA microarray tutkimuksia munasarjasyöpä [17] – [20], vaikka kattavin array alustojen rajoittui 470 ihmisen miRNA ja tähti muotoja [17], kun taas nykyinen vapauttamista miRBase ( release 12,0) [21], [22] sisältää 969 ihmisen miRNA ja tähti muotoja. Lisäksi 223 tunnettujen miRNA me tunnistaa ja kuvata sekvensointialustamme aineistoja ei edustettuina edes kattavin mikrosirulla. Tämän vuoksi tulokset esitetään tässä merkittävästi laajentaa leveys tietoa miRNA ilmaistuna munasarjasyöpä.

tunnistaminen romaani miRNA meidän data on erityisen merkittävä. Koska nämä uudet miRNA ei ole havaittu useita laajoja miRNA sekvensointi tutkimuksia muiden kudosten, me spekuloida, että ne ilmaistaan ​​munasarjasyöpäsolu sifisistä ja voi olla erityistä etua kuin syöpä biomarkkereita. Jatkotutkimuksissa tarvitaan testata tätä hypoteesia, sekä tutkia biologisia rooleja näiden uusien miRNA munasarjasyövän synnyssä.

Yhdessä tunnettuja ja uusia miRNA tunnistettu tässä tutkimuksessa antaa allas ehdokas miRNA markkereita tuleville analyysissä veripohjaisten markkereita havaitsemiseksi munasarjasyöpä. Differentiaalikaavojen normaalin ja pahanlaatuisen valtiot voivat tarjota yksi menetelmä priorisointia ehdokkaiden eteenpäin. Olemme myös kuvitella, että miRNA että löysimme ekspressoitua eri väliin histologinen syövän alatyyppejä voisi palvella kahta tarkoitusta kuin veripohjaisten markkereita sekä syövän havaitsemiseen ja histologisen luokituksen.

Yksi ainutlaatuiset piirteet Tutkimuksemme on käyttö primääriviljelmien normaalin ihmisen munasarjan pintaepiteelissä kuin normaali vertailuryhmä. Vaikka munasarjojen pinnan epiteeli (ja lähistöllä distaalisen munanjohdin epiteelin) pidetään alkuperä epiteelin munasarjasyöpä [39] useimmat muut miRNA profilointi tutkimuksissa on tavallisesti käytetty koko munasarja kuin normaali vertailun. Tämä on ongelmallista tunnistamiseksi miRNA jotka ilmentyvät differentiaalisesti munasarjasyöpä suhteessa normaaliin, koska yhden solun paksuinen pintaepiteelisolujen kerros käsittää paljon vähemmän kuin 1%: n solun sisällön koko munasarja. Esittävät vertailuja munasarjasyövän kudoksen sopivaan normaali ohjaus on haastava ongelma munasarjasyövän tutkimukseen. Meidän lähestymistapamme, vaikka se välttää ongelmat, jotka liittyvät käytössä koko munasarja tavallisena näyte, on rajoitus, että emme tiedä, onko ja mitä muutoksia microRNA ilmentyminen voi johtua viljelyolosuhteet käytetään ensisijaisesti HOSE soluviljelmässä. Jatkotutkimuksissa sisällyttämällä rinnakkaisanalyysejä ensisijaisen soluviljelmissä peräisin munasarjasyöpä kudoksia voidaan käsitellä tätä kysymystä.

Vaikka käyttö erilaisten ”normaali” munasarjan yksilöitä tekee vertailun meidän tietoja muiden tutkimusten vaikeita useimmissa tapauksissa