Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

molekyylitason mekanismi välillä Helicobacter pylori (H. pylori) -infektio ja mahalaukun syövän pysyi suurelta osin tuntemattomia. Tässä tutkimuksessa määritimme rooli miRNA H. pylori aiheuttama mahasyövässä.

Menetelmät ja tulokset

Huomasimme, että miR-204 aleni H. pylori kudoksista qRT- PCR. Knockdovvn miR-204 tehosti hyökkäyksen ja leviämisen kyky mahasyövän soluissa in vitro. Lusiferaasianalyysissä paljasti, että SOX4 oli kohdegeeni miR-204, joka löydettiin säädellään ylöspäin helikobakteeri positiivinen kudoksiin. Down-regulation miR-204 ja yli-ilmentyminen SOX4 edistänyt epiteelin-mesenkymaalitransitioon prosessi.

Johtopäätös

Yhteenvetona havaintomme osoitti, että miR-204 voi toimia tuumorisuppressori H. pylori aiheuttama mahasyövän kohdistamalla SOX4.

Citation: Zhou X, Li L, Su J, Zhang G (2014) Vähentynyt miR-204 helikobakteeri-Associated mahasyövän Edistää Cancer Cell Proliferation ja Invasion by kohdistaminen SOX4. PLoS ONE 9 (7): e101457. doi: 10,1371 /journal.pone.0101457

Editor: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu 18 maaliskuuta 2014; Hyväksytty: 5 kesäkuu 2014; Julkaistu: 01 heinäkuu 2014

Copyright: © 2014 Zhou et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoittajat: Guoxin Zhang rahoittivat National Natural Science Foundation of China (nro 81270476) (https://www.nsfc.gov.cn/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpä on neljänneksi yleisin syöpä ja toiseksi yleisin syy syövän liittyvän kuoleman maailmanlaajuisesti [1]. Tähän mennessä molekyylitason mekanismeja mahasyövän on tutkittu, mutta ne eivät ole täysin ymmärretty [2]. Mahakarsinoomat on tarkoitus kehittää mukainen monivaiheinen prosessi syövän, joka on vahvasti liittyy infektion bakteeripatogeeni,

Helicobacter pylori

(

H. Pylori

) [3].

H. pylori

, joka colonizes mahalaukun 50% maailman väestöstä, on luokiteltu luokan karsinogeeniksi koska sen kausaalinen rooli kehityksen mahasyövän [4].

On raportoitu että kehittymistä ja etenemistä mahalaukun syöpä voi johtua MikroRNA (miRNA) [5] – [8]. MiRNA ovat pieniä, ei-koodaavat RNA: t, jotka säätelevät ilmentymistä kohdegeenien läpi translaation tukahduttamisen tai lähetti-RNA (mRNA) hajoaminen [9]. MiR-204 poikkeavasta ilmentyminen ilmoitettiin yhdistää erilaisiin syöpiin [10], [11]. Kuitenkin vähän tiedetään miRNA-204 toiminto mahasyövän. Matsushima suoritetaan miRNA array tutkimuksessa helikobakteeri positiivinen kudosten ja contols ja totesi, että miR-204 ilmentyminen oli merkitsevästi alhaisempi H. pylori kudoksissa [12].

Ihmisillä sukupuoli määräävä Y-alueen (SRY ) box perhe, myös viittasi SOX perhe käsittää 20 erittäin säilyneitä transkriptiotekijöiden että tärkeä rooli kehityksessä eturauhassyövän [13]. Nämä transkriptiotekijät määritellään konservoitunutta Tunnussarja korkean liikkuvuuden ryhmä (HMG) DNA: ta sitovan domeenin (DBD) [14], [15]. SOX4 on 47-kDa: n proteiini on erittäin konservoitunut selkärankaisten ja sen kliinistä merkitystä on saavuttanut kasvavaa huomiota viime vuosina, ja lukuisia raportteja, viittaa siihen, että SOX4 voi myötävaikuttaa taudin etenemiseen [16], [17]. Lisääntynyt SOX4 ilmentyminen tuumoreissa havaittu virtsarakon, eturauhasen, ja paksusuolen, ja ei-pienisoluisen keuhkosyövän kasvaimia [18] – [21]. Vapautettiin ilmaus SOX4 on korreloinut lisääntynyt syöpäsolujen proliferaatiota ja elossa pysymistä, apoptoosin estämisestä ja syövän etenemisen mahasyövän [22]. Sen yli-ilmentyminen on myös liittyvät huonoon ennusteeseen klinikoilla ja se on merkki ennustaa potilaiden mahalaukun syöpä [23].

Kuitenkin viime aikoihin asti, on epäselvää, että onko H. pylori infektio voi aiheuttaa SOX4 ilmaisun alaspäin säätelemällä miR-204. Niinpä teimme Tutkimuksemme edelleen tutkia roolia miR-204 ja SOX4 in helikobakteeri aiheuttama syövän syntymistä.

