Krooninen sairaus

tiivistelmä

gemsitabiini, tehokas aine hoidossa syöpä haima, on kokenut epäonnistumisia monissa tapauksissa toistuvassa hoitosyklin takia syntymistä lääkeresistenssin. Yhdistelmä ravinnon yhdisteiden, joilla on kliinisesti validoitu huumeita on tullut tehokas terapeuttinen lähestymistapa hoitoon haimatuumorien, reagoivat huonosti Gemsitabiinihoidon. Jotta voidaan optimoida mahdollisen synergistisen yhdistelmän Gemsitabiini (GCB) ruokavalion molekyylien Betuilnic happo (BA) ja Thymoquinone (TK), stand-alone IC

50 annosta GCB, BA ja TQ laskettiin haimasyövän solulinjoissa . Kiinteä IC

50 annossuhteessa ravinnon molekyylien yhdistelmänä vähensi IC

50 annosta GCB testattiin GCB kestävä PANC-1 ja herkkä MIA PaCa-2 solujen synergismiksi lisäaineen vasteen ja vihamielisyys, käyttäen CalcuSyn-. Yhdistelmä-indeksi (CI) paljasti, että esikäsittely BA ja TK yhdessä GCB synergistisesti inhiboi syöpäsolujen proliferaatiota

in-vitro

kokeita. Pyruvaattikinaasia (PK) M2 isoformin, lupaava kohde osallisina syövän solujen aineenvaihduntaa, osoitti alassäätöä läsnäollessa TQ tai BA yhdistettynä GCB. GCB BA toiminut valikoivasti kasvaimen mitokondrioita ja laukaisi mitokondrioiden läpäisevyys siirtyminen. Pre-altistuminen solulinjojen, MIA PaCa-2 ja PANC-1, ja TQ yhdessä GCB aiheuttamaa apoptoosia. Siten tehokkuus BA tai TK yhdessä GCB estävän solujen lisääntymistä, apoptoosin ja alas-säätelemään PKM2 heijastaa lupaavaksi haimasyövän hoidossa.

Citation: Pandita A, Kumar B, Manvati S, Vaishnavi S, Singh SK, Bamezai RNK (2014) synergistinen yhdistelmä Gemsitabiini ja Ruokavalion molekyyli indusoi apoptoosia haimasyöpäsoluissa ja alas Säätelee PKM2 Expression. PLoS ONE 9 (9): e107154. doi: 10,1371 /journal.pone.0107154

Editor: Ajay Pratap Singh, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 24, 2014; Hyväksytty: 13 elokuu 2014; Julkaistu: 08 syyskuu 2014

Copyright: © 2014 Pandita et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Kirjoittajat eivät tuki ja rahoitus raportoida.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

yrityksiä on ollut madeto parantavat tehokkuutta kliinisesti validoitu lääkkeiden yhdistelmä hoito parantaa niiden vaste kohti tulenkestävien kasvaimia, kuten haimasyövän [1]. Rinnalla 5-fluorourasiili, gemsitabiini (GCB), joka on laajalti käytetty kemoterapeuttisen lääkkeen haimasyöpä, on osoittanut epäonnistumiset toistuvassa hoitosyklin takia syntymistä Lääkeresistenssin [2], [3]. Hoitoon haiman kasvaimia, jotka reagoivat huonosti Gemsitabiinihoidon on haaste onkologit. Ponnistelut, kuten muissa syövissä, kohdistaa avainprosessit, kuten syöpää aiheuttavaksi aineenvaihdunta, solunjakautumisen, erilaistuminen, apoptoosi, haimasyövän kehitys on herättänyt kiinnostusta ruokavalion phytochemicals mahdollisten syövän kemopreventiossa. Mekanistinen yhteys ruokavalion ja haimasyövän tulee sen pitkän tunnustettu keskinäinen [4]. Yksi tällainen ravinnon aine, jota voitaisiin käyttää yhdessä GCB hoitoon haimasyöpä, on betuliinihappo (BA), joka on luonnossa esiintyvä pentasyklinen-triterpeenistä erilaisia ​​biologisia vaikutuksia, mukaan lukien voimakas antituumoriominaisuuksia [5]. BA sisältyy ulomman kuoren eri kasvien koko kasvikunnan, myös valkoinen-haukkui koivuja [6], jolla on tulehdusta, anti-virus ja anti-neoplastisia toimintaan [7]. Syövän vastaista aktiivisuutta BA on yhdistetty sen kykyyn suoraan laukaista mitokondrion kalvon läpäiseväksi, keskeinen tapahtuma apoptoottisen prosessin nostamalla toivoa ohittaa vastuksen perinteisille kemoterapeuttisia [6]. Thymoquinone (TQ), toinen mahdollinen syövänvastainen-nutraceutical aine, on bioaktiivisten yhdisteiden johdettu musta siemen (

