Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tuumorinekroositekijä kaltaisia ​​heikkoja apoptoosin indusoija (nipistää, TNFSF12) on jäsenenä tuumorinekroositekijän Yläheimo. TWEAK aktivoi FN14 reseptoria, ja voi säädellä solukuoleman, selviytymistä ja proliferaatiota kasvainsoluissa. On kuitenkin vain vähän tietoa toiminnan ja sääntelyn tätä järjestelmää eturauhassyövässä. FN14 ilmaisun ja nipistää toimia tutkittiin kahdessa ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa, androgeenin riippumaton PC-3 solulinja ja androgen-herkkien LNCaP. Lisäksi ilmaus FN14 analysoitiin ihmisen koepaloja eturauhasen syöpä. FN14 ilmentyminen lisääntyy histologisia osissa ihmisen eturauhasen adenokarsinooma. Molemmat eturauhassyövän solulinjoissa ilmentävät konstitutiivisesti FN14, mutta androgeeni-riippumaton solulinja PC-3: n osoitti suurempia FN14 että LNCaP-solut. FN14 ilmentyminen säädellään ylöspäin PC-3 ihmisen eturauhasen syöpäsolujen läsnä tulehduksellisten sytokiinien (TNFa /IFNy) sekä esiintyminen ja naudan sikiön seerumia. Nipistää indusoi apoptoottista solukuolemaa in PC-3-solut, mutta ei LNCaP-soluissa. Lisäksi PC-3-solut, stimuloimalla yhdessä TNFa /IFNy /TWEAK indusoi korkeampi apoptoosin. Kuitenkin nipistää tai TWEAK /TNFa /IFNy ei aiheuttanut apoptoosia läsnä naudan sikiön seerumia. Nipistää solukuolema aktivaation kautta FN14-reseptorin. Apoptoosi liittyy kaspaasi-3, vapautuminen mitokondrion sytokromi C ja lisääntynyt Bax /BclxL suhde. TWEAK /FN14 reitin aktivaatio edistää apoptoosin androgeeni-riippumaton PC-3-solut tietyissä viljelyolosuhteissa. Edelleen luonnehdinta terapeuttinen kohde potentiaalia TWEAK /FN14 ihmisen eturauhassyövän on perusteltua.

Citation: Sanz AB, Sanchez-Niño MD, Carrasco S, Manzarbeitia F, Ruiz-Andres O, Selgas R, et ai . (2012) tulehdusta edistävien sytokiinien ja Survival tekijät seerumista moduloida Tweak-indusoitu apoptoosi PC-3 syöpäsolujen. PLoS ONE 7 (10): e47440. doi: 10,1371 /journal.pone.0047440

Editor: Daniel Sanchis, Universitat de Lleida – IRBLLEIDA, Espanja

vastaanotettu: 20 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 17 syyskuu 2012; Julkaistu: 15 lokakuu 2012

Copyright: © Sanz et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Grant tuki alkaen Fondo de Investigacion Sanitaria (FIS) PS09 /00447, Instituto de Salud Carlos III-Redes Temáticas de Investigación Cooperativa en Salud (ISCIII-retic) REDinREN /RD06 /0016. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on toiseksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat miehillä [1]. Useimmat eturauhassyövän läsnä paikallinen tauti ja voidaan kovettaa kirurgian ja säteilyä. Kuitenkin, kuten on totta useimmissa kiinteiden maligniteetit, kehittäminen etäpesäkkeitä on viime kädessä kuolemaan. Huolimatta aktiivinen systeemiset hoidot, metastasoituneessa fenotyyppi ajavat resistenssin kehittymistä ja taudin etenemiseen. Lisäksi systeemisiä hoitoja eturauhasen syöpä ovat rajalliset. Viime aikoihin asti oli vain kolme FDA-hyväksyttyjä kemoterapeuttisten aineiden käyttöön kastraatiotason kestävä eturauhassyövän (estramustiinifos-, mitoksantroni, ja dosetakseli) ja kaksi agentit hyväksyttiin vuonna 2010 (sipuleucel-T ja kabatsitakseli [2]. On kuitenkin edelleen selkeä tarve kehittää muita systeemisiä hoitoja. kasvu normaalien eturauhasen epiteelisolujen on alla tiukassa valvonnassa erilaisia ​​kasvutekijöitä, erityisesti androgeenit, kastraatio johtaa apoptoosin tämän solupopulaation. androgeenin ehtyminen on samanlainen vaikutus eturauhasen syöpiä . kuitenkin sen jälkeen alkuperäisen regressio kasvaimia palaavat usein androgeenista ehtyminen riippumaton muodossa, joka on usein tappava. Näin ollen on erityisen kiinnostava etsiä tekijöille pystyvät tappamaan androgeenista riippumaton eturauhassyöpä solut.

