Krooninen sairaus

tiivistelmä

epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) tyrosiinikinaasin estäjät (TKI), kuten gefitinibi, on todettu tehokkaasti inhiboimaan osajoukko ei pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). Valitettavasti suurin NSCLC ilmentävien villityypin EGFR on ensisijaisesti resistentti EGFR-TKI hoitoon. Tässä osoitamme, että leviämisen gefitinibin vastustuskykyisten NSCLC solulinjat H460 ja A549 pienenee pienen molekyylin SecinH3 joka epäsuorasti vaimentaa EGFR aktivaation inhibitio cytohesins, luokan äskettäin löydetty sytoplasmisen EGFR aktivaattoreita. SecinH3 ja Gefitinibillä synergistinen antiproliferatiivinen vaikutus, joka korreloi syvällinen esto Akt aktivaation ja surviviinin ilme. Hoitoon hiirillä H460 ksenografteissa kanssa SecinH3 osoitti antiproliferatiivisia ja pro-apoptoottinen vaikutus SecinH3 in vivo. Tuloksemme viittaavat siihen, että kohdentaminen EGFR epäsuorasti estämällä sen sytoplasmisen aktivaattorit, The cytohesins, on mahdollista parantaa hoitoon ensisijaisesti EGFR-TKI kestävä keuhkosyövässä.

Citation: Bill A, Schmitz A, König K, Heukamp LC, Hannam JS, Famulok M (2012) antiproliferatiivista vaikutus Cytohesin esto in Gefitinibi hylkivät Lung Cancer Cells. PLoS ONE 7 (7): e41179. doi: 10,1371 /journal.pone.0041179

Editor: Anna Maria Delprato, BioScience Project, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 15, 2012; Hyväksytty: 18 Kesäkuu 2012; Julkaistu: 18 heinäkuu 2012

Copyright: © 2012 Bill et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoitti Deutsche Forschungsgemeinschaft ja Collaborative Research Centerin 645 (SFB 645). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Dr. Schmitz ja Dr. Famulok ovat osakkaat patentin pieni molekyyli cytohesin estäjät otsikolla ”käyttö cytohesin estäjien kemiallisesti indusoivaa pitkäikäisyys” (WO2008058995, US 20100048594). Dr. Famulok on keksijä on patenttihakemuksen otsikolla ”Cytohesin inhibiittorit” (EP-patenttihakemus EP2286808 (WO2006053903). Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

käyttöönotto epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) tyrosiinikinaasin estäjät (TKI) osaksi hoito ei pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), joissa aktivoivia mutaatioita EGFR on siirtänyt hoitomuoto alkaen kemoterapeuttisen että kohdennettua lähestymistapaa. Valitettavasti vain 20 prosenttia adenokarsinoomat keuhkon karhun aktivoivia mutaatioita EGFR ja ovat herkkiä EGFR-täsmähoitoihin. Lisäksi potilaita EGFR kohdistettuja TKI hoidetuista toisioresistanssi hoidon aikana. mutaatiot EGFR pelata ratkaiseva rooli vastaus kasvaimen EGFR-täsmähoitoihin. Aktivoivat mutaatiot, erityisesti eksonit 19 ja 21, jotka ennustavat suotuisaa ensimmäinen vastaus EGFR-TKI: [1], [2], [3]. Päinvastoin, mutaatio ns portinvartija asema ATP: n sitoutuminen taskuun EGFR kinaasin domeenin, eli vaihdosta treoniini 790 mukaan metioniini, tekee resistenttejä soluja [4], [5], [6]. Portinvartija mutaatio on yleisin syy kehittämiseen toisioresistanssi reagoiva kasvaimia. Suurin osa NSCLCs näihin villityypin EGFR ja ovat näin ollen ensisijaisesti resistenttejä EGFR-TKI: [7]. Noin 25% näistä NSCLCs kantavat mutatoitunut muoto, Ras esikasvaintekijän, KRAS G61H tai G12V, ja läsnäolo tämä mutaatio on lähes erehtymätön indikaattori kestävyys EGFR-täsmähoitoihin [8]. Kuitenkin vitro -tutkimukset siRNA-välitteinen knock-down EGFR osoittavat, että leviäminen NSCLC soluja, jotka ilmentävät villityyppistä EGFR ja laakeri mutatoitunut KRAS on yhä riippuvainen jossain määrin EGFR [9], [10], [11 ], [12] viittaa siihen, että EGFR-TKI resistentit solut eivät ole täysin riippumattomia EGFR ja että näin ollen kohdistettu EGFR muilla keinoin kuin TKI voisi johtaa vähentyneeseen leviämisen jopa EGFR-TKI resistentit solut. Tässä osoitamme, että hoito SecinH3 NSCLC ilmentävien solulinjojen villityypin EGFR vaimentaa EGFR aktivointia ja signalointi, vähentää solujen proliferaation in vitro ja in vivo, ja tekee ne reagoivat EGFR-TKI gefitinibi. Kuten SecinH3 estää soluliman EGFR aktivaattorit cytohesin perheen [13] meidän tiedot viittaavat siihen, että kohdentaminen EGFR epäsuorasti estämällä sen aktivaattorit voivat edustaa lupaava lähestymistapa kehittää EGFR-kohdistettuja hoitoja useimpien NSCLCs jotka eivät ilmennä mutantti EGFR.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

