Krooninen sairaus

tiivistelmä

Fangchinoline on bisbenzylisoquinoline eristetty alkaloidi Radix

Stephaniae tetrandrae

S. Moore. Fangchinoline ja sen rakenne analoginen, tetrandrine, näytteillä suoraan sitoutumisaffiniteetti rekombinantilla ihmisen proteasomin β1 alayksikköä ja esti myös sen toiminta

in vitro

. Viljellyissä eturauhasen PC-3-solut ja LNCaP-solut, fangchinoline voi annoksesta riippuen estävät solujen proliferaatiota ja kaspaasi-kaltainen aktiivisuus solujen proteasomin jonka välittämä proteasomin β1-alayksikön. Inhibitive vaikutus fangchinoline on kaspaasi kaltainen aktiivisuus proteasomeja havaittiin myös puhdistetun ihmisen punasolujen 20S-proteasomin. PC-3-solut, fangchinoline aiheuttama solusyklin pysähtymisen G0 /G1 vaiheeseen ja apoptoosin. Hoito PC-3 kasvain nude-hiirissä, joilla fangchinoline inhiboi kasvaimen kasvua, indusoi apoptoosin ja aiheutti myös lasku proteasomin toiminnan tuumoriksenograftien. Annoksesta riippuvaa ja ajasta riippuvainen kertyminen ubikitinoitu proteiinien ja tärkeitä proteasomin alustoille kuten P27, Bax ja IKB-α havaittiin fangchinoline käsiteltyjä soluja. Yli-ilmentyminen proteasomin β1-alayksikön plasmiditransfektiolla lisääntynyt herkkyys solujen sytotoksisuuden fangchinoline kun pudotus proteasomeja β1 alayksikön lievittää sytotoksisuuden fangchinoline PC-3-soluja. Tulokset Tämän tutkimuksen ehdotti, että proteasomin esto oli mukana syöpälääkkeen vaikutuksia fangchinoline. Fangchinoline ja sen rakenne analogit voisi olla uusi luonnollinen proteasomiestäjät kohdistamista β1 alayksikköä.

Citation: Li D, Lu Y, Sun P, Feng L-X, Liu M, Hu L-H, et al. (2015) esto on Proteasome β1 alayksikkö mahdollisesti vaikuttavia Anti-Cancer vaikutukset Fangchinoline Human eturauhassyöpä solut. PLoS ONE 10 (10): e0141681. doi: 10,1371 /journal.pone.0141681

Editor: Chih-Pin Chuu, National Health Research Institutes, Taiwan

vastaanotettu: 20 maaliskuu 2015; Hyväksytty: 11 lokakuu 2015; Julkaistu: 29 lokakuu 2015

Copyright: © 2015 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukee osittain Shanghai Science Technology Support Program (13431900401), National Nature Science Foundation of China (81373964), Shanghai Science Technology Innovation toimintaohjelma (15140904800), National Science Teknologia suurhanke of China (2014ZX09301-306-03), ja kahdestoista viisivuotiseen National Science Technology Support Program (2012BAI29B06). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Nanjing Tianyi Bioscience Co Ltd, tukivat muodossa palkkojen tekijöille YL, mutta ei ollut mitään ylimääräistä roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Erityinen roolit nämä kirjoittajat ovat muotoutuneet ”kirjoittaja maksujen osiossa.

Kilpailevat edut: Yu Lu työskentelee Nanjing Tianyi Bioscience Co Ltd Ei ole patentteja, tuotteiden kehittämiseen, tai kaupan tuotteita julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

Proteasome on tullut tärkeä ja tehokas kohde syövän hoitoon [1]. Meidän luonnontuotteiden seulonnassa proteasomin inhibiittorit, fangchinoline ja tetrandrine kaksi bisbenzylisoquinoline alkaloideja eristetty kuivattu juuri on

Stephaniae tetrandrine

S. Moore (perhe, kilpikiertokasvit), joka tunnetaan nimellä Fangji Kiinassa, havaittiin olevan suoraan sitoutumisaffiniteetti rekombinantti ihmisen proteasomin β1 alayksikköä ja esti myös sen toiminta

in vitro

. Fangji on perinteinen kiinalainen lääketiede (TCM), jota oli käytetty klinikalla analgeetti, reumalääkkeet, ja verenpainelääkkeiden pitkään Kiinassa [2, 3]. Raportoitu toimintaa Fangji sisältyvät syövän vaikutukset [2, 4], anti-inflammatoriset vaikutukset [5], kardiovaskulaarisia vaikutuksia [6, 7], ja jne. Tärkeimmät aktiiviset komponentit Fangji oli todettu olevan fangchinoline ja tetrandrine [2 ]. Kemiallisia rakenteita fangchinoline ja tetrandrine oli kuviossa 1A ja kuviossa 1 B, vastaavasti. Puhdistettu tetrandrine oli myöntänyt Kiinan Food and Drug Administration käytettäväksi klinikalla tulehdussairauksien kuten silikoosi [8] ja käytettiin myös syövän hoidossa [9]. Sikäli kuin tiedämme, ei mitään puhdistettu yhdiste eristettiin Fangji eikä raakauute Fangji oli raportoitu aikaisemmin olevan proteasomin estäviä vaikutuksia. Proteasomi tiedetään rooleja syövän kehittymiseen, tulehdussairaudet ja sydän- ja verisuonitaudit [10]. Sen vuoksi voisi olla mielenkiintoista tutkia, onko proteasomin esto on mukana vaikutuksia fangchinoline, tetrandrine sekä Fangji.