Tuumorinekroositekijä (TNF) on alun perin kuvattu tekijä myrkyllinen kasvainten [3], [4]. myöhemmin osoitettiin kuuluvat TNF-superperheen (TNFSF) sytokiinien [5], [6]. Monet TNFSF sytokiinien säätelemään solukuolemaa ja proliferaatiota, sekä tulehdusta ja niillä voi olla rooli kasvaimen biologiaan, mukaan lukien eturauhassyöpä biology [7] – [9]. Esimerkiksi viime aikoina huomio on keskittynyt antituumorivaikutuksen TNF-sukuinen apoptoosia indusoiva ligandi (TRAIL) [10], [11]. Kuitenkin in vivo eturauhassyövissä ilmaista osteoprotege-, syötti reseptori sekä TRAIL ja aktivaattori Nukleaaritekijä-KB ligandi (RANKL) [12]. TNFSF sytokiinit aktivoivat perheen reseptorien (TNFRSF) monet kuljettaa kuolindomeeni (DD) ja toimivat kuolemareseptorien. Aktivointi kuoleman reseptorien kasvainsoluissa sytotoksisten immuunisolujen on tärkein mekanismi, jolla immuunijärjestelmä eliminoi pahanlaatuisia soluja [13].

tuumorinekroositekijä-, kuten heikko apoptoosin indusoija (TWEAK, Apo3L, TNFSF12) on yksi viime jäsenet TNFSF voidaan tunnistaa [14], [15]. TWEAK kuvattiin alun perin indusoi apoptoosin kasvainsoluissa. Lisäksi TWEAK voi säädellä solujen lisääntymistä, solukuoleman, solumigraatio, solujen erilaistumiseen, kudosregeneraatiossa neoangiogeneesiin ja tulehdus [16] – [24]. TWEAK aktivoi yhden reseptorin, fibroblastikasvutekijä-indusoituva-14 (FN14, nipistää reseptori, TNFRSF12A, CD266). TWEAK aktivointi FN14 reseptoriin johtaa apoptoottisen solukuoleman useiden kasvainsolulinjojen [22], [25] – [29]. Itse asiassa vaiheen I kliinisen tutkimuksen Humanisoidun anti-TWEAK reseptorin monoklonaalinen vasta henkilöillä, joilla on pitkälle edenneitä kiinteitä kasvaimia oli hiljattain valmistunut [30]. Kuitenkin TWEAK-FN14 up-säätelee VEGF ilmentymisen edistämiseksi munasarjojen syöpäsolumetastaasi [31] ja edistää rintasyövän solujen invasiivinen kyky [32]. On näyttöä siitä, että erilaisia, jopa vastakkaisia, toimia TWEAK voitiin määrittää microenvironment. Tässä suhteessa, TWEAK indusoi apoptoosia munuaistiehyiden solujen tulehdusta ympäristössä, kun se edistää proliferaatiota kun läsnä on naudan sikiön seerumia [33], [34]. Eturauhassyöpä solujen on osoitettu ilmaista FN14 ja korkea ilmentyminen FN14 oli merkitsevästi yhteydessä korkeampaan eturauhasen antigeenin uusiutumisriski potilailla, joille tehtiin eturauhasen [35]. FN14 oli hyvin ilmaistu androgeeni-riippumaton eturauhassyöpäsolulinjoissa, DU145 ja PC-3, kun taas ekspressio oli heikko androgen-herkkien LNCaP-soluissa. Rooli varten FN14 maahanmuuton, invaasio ja proliferaatio kuvattu PC-3-solujen [35].

Nyt tutkia manipuloinnin Soluviljelyolosuhteiden mahdollisena välineenä kääntää TWEAK /FN14 järjestelmän vastaan kasvain. Me raportoimme että tulehduksellisten sytokiinien ja eloonjäämistekijänä seerumista moduloivat vasteen PC-3-solujen nipistää. Koska seerumin TWEAK /FN14-reitin aktivaatio edistää apoptoosia androgeeni-riippumaton PC-3-soluissa, mutta ei androgeenistä herkkien LNCaP-soluissa. Parempi käsitys tästä sääntely voi kääntyä potentiaalinen etu kasvainsoluja terapeuttisen mahdollisuuden.