Materiaalit ja menetelmät

Kliininen Näytteitä

Potilaat, joilla on tai ilman H.

pylori

infektio oli tehty gastroscope The First Affiliated sairaala Nanjing Medical University, Jiangsu, Kiina maaliskuusta 2012 joulukuu 2013. näytteitä otetaan 250 potilasta (150 noncancerous potilasta ja 100 kasvain potilasta) kerättiin, ja tunnistettiin positiivinen, kun nopea ureaasin testi oli positiivinen. Nämä valitut potilaat vahvistettiin myös

13C puhalluskoe. Noncancerous potilaat luokiteltiin pinnallinen gastriitti, atrofisen gastriitin ja dysplasia mukaan patologisen luokittelun. Tämä pöytäkirja hyväksyttiin eettisen komitean ensimmäinen Affiliated sairaala Nanjing Medical University, ja jokainen potilas oli kirjallinen lupa.

Soluviljely

SGC-7901 /MKN45 mahasyövän solulinjoissa ( hankittiin ATCC) viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Gibico) ja penisilliiniä (100 U /ml). Soluja viljeltiin 37 ° C: ssa kosteutetussa ilmakehässä 5% CO

2.

Bakteeri kulttuuri ja -infektiomallia

H. pylori ympättiin levylle ja viljeltiin 37 ° C: ssa mikroaerofiilisiä 5% O

2, 10% CO

2 ja 85% N

2. Jälkeen 3 päivää, bakteeri suspendoitiin uudelleen RPMI-1640-elatusaineessa ilman FBS: ää ja tartunnan saaneiden solujen MOI 100. Sitten solut otettiin talteen 48 tunnin kuluttua infektiosta.

eristäminen kokonais-RNA: ta ja Kvantitatiivinen RT-PCR

Yhteensä-RNA: t uutettiin kerätyistä kudoksista ja solulinjoissa käyttämällä Trizol (Tarkara, Japani), ja sitten sekä miRNA ja mRNA käänteistranskriptio cDNA: ksi. Käänteinen transkriptio suoritettiin käyttäen käänteistranskriptio (Takara, Japani). Ilmaisu kypsä miRNA ja mahdollinen kohde geenejä mitattiin qRT-PCR: llä SYBR Green PCR Kit (Takara) on Applied Biosystems StepOne-Plus Real-Time PCR System ja ihmisen U6-RNA monistettiin sisäisenä kontrollina. Suhteellinen ilmentyminen suhde miR-204 laskettiin 2

-ΔΔCT menetelmällä. PCR-reaktiot suoritettiin seuraavilla alukkeilla: HSA-miR-204, eteenpäin, 5′-CAUCUUCCAGUACAGUGUUGGA-3 ’ja U6, eteenpäin, 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’. Suhteellinen ekspressiotasot SOX4 mRNA tutkittiin SYBR Green reaaliaikainen PCR (RT-PCR) ja normalisoitiin GAPDH. Alukkeet SOX4 olivat eteenpäin, 5 ’AGCCATCTCGGAGGAATA 3’ ja reverse, 5 ’CAGACAACCGGCCTTTAT 3′; ja GAPDH, eteenpäin, 5’-CGTGGGCCGCCCTAGGCACCA-3 ’ja reverse, 5′-TTGGCTTAGGGTTCAGGGGGG-3’. RT-PCR suoritettiin käyttäen ABI 7500 Fast Real-Time PCR-järjestelmä (ABI, CA, USA).

immunohistokemia

Kudokset fiksattiin 4% paraformaldehydillä ja leikataan parafiinia blokki 5 um paksuus. Sen jälkeen vahanpoisto ksyleenillä ja nesteytys asteittaisella sarja etanolia, kalvot kuumennettiin autoklaavissa kolmen minuutin ajan käyttäen sitraatti- natrium-puskuria (pH 6,0), ja niitä inkuboitiin vasta-aineen SOX4 (Cell Signaling Technology) 4 ° C: ssa yön yli. Estää seerumia tai vasta-aine, laimennus puskuria käytettiin negatiivisina kontrolleina. Vasta-aineet käytettiin ennen olivat samat kuin Western blot-analyysi. Kuvat ovat mik- roskoopilla (Nikon Eclipse 50i). Lukumäärä positiivista värjäytymistä soluissa osoittaa immunologista SOX4 kymmenessä edustaja mikroskooppikentäs- laskettiin, ja positiivisten solujen prosenttiosuuden laskettiin myös. Prosenttiosuus pisteytys immunoreaktiivisia kasvainsolujen kuvataan seuraavasti: 0 (0%), 1 (1-10%), 2 (11-50%), ja 3 ( 50%). Intensiteetti pisteytettiin seuraavasti: 0 (negatiivinen), 1 (heikko), 2 (kohtalainen) ja 3 (voimakas). Ilmaisu taso SOX4 mitattiin kertomalla prosenttiosuus ja intensiteetti pisteet. Korkea ilme näytteitä tarkoitetaan kasvaimista kerrotun pisteet ylittää 4, kun taas toiset pidetään pienenä ilmaisua.