SecinH3, Secin16 ja XH1009 syntetisoitiin, kuten on kuvattu [14], [15], gefitibiniä ostettu Biaffin. H460 ja A549-solut olivat ATCC: stä ja viljeltiin RPMI1640 (PAA), jossa oli 10% vasikan sikiön seerumia (Lonza). Identiteetti solulinjojen todennettiin lopussa koejakson perustuu mikrosatelliittimerkkien genotyypitys ECACC Cell Line Identity Verification Service. STR profiilit sovitettu profiilit solulinjat on talletettu ATCC ja ECACC STR tietokantoja.

proliferaatiotestillä

3 x 10

3 solua kohden 96-kuoppaiset ympättiin selkeä, tasapohjainen 96-kuoppaiset levy (TPP). 24 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla estäjien tai liuotinta (lopullinen DMSO-pitoisuus 0,4%) RPMI, joka sisälsi 50 ng /ml EGF: ää tai IGF-1 (Peprotech), vastaavasti. Medium vaihdettiin päivittäin 3 päivää ja solujen proliferaatiota analysoitiin 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT) (Promega), kuten on kuvattu valmistajan protokollan avulla Varioscan mikrolevylukijalla (Thermo Scientific). Kaikki määritykset suoritettiin vähintään kolmena kappaleena. Laskemiseksi suhteellinen leviämisen nopeus, keskimääräinen absorbanssi DMSO-käsitellyt solut asetettiin 1.

pesäkemuodostusta

klonogeeninen kasvun määritykset suoritettiin, kuten on kuvattu [16]. Lyhyesti, 3000 solua /kuoppa siirrostettiin kuuteen-kuoppaisille levyille, annettiin kiinnittyä yli yön ja käsiteltiin kanssa konsentraatiot yhdistettä tai DMSO: ta 72 tuntia. Solut irrotetaan, maljattiin uudelleen kuuden kuoppalevyille ja viljeltiin 7-10 päivää normaaleissa kasvualustoissa. Pesäkkeet värjättiin 0,1% Coomassie, 10% etikkahappoa, 30% metanolia PBS: ssä ja analysoitiin käyttämällä Odyssey lähi-infrapuna skanneri (LI-COR Biosciences).

-tuumoriksenografti

Kaikki eläin menettelyt olivat mukaisesti Saksan lait eläinsuojelulaki ja hyväksyi paikallinen eläinsuojelun komitea ja paikalliset viranomaiset (Bezirksregierung Köln, Saksa). Kasvaimet syntyvät s. c. injektiot 5 x 10

6 H460 soluja nu /nu Kateenkorvattomien uroshiirillä. Sen jälkeen, kun kasvain perustaminen hiiret satunnaistettiin kahteen ryhmään, kontrolli (vehikkeli) ja SecinH3-käsitellyillä hiirillä. Hiiriä hoidettiin päivittäin i. p. injektiot (100 ui 2,5 mM SecinH3 50% DMSO /50% isotonista glukoosiliuosta tai ajoneuvo vain). Kasvaimen tilavuus mitattiin päivittäin ja lasketaan kaavalla:

K

L

= suurempi halkaisija;

D

S

= pienempiä.

TUNEL määritys suoritettiin valmistajan käsikirjan (ApopTag Plus Peroksidaasiaktiivisuus In situ Apoptosis Kit, Merck Millipore).

pilkottiin kaspaasi 3: n ekspressio määritettiin immunohistokemialla formaliinilla ja parafiiniin kudosleikkeiden käyttäen spesifistä vasta-ainetta lohkaistaan ​​kaspaasi 3 (1:750, Cell Signaling Technology) sen jälkeen, kun antigeeni haku pH: ssa 6, kuten on kuvattu [17].

