Krooninen sairaus

tiivistelmä

Snail, joka on voimakas repressori E-kadheriinin ilmentymisen, on keskeinen rooli epiteelisolujen-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) in epiteelin syöpä. Äskettäin EMT ja stemness ohjelmat löytyvät liittyvät toisiinsa. Nykyisessä tutkimuksessa, ilmaus Snail ja sen vaikutuksesta syövän kantasoluja (CSC) merkki ilmaisun, invasiivisuus, itseuudistumisen, kyky muodostaa klooneja, ja tuumorigeenisyystesti haimasyövän soluja tutkittiin. Tuloksemme osoittivat, että Snail on erittäin ilmaistu CSC

korkea solulinjaa Pancin-1. Vakaa, lyhyt hiusneula-RNA (shRNA) -välitteisen Snail Knockdown laski hyökkäyksen Pancin-1-soluissa, linjassa lisääntynyt E-kadheriinin ilmentymisen ja sen translokaation tumasta kalvon. Snail hiljentäminen in Pancin-1 esti myös CSC merkki ALDH ilmaisua, yhdessä vähentynyt pallo ja pesäkkeitä muodostavien kapasiteettia, mikä oli hyvin pitkälti ilmaus kantasolujen liittyvien transkriptiotekijöiden kuten Sox2 ja Oct4. Hiiren ksenograftimalleissa, pudotus Snail johti pienempään määrään kasvaimen kantavien hiirten ja vähentää keskikoko kasvaimia, jotka oli vahvempi kalvon värjäytyminen E-kadheriinin ja kevyempi värjäytymistä Oct4. Yhdessä nämä havainnot sekaantumaan Snail tarvitaan ylläpidosta kantasolun kaltainen fenotyyppi haimasyövän, ja esto Snail voisi olla tehokas strategia hoitoon haimasyövän kohdistamalla CSCS.

Citation: Zhou W, Lv R, Qi W, Wu D, Xu Y, Liu W, et ai. (2014) Etana Auttaa huolto kantasolun Fenotyyppikuvaus solut Human Haimasyöpä. PLoS ONE 9 (1): e87409. doi: 10,1371 /journal.pone.0087409

Editor: Michael Klymkowsky, University of Colorado, Boulder, Yhdysvallat

vastaanotettu: 09 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 24 joulukuu 2013; Julkaistu: 29 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Zhou, et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China [81001095]. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haiman adenokarsinooma on erittäin aggressiivinen epiteelin syöpä, jonka ilmoittama 5 vuoden pysyvyys on noin 5% [1]. Vain 20% haimasyövän potilaat ovat oikeutettuja kirurginen resektio, ja etäpesäkkeitä usein kehittyy vielä leikkauksen jälkeen, kun nykyinen kemo- ja radio-hoidot ovat pitkälti tehottomia [2]. Siksi ymmärtäminen molekyyli tapahtumia taustalla kehittymistä ja etenemistä haimasyövän tarvitaan kiireellisesti, mikä voi olla avain kehitykseen tehokkaampia ja uusia hoitostrategioita.

Yhä enemmän tieteellistä näyttöä siitä, että kasvaimet sisältävät pieni solujen alapopulaation, eli syövän kantasoluja kaltaisia ​​soluja (CSCS) tai syöpä-aloitetaan solut (CIC), joka näytteille uudistuva kapasiteettia, kestää tavanomaista kemoterapiaa ja vastaavat hoidon epäonnistumiseen, syövän uusiutumisen ja etäpesäkkeiden [3 ]. Vaikka CSCS hypoteesi ehdottaa, että kasvaimia voi syntyä kantasolut tai esi, tutkimukset joissakin laboratorioissa osoittavat, että epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT), kehityksellinen prosessi, jossa solut menettävät epiteelin ominaisuudet ja hankkia mesenkymaalisten ominaisuudet, kuten lisääntynyt liikkuvuus ja invaasio, voi antaa solujen kantasolujen kaltaiset ominaisuudet [4] – [6].