Solulisääntyminen assasy

Solulisääntyminen tutkittiin käyttäen vesiliukoista tetratsoliumsuolaa määritys käyttäen Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japani). Lyhyesti sanottuna, soluja (1,5 x 10

3 /kuoppa) ympättiin 96-kuoppaisille viljelylevyille kolmena kappaleena, ja inkuboitiin 4 päivää 37 ° C: ssa /5% CO 2: ssa kosteutetussa inkubaattorissa. Elävät solut kvantitoitiin jokaisena 24 tunnin välein mittaamalla OD450 käyttämällä mikrolevyn lukijaa (Epoch; BioTek, Winooski, VT).

Solut (2 x 10

6) kiinteään 75% etanolia 4 ° C yön yli ja pestiin sitten kylmällä PBS: llä ja käsiteltiin RNaseI, mitä seurasi värjäys propidiumjodidilla 30 min pimeässä. Solusyklin analyysi suoritettiin sitten virtaussytometrialla (FACSCalibur; Becton Dickinson, Sparks, MD).

Solut trypsinoitiin ja maljattiin 6-kuoppalevyille (500 solua /kuoppa) ja viljeltiin 2 viikkoa. Pesäkkeet värjättiin 1% kristallivioletilla 30 minuutin ajan sen jälkeen, kun kiinnityksen 4% paraformaldehydillä 30 minuutin ajan. Pesäkkeiden lukumäärä, jotka on määritelty 50 solua /pesäke laskettiin. Kolme itsenäistä koetta suoritettiin. Tiedot laskettiin pariksi t-testiä.

Cell migraatiokokeessa (haavan paranemista) B

arpeutumisprosessit määritystä käytettiin arvioimaan kykyä kasvain solun liikkuvuus. Lyhyesti, solut (1 * 10

6 /kuoppa) siirrostettiin kuusi-kuoppalevyille, viljeltiin yön yli, ja transfektoitiin miR-204 jäljittelee tai inhibiittori, pcDNA-SOX4 tai pcDNA-NC. Saavutettuaan yhtymäkohta, solukerros oli naarmuuntunut steriilillä muovinen kärki ja pestiin sitten viljelyalustaan ​​kahdesti ja viljeltiin uudelleen jopa 48 seerumia alennetaan, joka sisälsi 1% FBS: ää. Kuilu sulkeminen mitattiin ja data tehtiin yhteenveto perustuu sextuple määrityksiä kussakin kokeessa.

Cell invaasiomääritys

Solun invaasio aktiivisuus arvioitiin käyttäen soluviljelmissä inserttejä päällystetty tyvikalvon matriisin (BD Biosciences , Bedford, MA) mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, yhteensä 1 x 105 solua 0,2 ml: ssa seerumitonta RPMI-1640-väliaine ympättiin Transwell laitteessa. RPMI-1640, joka sisälsi 10% FBS: ää (600 ui) lisättiin alempaan kammioon. Inkuboinnin jälkeen soluja 24 tuntia 37 ° C: ssa 5% CO 2-inkubaattorissa, solujen päällä sisäkkeen poistettiin pyyhkimällä pumpulipuikolla. Solut, jotka tunkeutuivat pohjaan sisäkkeen oli vahvistettu 100% jäähdyttäen metanolia 30 minuutin ajan, värjättiin 0,5% kristallivioletilla 30 minuutin ajan, sitten huuhdottiin PBS: ssä ja mikroskooppisesti tarkastus. Solut laskettiin mikroskoopilla viidellä satunnaisesti aloilla ja suhteellinen hyökkäyksen ja muuttoliike tulkittiin keskimääräinen solujen lukumäärä ± keskihajonta per kenttä.