A, rakenteet estäjien käytetään tässä tutkimuksessa. B – C, leviämisen A549 (B) ja H460 (C) solut määritettiin MTT-määrityksellä, että läsnä on ilmoitettua estäjiä. ***, P 0,001 verrattuna DMSO-käsiteltyihin soluihin.

Immunoblotit

Soluja seerumia yön yli, kun läsnä on ilmoitettua estäjää tai DMSO: ta (lopullinen DMSO-pitoisuus 0,4 %). Keskipitkällä ja inhibiittorit päivittyy 1 h ennen stimulaatiota. Stimulaatio oli 5 min 50 ng /ml EGF: ää tai IGF-1, vastaavasti. Solut lyysattiin lyysauspuskurissa (20 mM Tris-Cl, pH 7,5 /150 mM NaCl /1 mM EDTA /1 mM EGTA /2,5 mM natriumpyrofosfaatti /1 mM β-glyserofosfaatti /1 mM natriumvanadaattia /1% Triton X-100 ) täydennettynä proteaasi-estäjän-mix HP (Serva). Normalisoitu määrät proteiinia erotettiin 6% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosalle. Seuraavia vasta-aineita käytettiin: Pakt (Thr473) (Cell Signaling Technology), pEGFR (Tyr1086) (Epitomics), pIRS1 (Tyr612) (Life Technologies), EGFR, surviviini, p27 (SantaCruz Biotechnology), Hsc70 (Enzo Life Sciences). Havaitseminen suoritettiin koskevasta Odyssey skannerin DyLight800-leimattuja sekundaarisia vasta-aineita (Thermo Scientific).

A – B, leviämisen H460-solujen läsnä ollessa gefitinibin tai SecinH3 yksinään tai niiden yhdistelmänä määritettiin MTT-määrityksellä ( A) tai pesäkemuodostusta (B). In A numerot antavat suhteellisen arvon leviämisen kanssa käsittelemättömien solujen asetettu 1. leviämisen olettaen additiivinen vaikutus SecinH3 ja gefitinibin (odotettu) verrataan arvoon löytyy kokeissa (havaittu). Havaitut arvot alle odotetun arvot osoittavat synergiaa.

A – C, H460-soluja käsiteltiin yli yön 1 uM gefitinibin, 15 uM SecinH3 tai niiden yhdistelmä. A, ilmaus p27Kip ja surviviinin analysoitiin western-blotilla. B, C, tilastollinen arviointi Western blot tiedot esitetään A. ** B osoittaa p 0,01 verrattuna DMSO-käsiteltyihin kontrolleihin sekä gefitinibille käsiteltyjä soluja. *** C osoittaa p 0,001 verrattuna DMSO-käsiteltyihin kontrolleihin. n = 3.

A – D, seerumin puutteessa soluja stimuloitiin EGF 5 min ja testattiin Western blot aktivoimiseksi ilmoitettu proteiineja. A edustava Western blot. B – D, tilastollinen arviointi fosforylaation EGFR (B), insuliinireseptorisubstraatti 1 (C), ja Akt (D) EGF-stimuloidun H460-solujen läsnä ollessa gefitinibin, SecinH3, tai molempien yhdistelmä-estäjiin. p ilmaisee fosforyloitu, eli aktivoitu, proteiinin muoto. Signaalit normalisoitiin lastaamiseen valvontaa Hsc70. Virhe palkit antavat keskivirheen. *, P 0,05, **, p 0,01, ***, p 0,001 verrattuna EGF-käsiteltyjen solujen lukuun ottamatta niitä vertailut, jotka on määritetty suluissa.

Tilastot

tulokset annetaan keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon (SEM). Tilastolliset analyysit tehtiin Prism (GraphPad Software) soveltamalla yksisuuntainen ANOVA Tukeýs post-testi in vitro-kokeiden ja t-testi ksenografteista. Erot keinojen katsottiin merkitsevä merkitsevyystasolla 0.05.