EMT aiheutetaan tukahduttaminen E-kadheriinin ilmentymisen EMT sääntelyviranomaisten kuten Snail, Slug, ja Twist. Snail perhe sinkkisormen transkriptiorepresso- suoraan tukahduttaa E-kadheriinin in vitro ja in vivo vuorovaikutuksen kautta välillä COOH-terminaalisen alueen ja 5′-CACCTG-3 ’sekvenssin E-kadheriinin promoottori [7]. Ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän soluja, yliekspressio Snailin raportoitu aiheuttavan paitsi EMT mutta myös CSC-kaltainen fenotyyppi, joka parantaa solujen vaeltamiseen ja invaasion in vitro ja lisää etäpesäkkeiden muodostumista in vivo [8]. Tutkimukset ovat myös osoittaneet, että Snail on olennainen rooli etenemisessä ja metastaattisen prosessin ihmisen haimasyövän [9], [10]. Vuonna hoitopaikassa, Snail yli-ilmentyminen on aiemmin yhteydessä heikompaan ennusteeseen ja entistä invasiivisia fenotyyppi monissa maligniteettien [11] – [13]. Kuitenkin vain harvat raportit liittyy siihen, onko yhteys Snail ilmaisun ja voitto haimasyövän kantasolujen ominaisuuksia. Siksi arvioitiin Snail n toiminto kantasolujen merkki ilmaisu, kyky uusiutua haimasyövän solulinjassa in vitro ja ksenograftikasvaimissa muodostumista in vivo. Työmme osoittaa, että geenisäätelyn välittämä Snail voi tukea ihmisen haimasyövän kasvua ylläpitämällä haimasyövän kantasolujen.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Ihmisen haiman syöpäsolulinjoissa Panc-1 ja BxPC-3 saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). Soluja viljeltiin ja ylläpidettiin DMEM-alustassa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Gibco /Invitrogen, CA), penisilliini-streptomysiinillä (Flow Laboratories, Rockville, MD). Molemmat solulinjat pidettiin kosteutetussa ilmakehässä 37 ° C: ssa 5% CO2. Gross solujen morfologia läsnäolo tai puuttuminen morfologisia ominaisuuksiltaan EMT arvioitiin kaksi tarkkailijaa sokkoutettu hoidon olosuhteissa. Kuvia solulinjoja otettiin käyttäen Nikon Eclipse TS100 käänteismikroskoo- ja Pro-MicroScan kamera (Oplenic).

arviointi aldehydidehydrogenaasin toiminnan

Aldefluor substraattia (2,5 ui, Aldagen, Inc., Durham, NC), lisättiin 1 x 10

6 kasvainsolujen 500 ui määrityspuskurissa ja inkuboitiin 60 min 37 ° C: ssa. Solut analysoitiin FACSCalibur-virtaussytometrillä (Becton Dickinson) mukaan valmistajan ohjeiden. Solujen käsittely 5 ui ALDH-inhibiittoria dietyyliamino-bentsaldehydiä (DEAB) toimi negatiivisena kontrollina. Lentivirusvektoreita ilman fluoresenssi käytettiin transfektion aikana FACS-analyysi.

Sphere muodostumista määrityksessä

Sphere muodostumisen määritys suoritettiin, kuten on kuvattu muualla [14]. Lyhyesti, solut maljattiin kuusikuoppaisille ultralow kiinnityslevyt (Corning Inc., Corning, NY) tiheydellä 1000 solua /ml DMEM: ssä, jota oli täydennetty 1% N2 täydennys (Gibco, Grand land, NY), 2% B27 täydentää (Gibco, Grand island, NY), 20 ng /ml ihmisen verihiutaleiden kasvutekijä (Sigma-Aldrich), 100 ng /ml epidermaalista kasvutekijää (PeproTech, Rocky Hill, NJ) ja 1% antibiootti-antimykoottia (Invitrogen) 37 ° C ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 95% ilmaa ja 5% CO2: ta. Sphere viljelmiä siirrostettiin kuluttua 7~10 päivää. Kulumisesta aloilla, väliaine poistettiin ja palloja kerättiin ja niitä inkuboitiin huoneen lämpötilassa 5 min 0,05% trypsiiniä (Solarbio, Peking, Kiina) ja havaittiin mikroskoopilla tarkistaa dissosiaatiota. Saadut solut dissosiaatiosta seulottiin 40 um: n suodattimen ja lasketaan laskurilla käyttämällä trypaanisinivärin ennen jatkomaljausta.

Soft agar määrityksessä

arvioimiseksi klonogeenisten potentiaalin pesäkemuodostuksen määritys suoritettiin seuraavasti. Kukin kuoppa kuuden hyvin viljelymaljalle päällystettiin 2 ml: lla pohja agar seosta (DMEM, 10% (v /v) FCS: ää, 0,6% (w /v) agaria). Sen jälkeen, kun pohjakerros jähmettynyt, 2 ml top agaria väliaineen seosta (DMEM, 10% (v /v) FCS: ää, 0,3% (w /v) agaria), joka sisälsi 1 x 10

4-soluja lisättiin, ja maljaa inkuboitiin 37 ° C: ssa 3 viikkoa. Levyt värjättiin 0,5 ml 0,005% kristalliviolettia 1 h ja sitten preparointimikroskooppia käytettiin laskea pesäkkeiden lukumäärä 50 soluihin [15].

Transwell invaasiomääritys

sillä invaasiomääritys, 24-kuoppaisen levyn Transwell järjestelmässä, jossa on 8 pm huokoskoon polykarbonaattisuodattimen kalvo (Corning Costar, Corning, NY), on käytetty. 1 x 10

5 solua 100 ul: ssa seerumia lisättiin yläkammioon päällystetty Matrigelillä (BD Bioscience, Bedford, MA). Alempi kammio sisälsi 10% FBS: ää sisältävässä väliaineessa. Soluja inkuboitiin 48 tuntia ja solut, jotka olivat tunkeutuneet kautta Matrigel päällystettyä kalvo kiinnitettiin ja värjättiin kristallivioletilla, sitten laskettiin valomikroskoopilla neljällä satunnaisesti kenttiä sokkona.