Western blotting

Yhteensä proteiinit valmistettiin ja kvantitoitiin käyttäen proteiini-määritys (BCA-menetelmällä, Thermo, USA). Proteiinit fraktioitiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) siirrettiin polyvinylideenifluoridi (PVDF) kalvo, estetty 5% kuivamaitoa huoneen lämpötilassa 1 tunti ja immunovärjättiin vasta 4 ° C: ssa yön yli käyttäen anti-SOX4 ( 1:1000, CST, USA), anti-N-kadheriinin (1:1000, CST, USA) ja anti-E-kadheriini (1:1000, CST, USA). Anti-GAPDH (1:5000, sigma, USA) käytettiin latauskontrollina. Tulokset visualisoitiin kautta kemiluminesenssiosoitusta järjestelmä (Pierce ECL Alustan Western blot tunnistusjärjestelmä, Thermo, Pittsburgh, PA) ja sitten altistuvat Molecular Imager ChemiDoc XRS System (Bio-Rad, Hercules, CA).

plasmidikonstruktion

ennustaminen miR-204 sitoutumiskohtien suoritettiin käyttäen TargetScan ohjelmistoa (https://www.targetscan.org). 3′-UTR-sekvenssin SOX4, joka oli ennustettu olevan vuorovaikutuksessa miR-204 tai mutantin sekvenssin ennustettu kohdesivustoluetteloon insertoitiin Kpnl- ja SacI-kohtiin pGL3-promoottorin (Invitrogen). Ne nimettiin pGL3-SOX4 ja pGL3-SOX4-mut. Solut maljattiin 6-kuoppalevyille ja transfektoitiin 100 ng pGL3-SOX4 tai pGL3-SOX4-mut, ja miR-204 jäljittelee (50 nM) käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp, CA, USA). Me normalisoitui erot transfektion tehokkuutta kotransfektoimalla Renillaa sivektorissa PRL-SV40 (5 ng).

SOX4 geeni syntetisoitiin (ostettu Genscript, Piscataway, NJ), jossa rajoittava ruoansulatusta käyttäen Mlul ja subkloonattiin pLV-GFP-plasmidi, ja nimettiin pLV-GFP-SOX4. Rekombinantti lentivirus tuotettiin 293T-soluihin käyttäen kalsiumfosfaattisaostusta. SGC-7901-solulinjat transfektoitiin lentiviruksen avulla polybreenin (8 ug /ml).

Lusiferaasiaktiivisuudet analyysi

Soluja viljeltiin 24-kuoppalevyille ja transfektoitiin 0,2 ug: lla joko laaja- tyypin tai mutantti pGL-SOX4 sisältävä plasmidi tulikärpäsen lusiferaasi, sekä 0,01 ug PGL-SOX4 (Invitrogen), joka sisälsi Renilla lusiferaasin ja 1 ug oligonukleotideja. Transfektio suoritettiin käyttämällä Lipofectamine 2000 reagenssia (Invitrogen). Suhteellinen lusiferaasin aktiivisuus laskettiin 48 tuntia transfektion jonka Dual Luciferase Reporter Assay (Promega). Kaikki transfektiokokeis- tehtiin kolmena kappaleena ja toistettiin kolme kertaa itsenäisesti. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD.

Tilastollinen

Studentin t-testiä tai yksisuuntaista varianssianalyysi käytettiin tilastolliseen analyysiin tarvittaessa. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS 17.0 (SPSS, Chicago, IL). Kahden pyrstö arvo P 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

MiR-204 on poikkeavasti säädellä vähentävästi

H. pylori

positiiviset kudosten ja solujen

Ilmaisu valittujen miRNA mukaan edelliseen microarray data [10] havaittiin 75 paria helikobakteeri positiivisia ja negatiivisia normaaleista kudoksista, ja 50 paria H. pylori ja negatiivinen kasvain kudosten reaaliaikaisella PCR: llä. Olemme havainneet, että miR-204 oli yksi merkittävimmistä miRNA alas-säädellään H. pylori-infektion (kuvio S1A, kuvio 1A, B). Lisäksi miR-204 ilmentyi alemmilla tasoilla ankarampaa gastriitti (kuvio 1 C). Olemme edelleen verrattuna ilmaisunsa tuumorikudoksissa kanssa normaaleissa kudoksissa, riippumatta helikobakteeri tilan ja totesi, että miR-204 ilmentyi merkitsevästi pienempi tuumoreissa (kuvio S1B). Jaoimme potilaiden kasvain mukaan eri TNM vaiheisiin ja T2-T4 ja M1 potilaat ilmaisivat huomattavasti pienempi miR-204 kuin T1 ja M0 potilailla (kuvio S1C, S1D). Tutkimme myös miR-204 ilmentymistä infektoiduissa soluissa helikobakteeri ja huomasimme, että ilmentyminen miR-204 oli merkitsevästi pienempi useita H. pylori tartunnan soluja kuin kontrolli (kuvio 1D, kuviossa S1E).

(EN) ekspressiotasot miR-204 ihmisen H.pylori positiivinen ja normaalit kudokset suhteessa U6 määritettiin qRT-PCR. (B) Ilmaisulla tasot miR-204 H. pylori positiivisten ja negatiivisten tuumorikudoksia. (C) Ilmaisulla tasot miR-204 CG, CAG ja dysplasia H. pylori kudosten ja helikobakteeri negatiivinen kudosta. (D) ilmentyminen tasot miR-204 helikobakteeri-infektoiduissa soluissa. (* P 0,05).