ryytineito

) öljyä. Vuonna kansanperinne lääke, kulutus TK siemenet on liittynyt erilaisia ​​terapeuttisia etuja astmaa, punatauti, päänsärky, ruoansulatuskanavan ongelmia, ihottuma, kohonnut verenpaine ja liikalihavuus [8]. Yhteydessä syövän, TK on raportoitu olevan antiproliferatiivisia vaikutuksia solulinjoissa, jotka ovat peräisin rinta-, paksusuoli-, munasarja-, kurkunpään, keuhkojen, myeloblastinen leukemia ja osteosarkooma [9] – [15]; ja anti-etäpesäkkeitä vaikutus humanpancreatic syöpään. On osoitettu, tukahduttaa migraation ja invaasion PANC-1-solujen annoksesta riippuvalla tavalla [16] ja alas-säädellä NF-kappa B: n ja MMP-9 ilmentymistä. Aikaisemmat tutkimukset ovat myös osoittaneet, biologista aktiivisuutta thymoquinone (TK) haiman syöpäsoluissa

in vitro

. Tämä on osoittanut sen kemiallis-herkistävä vaikutus sen jälkeen, kun ennalta-altistus solujen TQ (25 umol /l) 48 tunnin ajan, jonka jälkeen gemsitabiini tai oksaliplatiini, jolloin 60%: sta 80% kasvun inhibitio verrattuna 15%: sta 25% inhibitioastetta gemsitabiinin tai oxaliplatinalone [17].

Syöpäsolut, pääasiallisesti riippuvainen uudelleenohjelmointi niiden aineenvaihdunnan tarpeisiin, kuluttaa enemmän glukoosia ja tuottaa suuren määrän laktaattia jopa hyvin oxygenized ympäristö; prosessia kutsutaan kuin aerobinen Glykolyysivaiheen tai ”Warburg vaikutus” [18], [19]. Vaikka normaali erilaistuneet solut maksimoida ATP tuotantoa mitokondrioiden oksidatiivisen fosforylaation glukoosia alle happiolosuhteissa, syöpäsolut tuottavat paljon vähemmän ATP glukoosista aerobinen Glykolyysivaiheen. Huolimatta tehottomampaa ATP tuotanto, Glykolyysivaiheen on huomattavasti nopeampaa prosessi syöpäsoluissa [20], [21]. Tässä pyruvaattikinaasia (PK) katalysoi viimeinen reaktio siirto korkean energian fosfaattiryhmän fosfo-enolpyruvate (PEP) ADP, tuottaa ATP: tä ja pyruvaatti joka pelkistetään laktaatti mukaan laktaattidehydrogenaasin (LDH) sytosoliin. Pyruvaattikinaasia (PK) koostuu neljästä isoformien, jotka PKM2 ilmaisee pääasiassa syöpäsoluissa [22]. Nämä ovat: paksusuolen [23], munuaissolukarsinooma [24], keuhkosyöpä [25] ja muut. PKM2 on osoitettu toimivan markkerina: munuaissolukarsinooma (RCC) [26], [27], kivessyöpä [28], rintasyöpä [29], urologiset kasvaimet [30], keuhkokarsinooma, kohdunkaulan syöpä, ja ruoansulatuskanavan kasvaimet [31]; ja sitä on mahdollista havaita ulosteissa potilailla, joilla on maha- ja peräsuolen syöpiä [32]. Viime aiemmin, massaspektrometria on lisäksi osoittanut hallitseva läsnäolo PKM2 sisään: RCC, virtsarakon syöpä, maksasyövän, peräsuolen syöpä, keuhkosyöpä, ja follikulaarinen kilpirauhasen adenoomia [33].