Tulokset

NSCLC solut, jotka ilmentävät Villityypin EGFR Vastaa SecinH3

Vaikka NSCLC soluja, jotka ilmentävät villityyppistä EGFR eivät reagoi kliinisesti merkittävinä pitoisuuksina EGFR-TKI niiden leviäminen näyttää riippuvan jossain määrin EGFR signalointi kuten on osoitettu EGFR pudotus kokeissa [9], [10], [11], [12]. Siksi kysyimme onko leviämisen NSCLC A549, joka ilmentää villityypin EGFR ja KRAS kanssa aktivoivan mutaatio G12S vaikutti käsittelemällä soluja SecinH3 (Fig. 1A). SecinH3 on cytohesin inhibiittori [14], [15] ja ei estä tyrosiinikinaasiaktiivisuutta EGFR suoraan [13]. Cytohesins on pitkään tunnettu guaniininukleotidiä vaihto tekijöitä pienten G-proteiinien ARF perheen [18], mutta on viime aikoina osoitettu myötävaikuttavan EGFR aktivointi [17]. Mekanismi cytohesin-välitteisen EGFR aktivointi, joka on vielä tunneta yksityiskohtaisesti, sisältää suoran vuorovaikutuksen cytohesins kanssa EGFR, on ARF-riippumaton, ja voidaan estää SecinH3. Kun A549-soluja käsiteltiin SecinH3 tai niihin liittyvien cytohesin estäjä Secin16 [19] pitoisuudesta riippuvaa vähenemistä proliferaatiota havaittiin (Fig. 1 B). Verrattuna erittäin EGFR-addiktoitunut PC9 soluja, jotka ilmentävät EGFR pitäen deleetion eksonissa 19 [20], leviämisen, joka esti täydellisesti 15 uM SecinH3 [17], väheneminen leviämisen oli vähemmän ilmeinen A549-soluja, jotka on mukaisesti pienempi riippuvuus A549 solujen EGFR signalointia. Inhibitio ei havaittu soluissa, joita käsiteltiin ohjaus yhdisteen XH1009, joka on rakenteellisesti sukua SecinH3, mutta ei inhiboi cytohesins [14]. Gefitinibin käytetään terapeuttinen konsentraatio 1 uM vain marginaalisesti inhiboivat A549-solut. Aktiivisuus käytetty gefitinibin varmistettiin käsittelemällä gefitinibin herkän solulinjan PC9 [20], jossa 100 nM gefitinibin inhiboi solujen lisääntymistä lähes kokonaan (tietoja ei esitetty). Sulkea pois, että vaikutus SecinH3 rajoitettiin A549-soluja kokeet toistettiin H460-soluja, ei-pienisoluisen keuhkosyövän solulinjaa, joka ekspressoi myös villityypin EGFR mutta eri Kras mutantti, eli G61H (Fig. 1 C). Kuten A549, 15 uM SecinH3 aiheutti noin 50%: n vähennys leviämisen. Tämä arvo sopii kohtuullisen hyvin puoli-maksimaalinen estävä pitoisuus SecinH3 varten katalyyttinen aktiivisuus puhdistetun cytohesins, joka on 10-12 uM [14].

SecinH3 ja Gefitinibin ovat synergistisiä

oltuaan että SecinH3 vaimennettu leviämisen gefitinibin vastustuskykyisten NSCLC-solujen kysyimme hoito SecinH3 saattaisi estää solujen reagoivat gefitinibin ja siten toimivat synergistisesti tämän EGFR-TKI. Näin ollen, leviämisen H460-solujen määritettiin 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT), kun läsnä on 1 uM gefitinibin ja kasvavia pitoisuuksia SecinH3 (kuvio . 2A). Kunkin yhdistelmän eston odotetaan Bliss riippumattomuuden kaksi yhdistettä on laskettu murto-tuotteen menetelmällä [21] ja verrattiin havaittuihin estoas- [22]. Kaikki kolme testattavien yhdistelmien synergistinen vaikutus gefitinibin ja SecinH3 todettiin. MTT-määritys määrittää proliferaation epäsuorasti mittaamalla metabolinen aktiivisuus solupopulaation. Saada lisää ja enemmän suoraa näyttöä, että proliferaation esto pesäke muodostumisen määritys suoritettiin (Fig. 2B). Myös tässä kokeessa, yhdistelmä SecinH3 gefitinibin kanssa oli tehokkaampi kuin kunkin inhibiittorin.