(A) kemiallinen rakenne fangchinoline. (B) Kemiallinen rakenne tetrandrine. (C) Reaaliaikainen sitoutumisaffiniteetti mittaukset fangchinoline Rekombinanttireitin proteasomin β1 alayksikköproteiinia. (D) Reaaliaikainen sitoutumisaffiniteetti mittaukset tetrandrine Rekombinanttireitin proteasomin β1 alayksikköproteiinia. (E) entsyymiaktiivisuudet yhdistelmä-proteasomin β1-alayksikköä tai ilman läsnäoloa fangchinoline eri pitoisuuksilla. (F) entsyymiaktiivisuudet yhdistelmä-proteasomin β1-alayksikköä tai ilman läsnäoloa tetrandrine eri pitoisuuksilla. Tiedot olivat tilastolliset tulokset kolmen erillisen kokeen.

Molemmat fangchinoline [2, 11-14] ja tetrandrine [4, 15-26] oli raportoitu olevan anti-syöpä vaikutuksia

in vitro

ja

in vivo

. Tässä tutkimuksessa olemme keskittyneet tutkitaan syöpälääkkeen vaikutuksia fangchinoline. Edellinen raportit osoittivat, että fangchinoline voivat aiheuttaa solusyklin pysähtymisen [11, 13, 14, 27] ja apoptoosin [2, 14, 27] viljellyissä syöpäsoluissa. Myös yksi raportti syöpälääkkeen toimintaa fangchinoline

in vivo

[13]. Esillä olevassa tutkimuksessa, anti-syöpä vaikutuksia fangchinoline arvioitiin viljellyissä PC-3-solut, viljellyt LNCaP-soluja ja PC-3 tuumoria kantavissa nude-hiirissä. Sekä estävä vaikutus fangchinoline toimintaa solujen proteasomin syöpäsoluissa ja toimintaa ihmisen puhdistetun 20S-proteasomin tarkastettiin. Tehokkuus proteasomin tavoitteeksi syöpäterapialle perustui siihen, että ubikitiinipromoottori proteasomin järjestelmä oli vastuussa hajoamista monia tärkeitä solunsisäisiä proteiineja, jotka liittyvät kriittisten soluprosesseihin kuten solusyklin etenemistä, lisääntymistä ja apoptoosin [28-30]. Siksi vaikutukset fangchinoline hoidon hajoamiseen tärkeitä proteasomin alustoille kuten p27, joka pelataan rooli solusyklin etenemistä, Bax joka oli mukana apoptoosin, ja IKB jotka liittyvät NF-KB-reitin [31] oli edelleen tarkistettu esillä tutkimus. Lisäksi olemme myös havaittu vaikutusta yli-ilmentymisen proteasomeja β1 alayksikköä tai knockdown proteasomeja β1 alayksikköä herkkyydestä solujen sytotoksisuutta fangchinoline.

Yhdessä tuloksemme ehdotti osallistumista proteasomin esto anti -cancer vaikutukset fangchinoline

in vitro

ja

in vivo

. Tulokset Tämän tutkimuksen osaltaan ymmärtää anti-kasvain mekanismi fangchinoline sekä Fangji.

Materiaalit ja menetelmät

Chemicals

Fangchinoline, jonka puhtaus on yli 98% ja tetrandrine joiden puhtaus on yli 98% molemmat ostettiin Shanghai Lähde Leaf Technology Co, Ltd (Shanghai, Kiina). Fangchinoline tai tetrandrine liuotettiin DMSO: hon pitoisuuteen 0,1 M kantaliuoksena ja säilytetään -20 ° C: ssa. Fluorogeenisiä peptidisubstraateilla Z-LLE-AMC tarkastamiseksi proteasomin kaspaasin kuten (C-L) aktiivisuus ja Z-ARR-AMC tarkastamiseksi proteasomin trypsiinin kaltaista (T-L) aktiivisuus oli Calbiochem, Merck. Fluorogeenista peptidisubstraattia Suc-LLVY-AMC tarkastamiseksi proteasomin kymotrypsiinin kaltainen (CT-l) aktiivisuus oli Sigma-Aldrich. Muut kemialliset reagenssit, ellei erityisesti mainita, hankittiin Sigma-Aldrich.

