Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kemoterapia ensisijainen hoitoa syöpään, mutta sen tehokkuus on usein rajoittaa haitallisia vaikutuksia sytostaattien. Kohdennettu lääkeaineen voi vähentää ei-spesifistä toksisuutta kemoterapian valikoivasti suuntaamalla syöpälääkkeiden kasvainsoluihin. MUC1-proteiinia, on houkutteleva kohde kasvain-spesifisen lääkeaineen omistavan sen yli-ilmentymisen useimmissa adenokarsinoomat. Tässä tutkimuksessa uusi MUC1 aptameeriin on hyödynnetty kohdistamisen ligandina kuljettaa doksorubisiini (Dox) syöpäsoluihin. Kehitimme 86-base DNA aptameeri (MA3), joka peptidiin sitoutuneena epitoopin MUC1 kanssa

K

d 38,3 nM ja vähäinen ristireaktiivisuus albumiiniin. Käyttäen A549 keuhkosyöpä ja MCF-7-rintasyöpäsolujen kuten MUC1-ilmentäviä malleja, MA3 havaittiin sitoutua edullisesti MUC1-positiivinen, mutta ei MUC1-negatiivisia soluja. Aptameeristä-doksorubisiini kompleksi (Apt-Dox) muotoili interkalatoivista doksorubisiinin osaksi DNA rakenteeseen MA3. Apt-Dox havaittiin pystyy kuljettamaan doksorubisiinia osaksi MUC1-positiivisia kasvainsoluja, kun taas vähentää merkittävästi lääkkeen saanti MUC1-negatiivisia soluja. Lisäksi Apt-Dox säilytti tehon doksorubisiinin vastaan ​​MUC1-positiivisia kasvainsoluja, mutta alensi myrkyllisyys MUC1-negatiiviset solut (P 0,01). Tulokset viittaavat siihen, että MUC1 aptameeriin voi olla potentiaalia hyödylliseksi kohdistaminen ligandina selektiivisen sytotoksisen aineen MUC1 ilmentäviä kasvaimia.

Citation: Hu Y, Duan J, Zhan Q, Wang F, Lu X, Yang XD (2012) Novel MUC1 aptameeriin valikoivasti Antaa sytotoksinen aine syöpäsoluja in vitro. PLoS ONE 7 (2): e31970. doi: 10,1371 /journal.pone.0031970

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 15 syyskuu 2011; Hyväksytty: 19 tammikuu 2012; Julkaistu: 22 helmikuu 2012

Copyright: © 2012 Hu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat varoja Kiinan Ministry of Science and Technology (2011CB933504, 2011CB911004, 2011CB911003) ja Natural Science Foundation of China (81071870).

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

Kemoterapia on olennainen hoitoa syöpään, erityisesti myöhäisvaiheen etäpesäkkeitä. Kuitenkin tehokkuus kemoterapian rajoittaa usein kielteisten vaikutusten sytostaattien, joita käytetään useimmissa hoito-. Suuri ongelma liittyy sytotoksisten lääkkeiden on, että ne aiheuttavat vahinkoja sekä syöpäsolujen ja normaalia kudosta, tuottaa vakavia haittavaikutuksia, jotka usein rajoittavat voimakkuus ja kesto kemoterapia. Näin ollen on usein vaikea sytotoksisten lääkkeiden poistaa kaikki syöpäsolut kehon sisällä, jolloin hoidon epäonnistuminen ja huonoon ennusteeseen. Tällainen epäonnistuminen korostaa tarvetta kehittää yhä voimakkaita hoidon alentunut myrkyllisyys. Yksi lähestymistapa tavoitteen saavuttamiseksi on suunnattu syövän hoidossa, jossa syöpälääkkeiden selektiivisesti toimitetaan syöpäsoluja, niin että sytotoksisuus kasvain on parannettu samalla kun haitallisia vaikutuksia pienennetään. Kohdennettu syövän hoidossa lupaava parantamisessa syövän vastaisen tehon. On raportoitu, että aptameeriin-ohjattu harjoittajat paklitakselia sisältävä voidaan merkittävästi parantaa tehokkuutta eturauhassyöpää vastaan ​​eläinmalleissa [1]. Monoklonaalisia vasta-aineita on myös kytketty kovalenttisesti lääkkeitä kohdennettuja syövän hoitoon [2]. Tutkimus trastutsumabilla emtansine (T-DM1), konjugaatti humanisoidun anti-HER2-vasta-aine ja kemiallinen lääke, on parhaillaan faasin III kliinisessä tutkimuksessa [3].