A, H460-soluja pidettiin seerumin puutteessa ja käsiteltiin yli yön 0,5 uM AG1024, 15 uM SecinH3 tai niiden yhdistelmän. Stimulaation jälkeen IGF1 5 min fosforyloitumisaste osoitettujen proteiinien analysoitiin western-blotilla. Käyrät yhteenveto 3 kokeita, virhepalkkien antaa keskivirheen. *, P 0,05, **, p 0,01, ***, p 0,001 suhteessa IGF1 käsiteltyjä soluja lukuun ottamatta niitä vertailut, jotka on määritetty suluissa. B, leviämisen H460-solujen läsnä on ilmoitettua estäjien määritettiin MTT-määrityksellä. Numerot antavat suhteellinen arvo leviämisen kanssa käsittelemättömien solujen asetettu 1. leviämisen jos additiivinen vaikutus SecinH3 ja gefitinibin oletetaan (odotettu) verrataan arvoon löytyy kokeissa (havaittu). Havaitut arvot alle odotetun arvot osoittavat synergiaa. ***, P 0,001.

EGFR signaloinnin EGFR-riippuvaisten solujen tiedetään aiheuttavan solusyklin pysähtymiseen ja johtaa apoptoosin induktioon. Sijaismarkkereina solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin, päätimme ilmaus solusyklin etenemisen estäjä p27Kip1 ja apoptoosi-inhibiittori surviviinin (Fig. 3A). Solujen käsittelyn kanssa SecinH3 tai gefitinibin johti vähenemiseen surviviini (Fig. 3B) ja kasvu p27Kip1 (Fig. 3C), vastaavasti. Tämä vaikutus oli voimakkaampi soluissa, joita käsiteltiin molempien estäjiä.

Koska ilmaisua molemmat proteiinit, p27Kip1 ja surviviini, säätelee Akt signalointi fosforylaation Akt analysoitiin vastauksena EGF stimulaation solujen (Kuva. 4A). Kun taas EGF-indusoitu fosforylaatio EGFR ja sovittimen proteiinia insuliini-reseptorin alustan 1 (insuliinireseptorisubstraatti 1) oli huomattavasti pienentää gefitinibin (Fig. 4B, C) fosforylaatiota Akt ei (Fig. 4D), mikä osoittaa, että Akt signalointi oli ennallaan gefitinibin saaneilla H460-soluissa. Sen sijaan SecinH3 oli vähemmän estävä vaikutus EGFR ja insuliinireseptorisubstraatti 1 fosforylaatio mutta osoitti merkittävää estoa Akt aktivointia. Näin ollen, yhdistelmä SecinH3 ja gefitinibin johti lähes täydelliseen inhibitioon fosforylaation kaikkien kolmen proteiinin. Nämä tiedot osoittavat, että lisääntymistä estävä vaikutus yhdistettynä SecinH3 /gefitinibi hoito johtuu tehokkaasti estämällä EGFR – Akt signalointia akselilla.

Hiiret, ihon alle H460 -ksenografteja käsiteltiin SecinH3 päivittäin vatsaonteloon injektioita. A, kasvaimen tilavuus määritettiin joka päivä. Päivänä 9 kokeen jouduttiin keskeyttämään, koska kasvaimen kontrolliryhmän eläimillä ylitti 1 cm

3. B, jakelu kasvainten 9. päivänä C – D, aste apoptoosin analysoitiin osissa kasvainten päivänä 9. C, määrä hajanainen ytimien määritettiin TUNEL värjäys. D, pilkkoa, eli aktivoitu, kaspaasi-3 havaittiin imunohistochemistry. Edustavia tuumorisektioiden näkyvät. 5 × 40 × osoittavat suurennus tavoitteen. Kaikkien kuvaajat, merkitsee ja keskivirheet esitetään (n = 14). *, P 0,05, **, p 0,01, ***, p 0,001.