Soluviljely

Ihmisen PC-3 eturauhasen syöpäsolujen ja ihmisen LNCaP eturauhassyövän solut ostettiin Cell Resource Center Shanghai Institutes for Biological Sciences, Kiinan tiedeakatemia. PC-3-solut ja LNCaP-soluja viljeltiin RPMI 1640-elatusaineessa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 100 yksikköä /ml penisilliiniä, ja 100 ug /ml streptomysiiniä ja pidettiin 37 ° C: ssa ja 5% CO

2. Naudan sikiön seerumia, RPMI 1640, penisilliiniä ja streptomysiiniä olivat kaikki Hyclone.

Pintaplasmoniresonanssianalyysi biosensorianalyysin

ihmisen rekombinantti proteasomin β1-alayksikön, tuote PSMB6 geenin, ilmaistiin His-Tag proteiinit käyttäen Escherichia coli, ja sitten puhdistettiin affiniteettikromatografialla, kuten on esitetty edellisessä tutkimuksessa [32]. Sitoutumisaffiniteettien fangchinoline tai tetrandrine rekombinantille proteasomin katalyyttinen β1 alayksikköä, testattiin

in vitro

käyttäen Biacore 3000 väline (Biacore AB, Rapsgatan 7, S-754 50 Uppsala, Ruotsi) kuten on raportoitu aiemmin [33] . Lyhyesti, rekombinantti-proteasomin β1 alayksikköproteiinia immobilisoitiin CM5-anturin siru ligandina 11624,5 RU N-etyyli-N ’- (3-dimetyyliaminopropyyli) karbodi-ja N-hydroksisukkinimidiä standardin primaarinen amiini-kytkentä menettelyjä, ja HBS- EP (10 mM HEPES, 150 mM NaCl: a, 3 mM EDTA, 0,005% (v /v) pinta-aktiivista ainetta P20, pH 7,4) käytettiin ajopuskurilla. Tasapainotuksen -perusuraa suorittaa jatkuva HBS-EP läpi sirun pinta 1-2 h. Biacore kerättiin 25 ° C: ssa HBS-EP kuin ajopuskurissa vakiovirtauksella 20 ul /min. Fangchinoline tai tetradrine tehtiin laimennossarja ajopuskurin 0, 2,4, 3,43, 4,90, 7,0, 10 ja 20 uM. Näytteet ruiskutettiin kanavia virtausnopeudella 20 ul /min, mitä seurasi pesu ajopuskurilla. Sitova vasteet tallennettiin jatkuvasti vasteyksikköä (RU) on 1 Hz taajuudella kuin sensogrammien ja esitetään ajan funktiona. Yhdistyksen (

k

a) ja dissosiaation (

k

d) nopeusvakioista, tasapainotilan dissosiaatiovakio () määritettiin analyysin sensorigrammin-käyrät saatu eri pitoisuuksia yhdistettä käyttämällä BIA arvioinnin ohjelmistoversion 3.1 (Biacore), ja 1: 1 Langmuir sitova sopiva malli.

määritys entsyymin aktiivisuutta rekombinantti-proteasomin katalyyttisen β1 alayksikön

Lyhyesti, katalyyttinen aktiivisuus ihmisen rekombinantti-proteasomin β1 alayksikön määritettiin lisäämällä yhdistelmä-β1 alayksikköproteiinia (30 ug) 100 ul: proteasomiaktiivisuuden määrityspuskurissa (10 mM Tris-HCL, pH 7,8, 5 mM adenosiinitrifosfaattia, 0,5 mM ditiotreitolia, ja 5 mM MgCl

2 • 6H

2O), joka sisälsi 50 uM Z-LLE-AMC: n läsnä ollessa fangchinoline tai tetrandrine eri pitoisuuksina tai ei. Hydrolaasi aktiivisuus proteasomin katalyyttinen β1 alayksikköä voisi vapauttaa fluorogeenisen AMC komponentin alustan Z-LLE-AMC ja AMC vapautuminen mitattiin 2 tunnin inkuboinnin käyttäen Microplate Reader Bio-Rad 550 heräte ja emissioaallonpituuksia 360 ja 465 nm vastaavasti.

MTT-määritystä vaikutusten fangchinoline proliferaatioon PC-3-solut ja LNCaP-solut

inhibitive vaikutukset fangchinoline proliferaatioon PC-3-solut tai LNCaP-solujen havaittiin tarkistamalla solujen elinkelpoisuuden soluihin käyttämällä MTT-määritystä kuten aiemmin on kuvattu [33]. Lyhyesti, solut siirrostettiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 5 x 10