Tyypillinen kohdistuva lääkkeiden annostelu järjestelmä koostuu yleensä of syöpälääkkeen ja kohdistaminen ligandin, joka voi spesifisesti sitoutuu kasvainmerkkiaineet että runsaasti ilmaista syöpäsoluissa [4]. Ihanteellinen kasvaimen merkkiaine täsmähoitoihin pitäisi olla kalvo proteiini, joka yli-ilmentyy pinnalla syöpäsolujen suhteellisen heikkoa ilmentymistä normaalissa kudoksessa. MUC1 on hyvin ominaista suuri läpäisevä glykoproteiini, joka voi mahdollisesti olla tavoitteeksi syövän hoitoon. Sen ilmentyminen lisääntyy vähintään 10-kertaisesti kaikkein haitallisimpia adenokarsinoomat, mukaan lukien rintasyöpä, keuhkosyöpä ja paksusuolen syöpä, joten se on houkutteleva kasvaimen merkkiaine täsmähoitoihin [5]. Lisäksi tuumorimarkkeri kasvaimeen kohdistaminen ligandi on myös tärkeä tekijä kohdennettuja syövän hoidossa. Ihanteellinen kohdistaminen ligandin pitäisi olla korkea sitoutumisaffiniteetti tuumorimarkkeri hyvä spesifisyys ja alhainen immunogeenisyys [6]. Viime aikoina uusia kohdistaminen aineiden, mukaan lukien aptameerit [7], lyhyet peptidit [8], ja muut pienet molekyylit, [9], on tullut uuden sukupolven kohdennusmolekyylejä. Aptameerit ovat yksijuosteisten oligonukleotidien, jotka voivat sitoutua kohdemolekyyleihin, joilla on korkea affiniteetti ja spesifisyys. Vertaamalla monoklonaalisia vasta-aineita, aptameerit erottamiskyky etuja kohdistaminen ligandina: korkea affiniteetti sitoutumisessa useimpien molekyylien, rajoitettu synteesi kustannukset, matala-immunogeenisyys, ja pieni koko, joka sallii sen tunkeutumaan kiinteiden kasvainten [10]. Johtuen nämä edut, aptameerejä on käytetty uusina kohdistaminen ligandeja lääkeainekuljetussysteemeissä eturauhassyöpää vastaan ​​[11], [12], [13] ja leukemia [14]. Sillä tuumorimarkkeri MUC1, Ferreira et ai ovat kehittäneet useita aptameerejä, jotka voivat sitoutua MUC1-positiivisiin kasvainsoluihin [15]. On myös osoitettu, että MUC1 Aptameerien voitaisiin käyttää valikoivasti toimittaa valohoitoa aineen syöpäsoluja

in vitro

[16].

Sytotoksiset lääkkeet ovat olennaisimpia eniten solunsalpaajahoitoa syöpä hoitoon. Siksi on tärkeää tutkia, onko MUC1 aptameeriin voidaan käyttää suoraan valikoivasti toimittaa sytotoksisen aineen syöpäsoluihin. Toistaiseksi ei kuitenkaan ole tällainen tutkimus on raportoitu kirjallisuudessa. Täällä tässä tutkimuksessa olemme kehittäneet uuden MUC1 aptameeriin, ja arvioitiin sen kyky tuottaa doksorubisiinin syöpäsoluihin

in vitro

. Erityisesti meidän valinnut 86-base DNA aptameeriin (kutsutaan MA3) vastaan ​​peptidiepitooppiin MUC1, ja arvioitiin sen sitoutumisaffiniteetti MUC1-positiivisten ja -negatiivisilla soluja. Tutkia sitoutumisen spesifisyyden aptameerin, arvioitiin myös sen sitoutumisen albumiiniin, joka on yleisin proteiini plasmassa, ja voi ei-spesifisesti sitoutuvat aptameerejä ja häiritä niiden kohdistaminen toiminto. Doksorubisiini on yksi yleisimmin käytetty syöpälääkkeiden, ja voi inhiboida syöpäsolujen kautta interkalatoivia DNA: han rakenteen solutumissa. Aptameeristä-doksorubisiini kompleksi (Apt-Dox) formuloitiin sisällyttämällä doksorubisiinin osaksi aptameeriin rakenteeseen MA3. Nyt raportoivat, että Apt-Dox voi valikoivasti toimittaa doksorubisiinin MUC1-positiivisten solujen

in vitro

.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

oligonukleotidialukkeita syntetisoitiin Invitrogen (Shanghai China). Peptidejä vähintään 95%: n puhtaudella syntetisoitiin SBS Genetech (Beijing China). Naudan seerumin albumiini (BSA) hankittiin Tbdscience (Tianjin Kiina). Monodispersseistä magneettinen urea-formaldehydi mikropallot hankittiin Baseline Chromtech (Tianjin Kiina). Trypsiini hankittiin Amresco (USA). Streptavidiinilla päällystettyjen magneettikuulien hankittiin Promega (USA). 1-etyyli-3- (3-dimethyllaminopropyl) karbodi-imidihydrokloridia (EDC) hankittiin Sigma (USA).