SecinH3 Vähentää IGF1 R-riippuvaisen Merkinanto ja leviämisen

Lisäksi EGFR, insuliinin kaltainen kasvutekijä-1-reseptorin (IGF1 R) on tärkeä säätelijä Akt aktivointi ja cross-talk välillä IGF1 R ja EGFR tai EGFR perheenjäsenten kuten Her2 on raportoitu mekanismina vastustuskyvyn huumeiden kohdistamista EGFR tai Her2 useassa syöpätyypit [16], [23], [24], [25], [26]. Kuten SecinH3 estää signalointi alavirtaan insuliinin reseptorin [15], [27], joka jakaa keskeiset piirteet IGF1 R signalointi testasimme hoitoon H460-solujen kanssa SecinH3 johti vähentyneeseen aktivaatioon IGF1 R – Akt signalointireitille (Kuva. 5A). Kanssa saadut tulokset insuliinin reseptori, autofosforylaatiota on IGF1 R ei pienennetty upon SecinH3 hoitoa, mutta lisääntynyt. Kuitenkin, aktivointi insuliinireseptorisubstraatti 1 ja Akt väheni huomattavasti. Inhibitio Akt aktivointia ei nähty kun gefitinibi hoitoa. Kasvu IGF1 R fosforylaation käsittelemällä gefitinibin ja SecinH3 hyväksyy aiempien havaintojen estämällä EGFR johtaa lisääntyneeseen aktivointi IGF1 R [16], [22], [25], [26]. Sitten kysytään SecinH3 vähentää proliferaatiota kun läsnä on IGF1 (Fig. 5B). Todellakin, leviämisen väheni upon SecinH3 hoitoa ja vähennys oli synergistinen kanssa IGF1 R estäjän AG1024. Yhdistelmä gefitinibin ja AG1024 osoitti myös synergistisen antiproliferatiivinen vaikutus joskin vähäisempi kuin yhdistelmä SecinH3 ja gefitinibin.

SecinH3 Retards kasvu H460 ksenoqraftit in vivo

on osoittanut, että SecinH3 vähentää leviämisen EGFR-villityypin NSCLC-solujen in vitro kysyimme kasvaimen kasvu estyisi myös in vivo. Siksi kantavien nude-hiirten ihon alle H460 ksenografteja käsiteltiin päivittäin injektoimalla intraperitoneaalisesti SecinH3. Hoito SecinH3 hidasti merkittävästi kasvaimen kasvua (Fig. 6A). Kun hiiret tapettiin 9 päivää hoidon huomattavasti pienempi kasvainten havaittiin SecinH3-käsitellyssä ryhmässä verrattuna liuottimella käsitellyssä ryhmässä (Fig. 6B). Vuonna histologisia osat kasvainten TUNEL värjäys paljasti korotettuun apoptoosin hoidetuista eläimistä (Fig. 6C), mikä näkyi myös kaspaasi-3 värjäys (Kuva. 6D). Yhteenvetona tuloksemme osoittavat, että SecinH3 in vitro ja in vivo vähentää leviämisen NSCLC soluja, jotka ilmentävät villityyppistä EGFR.

Keskustelu

Tässä raportissa, osoitamme, että NSCLC soluilla ensisijainen vastus vastaan ​​EGFR-TKI gefitinibi reagoimaan hoitoon SecinH3, joka estää EGFR epäsuorasti kohdistamalla sen soluliman aktivaattorit cytohesin perheen. Tämä tulos saattaa esiintyä odottamatonta, koska vastustuskyky gefitinibi voidaan tulkita riippumattomuus EGFR signalointi. Tämä ei kuitenkaan ole asianlaita. Hoito EGFR-spesifisiä siRNA: iden eri EGFR-TKI resistenttejä NSCLC solulinjat ekspressoivat villityypin EGFR johti vähentyneeseen solujen proliferaatiota [9], [10], [11], [12], mikä osoittaa, että EGFR-TKI kestävyys ja EGFR riippumattomuus ovat ainakaan aina vastaava. Näin ollen on osoitettu, että EGFR edistää eloonjäämistä syöpäsolujen riippumaton sen kinaasiaktiivisuuden [28]. Nämä tiedot osoittavat, että kinaasi-esti EGFR voi silti aktivoida signalointireittejä, jotka stimuloivat proliferaatiota tai estää solukuoleman. Tämän tueksi oletus on se havainto, että esto EGFR mukaan erlotinibin indusoi heterodimerisoitumisella EGFR kanssa IGF1 R, joka aktivoi IGF1 R ja sen signalointi loppupään kinaasien kuten Akt [16]. Cytohesins on osoitettu olevan suorassa vuorovaikutuksessa EGFR ja siten vaikuttaa sen konformaatio [17]. Koska tietty konformaatio EGFR, epäsymmetrinen dimeeri, on edellytys kinaasin aktivaation [29], modulaatio EGFR konformaatio on liitetty aktivointi EGFR jonka cytohesins, prosessi, joka on estää SecinH3. Koska hoito H460-solujen SecinH3 johti lisääntyneeseen fosforylaation IGF1 R samanlainen funktio cytohesins aikana aktivoinnin IGF1 R, että EGFR voidaan sulkea pois. Ilmeisesti SecinH3 inhiboi signalointia EGFR-aktivoitua IGF1 R alavirtaan reseptoria. Tämä havainto on täysin samaa aikaisempien havaintojen kanssa, että SecinH3 eivät vaikuttaneet insuliinin reseptorin aktivoitumisen mutta inhiboi signalointia alavirtaan reseptorin tasolla sovittimen proteiinin insuliinin reseptori substraatti-1 mikä vähentää Akt aktivointi [15], [27], [ ,,,0],30]. Siten antiproliferatiivista aktiivisuutta SecinH3 EGFR-TKI resistenttejä NSCLC solut voidaan selittää sen dual estävä vaikutus sekä EGFR ja IGF1 R signalointi, jotka voivat estää solujen kiertämästä EGFR esto lisääntynyt IGF1 R signalointi. Haluamme huomauttaa, että meidän voida sulkea pois sitä mahdollisuutta, että synergistinen antiproliferatiivinen vaikutus SecinH3 gefitinibin kanssa voivat johtua SecinH3 vaikuttavat signalointia RTK lisäksi IGF1 R. Erityisesti, monistus hepatosyyttien kasvutekijän reseptorin c-MET [31], ja kun läsnä on EML4-Alk-fuusioproteiinia [32] ovat liittyneet EGFR-TKI vastus. Aktivointi Näiden RTK mukaan cytohesins ei kuitenkaan ole vielä tutkittu ja siksi emme tällä hetkellä tiedä, onko signalointia näiden RTK saattaa vaikuttaa SecinH3.