4 solua /ml PC-3 solujen ja 4 x 10

4 solua /ml varten LNCaP-soluja. Yli yön kulttuurin, median vaihdettiin tuoreeseen väliaineessa, joka sisältää erilaisia ​​pitoisuuksia fangchinoline tai 0,1% DMSO: ta (liuotin kontrolli) 24, 48 h tai 72 h. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin mittaamalla mitokondrioiden riippuvainen muuntaminen keltaisen tetratsoliumsuolan MTT violetti formatsaanikiteet metabolinen aktiiviset solut. (Optinen tiheys on verrannollinen elävien solujen lukumäärä) oli arvioitu Microplate Reader Bio-Rad 550 aallonpituudella 570 nm. IC

50-arvo (puolet maksimaalisesta inhiboiva pitoisuus) laskettiin logit menetelmällä.

määritys solu-proteasomin toiminnan PC-3-solut ja LNCaP-solut

Soluja käsiteltiin joko liuotin ohjaus (0,1% DMSO), fangchinoline eri pitoisuuksina, tai 1 uM carfilzomib (positiivinen kontrolli) 24 tunnin ajan 37 ° C. Entsymaattinen toiminta solun proteasomin solulysaatissa mitattiin raportoitu edellisessä paperi [32]. Lyhyesti, solut kerättiin, pestiin PBS: llä ja sitten hajotettiin proteasomiaktiivisuuden määrityspuskurissa 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Sitten homogenaattia sentrifugoitiin 12000 x g 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantti kerättiin koko solu-uutetta ja proteiinipitoisuus supernatantissa mitattiin Bradford-reagenssia. Catalytic toiminta solujen proteasomin analysoitiin lisäämällä kokosolu-uutetta (joka sisälsi 30 ug proteiinia) ja 100 ui proteasomiaktiivisuus määrityspuskuriin, joka sisälsi 50 uM fluorogeenisiä peptidisubstraateilla kuten Z-LLE-AMC havaitsemiseksi CL aktiivisuuden, Z-ARR-AMC varten havaitaan TL aktiivisuutta tai Suc-LLVY-AMC havaitsemiseksi CT-L aktiivisuuden, tässä järjestyksessä. Vapauttamaan fluorogeenisen AMC päässä peptidisubstraatit sitten edellä kuvatulla tavalla mitattuna.

määritys CL aktiivisuuden puhdistettua ihmisen 20S-proteasomin

20S-proteasomin iinianalyysikitissä ostettiin Enzo Life Sciences, Inc . (Farmingdale, NY 11735, USA). K

m, V

max arvot puhdistettua ihmisen punasolujen 20S-proteasomin varten fluorigenic peptidisubstraattia Z-LLE-AMC mitataan ohjeiden valmistajan antamia. Inaktivointi puhdistettu ihmisen punasolujen 20S-proteasomin mukaan fangchinoline määritettiin seuraamalla hydrolyysin, kun läsnä on eri pitoisuuksia fangcinoline. Määritykset suoritettiin 37 ° C: ssa reaktiopuskurissa (50 ui), joka sisälsi 50 mM Tris /HCI, pH 7,5, 25 mM KCL, 10 mM NaCl, 1 mM MgCI

2, 0,1 ug 20S-proteasomin ja Z-LLE- AMC. Reaktioiden annettiin edetä 120 minuuttia, ja fluoresenssin kerättiin välein 1 min, ja sitten piirrettiin ajan funktiona. Näennäinen dissosiaatiovakio, K

i

app, määritettiin epälineaarisella pienimmän-sovitus murto nopeus, v

i /v

0, funktiona [I], jossa v

i on vakaassa tilassa jäljellä oleva aktiivisuus entsyymin läsnä ollessa inhibiittorin (I) ja v

0 on alkunopeus inhibiittorin puuttuessa (). Dissosiaatiovakio Ki, laskettiin dissosiaatiovakio, K

i

app, käyttäen seuraavia ilmaisua, jossa [S] on alustan konsentraatio ja K

m on alustan sitova vakio () .

solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin fangchinoline PC-3-solujen

solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin fangchinoline PC-3-solujen havaittiin käyttämällä virtaussytometria-analyysiä kuvattu aiemmissa raporteissa [32-34]. Lyhyesti, virtaussytometriaa analyysi solusyklin, solut kerättiin käsittelyn jälkeen, pestiin PBS: llä ja kiinnitettiin sitten 70% etanolilla 4 ° C: ssa yön yli. Sen jälkeen, kun PBS pesun jälkeen solut suspendoitiin uudelleen värjäyspuskurilla (10 mg /ml RNaasi A: ta ja 5 mg /ml propidiumjodidia kylmässä PBS: ssä) 30 minuutin ajan pimeässä huoneenlämpötilassa ja sitten analysoitiin käyttäen FACSCalibur -virtaussytometrillä. Virtaussytometrianalyysiä apoptoosin, Alexa Fluor 488 anneksiini V PI /Dead solu Apoptosis Kit (Invitrogen) käytettiin. Solut kerättiin käsittelyn jälkeen, pestiin PBS: llä ja suspendoitiin sitten uudelleen sitomispuskuriin ja inkuboitiin sitten anneksiini V-FITC: llä ja propidiumjodidilla 15 minuuttia pimeässä huoneen lämpötilassa. Sitten, virtaussytometria-analyysi suoritettiin, ja data-analyysi suoritettiin CellQuest-ohjelmaa.