MiR-204 estää migraation /invaasion ja leviämisen mahasyövän solujen SGC-7901 ja MKN-45 solujen

Transfektoimme SGC7901 ja MKN45 solut HSA-miR-204 matkivat /estäjä oligonukleotidien ja tutki vaikutuksia solun proliferaatio ja migraatio /hyökkäystä. Ensinnäkin suoritetaan qRT-PCR, jotta voidaan varmistaa transfektion, kuten kuviossa. 2A, solujen transfektio miR-204 matkii /estäjä osoitti merkittävästi lisätä /vähennys miR-204 ilmentymisen verrattuna niiden negatiivisen kontrollin (NC /INC). Haavan paranemista testi osoitti, että yli-ilmentyminen miR-204 voi tukahduttaa solujen vaeltamiseen, kun taas sen knockdown aiheuttamaa solujen vaeltamiseen, joilla on merkittäviä lähempänä raon kuin kontrolli (kuvio 2B). Johdonmukaisesti, Matrigel invaasiomääritys osoittivat myös, että yli-ilmentyminen miR-204 heikennetty soluinvaasiota, kun taas knockdovvn se voisi kääntää koettu (kuvio 2C). Olemme myös suorittaa MTT-määritystä ja totesi, että kasvuvauhti transfektoitujen solujen miR-204 estäjä lisääntyi merkitsevästi verrattuna kontrolleihin, kun taas solujen miR-204 jäljittelee oli osoitti erilaisia ​​(kuvio 3A, B). Me tarkasteltiin myös solusyklin voisi vaikuttaa knockdown /yli-ilmentymisen miR-204 fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS) analyysi propidium–jodidi-värjäytyneiden solujen. Knockdovvn miR-204 johti merkittävään kasvuun prosenttiosuudet solut G2 vaiheisiin taas yli-ilmentyminen osoittivat päinvastainen vaikutus (kuvio 3C). Pesäkkeenmuodostusta määrityksiä paljasti, että esto miR-204 lisäsi merkittävästi kasvuvauhti solulinjojen (kuvio 3D). Vertasimme myös solujen toimintoja transfektoimalla miR-204 matkii kanssa matkii ja helikobakteeri-infektion. Huomasimme, että miR-204 matkii voi tukahduttaa solujen vaeltamiseen, invaasiota ja leviämisen yhteydessä helikobakteeri-infektion (kuvio S2). Nämä tulokset yhdessä osoittivat, että alas-säätely miR-204 aiheuttama helikobakteeri-infektion edistää muuttoliikettä /invaasion ja leviämisen mahalaukun syövän solulinja in vitro.

(A) MiR-204 tason transfektoiduissa soluissa miR-204 jäljittelee, miR-204 estäjä, negatiivinen kontrolli (NC) ja inhibiittoripastojen negatiivinen kontrolli (INC). Tulos oli validoitu reaaliaikaisella PCR: llä. (B) Kuvien kuvattuna 0 h (ylempi) ja 24 h (alempi) haavan tekemisen olivat esillä suurennos x200. C. Soluja käsiteltiin miR-204 jäljittelee, miR-204 estäjä, NC ja INC 24 tuntia. Edustaja kuvat invasiivisia solujen alareunassa kalvon värjättiin kristallivioletilla tehtiin näkyviksi, kuten on esitetty. Kvantitatiivinen solumigraation esitettiin prosentteina siirtynyt solujen määrä. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja esitetään keskiarvona ± SD. * Tarkoittaa merkitsevää eroa verrattuna kontrolliryhmään (P 0,05). Jokainen itsenäinen koe suoritettiin 3 kertaa.

(A) transfektoidut solut miR-204 estäjä ja elinkykyisyyksiä määritettiin CCK-8 määrityksessä. (B) Soluja transfektoitiin miR-204 matkii ja elinkykyisyyksiä määritettiin CCK-8-määrityksessä. (C) Effects of miR-204 jäljittelee tai inhibiittori solusyklin mahalaukun syövän solujen virtaussytometrialla. (D) Colony määrityksessä jälkeen transfektoitujen solujen miR-204 matkii ja estäjä. (* P 0,05).