Solulinjat

Ihmisen rintasyöpä (MCF-7), ihmisen maksasyöpä (HepG2), ihmisen keuhkosyöpä (A549), ja ihmisen normaali maksan soluihin (L02) saatiin Cell Center of Chinese Academy of Medical Sciences (Peking, Kiina). Soluja viljeltiin DMEM-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia (FBS), ja seosta penisilliini /streptomysiiniä. Soluja kasvatettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 5% CO

2. Kaikki kokeet suoritettiin solujen räjähdysmäinen kasvu vaihetta.

immobilisointi tavoite magneettihelmille

tavoite aptameeriin valinta on 9-AA peptidejä (peptide1) sekvenssin kanssa APDTRPAPG. Konjugointi kohde magneettihelmiin suoritettiin kautta silloittumisen -COOH ja -NH2. Kaksi ug peptide1 sekoitettiin 5 x 10∧5 karboksyloidut magneettiset helmet, ja inkuboitiin 200 ul: lla EDC: tä (40 mM) huoneenlämpötilassa varovasti sekoittaen 2 tuntia. Magneettiset helmet pestiin sitten kolme kertaa Hanks-puskurissa, ja varastoitiin 4 ° C: ssa. Samanlaisia ​​menetelmää käytettiin konjugoida helmien muiden aineiden, kuten BSA: ta ja 29-AA pitkien peptidien sekvenssin kanssa GSTAPPAGHGVTSAPDTRPAPGPGSTAPP (peptide2).

SELEX kirjasto ja alukkeita

liikkeellelähdön DNA-kirjasto joka koostuu 86-mer oligonukleotidit Keski 40 emästä pitkän, satunnaistettuja sekvenssejä syntetisoitiin. Sekvenssi kirjasto on 5’AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTC-N40-CACAGACACACTACACACGCACA3 ’, jossa N edustaa satunnaistettu nukleotidin joko A, G, C tai T. FITC-leimattu 5′-aluke (5′-FITC-AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTC-3′) ja biotiini-leimattu 3′-aluketta (5’-B-TGTGCGTGTGTAGTGTGTCTGTG-3 ’) käytettiin PCR-synteesiä varten kahden leimatun kaksijuosteisen DNA-molekyylejä, jotka sekoitettiin sitten streptavidiinilla päällystettyjen magneettisten helmien kanssa 10 min huonelämpötila. Denaturoinnin jälkeen emäksisessä kunnossa (0,1 M NaOH), FITC-konjugoitu sense yksijuosteisen DNA (ssDNA) erotettiin biotiini-leimattu antisense-ssDNA-juosteen streptavidiinilla päällystettyjen magneettisten helmien kanssa ja käytettiin aptameerin valinnassa.

In vitro valinnassa kohde-sitovan aptameerien

menettelyjen valinta olivat seuraavat. SsDNA-pooli (200 pmol) kuumennettiin ensin 95 ° C: ssa 5 minuuttia ja sitten jäähdytettiin välittömästi 0 ° C: ssa sitoutumisen (Hanks-puskuri) 15 min ennen sitoutumaan kohde. Taustan vähentämiseksi häiriöitä, 0,1 mg /ml lohen maidin DNA: ta ja 1 mg /ml BSA: ta lisättiin sitovaa puskuria. Ensimmäisessä valinnassa kierroksella peptide1 päällystetyt helmet suspendoitiin 200 ul: aan sitovaa puskuria, joka sisälsi 200 pmol satunnainen ssDNA. Kun oli inkuboitu seos 37 ° C: ssa 30 minuuttia varovasti ravistellen, sitoutumattomat oligonukleotidit poistettiin pesemällä neljä kertaa 500 ul: aan sitoutumispuskuria. Sen jälkeen, helmi sidottuja oligonukleotideja seokset monistettiin PCR: llä FITC- tai biotiini-leimattuja alukkeita (25 sykliä, 40 s 94 ° C: ssa, 30 s 65 ° C: ssa, 40 s 72 ° C: ssa, mitä seurasi 10 min 72 ° C: ° C Taq-polymeraasin ja dNTP: t saatiin Takara). Seurannut dsDNA PCR erotettiin ssDNA kautta kuvatun. Valitun sense ssDNA: ta erotetaan biotinyloidun antisense-DNA-juosteeseen streptavidiinilla päällystettyjen magneettisten helmien käytettiin seuraavalla kierroksella SELEX. Sen jälkeen useita valinta, valittu ssDNA-pooli PCR-monistettiin käyttämällä muunneltua alukkeita ja kloonattiin Escherichia coli TA -kloonausvälinesarjaa DNA: n sekvensointia.

Virtaussytometrianalyysi

Voit seurata rikastamiseen ja aptameerin ehdokkaiden valinnan jälkeen, FITC-leimatun ssDNA-pooli inkuboitiin peptide1 päällystettyjen magneettisten helmien 200 ul valinnan, joka sisälsi 10% FBS: ää 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Helmet pestiin kaksi kertaa 0,5 ml: aan sitoutumispuskuria ja suspendoitiin sitten 0,2 ml: aan sitoutumispuskuria. FITC-fluoresenssi määritettiin FACScalibur -virtaussytometrillä (Accuri C6, US). FITC-leimattu satunnaistettu ssDNA kirjastoa käytetään muodostamaan ohjaussignaali.