Eturauhasen adenokarsinooma Gleason pisteet 7 (3 + 4). Alkuperäinen suurennus × 200. FN14 värjäytyminen on erittäin myönteinen arvosana 3 adenokarsinooma (mustat nuolet) ja lievästi positiivinen korkealaatuinen PIN tarkennuksen (valkoinen nuoli). Vähän tai ei ollenkaan värjäytymistä havaittavissa normaalissa rauhasen (nuolenpäät). B) Yksityiskohta adenokarsinoomasolua samalta biopsia. Alkuperäinen suurennus × 400. C) Eturauhasen adenokarsinooma Gleason pisteet 6 (3 + 3). Lievä FN14 värjäystä korkealaatuisesta asteen PIN tarkennus (valkoinen nuoli), kun taas normaali kudos on negatiivinen (nuolenkärki). Alkuperäinen suurennus × 200. D) FN14 värjäytyminen on erittäin myönteinen arvosana 3 adenokarsinooma (mustat nuolet), kun taas normaali kudos on negatiivinen (nuolenpäät). Alkuperäinen suurennus × 200.

Methods

Solut ja reagenssit

Kaksi ihmisen eturauhassyövän solulinjaa käytettiin: androgeenisäädellyn riippumaton PC-3 solulinja ja androgeenireseptorin -sensitive LNCaP-soluja (ATCC, Rockville, MD, CRL 1435 ja 1740, vastaavasti) [36], [37]. Soluja kasvatettiin RPMI 1640: ssä, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 2 mM glutamiinia ja antibiootteja (100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä), 5% CO 2 37 ° C: ssa. RPMI-1640, penisilliiniä, streptomysiiniä, ja trypsiini-EDTA oli BioWhittaker (Waltham, MA) ja FBS Gibcolta (Carlsbad, CA). Kokeissa soluja pidettiin seerumin köyhdytettyä 24 tunnin ajan, ja käsiteltiin sitten eri ärsykkeille. Positiivisena valvonta FN14 ilmaisun ihmisen proksimaalisten tubulusten epiteelisolujen (HK-2) (ATCC, CRL 2190) käytettiin [38].

A) analyysi FN14 ja TWEAK mRNA: n ilmentymisen kvantitatiivisen RT-PCR. Keskiarvo (± SEM) kolmen erillisen kokeen; * P 0,05 vs LNCaP. B) analyysi FN14-proteiinin ekspression Western blot ihmisen eturauhasen syöpäsolujen viljeltiin kanssa tai ilman 10% FBS: ää 24 tunnin ajan. Keskiarvo (± SEM) kolmen erillisen kokeen. * P 0,02 vs LNCaP.

† p 0,05 vs 0% FBS PC-3-solut. HK2 solut esitetään positiivisena kontrollina. C) analyysi ilmentyminen solun pinnalla FN14 virtaussytometrialla. Edustava koe. Solut värjättiin isotyyppiyhteensopivan-aine (valkoinen alue) tai anti-FN14 vasta-ainetta (musta alue).

Rekombinantti ihmisen TWEAK (Millipore, Billerica, MA), ellei toisin mainita, käytettiin 100 ng /ml. ITEM-2 neutraloivat anti-FN14-vasta-aine (eBioscience, San Diego, CA), neutraloivat anti-TWEAK-vasta-ainetta (BioLegend, San Diego, CA) ja neutraloivat anti-TNF-vasta-ainetta (BioLegend) lisättiin 1 tunti ennen ärsykkeitä. Ihmisen TNFa (PrePotech, Lontoo, Iso-Britannia) 30 ng /ml, ja ihmisen interferoni-γ (IFNy) (PrePotech) 30 U /ml, käytettiin joissakin kokeissa. Kaikki nämä pitoisuudet ovat aiemmat annos-vaste tutkimuksia meidän lab [33], [34]. Bentsyylioksikarbonyyli-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone (zVAD-fmk) (Calbiochem, San Diego, CA, USA) liuotettiin DMSO: hon ja lisättiin 1 tunti ennen ärsykkeitä. Lopullinen DMSO-konsentraatio viljelmässä ei moduloida solukuolemaa. Bax-inhibiittoripeptidi, P5, liuotettiin veteen ja lisättiin 1 tunti ennen ärsykkeisiin (Tocris, Bristol, UK) [38].