Tehostettu aktivointia IGF1 R on tunnustettu tärkeäksi syy resistenssi EGFR kohdistettuja hoitomuotoja syöpäsoluissa eri alkuperää. Näin ollen, in vitro kokeet osoittivat yhdistetty inhibitio IGF1 R ja EGFR aktiivisuus vähentää kasvainsolujen proliferaatiota synergistisesti [16], [23], [24], [25], [26]. Valitettavasti näitä tuloksia ei käännetty Kliinisissä tutkimuksissa, joissa tähän asti, yhdistelmähoitoja soveltamalla EGFR ja IGF1 R kohdistaminen hoitojen ole osoittanut huomattavia parannuksia yhtä hoitoa [33], [34]. Syyt Näiden heikkojen tulosten tällä hetkellä tuntematon, mutta voi olla, että puutteellinen ymmärrys molekyylitason yksityiskohtia ylikuulumisen välillä EGFR ja IGF1 R signalointia, joka estää järkevä valinta potilaille, jotka voivat hyötyä yhdistelmähoitoa. Mutaatiot, jotka ennustavat vastaus täsmähoitoihin, kuten EGFR, ei ole raportoitu IGF1 R [35] ja voivat siten ei voida käyttää valitsemaan potilaille. Kliinisessä tutkimuksessa etsitään biomarkkereita ennustamiseksi hyötyä yhdistettynä EGFR /IGF1 R esto KRAS tunnistettiin [36]. In vitro tutkimukset osoittivat kuitenkin, ristiriitaisia ​​tietoja antiproliferatiivinen vaikutus yhdistettynä estämällä EGFR ja IGF1 R on KRAS-mutatoitunut H460-soluissa. Kun taas yksi tutkimus ei löytänyt synergiasta [25] Toisessa tutkimuksessa teki [16]. Tutkimuksessamme heikko synergia gefitinibin ja AG1024 havaittiin taas vahvempi synergia havaittiin yhdistelmiä joko näiden yhdisteiden kanssa SecinH3. Nämä eroavuudet korostavat ajatus, että estävä samanlaisia ​​tavoitteita eri estäjiä tai esto strategiat voivat johtaa erilaisiin biologisiin tuloksiin. Siksi lähestymistavat, jotka eivät ole riippuvaisia ​​suoraan EGFR ja IGF1 R kinaasiaktiivisuudet mutta kohdistaa näiden reseptorien kautta tapahtuva epäsuora aktivaattori tai sovitinta molekyylit voivat tarjota enemmän tietoa näistä signalointipolkujen ja siten tarjota vielä tunnistamattomia kohteita uusien terapeuttisten lähestymistapojen.

Kiitokset

Kiitämme Y. Aschenbach-Paul, A. Florin ja U. Rommerscheidt-Fuss tekniseen tukeen.