sitoutumisaffiniteetti Aptameerien määritettiin inkuboimalla peptide1 päällystettyjen magneettisten helmien kanssa eri pitoisuuksilla FITC-leimatun aptameerin 200 ul: aan sitoutumispuskuria at 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Helmet pestiin kaksi kertaa 0,5 ml: lla sidospuskuria, suspendoitiin 0,2 ml: aan sitoutumispuskuria ja altistettiin virtaavat-sytometrinen analyysi. FITC-leimattu valitsematta ssDNA kirjastoa käytettiin negatiivisena kontrollina määrittämiseksi spesifisen sitoutumisen. Kaikki kokeet sitoutumisen määritys toistettiin kolme kertaa. Keskimääräinen fluoresenssi-intensiteetti kohde leimattu aptameerien käytettiin laskea spesifinen sitoutuminen vähentämällä keskimääräinen fluoresenssi-intensiteetti on epäspesifinen sitoutuminen valitsematta kirjaston DNA [17]. Tasapainodissosiaatiovakio vakioita (

K

d) on aptameeri-peptide1 vuorovaikutuksen saatiin sovittamalla riippuvuus fluoresenssin voimakkuus spesifisen sitoutumisen pitoisuudesta ja aptameerien yhtälön Y = B max X /(Kd + X).

arvioimiseksi spesifinen sitoutuminen aptameerien kohdistaa, FITC-leimatun aptameerin on erikseen inkuboitiin peptide1-, peptied2-, tai BSA-päällystetyt magneettiset helmet. Helmet pestiin kaksi kertaa 0,5 ml: lla sidospuskuria, suspendoitiin 0,2 ml: aan sitoutumispuskuria ja analysoitiin virtaussytometrialla. Arvioimiseksi aptameerin sitoutumisen soluihin, solut kaavitaan viljelypullolaitteesta ja pestiin Hanks puskurilla. FITC-leimattua aptameerin inkuboitiin 10∧5 joko MCF-7, A549, HepG2 tai L02 soluja sitomispuskuriin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Sitten solut pestiin kolme kertaa Hanksin puskurissa ja analysoitiin virtauksen cytometrey.

soluja ja siRNA transfektio

A549-solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille 1-3 x 10

5cells /hyvin, kasvatetaan antibioottia vapaa tiedonvälitys yön yli, ja transfektoitu MUC1 siRNA tai ohjata siRNA [18] käyttämällä Lipofectamine 2000 Opti-MEM I vähensi seerumiväliaineessa mukaan valmistajan ohjeiden (Invitrogen Life Technology, Inc.). 72 tunnin kuluttua solut kerättiin ja värjättiin FITC-leimatulla aptameerin virtaussytometriaa määrityksessä, ja solulysaatit valmistettiin immunoblot-analyysillä.

Western blot-analyysi

Lysaatit valmistettiin subkonfluenteista soluja. Yhtä suuret määrät proteiinia, erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille. Immunoblottauksia koetettiin anti-MUC1-vasta. Immunokompleksien havaittiin piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-aineita ja tehostetun kemiluminesenssin (ECL).

lataaminen aptameerin doksorubisiinin

Aptameerit kuumennettiin ensin 95 ° C: ssa 5 minuutin ajan ja jäähdytettiin sitten välittömästi 0 ° C: ssa vedessä 15 minuuttia. Aptameerejä inkuboitiin vesiliuosta doksorubisiinin (3 nM) 1 tunnin musta 96-kuoppalevylle eri aptameerin /dox moolisuhteissa. Fluoresenssispektriä doksorubisiinin jälkeen tutkittavana Synergy4 analysaattori (Aex = 488 nm, Aem = 500-700 nm). FITC-leimattua Apt-Dox tai Apt-Dox inkuboitiin A549-soluja sitomispuskuriin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Sitten solut pestiin kolmesti Hankin puskurilla ja analysoitiin virtauksen cytometrey.

doksorubisiinin soluunottoa

erityinen soluunottoa Apt-Dox by MUC1-positiivisten A549 tutkittiin konfokaalisella fluoresenssi skannaus mikroskopia (Perkin Elmer Ultraview, USA) ja virtaussytometria. HepG2 solujen käytettiin MUC1-negatiivinen kontrolli. Solujen annettiin kiinnittyä lasipäällyslevyn 24 tuntia. Sitten soluja inkuboitiin 1,5 uM Dox tai aptameerin-Dox 2 h ajan 37 ° C: ssa. Sen jälkeen, kun pestiin kahdesti Hanks-puskurilla, solut kiinnitettiin 4% formaldehydiä 10 minuutin ajan ja analysoitiin konfokaalisella fluoresenssin pyyhkäisymikroskoopilla.

virtaussytometria-analyysi, solut kaavittiin pois viljelmästä pullosta ja pestiin kahdesti Hanks-puskuria. Soluja inkuboitiin 1,5 uM Dox tai aptameeri-Dox 4 h 37 ° C: ssa, ja pestiin kahdesti Hanks-puskurilla. Sitten solut kiinnitettiin 4% formaldehydiä 10 minuutin ajan ja analysoitiin virtauksen cytometriy.

MTS solunelinkykyisyysmääritys

arvioimiseksi sytotoksisuuden Apt-Dox tai Dox A549 ja HepG2-soluja, sekä solulinjoja kasvatettiin ensin 96-kuoppalevyille, ja sitten co-inkuboitiin 37 ° C: ssa Apt-Dox, Dox tai aptameerin pitoisuutena 3 uM: ssa 4 tuntia. Solut pestiin Hanksin puskurissa kaksi kertaa, ja viljeltiin vielä 48 tuntia. Jälkeenpäin MTS-määritys (Promega, USA) käytettiin määrittämään solujen elinkelpoisuuden kohti standardin protokollan kaavailema valmistukseen.