Reaaliaikainen RT-PCR-analyysi geenin ilmentymisen

reaaliaikaisen RT-PCR-analyysi, kokonais-RNA solujen uutettiin käyttäen Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA). cDNA syntetisoitiin käyttäen vastaavia määriä kokonais-RNA (1 ug), jossa satunnaisia ​​alukkeita 20 ul: n käänteiskopioijaentsyymin reaktioseosta (Promega, Madison, WI). Reaaliaikainen PCR-alukkeet suunniteltiin ja hankittiin Ruisai Inc (Shanghai, Kiina) seuraavasti:

Etana, eteenpäin (5′- GCTGCAGGACTCTAATCCAGA-3 ’) B

ja reverse (5′ ATCTCCGGAGGTGGGATG-3 ’);

Slug, eteenpäin (5′-AGCGAACTGGACACACATAC-3′) B

ja reverse (5′-TCTAGACTGGGCATCGCAG-3 ’);

Twist 1 , eteenpäin (5′-CACTGAAAGGAAAGGCATCA-3 ’) B

ja reverse (5′-GGCCAGTTTGATCCCAGTAT-3′);

ZEB1, eteenpäin (5′-CGAGTCAGATGCAGAAAATGAGCAA-3 ’) B-

ja reverse (5′-ACCCAGACTGCGTCACATGTCTT-3 ’);

ZEB2, eteenpäin (5′-GAGTTGATGCCTCGGCTATTGC-3′) B

ja reverse (5′-CTGGACATTGAGCTGCTTCGATC-3 ’) ;

GAPDH, eteenpäin (5′-GGTGTGAACCATGAGAAGTATG-3 ’) B

ja reverse (5′-GATGGCATGGACTGTGGTCAT-3′).

monistaminen suoritettiin kokonaistilavuudessa 20 ui, joka sisälsi 1 ui kutakin aluketta, 10 ui LightCycler FastStart DNA Master SYBR vihreä I (Roche Diagnostics, Pleasanton, CA) ja 1 ul 1:10 laimennettua cDNA: ta. PCR-reaktiot valmistettiin kahtena kappaleena, ja kuumennettiin 95 ° C: ssa 2 min, jota seurasi 40 sykliä denaturointi 95 ° C 15 sekuntia, pariutuminen 55 ° C: ssa 20 sekunnin ajan, ja pidennys 72 ° C: ssa 20 sekunnin ajan. Kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena ja laskettiin sen perusteella,

ΔΔCt menetelmällä. N-kertainen muutos mRNA-ilmentyminen määritettiin menetelmän mukaisesti 2-

ΔΔCT.

Lentivirusvektorikonstruktit-välitteisen RNAi Snail

pcDNA6.2-GW /EmGFP-miR vektori hankittiin Invitrogen (Carlsbad, CA). Kaksijuosteinen shRNAs kohdistaminen ihmisen Snail suunnitellut BLOCK-i T ™ RNAi Designer. Tavoiteltu sekvenssi 1 oli 5′-GCCTAACTACAGCGAGCTG-3 ’; kohdennettu sekvenssi 2 oli 5’-GGATCTCCAGGCTCGAAAG-3 ’. Molemmat kohdennetut sekvenssit todennettu spesifisiä Snail by Blast etsimällä vastaan ​​ihmisen genomin. Universal ei-kohdistuksen ohjaus shRNA (sekvenssit: 5’-TGCTGAAATGTACTGCGCGTGGAGACGTTTTGGCCACTGACTGACGTCTCCACGCAGTACATTT-3 ’; 5′-CCTGAAATGTACTGCGTGGAGACGTCAGTCAGTGGCCAAAACGTCTCCACGCGCAGTACATTTC-3’) käytettiin negatiivisena kontrollina. shRNAs syntetisoitiin ja kloonattiin pcDNA6.2-GW /EmGFP-miR, siirretään sitten lentiviruksen ekspressioplasmidiin pLenti6 /V5-DEST kanssa Gateway rekombinaation tekniikka. Lentiviruksen tuotanto tehtiin transfektoimalla 293-T-solujen kanssa shRNA tai negatiivinen kontrolli plasmidin ja pakkausten Mix (Invitrogen), kun läsnä on POLOdeliverer ™ 3000 Transfection Reagent (Ruisai Inc, Shanghai, Kiina). Supernatantit kerättiin 48 tuntia transfektion jälkeen ja sitten suodatettiin; viruksen tiitterit määritettiin sitten reaaliaikainen PCR. Subkonfluentit solut infektoitiin lentiviruksen on infektiokertoimella 50, kun läsnä oli 8 ug /ml polybreeniä (Sigma-Aldrich). Panc-1-soluja, joilla on stabiili hiljentäminen Snail-geeniä valittiin 2 ug /ml Blasticidin varten 4 viikkoa. Sitten soluja viljeltiin 1 ug /ml Blasticidin. Toinen negatiivinen kontrolli shRNA plasmidi (sc-108060) Santa Cruz Biotechnology, joka koodaa salattuja shRNA sekvenssi, jota käytettiin väliaikaisen transfektion protokollan mukaan.