PC-3 -tuumoriksenografti kokeissa

Male nude immuunivajaisiin hiirissä Balb /c-nu-nu, aged 4 viikkoa, ostettiin Shanghai Experimental Animal Centerissä. Kaikki toimenpiteet, joissa käytetään eläimiä hyväksyi Institutional Animal Care ja käyttö komitean Shanghai Institute of Materia Medica, Kiinan tiedeakatemia. Päivänä 0, PC-3-soluja (8 x 10

6 solua) suspendoitiin 0,2 ml: aan seerumitonta RPMI 1640 inokuloitiin s.c. oikeaan kylkeen kunkin hiiren (kuusi hiirtä ryhmää kohti). 14 päivää inokulaation jälkeen, hiiret jaettiin satunnaisesti 3 ryhmään ja alkoi injektio joko ajoneuvon hallintaan tai fangchinoline 25 mg /kg (ip., QD) tai 50 mg /kg (ip., QD). Kasvaimen koot mitattiin 4 päivän välein käyttäen jarrusatulat ja niiden määrät laskettiin käyttäen standardia kaavaa: leveys

2 x pituus /2. Suhteellinen kasvaimen tilavuus (RTV) määriteltiin suhde kasvaimen äänenvoimakkuus ilmoitettuina ajankohtina, ja kasvaimen tilavuus alussa lääkehoidon. Kehon paino mitattiin päivittäin. Päivänä 30 inokulaation jälkeen hiiret tapettiin CO

2 hengitettynä ja kasvainksenografteja leikeltiin. Visualisoida apoptoosin tuumoriksenografteja, TUNEL merkintöjä tehtiin havaitsemaan apoptoottisten tumien avulla in situ Death Detection Kit (Roche Molecular Biochemicals). Lyhyesti, tuumoriksenografteja kiinnitettiin 10% formaliiniliuokseen huoneenlämpötilassa 24 tuntia ja sitten upotettu mukaan parafiiniin. Näytteet kuumennettiin 1 h by vesihauteessa-Slide kuivempaa (LEICA H1 1220, saksa), inkuboitiin dimetyylibentseenillä kaksi kertaa (8 min kukin) ja inkuboitiin sitten 100%, 95%, 90% ja 85% etanolia kaksi kertaa ( 3 min kukin). Näytteet inkuboitiin sitten 0,1 M sitraattipuskuria (pH 6,0) ja mikroaaltosäteilyllä. Kun oli pesty PBS: llä kaksi kertaa (3 minuuttia kukin), viipaleita inkuboitiin reaktiopuskuria (alkaen In situ Death Detection Kit) kosteassa atmosfäärissä 37 ° C: ssa 1 h. Viipaleet pestiin sitten PBS: llä kolme kertaa (3 minuuttia kukin) inkorporoimatto- fluoreseiini-deoksiuridiini trifosfaatti. Tumat vastavärjättiin 4,6-diamino-2-fenyyli (DAPI) 1 ug /ml: ssa 3 minuuttia ja sitten pestiin PBS: llä kolme kertaa (3 minuuttia kukin). Kuvat otettiin käyttäen 20X tavoite (Olympus BX51, Japani) on epifluoresenssimikroskoopilla. Lisäksi proteasomin toiminta tuumoriksenograftien analysoitiin. Lyhyesti, ksenograftien homogenerized in proteasomiaktiivisuuden määrityspuskurissa käyttäen FastPrep System (MP FastPrep-24, USA), sitten sentrifugoimalla 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Sitten supernatantit käytettiin määrityksessä proteasomeja toimintaa käyttäen menetelmää, kuten edellä on kuvattu analyysi solujen proteasomin toiminnan.

Western blotting -analyysi

Western blot-määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [33, 34] . Lyhyesti, määräosa proteiinia (100 ug), näyte ladattiin 12% SDS-geelille, erottaa elektroforeettisesti ja siirrettiin nitroselluloosa-kalvolle (Bio-Rad). Sen jälkeen, kun kalvoa inkuboitiin 10 mM TBS 20% Tween 20 ja 5% kuivattu rasvaton maito estää epäspesifisen sitoutuminen proteiineihin, kaivoa inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla yli yön 4 ° C: ssa. Ensisijainen vasta-aineita (kaikki Cell Signaling Technology) käytettiin kanin polyklonaalinen vasta-aine ihmisen IKB-α (# 4812, 1: 400), Bax (# 2772, 1: 400), proteasomin β1 alayksikkö (PSMB6) (# 13267, 1 : 500), β-aktiini (# 4967, 1: 400) ja hiiren monoklonaalinen vasta-aine ihmisen p27 Kip1 (# 3688, 1: 400) tai ubikitiini (# 3936, 1: 1000). Jälkeen TBS pesujen jälkeen blotit inkuboitiin sekundaarisen vasta-aineen kanssa 2 tuntia huoneenlämmössä 1: 1000 laimennus, ja sitten visualisoidaan kemiluminesenssin (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). Toissijainen vasta-aineita käytettiin HRP-kytketty vuohen anti-kani-IgG: llä (# 7074) ja HRP-kytketty hevonen anti-hiiri-IgG (# 7076), niin Cell Signaling Technology.