Tilastot

Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen Statistical Analysis System (SAS, versio 9.2 ). Yksisuuntainen ANOVA Fisherin vähiten merkitsevää eroa (LSD) post hoc vertailuissa 99%: n luottamusväli käytettiin tilastollisessa vertailussa. Kaikki tiedot esitetään keskiarvona sen keskihajonnan osoitetaan (keskiarvo ± SD).

Tulokset

aptameeriin valinta ja kuvaaminen

solunulkoiset proteiini ydin MUC1 tehdään up of vaihteleva määrä erittäin konservoituneen tandem toistosekvenssistä koostuu 20 aminohaposta (TAPPAGHGVTSAPDTRPAPGPGS) [19]. Niistä tandem-toisto, sekvenssi APDTRPAPG oli todettu parhaiten immunodominantin peptidin epitooppi [20], ja käytettiin kohteena MUC1 aptameerin valinta ennen tutkimuksen [15]. Täällä tässä tutkimuksessa olemme myös käyttäneet tätä peptidejä tavoitteeksi meidän SELEX prosessissa. Kohde-peptidit on konjugoitu kovalenttisesti magneettisia helmiä käyttämällä EDC: tä katalyyttinä. Jokaisen kierroksen valintaa, helmiä inkuboitiin FITC-leimatun ssDNA-pooli, ja rikastamista Aptameerien seurattiin virtaussytometrialla. Verrattuna satunnainen kirjastosta peräisin oleva DNA-allas, yhä enemmän ssDNA sitoutuneen kohdistaa päällystetyt magneettiset helmet jokaisen kierroksen jälkeen valinta (Fig. 1). Aptameerejä sittemmin kloonattu ja 50 kloonia analysoitiin edelleen karakterisointiin. Näistä klooneista, yksi apatmer kutsutaan MA3 oli suhteellisen korkea sitoutuminen kohde-MUC1 peptidejä. DNA-sekvenssi aptameerin MA3 on 5′AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTCGGACTGCAACCTATGCTATCGTTGATGTCTGTCCAAGCAACACAGACACACTACACACGCACA3′.

Compared jossa alkaa satunnainen DNA-poolin (varjostettu histogrammi), virtaussytometria paljasti fluoresenssin intensiteetin lisääntymisen Aptameerien sidottu MUC1-peptidi (APDTRPAPG) jälkeen kolmas (harmaa käyrä) ja edelleen (musta käyrä) valintakierroksen.

sitoutumisspesifisyys on tärkeää arvioida aptameerin suorituskykyä. Koska albumiini on runsain proteiini veressä, tutkimme sitoutumisen aptameerin MA3 albumiiniin. Albumiini tai MUC1 peptidejä päällystettyjä helmiä inkuboitiin FITC-leimatun MA3, ja analysoitiin virtaussytometrialla. Valitsemattomat satunnainen kirjastosta peräisin oleva DNA-altaan käytettiin kontrollina. Kuten on esitetty kuviossa 2, MA3 aptameerin tuotti merkittävää sitoutumista MUC1 peptidit (Fig. 2A), mutta suhteellisen heikko sitoutuminen BSA samanlainen kuin satunnaisalukeleimauksella DNA (Fig. 2B). Tulokset viittasivat siihen, että välillä MUC1 peptidien ja albumiini, aptameeriä MA3 osoitti kohdistaminen spesifisyys kohti entinen. Vertailun vuoksi samanlaisia ​​kokeita toisen MUC1 aptameeri, S2.2, joka oli alhaisin

K

d kaikkien julkaistujen MUC1 aptameerit [15], [16]. Tulokset osoittivat, että vaikka S2.2 voi sitoutua MUC1-peptidejä (Fig. 2C), se on myös sitoutunut albumiiniin tietyssä määrin (Fig. 2D). Tulokset osoittivat, että verrattuna S2.2, MA3 oli alempi ristireaktiivisuus albumiiniin.

(A) MUC1-peptidi helmiä käsiteltiin MA3. (B) BSA helmiä käsiteltiin MA3. (C) MUC1-peptidi helmiä käsiteltiin S2.2. (D) BSA helmiä käsiteltiin S2.2. Täytetty histogrammit esittävät ohjaus- fluoresoivat signaalit generoidaan FITC-leimatun satunnainen kirjastosta peräisin oleva DNA-allas.

kvantitatiivisesti arvioida sitoutumisaffiniteetti aptameerin on MUC1, jotka on päällystetty MUC1 peptidejä inkuboitiin FITC -leimattuja MA3 eri konsentraatioiden (Fig. 3A). Käyttämällä epälineaarinen regressioanalyysi, aptameeriä havaittiin olevan