Western blot-analyysi

kokosolu proteiini uuttamalla solut lyysattiin jääkylmällä RIPA-puskuria, joka sisälsi 1 mM PMSF: ää ja sentrifugoitiin 14000 g: llä 5 minuutin ajan. Supernatantti, joka sisälsi eristetyn proteiinin kvantifioitiin kaupallisesti saatavilla modifioitu Bradfordin menetelmällä (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Western blot-proteiinin näytteet valmistettiin keittämällä eristetty proteiineja denaturoivissa näytepuskuria. Yhtä suuret määrät proteiinia, erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille. Sitten membraanit blokattiin 5% rasvatonta kuivamaitoa TBS ja 0,1% Tween 20: ssa 1 h ja tutkittiin sopivan primaarisen vasta-aineen yli yön 4 ° C: ssa. Sitten membraanit pestiin ja inkuboitiin sopivan piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten membraanit pestiin ja proteiinivyöhykkeet visualisoitiin käyttäen kaupallisesti saatavilla parannettu kemiluminesenssin (ECL) kit (Thermo Scientific). Oikeellisuuden lastaus proteiinia eristetään koko solun lysaatin, blotit riisuttu, pestiin ja uudelleenseulottiin GAPDH vasta-aineella (Bioworld) latauskontrollina. Kuvat tehtiin näkyviksi käyttämällä ECL Detection System (Amersham, Arlington Heights, IL). Vasta-aineita käytetään Western blot analyysit olivat seuraavat: kanin mAb anti-Snail, kanin mAb anti-E-kadheriinin, kanin mAb anti-vimentiinista, kanin mAb anti-Bmi1, kanin mAb anti-Nanog, kanin mAb anti-Oct4, kani mAb anti-Sox2 (Cell Signaling Technology, Inc.). Densitometria Western blotit analysoitiin Image J ohjelmisto.

Immunofluoresenssimikroskopia

Solut kasvatettiin lasipeitinlevyille, kiinnitettiin 4% formaldehydiä PBS: ssa 10 minuutin ajan, läpäiseviksi 0,2% Triton X -100 10 minuuttia, ja blokattiin 10% vuohen seerumilla PBS: ssä, 0,2% Tween 1 h. Peitinlasit inkuboitiin E-kadheriinin-vasta-ainetta (BD Biosciences, 1:200 laimennus) estoliuoksessa 1 h huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen, kun solut on pesty PBS-0,2% Tween, inkuboimme soluja 1 tunnin ajan vuohen anti-kani-IgG Alexa 594 (1:1000 laimentamista; Invitrogen). Tumat vastavärjättiin DAPI. Objektilasit pestiin perusteellisesti PBS: llä ja päällystettiin Fluoromount-G. Näytteitä valokuvattiin käyttäen immunofluoresenssilla mikroskooppia.

In vivo analyysi kasvaimen kasvua

Kaikki toimenpiteet, joissa eläimet hyväksynyt Animal Care ja käyttö komitean Zhejiangin yliopistossa School of Medicine (ZYXK2010-0149). Yksittäisten solujen suspensioita (2 x 10

5: n kokonaistilavuudessa 100 ui 1/1 (v /v) PBS /Matrigel) injektoitiin subkutaanisesti oikeaan ja vasempaan midabdominal alueen nude-hiirten (BALB /c-kannan ) 8 viikon ikäisillä. Tuumorin koko seurataan päivittäin työntömitoilla ja kasvaimen tilavuus laskettiin kaavalla (pituus x leveys

2) /2. Eläimet tehtiin ruumiinavaus 28 päivää sen jälkeen soluistutusryhmä ja kasvaimen kasvua arvioitiin.

immunohistokemia analyysi ksenograftikudoksesta

ihonalainen kasvaimia muodostunut hiiriä kiinnitettiin 10% fosfaattipuskuroidussa formaliinilla ja upotettu parafiini. 4 um: n paksuisia leikkeitä poistettiin parafiini käyttäen ksyleeniä ja hydratoidaan luokiteltujen sarjojen etanolipesujen. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus pysäytettiin 10 min inkubaation 3% H

2O

2. Inkuboinnin jälkeen blokkausliuoksella 30 min, leikkeitä inkuboitiin primaarisen vasta-aineen BD Biosciences (anti-Snail, 1:200 laimennus, anti-E-kadheriinin, 1:200 laimennus, ja anti-Oct4, 1:300 laimennus) ja 1 h, biotinyloidun sekundaarisen vasta-aineen kanssa 20 minuutin ajan ja sitten streptavidiini (HRP) 10 min. Vasta-aine visualisoitiin diaminobentsidiinillä (DAB) kromogeeni, ja leikkeet vastavärjättiin H 0,05.