MiR-204 sääteli SOX4 ilmentymistä mahasyövässä

tunnistettu loppupään tavoitteita miR-204 laskennallisilla ennustuksen valottaa mekanismeja joka miR-204 tukahdutetaan mahalaukun syöpäsoluinvaasiota. Satojen geenien ennustaa verkossa miRNA kohde ennustaminen verkkosivuilla (STARBASE, https://starbase.sysu.edu.cn/), me forcused huomiomme SOX4. SOX4 oli ilmoitettu säädellä mahalaukun syövän etenemiseen ja EMT tai toimia taustalla toiminnallinen kohde miR-204. Tunnistaa ennusteen kautta qRT-PCR ja immunohistokemia, huomasimme, että SOX4 oli säädellään ylöspäin helikobakteeri positiivinen kudoksiin. Sen ilmentyminen oli myös suurempi CAG kuin CG helikobakteeri positiivinen kudoksiin. (N = 75, p 0,05, kuvio 4A-C), joka korreloi käänteisesti miR-204. Pearsonin korrelaatio analyysi SOX4-miR-204 mRNA ilmaisun, saimme tilastollisesti merkitsevä käänteinen korrelaatio (kuvio S3A, R = -0,849, p = 0,002). Käyttämällä immunohistokemia olemme myös havainneet, että SOX4 ilmentyminen liittyi merkitsevästi mahan histologia (p 0,05, taulukko 1). In vitro, Huomasimme myös, että SOX4 mRNA ja proteiini taso oli säädellään ylöspäin mahasyövän soluissa tartunnan helikobakteeri (kuvio S3B, S3C). Sitten määritetään ilmentymistä SOX4 vastauksena muutoksiin miR-204 ilmentymistä. Western blot ja qRT-PCR-määrityksissä osoitti, että yli-ilmentyminen miR-204 voisi merkittävästi alas-säädellä mRNA: n ja proteiinin ilmentymistä SOX4, kun taas vaikutus knockdovvn miR-204 oli päinvastainen (kuvio 3D). Huomasimme myös, että ilmaus EMT markkereita, N-kadheriinin ja E-kadheriinin, muuttui myös liittyvät miR-204 lauseke (kuvio 4E), joka ehdotti, että miR-204 voi vaikuttaa EMT prosessi.

mRNA tasot SOX4 suhteessa GAPDH ihmisen helikobakteeri positiivinen kudokset (A) sisältäen CG ja CAG ja normaaleissa kudoksissa (B) arvioitiin qRT-PCR. Tulokset esitettiin hajontakuvion mediaani. * Merkittävästi erilainen verrattuna valvonta (P 0,05). (C) SOX4 proteiinin ilmentyminen H. pylori positiivisten ja negatiivisten kudosten havaittiin immunohistokemiallinen värjäys. (D) SOX4 proteiinia ja mRNA-tasoja transfektoiduissa soluissa negatiivisen kontrollin (NC), miR-204 jäljittelee; miR-204 estäjä ja INC analysoitiin kautta Western-blottauksella ja qRT-PCR. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina. Keskiarvot integroitujen optinen tiheys (IOD) arvioitiin analysoimalla viiteen näkökenttään objektilasia kohti ja tallennettu histogrammin. (E) E-kadheriinin ja N-kadheriinin proteiinin tasot transfektoitujen solujen negatiivisen kontrollin (NC), miR-204 jäljittelee; miR-204 estäjä ja INC analysoitiin kautta Western-blottauksella. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD. * Tarkoittaa P 0,05.

SOX4 on suora kohdegeeni miR-204 mahasyövän soluissa

Vaikka SOX4 on pidetty välittömänä kohteena asennuspalveli- 204, on epäselvää miR-204 voi suoraan tunnistaa 3′-UTR SOX4 mRNA. Mukaan ennakoi maalin sivuston Targetscan, me kloonattu 3′-UTR fragmentti, joka sisältää ennustetun sivuston pGL3 lusiferaasireportteri- vektori (pGL3-SOX4). 3′-UTR fragmentti mutatoidun sekvenssin sisällä ennustettu kohdesivusto kloonattiin myös kontrollina (pGL3-SOX4-mut). Tulokset osoittivat, että kotransfektion miR-204 jäljittelee ja pGL3-SOX4 vektori laski lusiferaasiaktiivisuuden SGC-7901-soluja. Kuitenkin miR-204 jäljittelee ei ollut vaikutusta lusiferaasiaktiivisuuteen, kun solut transfektoitiin pGL3-SOX4-mut-vektoriin (kuvio 5). Nämä tiedot osoittivat, että SOX4 geeni oli yksi kohdistu suoraa miR-204.

Mahdollinen miR-204 sitoutumiskohdan 3′-UTR SOX4 mRNA laskennallisesti ennusti Targetscan. Solut ko-transfektoitiin miR-204 jäljittelee (tai negatiivinen kontrolli) ja pGL3-SOX4 (tai pGL3-SOX4-mut) vektori. Lusiferaasiaktiivisuus normalisoitiin suhteessa tulikärpäsen ja Renillan lusiferaasin signaaleja. * Tarkoittaa P 0,05.