K

d 38,3 nM. Edelleen arvioida, onko aptameeri MA3 sitoutuisi MUC1 rakenne, tutkimme myös sen sitoutumisen 29-AA peptidit (GSTAPPAGHGVTSAPDTRPAPGPGSTAPP), joka sisältää koko tandem-toisto-sekvenssin (TAPPAGHGVTSAPDTRPAPGPGS), joka koostuu solunulkoisen MUC1-proteiinin ytimen. 29-AA peptidit konjugoidaan kovalenttisesti magneettiset helmet, jotka inkuboitiin FITC-leimatun MA3 ja analysoitiin virtaussytometrialla. FITC-leimattu random kirjastosta peräisin oleva DNA-altaan käytettiin kontrollina. Kuten on esitetty kuviossa. 3B, MA3 tuotti fluoresenssin signaali, joka oli merkitsevästi voimakkaampi kuin satunnaisesti DNA: n, mikä osoittaa, että aptameerin voisi myös sitoutua rakenne sisälsi koko MUC1 tandem-toisto-sekvenssin. Koska solunulkoinen domeeni MUC1-proteiinin ytimen pääasiassa tehty tandem-toistojen, on mahdollista, että aptameerin MA3 voivat tunnistaa MUC1-rakenne ulkopinnalle MUC1-ilmentäviä tuumorisoluja.

(A) kvantitatiivinen määritys affiniteetin välillä FITC-leimatun MA3 ja MUC1-epitoopin (APDTRPAPG). (B) Virtaussytometrianalyysi sitoutumisen välillä FITC-leimatun MA3 ja 26-AA MUC1-peptidi (GSTAPPAGHGVTSAPDTRPAPGPGSTAPP). Täytetty histogrammi on ohjattu fluoresenssi tausta tuottaman FITC-leimatun satunnainen kirjastosta peräisin oleva DNA-allas.

MA3 aptameerin sitoutuu selektiivisesti MUC1-ilmentäviä tuumorisoluja

arvioida, onko aptameeri MA3 sitoutuisi MUC1-ilmentävien syöpäsolujen, FITC-leimattu MA3 inkuboitiin joko MUC1-positiivisiin (A549 tai MCF7) [21], [22] tai MUC1-negatiivinen (HepG2 tai L02) solulinjat [21], [23]. Solut myöhemmin analysoitiin virtaussytometrialla, käyttäen soluja inkuboitiin FITC-leimatun satunnainen DNA kontrollina. Virtaussytometrianalyysissä profiilit on esitetty kuviossa 4. MUC1-positiivisten solulinjat A549 ja MCF7, MA3 hoidon luotu fluoresenssisignaalit, jotka olivat merkittävästi voimakkaampia kuin satunnaisia ​​DNA hoidon (Fig. 4A ja B). Kuitenkin MUC1-negatiivinen solulinjoissa HepG2 ja L02, MA3 hoito johti fluoresenssin signaaleja, jotka olivat samanlaisia ​​kuin satunnaisia ​​DNA hoidon (Fig. 4C ja D). Tulokset osoittivat, että aptameerin MA3 voi sitoutua ensisijaisesti MUC1-positiivisten syöpäsolujen, ja että aptameeri voi tunnistaa MUC1-rakenne näissä soluissa.

Histogrammit luotiin inkuboinnin jälkeen FITC-leimatun MA3 A549 (A ), MCF7 (B), HepG2 (C), ja L02 (D) solujen, vastaavasti. Täytetty histogrammit esittävät ohjaus- fluoresenssisignaalien FITC-leimattu random kirjastosta peräisin oleva DNA-allas.

MUC1 ilmentyminen vaikuttaa sitoutumisen aptameerin tuumorisoluihin

Jotta voitaisiin edelleen tutkia sitoutuminen aptameerin ja MUC1-positiivisia kasvainsoluja, ekspressio MUC1-proteiinin A549 ja HepG2-soluissa arvioitiin western blot anti-MUC1-vasta-ainetta. Kuten on esitetty kuviossa 5A, samalla kun A549-solut ekspressoivat MUC1-proteiinin runsaasti määrä, HepG2-soluissa ei, mikä viittaa siihen, että A549 oli todellakin MUC1-positiivisen solulinjan ja HepG2 oli MUC1-negatiivinen solulinja. Tulokset ovat yhtäpitäviä useita julkaistuja tutkimuksia, jotka laajasti analysoitu ilmentymistä MUC1 erilaisissa solulinjoissa ja selkeästi A549 kuten MUC1-positiivisten ja HepG2 kuten MUC1-negatiivinen solulinja [18], [24].