Tulokset

Snail ilmaisun ja kantasolujen merkki ALDH haiman solulinjoissa

Mikroskoopin, BxPC-3-soluja morfologisesti epiteelin luonnossa. Sen sijaan, Panc-1-soluja sekapopulaatioissa epiteelin ja karan muotoinen mesenkymaaliset tyypin solujen (kuvio 1 A). Käyttämällä virtaussytometria, huonosti erilaistunut solulinja Pancin-1 luonnehdittiin CSC

korkea solu enemmän ALDH

suuren kannan, kun taas hyvin erilaistunut solulinja BxPC-3 CSC

pieni solu vähemmällä ALDH

korkea väestöstä (kuvio 1 B). Sphere muodostumisen määritys paljasti myös, että Panc-1 muodostuu yhä suurempia aloilla kuin BxPC-3 ei (kuva 1 A). Perehtyä keskeistä roolia EMT sääntelyviranomaisten selvitimme perusilmennystä Snail, Slug, Twist1, ZEB1 ja ZEB2 in Pancin-1 ja BxPC-3. Erityisesti, reaaliaikainen RT-PCR-analyysit osoittivat, että Panc-1-soluissa oli merkittävästi suurempi ilmaus Snail ja ZEB1 mRNA: ta (noin 6-kertaiseksi ja 4-kertaiseksi, P 0,01) verrattuna BxPC-3-soluja (kuvio 1 C). Oli korrelaatio huono erilaistumisen, Snail ja ZEB1 ekspressiotasot ja palloja muodostavan kapasiteetin näissä kahdessa haimasyövän solulinjoissa. Valitsimme Pancin-1 solulinja myöhempää Snail hiljentäminen kokeissa johtuen sen suhteellisen korkea ilmentymistaso Snail ja erinomainen lentiviral transfektiotehokkuudelle.

. Morfologia Pancin-1 ja BxPC-3-soluissa ja niiden aloilla. Huomaa, että Pancin-1-soluissa on enemmän kara-muotoinen mesenkymaalisten väestön ja voivat muodostaa yhä suurempia aloilla. ** P 0,01 verrattuna BxPC-3. B. ALDH aktiivisuus Pancin-1 ja BxPC-3-soluissa. Pistekuvioita solujen analysoitiin virtaussytometrialla ALDH toimintaa. Soluja käsiteltiin Aldefluor substraatin läsnä ollessa tai puuttuessa ALDH-inhibiittoria DEAB. Käsittelyn jälkeen näytteet analysoitiin virtaussytometrialla läsnäolon ALDH

korkea-soluja. Esitetyt arvot ovat keskiarvoja kolmen erillisen kokeen. C. Reaaliaikainen RT-PCR quantifing Snail, Slug, Twist1, ZEB1, ja ZEB2 mRNA ilmaisun Pancin-1 ja BxPC-3-soluissa. Bar kaaviot osoittavat suhde ilmentymistasoon Panc-1-solujen, että BxPC-3-soluja. ** P 0,01.

Snail indusoi EMT kaltaisia ​​muutoksia haimasyövän solussa

Jotta voidaan tutkia roolia Snail in EMT induktio ja CSC sukupolvi, saimme aikaan vakaasti Snail knockdown Pancin-1 solulinja (Panc-1 /shSnail) mukaan lentiviral transfektiolla.

Kaksi itsenäistä vakaa shSnail-ilmentävien kloonien (S1, S2) ja stabiili negatiivinen kontrolli shRNA klooni (NC) analysoitiin Snail mRNA ilmaisun . S1 ja S2 osoittivat jopa 80% downregulation Snail mRNA, kun taas kontrolli klooni eivät osoittaneet mitään merkittävää vähenemistä Snail mRNA (kuvio 2A). Valitsimme S1-kloonia Pancin-1 /shSnail varten Seuraava koe, koska sen suurempi laajuus Snail hiljentäminen. Pudotus Snailin Panc-1-soluissa varmistettiin Western blot -analyysillä (kuvio 2B ja C). Kanin mAb anti-Snail on validoitu solulysaatteja Panc-1, MIA-PaCa2, BxPC-3, ja Capan-1 solulinjoissa. Värjäyskuvio oli samanlainen kuin aiemmin julkaistut tiedot (kuvio S1) [9], [16]. Sulkea pois heterogeenisyys aiheuttamat vakaa transfektion ja selektioprotokollaa käytimme toinen negatiivinen kontrolli shRNA plasmidi (sc-108060) ja lyhytaikaista transfektiota. Reaaliaikainen RT-PCR ja Western blot ei paljastanut mitään merkittävää eroa of Snail ilmaisun välillä vakaasti ja transfektoitiin kontrolli klooneja (kuva S2).