Yli-ilmentyminen SOX4 vaikutus on miR-204 mahalaukun syöpäsolujen invaasiota

Voit selvittää SOX4 toiminnalliset efektori miR-204 mahasyöpä invaasio, me yli-ilmentynyt SOX4 transfektoimalla lentiviruksen ja tutkitaan sen vaikutuksia mahalaukun syöpäsoluja. Yli-ilmentyminen SOX4 solulinjassa vahvistettiin Western-blottauksella (kuvio 6A). Olemme myös havainneet, että E-kadheriinin oli alassäädetty taas N-kadheriinin oli säädelty jälkeen pLV-SOX4 transfektiota. Kautta haavan paranemista ja Matrigel invaasiomääritys, me sitten havaittiin, että yli-ilmentyminen SOX4 merkittävästi edistänyt solujen muuttoliikettä ja invaasiota (kuvio 6B ja 6C). Jotta edelleen osoittaa, että miR-204 aiheuttama menetys SOX4 tukahdutetaan leviämisen ja invaasion mahasyövän soluja, solut transfektoitiin miR-204 matkii ja SOX4 yli-ekspressiovektorin yhdessä ja tulokset osoittivat, että tukahduttaminen muuttoliikkeen, invaasion ja lisääntymisen miR-204 on heikennetty (kuvio S4).

(A) SOX4, N-kadheriinin ja E-kadheriinin proteiinin ekspressiota analysoitiin Western-blottauksella soluissa transfektoimalla lentiviruksen, ohjaus plasmidi, ja Mock. GADPH näkyi sisäisen valvonnan. (B) Haavan paranemista määritys Näiden kuvien 0 h (ylempi) ja 24 h (alempi) haavan tekemisen olivat esillä suurennos x200. (C) SOX4 yliekspressoitujen ja NC ryhmät olivat vastaavasti värjätään. Edustaja kuvat invasiivisia solujen alareunassa kalvon värjättiin kristallivioletilla tehtiin näkyviksi, kuten on esitetty. Kvantitatiivinen solumigraation esitettiin prosentteina siirtynyt solujen määrä. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja esitetään keskiarvona ± SD. * Tarkoittaa merkitsevää eroa verrattuna kontrolliryhmään (P 0,05). Jokainen itsenäinen koe suoritettiin 3 kertaa.

Keskustelu

Mahalaukun syöpä on maailmanlaajuinen sairaus ilmaantuvuus on suuri, erityisesti Kaakkois-Aasiassa [21]. 5 vuoden eloonjäämisaste mahasyövän on varsin alhainen. Osa mahasyövän potilaat olivat helikobakteeri liittyvä. Sen vuoksi on välttämätöntä tutkia perusteellisesti synnyssä ja kehittää uusia kohdennettuja hoitoja H. pylori liittyvät syöpään.

miRNA suuri perhe geenin säätimiä, jotka säädellä negatiivisesti niiden kohde-mRNA: iden sekvenssi-spesifisellä tavalla. miRNA voivat toimia myös tuumorisuppressoreilla tai onkogeenien [22]. Viimeaikaiset todisteet ehdotti, että miRNA pelata olennainen rooli useiden biologisiin prosesseihin liittyvät syöpään, mukaan lukien solujen erilaistuminen, proliferaatio, tumorignesis, angiogeneesi, invaasio ja etäpesäkkeiden [23]. MiR-204 on raportoitu toimivan tuumorisuppressorina ja matalan tason ilmentymisen miR-204 liittyy huono prognostisia fenotyypin syöpäpotilailla [24], [25]. Oli kuitenkin muutamia tutkimuksia tutkivat miR-204 toiminto H. pylori liittyvät mahasyövän. Täällä olimme ensimmäisenä esittää todisteita, että miR-204 oli merkittävästi säädellä vähentävästi helikobakteeri positiivinen kudoksia (normaali ja kasvaimen kudokset) ja että yli-ilmentyminen miR-204 tukahdutetaan SOX4 proteiinin ilmentymisen ja solujen kasvu on johdettu mahakasvaimen.

ensimmäinen määrällisesti ilmentymistä miR-204 helikobakteeri-infektion kudosten ja valvontaa ja löysimme että miR-204 ilmentyminen on huomattavasti alhaisempi H.pylori tartunnan saaneilla potilailla. Huomasimme myös, että ilmaisu liittyy histologia potilaista, eli ilmentymistä miR-204 on huomattavasti alhaisempi H.pylori positiivisilla potilailla, joilla on krooninen atrofinen gastriitti kuin kroonisten ei-atrofinen gastriitti. Tämä ilmaus malli osoitti, että mahdollisuus, että miR-204 liittyy erilaisia ​​gastriitti ja vaikeampia potilaat olivat, sitä pienempi ilmentyminen miR-204 oli. Perustuu miR-204 ekspressiotaso, valitsimme SGC-7901 ja MKN45 solujen myöhempää voitto-of-function ja menettämisestä toiminnon tutkimuksissa vastaavasti. Tulokset viittaavat siihen, että alas-säätely miR-204 mahalaukun syöpäsolun liittyy sen etenemistä. Vaikka suuri määrä ihmisen miRNA on raportoitu, monet niiden mRNA tavoitteet ovat tunnistamatta [9]. Tässä tutkimuksessa käytimme yhdistetyn bioinformatiikan ja kokeellinen lähestymistapa tunnistaa, että SOX4 ovat toiminnallisia alavirtaan tavoite miR-204.