Tässä tutkimuksessa selvitettiin vaikutus BA tai TK kanssa GCB, itsenäisesti ja yhdessä, ihmisen adenokarsinoomasolua, MIA PaCa-2 ja PANC-1, aiheuttaa solukuoleman. Oleva mekanismi niiden toimintaa, erityisesti mitä PKM2 ilmaisun ja toimintaa sekä mitokondrioiden läpäisevyys siirtyminen arvioitiin.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Lines, huolto- ja reagenssit

Ihmisen haiman syöpäsolulinjoissa, PANC-1 ja MIA PaCa-2 hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). Soluja viljeltiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2-ilmakehässä. Glutamiini, HEPESiä tai natriumpyruvaattia lisäravinteet, lisättiin ylläpitämään solujen kasvua. Betuliinihappo (BA), Thymoquinone (TQ), gemsitabiini (GCB), dimetyylitiatsoli-2-yyli-2, 5-difenyyli-tetratsolium-bromidia (MTT), Rodhamine-123 (Rh-123), propidiumjodidia (PI) ja muut kemikaalit (Sigma Chemical Co., USA); yhdessä anneksiini-V-FITC apoptoosin detektioreagenssipakkaus (Cayman Chemical Company), vasta-aineita: Pro-Caspase-3, beeta-aktiini, PKM2, poly-ADP-riboosi-polymeraasi (PARP) (Cell Signaling), hankittiin ja niitä käytettiin tutkimuksessa.

hoito profiilin ja solunelinkykyisyysmääritys

PANC-1 ja MIA PaCa-2-soluja kasvatettiin T-75-pulloihin. Sen jälkeen kun 80%: n konfluenssiin, solut trypsinoitiin ja sentrifugoitiin 100 x g: ssä 5 min. Solupelletti suspendoitiin DMEM-alustassa; ja 2 x 10

5 solua /kuoppa annostellaan Nunclon-96-kuoppaisille tasapohjaisille levyille kiinnittyä 24 tuntia. Solut altistettiin eri pitoisuuksia BA, TQ ja GCB, yksin ja yhdistelminä. Yhdessä kokeissa soluja käsiteltiin ensin ja herkistetty BA tai TK 24 tuntia, minkä jälkeen altistus GCB seuraavan 24 tunnin ajan ja inkuboitiin CO

2-inkubaattorissa 37 ° C: ssa. Solujen elinkyvyn, MTT-liuosta (20 ui 2,5 mg /ml DMEM: ssä) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja viljelyä levyt sekoitettuna varovasti, jonka jälkeen inkuboitiin CO

2-inkubaattorissa 37 ° C: ssa 3 tunnin ajan. Supernatantti imettiin pois ja MTT-formazon kiteet liuotettiin 150 ul DMSO. Levyjä inkuboitiin jälleen 37 ° C: ssa ja sekoitettiin 10 minuutin ajan levyravistajassa. Absorbanssi DMSO liuenneen MTT-formazon kiteet mitattiin 570 nm: ssä. Chemo-herkkyys arvot ilmaistiin% solujen elinkelpoisuutta lääkeaineen pitoisuus, joka esti 50% solujen kasvun; ja IC

50-arvot lasketaan pitoisuus-seuraussuhteista, käyttäen Graph Pad prisma Version 5.00.