(A) Western blot-proteiinin otteita A549-soluja, HepG2-solut, A549-soluja käsiteltiin ohjaus siRNA, ja A549-soluja käsiteltiin MUC1 siRNA, vastaavasti. Aktiini myös blotattiin muodostaa valvonta. (B ja C) Virtaussytometria arviointi apatamer n sitoutumista A549-soluja käsiteltiin MUC1 siRNA (B) tai kontrolli-siRNA (C). Täytetty histogrammit esittävät ohjaus- fluoresenssisignaalien FITC-leimattu random kirjastosta peräisin oleva DNA-allas.

arvioimiseksi vaikutuksen MUC1 ilmaisua aptameerin n sitoutuminen MUC1-positiivisten solujen, käytimme MUC1 siRNA joka oli aikaisemmin osoitettu pystyy kaatamalla MUC1 ilmaisun [18]. SiRNA transfektoitiin MUC1-positiivisten A549-solut, ja se varmistettiin Western blot, että se voisi alas säädellä MUC1 ilmentymistä (Fig. 5A). A549-soluja käsiteltiin joko MUC1 siRNA tai ohjaus siRNA, inkuboitiin FITC-leimatun aptameerin, ja arvioitiin virtaussytometrialla. Kuten esitetään kuviossa 5B ja C, aptameeri sitoutuminen soluihin väheni merkittävästi, kun down-regulation of MUC1 ilmentymisen (Fig. 5B), kun taas sitoutuminen käsiteltyihin soluihin ohjaus siRNA ei ollut vaikutusta (kuvio. 5C). Tulokset viittasivat siihen, että MUC1 ilme kohdesoluihin vaikutti aptameerin n affiniteetti näihin soluihin, ja että menetys MUC1 proteiini voitaisiin vähentää aptameeriin sitova significantl

y

.

lisäys aptameeriä kanssa Dox

jotta toimittaa Dox että MUC1-positiivisia kasvainsoluja, aptameeristä-doksorubisiini kompleksi (Apt-Dox) muodostettiin interkalatoivista doksorubisiinin osaksi DNA rakenteeseen MA3 aptameerin. Sen arvioimiseksi, Dox todellakin sisällytettiin MA3, olemme käyttäneet ilmiö, että fluoresenssin Dox olisi sammutettiin työntymällä DNA [25]. Erityisesti meidän suorittaa -sitoutumistutkimukset välillä MA3 ja Dox, ja työllisten fluoresenssispektroskopia arvioida fluoresoiva signaali syntyy doksorubisiinin. Kuten on esitetty kuviossa 6A, juokseva pienenee natiivissa fluoresenssispektriä Dox havaittiin, kun kiinteä pitoisuus Dox inkuboitiin yhä moolisuhde MA3 aptameerin. Kun aptameeriin /DOX moolisuhde saavutti 0,1, fluoresenssispektriä Dox oli alimmalla tasolla ei muuttunut edelleen, mikä osoittaa, että suurin osa DOX oli sisällytetty DNA rakenne MA3 tässä aptameeriin /DOX suhde.

(A) fluoresenssispektrit doksorubisiiniliuosta sekoitetaan yhä moolisuhteet MA3 aptameerin (ylhäältä alas: 0, 0,001, 0,003, 0,005, 0,01, 0,03, 0,1, ja 1). (B) A549-soluja käsiteltiin FITC-leimatun MA3 aptameeri. (C) A549-soluja käsiteltiin FITC-leimatun Apt-Dox. Täytetyt histogrammit edustavat ohjaus fluoresenssisignaalien FITC-leimatun satunnainen kirjastosta peräisin oleva DNA-altaan.

tutkimiseksi, intercalation doksorubisiinin osaksi Aptameerin häiritsisi aptameerin n affiniteettia MUC1-positiivisia kasvainsoluja , sitoutuminen Apt-Dox monimutkainen A549-soluja arvioitiin virtaussytometrillä, ja verrattuna MUC1 aptameerin yksin. Kuten kuviossa 6B on esitetty, ja C, Apt-Dox-kompleksia (Fig. 6C) oli affiniteetti A549-soluja, jotka oli samanlainen MUC1 aptameerin yksinään (Fig. 6B). Tulokset viittasivat siihen interkalaation Doksorubisiinin osaksi MUC1 aptameeriin ei merkittävästi häiritse sitoutumisen aptameerin ja MUC1-positiivisia kasvainsoluja.

Aptameerit kuin ajoneuvoja selektiivisen doksorubisiinin MUC1 positiivisten syöpäsolujen

epäselektiivisten otto vapaan Dox sekä syövän ja normaalit solut on ensisijainen syy sen haittavaikutusten normaalia kudosta vastaan. Kun Dox on interkaloituina osaksi DNA rakenteeseen MUC1 Aptameerin (Apt-Dox), kompleksi voi sitoutua valikoivasti MUC1-positiivisten syöpäsolujen. Tämän testaamiseksi postulate, fluoresenssi ominaisuuksia doksorubisiinin käytettiin arvioimaan lääkkeen oton joko MUC1-positiivisten (A549) tai MUC1-negatiivinen (HepG2) solut. Soluja inkuboitiin erikseen ilmaisella Dox tai Apt-Dox ja analysoitiin konfokaalimikroskopialla. Tulokset osoittivat, että punaisen fluoresenssin lääkeaineen oli yhtä vahva kahdessa solulinjassa käsitelty vapaa Dox (Fig. 7A ja B), mikä osoittaa, että otto vapaan Dox nämä solut oli ei-selektiivisiä. Sitä vastoin, kun soluja käsiteltiin Apt-Dox, fluoresenssi in MUC1-positiivisten A549-solut oli merkittävästi korkeampi kuin MUC1-negatiivinen HepG2-soluissa (kuvio. 7C ja D), ja että otto lääkeaineen HepG2-soluissa oli selvästi vähentynyt. Tulokset viittasivat siihen, että Apt-Dox näytteillä solu-spesifisyys ja voitaisiin selektiivisesti tarttunut MUC1-positiivisten solujen. Mielenkiintoista, solunsisäistä jakelua lääkkeen A549 oli lähinnä rajoittuu ytimet ilmaisen Dox ja laajennettava sytoplasmaan asettamisessa Apt-Dox, mikä viittaa siihen, että mekanismit oton vapaan Dox ja Apt-Dox saattaa olla erilainen.