. Snail mRNA ilmentyminen vakaa shSnail ilmentävien (S1, S2) ja negatiivinen kontrolli shRNA ilmentävien (NC) Pancin-1 klooneja. Arvot ovat keskiarvoja ja keskihajonnat kolminkertaisten mittausten. ** P 0,01 verrattuna NC. B. Western blot, joka osoittaa epiteelin mesenkyymisoluyhteisviljelmissä markkereita Snail, Slug, Twist1, ZEB1, ZEB2, E-kadheriinin ja vimentiinista in Pancin-1-solut transfektoitu lentivirusta välittämää negatiivinen kontrolli shRNA (Panc-1 /NC) tai shSnail (Panc-1 /shSnail). GAPDH käytettiin latauskontrollina. C. kvantitointi proteiinin tasot Snail, Slug, Twist1, ZEB1, ZEB2, E-kadheriinin ja vimentiinista in Pancin-1 /NC ja Panc-1 /shSnail soluja. * P 0,05, ** P 0,01.

Kun lentivirus infektio, sokaisi tutkijat havaittu eroja brutto ulkonäkö soluja. Vakaa infektio Panc-1-soluissa shSnail lisäsi merkittävästi solujen välistä adheesiota ja mukulakiven kaltainen muoto, verrattuna kontrolli-soluja (kuvio 3A). Seuraavaksi arvioitiin ilmentymisen ja lokalisaation E-kadheriinin käyttäen immunofluoresenssivärjäyksen. Verrattuna Panc-1 /NC-solut, Panc-1 /shSnail solut olivat kasvaneet ekspressiotasot E-kadheriinin ja siirto E-kadheriinin ydin- osastosta solukalvoon (kuvio 3B). Nämä muutokset olivat tyypillisiä solujen kanssa epiteelin fenotyyppi, joka osoittaa, että solut, joille mesenkymaalisten-to-epiteelin siirtymistä (MET) jälkeen Snail hiljentäminen. Edelleen vahvistaa havainto, arvioimme ilmentymisen epiteelisolujen adheesiomolekyyli E-kadheriinin, mesenkymaalisten solujen markkeri vimentiinista ja muut EMT transkriptiotekijöiden Slug, Twist1, ZEB1 ja ZEB2 Western-blottauksella solulysaateille. Kuten odotettua, kun hiljentäminen Snailin Panc-1, ilmentymistä E-kadheriinin havaittiin kasvavan. Kääntäen, lasku ilmaus vimentiinista ja ZEB1 jälkeen havaittiin Snail knockdown. Merkittäviä eroja ei havaittu proteiinin tasot Slug, Twist1 ja ZEB2 (kuvio 2 B, C). Nämä tulokset osoittavat selvän suhde Snail ja E-kadheriinin ja myös ehdottaa suoraa tai välillistä vuorovaikutusta Snail ja ZEB1, jotka molemmat pitävät mahdollisuudet tukahduttaa E-kadheriinin transkriptio.

. Morfologisten muutosten ja Panc-1-soluissa, kun Snail hiljentäminen osoittavat muutoksen solun kasvun kuvio päässä mesenkymaalisten kohti epiteelin fenotyyppiä. B. immunofluoresenssi ilmentämiseen ja sijainti solun E-kadheriinin stabiileja klooneja Panc-1 /NC ja Panc-1 /shSnail. Nuclear DNA havaittiin DAPI-värjäyksellä. Vakaa Snail pudotus johtaa lisääntyneeseen ekspressioon E-kadheriinin ja sen translokaation tumasta kalvon. C. Snail hiljentäminen estää Pancin-1 invasiivisuus in vitro matrigeeliin hyökkäystä määrityksiä. ** P 0,01 verrattuna Pancin-1 /NC. Tiedot esitetään tässä ovat keskiarvoja ± SD kolmesta kokeesta.

Snail kasvattaa soluinvaasiota kyky haimasyövän solussa

Koska prosessit EMT on yhdistetty solujen invaasiota, me seuraavaksi kysytään Snail ilmaisu on jonkin verran vaikutusta soluinvaasiota kapasiteettia haiman syöpäsoluja. Käyttämällä Matrigel in vitro invaasiomääritys, löydettiin Panc-1-solujen Snail hiljentäminen oli merkittävästi vähentynyt kapasiteetti invaasio verrattuna kontrollisoluihin (kuvio 3 C). Nämä tiedot vahvistavat, että Snail ilmaisu parantaa invasiivisen kapasiteetti haimasyövän soluja, ja inaktivoimiseksi Snail johtaa MET vähemmän invasiivisia ominaisuuksia.