yli-ilmentyminen proteasomin β1-alayksikön PC-3-solujen plasmiditransfektiolla

solut yli-ilmentyminen proteasomin β1-alayksikön saatiin transfektoimalla pcDNA3.1-plasmidi, joka koodaa täyspitkää ihmisen PSMB6 cDNA kuten aiemmin on kuvattu [34]. Plasmidin transfektion, 5 x 10

5 solua siirrostettiin jokaiseen kuoppaan ja kuuden kuoppalevyllä, kunnes solut saavuttivat noin 80% konfluenssin jälkeen viljeltiin 24 tuntia. 2,5 ug pcDNA3.1-plasmidi-DNA, joka koodaa PSMB6 tai pcDNA3.1-plasmidi-DNA: ilman PSMB6 (negatiivisena kontrollina) laimennettiin 250 ui seerumia, ja sitten inkuboitiin 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa seoksella, jossa oli 10 ui Lipofectamine 2000 (Invitrogen ) ja 400 ui seerumia. Saatu monimutkainen seos lisättiin sitten kuhunkin kuoppaan soluviljelylevy. 6 tunnin kuluttua inkuboinnin monimutkainen väliaine korvattiin tuoreella vähintään essential medium, jota oli täydennetty 10% (v /v) FBS: ää ja annettiin kasvaa yön yli. Sitten G418 (Merck) lisättiin väliaineen päästä lopulliseen pitoisuuksina pienin kohtalokas annos (400 ug /ml). Solujen annettiin kasvaa ja liikkuminen on G418: n läsnäollessa yli 2 viikkoa. Expression of proteasomin β1 alayksikön transfektoiduista soluista tarkistettiin käyttäen Western blotting-määritys ja sitä verrattiin villin tyypin solujen ja negatiivinen kontrolli solut. Sytotoksisuutta fangchinoline soluilla yli-ilmentyminen proteasomin β1 alayksikköä tarkastetaan käyttämällä MTT-menetelmää edellä kuvatulla tavalla ja verrattiin villin tyypin solujen ja negatiivinen kontrolli solut.

pudotus proteasomeja β1 alayksikön PC-3-soluista siRNA transfektion

validoitu siRNA: ita varten PSMB6 (Sigma-Aldrich) transfektoitiin PC-3-soluista käyttämällä Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollaa. Sekoitetun negatiivinen kontrolli siRNA: ita (Sigma-Aldrich) käytettiin negatiivisena kontrollina. Ekspressiotasot PSMB6 (proteasomin β1 alayksikkö) laaja-tyypin solujen, PSMB6 pudotus (solut käsitelty siRNA varten PSMB6), negatiivinen kontrolli (solut transfektoitu sekoitetun negatiivisen kontrollin siRNA: t) tarkastettiin käyttämällä Western blotting määritystä. Voit tarkistaa vaikutuksen proteasomin β1 alayksikön pudotus on sytotoksisuutta fangchinoline, solut transfektoitiin siRNA varten PSMB6 tai sekoitetun negatiivinen kontrolli siRNA 24 tuntia. Sitten solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 5 x 103 solua /kuoppa ja vaikutukset fangcinoline soluproliferaatioon tarkastettiin käyttäen MTT-määritystä, kuten edellä on kuvattu. Lisäksi vaikutukset fangchinoline on markkereita apoptoosin ja autophagy soluissa, joilla on normaali tai knockdovvn β1-alayksikön tarkastettiin käyttäen Western blotting menetelmää edellä kuvatulla tavalla. Lyhyesti, sen jälkeen, kun on transfektoitu siRNA: t ja PSMB6 tai sekoitetun negatiivinen kontrolli siRNA: ssa 24 tuntia, solut käsiteltiin fangchinoline 40 uM 24 tuntia. Sitten solut kerättiin Western blot-määrityksessä. Ensisijainen käytetyt vasta-aineet olivat kanin anti-kaspaasi 3-vasta-aine (1: 1000, Cell Signaling Technology, Cat # 9662), kanin anti-PARP-aineella (1: 1000, Cell Signaling Technology, Cat # 9542) ja kanin anti-LC3B vasta-ainetta ( 1: 1000, Cell Signaling Technology, Cat # 2775). Sekundäärinen vasta-aine käytettiin HRP-kytketty vuohen anti-kani IgG (1: 1000, Cell Signaling Technology, Cat # 7074).