SOX4 yli-ilmentyy erilaisissa syövissä ja läheisesti korreloivat kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden [ ,,,0],16] – [19]. Se on myös yksi jäsenistä EMT-transkription indusoijat [26]. EMT on keskeinen kehityshäiriöitä ohjelma, joka on usein aktivoidaan syövän etenemiseen ja saattavat edistää vastustuskykyä hoito [27]. Zhang et al [20] osoitti, että yli-ilmentyminen SOX4 ihmisen maitorauhasen epiteelisolujen johti hankintaan mesenkymaalisten piirteitä, ja parannettu solumigraatio ja invaasiota. Lisäksi SOX4 säätää positiivisesti ilmaus tunnetaan EMT induktorien ja aktivoi TGF-β-reitin edistää EMT [28]. Tähän mennessä EMT on houkutteleva kohde hoitotoimenpiteiden, tarjoaa uuden perustan etenemisen karsinooma kohti dedifferentoituneiden ja pahanlaatuisten valtioiden [29]. Tutkimuksemme ensinnäkin osoitti, että helikobakteeri-infektion aiheuttama miR-204 alas sääntely aiheuttaa mahalaukun syövän EMT prosessi.

Lopuksi meidän näytön mukaan miR-204 oli alassäädetty, kun SOX4 oli ylös- säännelty helikobakteeri-infektion ja mahasyövän. Kohdunulkoinen miR-204 ilmaisu laski SOX4 ilmentymisen mRNA ja proteiini tasoilla mahasyövän solulinja. Olemme myös osoittaneet, että miR-204 oli suoraan sidottu 3′-UTR SOX4. MiR-204 ilmaisu esti EMT kautta tukahduttamisesta SOX4. Lisäksi miR-204-EMT polku, joka olemme määritelleet voidaan hyödyntää terapeuttisessa lähestymistapa hoitoon H.pylori liittyviä syöpiä.

tukeminen Information

Kuva S1.

(A) ilmentyminen 5 miRNA H pylori positiivisten ja negatiivisten kudosten havaittiin qRT-PCR. (B) ekspressio tasot miR-204 kasvaimen ja valvonta kudoksiin. (C) ilmentyminen tasot miR-204 mukaan TNM vaiheissa. (D) Ilmaisu taso miR-204 kolmella sellaista helikobakteeri tartunnan soluja. (* P 0,05).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0101457.s001

(TIF) B Kuva S2.

transfektoidut solut miR-204 matkii ja jäljittelee kanssa helikobakteeri-infektion ja (A) elinkykyisyyksiä määritettiin CCK-8 määritys (B) Kuvien kuvattuna 0 h (ylempi) ja 24 h (alempi) haavan tekemisen oli esitetty suurennos x200 (C) Edustavat kuvat invasiivisia solujen alareunassa kalvon värjättiin kristallivioletilla tehtiin näkyviksi, kuten on esitetty. (* P 0,05).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0101457.s002

(TIF) B Kuva S3.

(A) Suhteellinen mRNA ilmentymistä miR-204 ja SOX4, normalisoitu U6 ja GAPDH, arvioitiin 15 yksilöiden helikobakteeri positiiviset ja negatiiviset kudoksista qRT-PCR. (B) Käänteinen korrelaation SOX4 ja miR-204 ekspressiotasot tutkittiin (R = -0,920, p = 0,001). (C) ilmentymistä SOX4 mRNA määritettiin qRT-PCR helikobakteeri infektoiduissa soluissa. (D) ilmentymistä SOX4 proteiinin taso määritettiin western blot helikobakteeri infektoituneita soluja. (* P 0,05).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0101457.s003

(TIF) B Kuva S4.

transfektoidut solut miR-204 matkii ja jäljittelee kanssa pLV-SOX4 ja (A) elinkykyisyyksiä määritettiin CCK-8-määritys (B) edustaja kuvat invasiivisia solujen alareunassa kalvon värjättiin kristallivioletilla oli visualisoida esitetty. (C) Kuvien kuvattuna 0 h (ylempi) ja 24 h (alempi) haavan tekemisen olivat esillä suurennuksella x200 (* p 0,05).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0101457.s004

(TIF) B