PC3 ja LNCaP-soluja stimuloitiin 100 ng /ml TWEAK varten osoitettu pistettä, ja FN14 ja MCP-1 mRNA-tasot mitattiin RT-PCR: llä. Molemmat solulinjat reagoivat nipistää, mutta, PC-3 vaste on pysyvämmät kuin LNCaP. Keskiarvo (± SEM) kolmen erillisen kokeen. * P 0,05 kontrolliryhmään verrattuna.

Cell Surface FN14 Expression

Solut maljattiin tiheydellä 8 x 10

4 solut kahdentoista kuoppalevyillä. Stimulaation jälkeen ne irrotettiin 2 mM EDTA /1% BSA: ta PBS: ssä, pestiin ja suspendoitiin uudelleen PBS /1% BSA: ta ja estää 4 min. Sitten soluja inkuboitiin 1 ug /ml anti-FN14 ITEM4-vasta-ainetta (eBioscience, San Diego, CA), tai isotyyppi-sovitettua kontrolli-vasta-aineen 30 minuuttia jäillä. Solut pestiin kahdesti, blokattiin 4 min ja inkuboitiin Alexa488-leimattua vuohen anti-hiiri-IgG-vasta-ainetta (1/300, Invitrogen, Carlsbad, CA) 45 min ajan jäillä pimeässä. Seuraavat kaksi lisäpesua PBS /1% BSA: ta, solut suspendoitiin uudelleen 1% suodatettiin paraformaldehydillä PBS: ssä ja analysoitiin virtaussytometrialla käyttämällä BD CellQuest-ohjelmisto (BD Biosciences, San Jose, CA). [39]

PC -3 eturauhassyövän soluja viljeltiin 0% tai 5% FBS: ää 3 tai 24 tuntia. FN14 mRNA-ekspressio mitattiin kvantitatiivisella RT-PCR: llä (A) ja FN14 proteiinin ilmentyminen tutkittiin Western blot (B). Keskiarvo (± SEM) neljästä itsenäisestä kokeesta. * P 0,03 versus 0% FBS 3h; # P 0,003 vs 0% FBS 24 tuntia. C, D) analyysi FN14 mRNA: n ilmentymisen (C), ja FN14-proteiinin ilmentymistä (D) PC-3-soluja käsiteltiin TNFa: n (30 ng /ml) /IFNy (30 u /ml), 3 tai 24 tuntia. Keskiarvo (± SEM.) Neljästä itsenäisestä kokeesta. # P 0,03 kontrolliryhmään verrattuna 24 tuntia. E) edustaja VVestern FN14 PC-3-solut on viljelty 0% FBS, 5% FBS tai TNFa /IFNy 3 ja 24 tuntia.

RNA ja reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio

Kokonais-RNA uutettiin soluista, joita TRI Reagent-menetelmää (Sigma) ja 1 ug RNA: ta käänteistranskriptio High Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). Pre-kehittänyt pohjamaali ja koetin määrityksiä varten FN14, ja GAPDH (ihmisen) olivat Applied (Applied Biosystems). Kvantitatiivinen PCR suoritettiin 7500 Real Time PCR System kanssa Prism 7000 System SDS Software (Applied Biosystems) ja RNA ilmentymistä erilaisten geenien korjattiin GAPDH [40].

Solukuolemaan arvioitiin virtaussytometrialla DNA sisältöä. Hypodiploid soluja pidettiin apoptoottisia. A) PC-3-solut, viljellyt kanssa tai ilman 10% FBS: ää, stimuloitiin TWEAK (100 ng /ml) yksinään tai läsnä TNFa (30 ng /ml) /IFNy (30 U /ml) 24 tunnin ajan. Keskiarvo (± SD) neljästä itsenäisestä kokeesta. * P 0,002 vs kontrolli; # P 0,001 vs TWEAK yksin; † p 0,002 vs 0% FBS kanssa ärsykkeitä. B) LNCaP-soluja, viljellään ilman FBS, stimuloitiin TWEAK yksin tai yhdessä TNFa /IFNy 24 tunnin ajan. Keskiarvo (± SD) on kolmen erillisen kokeen. C) TWEAK, yksin tai yhdessä TNFa /IFNy, indusoi apoptoosia PC-3-solujen annoksesta riippuvalla tavalla. Keskiarvo (± SD) on kolmen erillisen kokeen. * P 0,002 vs kontrolli; # P 0,0001 kontrolliryhmään verrattuna. D) aika-kulku TWEAK aiheuttaman apoptoosin PC-3-solut, yksin tai yhdessä TNFa /IFNy. Keskiarvo (± SD) on kolmen erillisen kokeen. * P 0,002 vs kontrolli; # P 0,0001 vs. kontrolli.