Tilastollinen

Opiskelijan

t

– testiä käytettiin arvioimaan eroja käsiteltyjen ja kontrolliryhmien. Tiedot ilmaistiin keskiarvona ± SEM ja tulokset vähintään 3 itsenäistä koetta käytettiin tilastolliseen analyysiin. Tähdet osoittavat merkittävää eroa (P 0,05) verrattuna un hoidettuun kontrolliryhmään.

Tulokset

sidosaffmiteetti ja suorat inhibitive vaikutukset fangchinoline /tetrandrine Rekombinaatiotuotteiden proteasomin β1 alayksikköä

sekä fangchinoline (kuvio 1 C) ja tetrandrine (kuvio 1 D) osoitti suoraa sitoutumisaffiniteetti rekombinantilla ihmisen proteasomin β1 alayksikköä. Kuten on esitetty kuviossa 1C, RU kohosi lisääntyvän fangchinoline pitoisuus, joka osoitti, että fangchinoline kykeni sitoutumaan proteasomi β1 alayksikön annoksesta riippuvalla tavalla. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin tetrandrine (kuvio 1 D). Yhdistyksen (

k

a), dissosiaatio (

k

d) ja Tasapainodissosiaatiovakio (

K

D) vakioita fangchinoline tai tetrandrine sitoutuminen proteasomi β1-alayksikön on esitetty taulukossa 1. tulosten mukaan fangchinoline ja tetrandrine näytteillä samanlainen sitoutumisaffiniteetti proteasomi β1 alayksikköön. Lisäksi sekä fangchinoline ja tetrandrine voi suoraan estää entsyymin aktiivisuutta rekombinantti-proteasomin β1-alayksikön

in vitro

. Kuten kuviossa 1E, fangchinoline annosriippuvaisesti inhiboi rekombinantti-proteasomin β1 alayksikköön. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin tetrandrine (kuvio 1 F).

inhibitive vaikutuksia fangchinoline proliferaatioon ja solu-proteasomin toiminnan syöpäsolujen

Kuten kuviossa 2A, fangchinoline voi annosriippuvaisesti ja aikariippuvainen vähentää elinkelpoisuuden PC-3-soluja. IC

50-arvot fangchinoline estossa solujen lisääntymisen PC-3-solut olivat 27,53 ± 3,346 uM 24 tuntia, 13,13 ± 1,579 uM 48 tuntia, ja 7,247 ± 0,3122 uM 72 tuntia hoitoa, vastaavasti. Lisäksi, kuten on esitetty kuviossa 2B, fangchinoline voi annoksesta riippuen estävät C-L aktiivisuus solujen proteasomin, joka välitti proteasomin β1-alayksikön. Inhibitio on C-L-aktiivisuus oli merkittävä annoksina 1 ja 10 uM fangchinoline. Toiminta proteasomin trypsiininkaltaisista (TL) ja kymotrypsiinin kaltaiset (CT-L) toimintaa, jota välittävät proteasomin β2 ja β5 alayksikkö, eivät vaikuta merkittävästi fangchinoline hoitoon.

(A) Solujen elävyys (MTT määrityksen tulos) PC-3-solut, joita käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla fangchinoline 24, 48 tai 72 tuntia. Tiedot olivat tilastolliset tulokset kolmen erillisen kokeen. (B) Cellular proteasomin toiminnan PC-3-soluja käsiteltiin 0,1% DMSO: ssa tai fangchinoline eri pitoisuuksilla 24 tunnin ajan. (C) Solujen elinkyky (MTT-määritys tulos) LNCaP-soluja käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla fangchinoline 24, 48 tai 72 tuntia. (D) Cellular proteasomin toiminnan ohjaus-PC-3-soluja käsiteltiin 0,1% DMSO: ta (liuotin kontrolli) tai fangchinoline eri pitoisuuksilla 24 tunnin ajan. Tiedot olivat tilastolliset tulokset kolmen erillisen kokeen. *

p

0,05 vs. liuotinkontrolli. Carfilzomib käytettiin positiivisena kontrollina.

Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin toisessa syövän solulinja, LNCaP-solut. Fangchinoline annosriippuvaisesti ja aikariippuvainen vähentävät elinkelpoisuutta LNCaP-soluissa (kuvio 2C). IC

50-arvot fangchinoline estossa soluproliferaatiota LNCaP-soluja 36,18 ± 6,33 uM: ssa 24 tuntia, 11,59 ± 0,22 uM 48 tuntia, ja 12,73 ± 0,59 uM 72 tuntia hoitoa, vastaavasti. Ja fangchinoline myös voisi merkittävästi estää CL aktiivisuutta solujen proteasomin mutta ei vaikuttanut toimintaan proteasomin TL ja CT-L toimintaa LNCaP-soluissa (kuvio 2D).