Snail tehostaa kantasolun kaltaisia ​​ominaisuuksia haiman syöpäsoluissa

Kuten Snail ilmentyy voimakkaasti CSC

korkea verrattuna CSC

alhainen soluja, me syystä tutkittiin Snail voi vaikuttaa ilmaus kantasolujen merkki ALDH. Snail vaiennetaan Pancin-1-solut osoittivat merkittävää laskua ALDH

korkea väestöstä (1,60%) verrattuna niiden ohjaus kollegansa (6,01%) (kuvio 4). Seuraavaksi käytimme in vitro alalla muodostumisen määritys tutkia Snail osallistuu CSC uusimisen yhteydessä serial johtamisella. Osoitimme, että Snail Knockdown ei vaikuta vain peruspätevyys palloja, mutta johti myös jatkuvasti vähentämään pallo numeroita seuraaviin sukupolviin. Pesäkkeenmuodostusta testi osoitti myös, että hiljentäminen Snail merkittävästi estänyt pesäkkeen kasvua Pancin-1-soluissa (kuva 4 B). Nämä kokeet sotkea että Snail on tärkeä rooli sääntelyn haiman CSC sisältöä ja on tarpeen itseuudistuvien kapasiteettia.

. Snail hiljentäminen pienenee ALDH

korkea väestön Pancin-1-soluissa. Pistekuvioita solujen analysoitiin virtaussytometrialla ALDH toimintaa. Esitetyt arvot ovat keskiarvoja kolmen erillisen kokeen. B. Snail hiljentäminen merkittävästi estää kyky pallon muodostumisen sarja johtamisella ja kykyä kyky muodostaa klooneja in Pancin-1-soluissa. Edustavia kuvia pesäkkeitä yläpuolella näkyvät pylvään kaavio. Samanlaisia ​​kokeita toistettiin kolme kertaa. ** P 0,01 verrattuna Panc-1 /NC. C. Western blot-analyysi solu otteita Pancin-1 /NC ja Panc-1 /shSnail soluja Bmi1, Nanog, Sox2, ja Oct4 ilme. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina. D. kvantitointi proteiinin tasot Bmi1, Nanog, Sox2, ja Oct4 in Pancin-1 /NC ja Panc-1 /shSnail soluja. * P 0,05, ** P 0,01 verrattuna Pancin-1 /NC.

Snail lisää ilmentymistä kantasolujen liittyvien transkriptiotekijöiden

Koska Snail ilmaisu on jonkin verran suhde CSC sisältöä, käytimme Western blotting onko Snail ilmentyminen on rooleja muuttuvassa ilmentymisen Bmi1, Nanog, Sox2, ja Oct4, joita tarvitaan säilyttämään pluripotenttisuuden kantasoluja. Kuten kuviossa 4 C ja D, lentivirus- transfektio Snail shRNA indusoi dramaattinen väheneminen ilmentymisen Sox2 ja Oct4 (P 0,05 ja P 0,01, vastaavasti) in Panc-1-soluissa, jotka oli yhdenmukainen menetys CSC fenotyyppi, mikä viittaa siihen, että ilmentyminen nämä tekijät voivat olla tärkeitä Snail aiheuttama CSC muodostumista haiman syöpäsoluja.

Snail lisää haimasyövän solujen kasvainten muodostumiseen in vivo

Koska meidän in vitro viittasivat siihen, että Snail näyttelee säätelevä rooli haimasyövän soluinvaasiota ja CSC muodostumista, me ihonalaisesti yhtä paljon Pancin-1 /NC ja Panc-1 /shSnail nude hiirillä ja mitataan tuloksena kasvaimen kasvua. Kun pistetään 2 x 10

5 solua, Panc-1 /NC oli 100% (8/8) kasvaimen muodostumisen ja vain 2/8 hiiriin ruiskutettiin Pancin-1 /shSnail osoitti haiman kasvain siirteen. Lisäksi suuntaus myöhässä kasvaimen muodostumisen ja vähentää kasvaimen kokoa havaittu kasvaimia peräisin Snail hiljentäminen soluista verrattuna kontrollista soluista (kuvio 5A). Immunohistokemia kasvaimia oli kevyempi värjäytymisen Snail ja Oct4, kun taas vahvempi kalvon värjäytyminen E-kadheriinin in Panc-1 /shSnail kasvaimissa verrattuna kuin Panc-1 /NC kasvaimia (kuvio 5B). Nämä tiedot ovat sopusoinnussa meidän in vitro havainnot ja roolia tukevat Snail ylläpidossa haiman CSC osastoon.

. Graafisesti kasvuvauhdin ihonalainen ksenograftikasvaimissa käyttäen soluja Pancin-1 /NC ja Panc-1 /shSnail. 2 x 10

5 jokaisen solun oli istuttaa kahdeksan hiirtä ryhmää kohti. Kaikki hiiret Pancin-1 /NC ryhmä, kun taas vain 2 hiiret Pancin-1 /shSnail ryhmällä oli kasvaimen muodostumisen. B. Expression of Snail, E-kadheriinin ja Oct4 ksenograftikasvaimissa. Edustavia esimerkkejä Snail, E-kadheriinin ja Oct4 ekspressio määritettiin immunohistokemiallisesti. Vahvasti positiivinen Snail ilme on läsnä tumassa ja sytoplasmassa Pancin-1 /NC kasvaimet (a), mutta ei Pancin-1 /shSnail kasvaimet (b). Expression of E-kadheriinin on heikko ja heterogeeninen, että Panc-1 /NC kasvaimet (c), mutta tehokkaampi kalvoon Pancin-1 /shSnail kasvaimet (d). Alhaisempi Oct4 ilme on läsnä Pancin-1 /shSnail kasvaimet (f), koska verrattuna Pancin-1 /NC kasvaimet (e). Mittaviivat: 10 um.