(A-D) CLSM kuvia A549 ja HepG2-solujen inkubaation jälkeen vapaa doksorubisiinia (A ja B) tai Apt-Dox (C ja D) 2 tuntia. (E ja F) Virtaussytometria histogrammi profiilit A549 (E) ja HepG2 solut (F) kanssa inkuboinnin jälkeen joko vapaa doksorubisiini (mustat käyrät) tai Apt-Dox (harmaa käyrät). Täytetty histogrammit ovat ohjaussignaalit muodostetaan käsittelemättömissä soluissa.

edelleen tutkia, Apt-Dox voidaan selektiivisesti ottaa ylös MUC1-positiivisten solujen virtaussytometria käytettiin myös seurata fluoresenssin doksorubisiinilla inkuboinnin jälkeen molemmat solulinjat ilmaisella Dox tai Apt-Dox. MUC1-positiivisten A549-soluja, fluoresoivat signaalit tuottamat vapaa Dox tai Apt-Dox olivat samanlaisia ​​(kuva. 7E); kun taas MUC1-negatiivisten HepG2-soluissa, fluoresoiva signaali syntyy Apt-Dox oli huomattavasti alhaisempi kuin tuottamat vapaa Dox (Fig. 7F). Tulokset jälleen ehdotti, että Apt-Dox voitaisiin selektiivisesti tarttunut MUC1 positiiviset syöpäsolut. Yhdessä meidän mikroskopia ja virtaussytometrialla tietojen mukaan aptameeriin MA3 voi toimia välineenä kohdistettu annostelu Dox että MUC1-positiivisten syöpäsolujen.

Apt-Dox vähentää selektiivisesti sytotoksisuuden MUC1-negatiivisten syöpäsolujen

Koska doksorubisiinin imeytyminen väheni MUC1-negatiiviset solut käsiteltiin Apt-Dox, on mahdollista, että sytotoksisuus näihin soluihin olisi myös pienentynyt. Testaa olettamus,

in vitro

sytotoksisuuden aiheuttama Apt-Dox tai vapaa Dox verrattiin HepG2 ja A549 solulinjoissa. Kuten esitetään kuviossa 8A, MUC1-negatiivinen HepG2-soluissa, sytotoksisuus syntyy Apt-Dox todellakin laski verrattuna syntyy vapaa Dox (P 0,01). Kuitenkin MUC1-positiivisten A549-solut, mitään eroa ei havaittu välinen sytotoksisuuden tuottamat Apt-Dox tai vapaa Dox (Fig. 8B). Tulokset viittaavat siihen, että Apt-Dox pyrkii vähentämään vahinkoja MUC1-negatiiviset solut säilyttäen teho doksorubisiinin vastaan ​​MUC1-positiivisia soluja. On huomattava, että aptameerin yksinään myrkyttömiä kohti molemmissa solulinjoissa, mikä osoittaa, että aptameerin itsessään oli suhteellisen turvallinen soluihin ja että sytotoksisuus johtui pääasiassa doksorubisiinin.

HepG2 (A) ja A549 (B ) soluja arvioitiin tavallisella MTS-määritys 48 tunnin jälkeen edelleen inkuboinnin (keskiarvo ± SD, n = 6).

keskustelu

tehoa kemoterapiaan usein rajoittaa haittavaikutusten sytostaattien jotka vahingoittavat sekä syövän ja normaalit solut. Yksi strategia vähentää haitallisia vaikutuksia kemoterapian on suunnattu lääkeaineen syöpäsoluihin. MUC1 pidetään arvokkaana kohteena ligandi-ohjattu syöpälääkkeiden johtuen sen yli-ilmentyminen useimmissa adenokarsinooman. Täällä tässä tutkimuksessa käyttäen SELEX tekniikkaa ja peptidi epitoopin MUC1 tavoitteeksi, olemme kehittäneet uuden MUC1 aptameeriin (MA3) ja

K

d 38,3 nM. Huomasimme, että MA3 voisi konkreettisesti sitoutua MUC1-positiivisten syöpäsolujen, minimaalisella ristiinreagoinnin albumiiniin (Fig. 1,2,3,4). Lisäksi aptameeristä huumeiden kompleksi (Apt-Dox) muodostettiin interkalatoivista doksorubisiinin osaksi DNA rakenne MA3 Aptameerin (Fig. 6). Tärkeää on, Apt-Dox johti selektiivinen doksorubisiinin osaksi MUC1-positiivisten solujen samalla merkittävästi vähentänyt lääkkeen saanti MUC1-negatiiviset solut (Fig. 7).