Western Blot

Cell homogenisoitiin lyysipuskurissa (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA, 0,2% Triton X-100, 0,3% NP-40, 0,1 mM PMSF ja 1 ug /ml pepstatiini A) erotetaan sitten 12% SDS-PAGE pelkistävissä olosuhteissa. Elektroforeesin jälkeen näytteet siirrettiin PVDF-kalvoille (Millipore), salvattiin 5% rasvatonta maitoa PBS /0,5% v /v Tween 20: ssa 1 tunnin ajan, pestiin PBS /Tween, ja inkuboitiin kanin polyklonaalisen anti-FN14 (1: 1000, Cell Signaling, Danvers, MA), hiiren monoklonaalinen anti-BclxL (1:500, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), kanin polyklonaalinen anti-Bax (1:500, Santa Cruz Biotechnology) tai kanin polyklonaalinen anti halkaistut aktiivinen kaspaasi 3 (1:500, Cell Signaling). Anti-FN14 laimennettiin 5% BSA ja muut vasta-aineet laimennettiin 5% maitoa PBS /Tween. Blotit pestiin PBS /Tween ja inkuboitiin asianmukaisten piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (1:2000, Amersham, Aylesbury, UK). Pesun jälkeen PBS /Tween-blotit kehitettiin kemiluminesenssi menetelmällä (ECL) (Amersham). Sitten blotit tutkittiin hiiren monoklonaalisten anti-α-tubuliinin-vasta-ainetta (1:2000, Sigma) ja ekspressiotasot korjattiin pieniä eroja loading [41].

Solukuolema arvioitiin virtaussytometrialla DNA sisältöä. A) PC-3-soluja esikäsiteltiin anti-TWEAK neutraloiva vasta-aine (10 ug /ml), ITEM2 anti-FN14-vasta-aine (10 ug /ml), tai anti-TNFa-neutraloiva vasta-aine (10 ug /ml), lisättiin 1 tunti ennen TWEAK. Solukuolemaa arvioitiin 24 tunnin kuluttua. Keskiarvo (± SD) on kolmen erillisen kokeen. * P 0,02 vs. kontrolli; # P 0,0001 vs TWEAK yksin. B), C) PC-3-soluja esikäsiteltiin anti-TWEAK neutraloiva vasta-aine (B) tai ITEM2 anti-FN14-vasta-aine (C), lisättiin 1 tunti ennen TWEAK /TNFa /IFNy. Solukuolemaa arvioitiin 24 tunnin kuluttua. Keskiarvo (± SD) on kolmen erillisen kokeen. * P 0,02 vs. kontrolli; # P 0,0001 vs TWEAK /TNFa /IFNy yksin.

Apoptoosi ja solukuolema

10000 solua ympättiin 12-kuoppalevyille (Costar, Cambridge, MA) 10% FCS RPMI yössä. Joissakin tapauksissa ne annettiin levätä seerumittomassa väliaineessa 24 tunnin ajan. Sen jälkeen, ärsykkeet lisättiin Subkonfluentit solut. Apoptoosi leimasi morfologiset ja toiminnalliset kriteerit. Tumat formaliinilla kiinnitettyjä soluja värjättiin DAPI (Sigma) tarkkailla tyypillinen morfologiset muutokset, kuten aiemmin on kuvattu [33], [42]. Arviointia apoptoosin virtaussytometrialla kiinnittyneet solut yhdistettiin spontaanisti irrotettuja soluja, ja niitä inkuboitiin 100 ug /ml propidiumjodidia (PI), 0,05% NP-40, 10 ug /ml RNaasi A: ssa PBS: ää 4 ° C: ssa 1 h. Tämä määritys permeabilizes soluja, mikä PI tahrat sekä elävät ja kuolleet solut. Prosenttiosuus apoptoottisten solujen vähentynyt DNA-värjäys (hypodiploid solua) laskettiin virtaussytometrialla käyttämällä BD CellQuest-ohjelmisto (BD Biosciences) [33], [34], [42].

virtaussytometria DNA-pitoisuus. Huomautus hypodiploid, apoptoottiset solut (