Keskustelu

tutkimus osoittaa, että Snail, joka liittyy EMT ihmisen haimasyövän soluja voidaan myös säädellä ilmentymistä kantasolujen merkkiaineita ja pluripotenttisuuden ylläpitämiseen transkriptiotekijöiden , moduloiva kyky uusiutua ja kyky muodostaa klooneja. Yhdessä tuumorin implantaation tutkimuksessa, tuloksemme osoittavat, että aktivointi Snail vaaditaan ylläpitoa varten syövän kantasolun ominaisuuksia, joka vaikuttaa suoraan tuumorin aloittamista, kasvua in vivo. Olemme osoittaa vakuuttavasti, että inhibitio Snail voidaan pitää uutena strategia parantaa biologisia vaikutuksia syövän vastaisia ​​ja kemopreventiivisiä aineita.

Tutkijat tunnistetaan yleensä CSCS päässä haimasyöpä perustuu ilmentymisen solun pinta-antigeenien, kuten CD44 , CD24, epiteelin-antigeenin (ESA), ja CD133 [17] – [20]. On olemassa erilaisia ​​johtopäätöksiä erillisissä tutkimuksissa, mitä merkkilankaan parhaiten rikastaa haiman CSCS. Kuitenkin viimeaikaiset tutkimukset ovat havainneet, että solujen populaatiot rikastettu korkean ALDH aktiivisuus yksin riitä tehokkaaseen kasvaimeen aloittamista tiiviimmän Tuumorigeenisuustutkimuksissa [21]. Meidän kokeessa Knockdown keskeisistä EMT indusoijan Snail vähensi ALDH

korkealla solupopulaatio. Nämä tiedot osoittavat, että EMT hankkii kasvainsolujen kantasolun kaltaisia ​​ominaisuuksia. Tuloksemme ovat sopusoinnussa tutkimuksen Chen et al, jossa todettiin ALDH

korkea solujen pään ja niskan levy- syöpä ottaa EMT siirtyminen ja endogeenisesti koekspressoi Snail. Lisäksi knockdovvn Snail ilmaisun vähensi ilmaus ALDH, esti syövän varsi kaltaisia ​​ominaisuuksia [22]. Nämä havainnot vahvistettiin lisäksi pallo muodostumista in vitro ja kasvaimen implantaation in vivo, jossa Snail knockdown johti vähemmän ja pienempiä siirteen. Nämä havainnot ovat yhtäpitäviä Mani ja työtovereiden [4], jotka ovat osoittaneet, että pakko ilmentymistä EMT liittyvien molekyylien kuten Snail ja Twist johtaa solujen syövän kantasolujen fenotyyppiä. EMT tarjoaa vaihtoehtoinen tapa tuottaa syövän kantasolujen ominaisuuksia eriytetty epiteelikasvainsolut. Tämä hypoteesi erilaistamattomuuden tukee äskettäin kuvattu sukupolven pluripotenttien kantasolujen näennäisesti terminaalisesti erilaistuneita somaattisia soluja [23].

Yleisesti katsotaan, että Sox2 ja Oct4 ovat keskeisiä transkriptio säätelijöitä alkion kantasolujen (ESC) itseuudistumiseen ja pluripotenttisuus [24] – [26]. Kertyvät todisteet osoittavat, että nämä transkriptiotekijät alakohtaisten neuvostojen ilmaistaan ​​CSC kaltaisten solujen eri syöpätyyppien. Knockdown näistä geeneistä voi johtaa vähentynyt CSC fenotyyppiin, vähentää klonogeeniset ja tuumorigeenisen ominaisuudet syöpäsolujen. [27] – [29]. Ne ovat myös riittävät ohjelmoida ihmisen somaattisten solujen pluripotenttien kantasolujen että keskeiset ominaispiirteet alakohtaisten neuvostojen [23]. Tässä tutkimuksessa, huomasimme, että ekspressiotasot Sox2 ja Oct4 määrä väheni Snail-vaientaminen Pancin-1-soluissa kontrolliin verrattuna soluihin. Tämä viittaa siihen, että Snail toimii pääkytkimenä aikana säätelemällä pluripotenttien potentiaalit kantasolujen. Samanlaisia ​​tuloksia löydy muista tutkimuksista, joissa korkea ilmentyminen Oct4 ja Nanog edistää EMT, ja liittyy lääkeresistenssi, kasvaimen etäpesäke ja huonon ennusteen erilaisissa ihmisen malignances. [30], [31].