inhibitive vaikutukset fangchinoline CL toimintaa puhdistettua ihmisen 20S-proteasomin

hydrolyysi käyrä β1-erityisiä fluorigenic peptidisubstraattia Z-LLE-AMC eri pitoisuuksia puhdistettua ihmisen 20S proteasomin oli kuviossa 3A. K

m ja V

max puhdistettua proteasomin laskettiin olevan 244,2 uM ja 9.749X10

-4 nmol /min, vastaavasti. Edustaja aikariippuvainen hydrolyysi käyrät Z-LLE-AMC (75 uM), jonka proteasomista tai ilman läsnäoloa 500pM fangchinoline oli kuviossa 3B. Tulokset osoittivat, että hydrolyysi substraatin proteasomin oli osittain inhiboitu, kun läsnä on fangchinoline. Inhibitive vaikutukset fangchinoline eri annoksia kuviossa 3C. K

i fangchinoline laskettiin olevan 356,58 ± 30,63 uM.

(A) hydrolyysi β1-erityinen fluorigenic peptidisubstraattia Z-LLE-AMC eri pitoisuuksia puhdistettua ihmisen 20S-proteasomin. (B) Aika riippuva hydrolyysi 75 uM alustan Z-LLE-AMC by 20S proteasomista tai ilman läsnäoloa 500gM fangchinoline. (C) inhibitive vaikutukset fangchinoline eri pitoisuuksilla hydrolyysistä aktiivisuuteen 20S-proteasomin. Tiedot olivat tilastolliset tulokset kolmen erillisen kokeen.

Fangchinoline aiheuttama solukierron pysähtymisen ja apoptoosin PC-3-solujen

edustaja tulokset solusyklin analyysi oli kuviossa 4A ja tilastollinen analyysi tulokset on esitetty taulukossa 1. Fangchinoline-käsitelty PC-3-solut näyttivät kerääntyä G0 /G1 vaiheeseen samanaikainen lasku prosentteina solujen S-vaiheessa. Ja fangchinoline myös annoksesta riippuen aiheuttaman apoptoosin in PC-3-solut. Edustavia tuloksia apoptoosin analyysin oli esitetty kuviossa 4B, ja tilastollinen analyysi Tulokset on esitetty taulukossa 2.

(A) edustaja virtaussytometria-analyysi, DNA-histogrammit PC-3-soluja käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla fangchinoline 24 h. Solusyklin pysähtymisen G0 /G1 vaiheessa havaittiin. (B) edustaja virtaussytometria-analyysin tuloksia apoptoosin PC-3-soluja käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla fangchinoline 24 tuntia. Osoittivat olivat edustavia tuloksia kolmen itsenäisen kokeen.

Fangchinoline hoito esti kasvua PC-3 eturauhassyöpäksenografteissa ja indusoi apoptoosin

Kuten kuviossa 5A, fangchinoline hoidon 25 ja 50 mg /kg voi annoksesta riippuen kasvun estämiseksi PC-3-ksenografteissa. Tiedot osoittivat kuviossa 5A on suhteellinen kasvaimen tilavuus (RTV), joka määriteltiin suhteessa kasvaimen äänenvoimakkuus ilmoitettuina ajankohtina, ja kasvaimen tilavuus alussa lääkehoidon. Tiedot Kasvaimen tilavuus (mm

3) kunkin ryhmän oli osoitti S1 taulukossa. Ja, tulokset TUNEL merkintöjä (kuvio 5B) osoitti, että apoptoosi indusoitiin PC-3-ksenografteissa hoidettujen eläinten fangchinoline.

(A) Kasvaimen kasvu käyrän nude-hiirillä, joita hoidettiin vehikkelillä ohjaus, 25 mg /kg fangchinoline tai 50 mg /kg fangchinoline. (B) Apoptosis (osoittivat TUNEL merkinnät) aiheuttama fangchinoline vuonna tuumoriksenografteja hoidettujen eläinten fangchinoline. Asteikko bar = 10 um. (C) Proteasome toimintaa tuumoriksenograftien hoidettujen eläinten ajoneuvon ohjaus- tai fangchinoline. *

P

0,05 vs. kontrolliryhmä.

Proteasome eston ksenografteissa hoidettujen eläinten fangchinoline

Kuten kuviossa 5C, tulokset proteasomiaktiivisuus -määritys ksenograftien osoitti, että proteasomin toiminnan vierassiirrännäisiä fangchinoline-käsiteltyjen ryhmien pieneni verrattuna ajoneuvon hallinnan. Lasku proteasomin aktiivisuus oli merkittävä 50 mg /kg fangchinoline saaneessa ryhmässä.

Fangchinoline aiheuttamaa kertyminen ubikitinoitu proteiineja sekä Ub-IκBα, Ub-P27 ja Ub-Bax

Proteasome estäminen aiheuttaisi kertymistä ubikitinoitu proteiineja. Kuten kuviossa 6A ja kuviossa 6B, fangchinoline indusoi annoksesta riippuvan ja ajasta riippuvaa kerääntymistä ubikitinoituja proteiinien soluissa.