Analyysi yhdistetyn lääkkeen vaikutuksia

Drug synergia määritettiin isobologram- ja yhdistelytoimenpiteistä indeksimenetelmiä johdettu mediaanivaikutus periaate Chou ja Talalay [34], käyttäen CalcuSyn ohjelmistoa (Biosoft, versio 2.1). Tiedot on saatu kasvunestoaine kokeissa käytettiin analyysien tekemiseen. Isobologrammimenetelmällä on graafinen esitys farmakologisesta vuorovaikutuksen; ja muodostetaan valitsemalla haluttu murto vaikuttaa solukuolemaan (Fa). Suora viiva vedettiin yhdistämään Fa pistettä piirretty kokeellisesti käytetty kiinteä suhde lääkeainefor- (GCB) ja ravinnon molekyyli (BA tai TK) on X- ja Y-akselit tuottaa isobologrammit. Yhdistelmä datapisteiden putosi linjan edustaa lisäaineen lääkeainetutkimuksissa; katsoo, datapisteet, jotka olivat alle tai yli viivan edustettuina synergiasta tai antagonismia, vastaavasti. Yhdistelmä-indeksi (CI), numeerinen arvo, laskettiin kaavalla [35]: Jos C

A, x ja C

B, X, olivat pitoisuudet lääkkeestä anddrug B, jota käytetään yhdistelmä saavuttaa x% lääkkeen vaikutuksen. IC

x, A ja IC

x, B olivat pitoisuudet yksittäisten aineiden saavuttaa sama vaikutus.

Yhdistelmä-indeksi (CI) menetelmä on matemaattinen ja määrällinen esitys kaksi -drug farmakologinen vuorovaikutusta. Tietojen avulla kasvua estävän kokeiluja ja atk-ohjelmisto, CI-arvot syntyy laajalla Fa tasoja 0,05-+0,90 (5% -90% kasvun esto). CI 1 ilmoitettu additiivinen vaikutus näiden kahden aineet, kun taas CI 1 tai CI 1 osoitti, synergiasta tai antagonismia, vastaavasti.

virtaussytometrianalyysin havaitsemiseksi apoptoosin

1 x 10

5 solua /ml /kuoppa MIA PaCa-2 ja PANC-1 olivat käsitelty BA, TQ, ja GCB yksinään ja yhdistelmänä 48 tuntia. Solut pestiin ja värjättiin anneksiini-V-FITC-vasta ja PI, kohti valmistajan ohjeiden. Flow-Sytometrisen pistekuvaajan määritys suoritettiin ja solut etsitään fluoresenssin voimakkuus in FL-1 (FITC) ja FL-2 (PI) kanavia. Osa solupopulaation eri neljännesten analysoitiin käyttämällä neljännekseen tilastoja. Solut oikeassa alakulmassa neljännekseen, edustaa apoptoosia; ja oikeassa yläkulmassa neljänneksessä, kuolion tai postitse apoptoottisia kuolion [36].

mittaus mitokondrion kalvon potentiaalia

1 x 10

5 solua /ml /kuoppa MIA PaCa-2 ja PANC-1-soluja käsiteltiin BA, TQ, ja GCB yksinään ja yhdistelmänä 12-kuoppalevyllä 48 tunnin ajan. Viimeisen 1 tunnin inkuboinnin jälkeen ennen päättämistä altistuksen, solut värjättiin rodamiini-123 (5 ug /ml). Solut pestiin PBS: ssa ja sentrifugoitiin 100 x g 5 min ja suspendoitiin PBS: ään. Havaitsemaan muutokset mitokondrion transmembraanisen potentiaalin (ψ), seurauksena mitokondrion häiriön, vähenemistä fluoresenssin intensiteetissä analysoitiin virtaus- cytometrically on FL-1channel [37].

valmistaminen kokosolulysaatissa ja immunoblottauksella

Solut, (2 x 10

6/6 ml keski /60 mm kudosviljelymaljalla) altistettiin BA, TQ, ja GCB yksinään ja yhdistelmänä jälkeen 48 tuntia hoidon, kerättiin trypsinisaatiolla ja pestiin PBS.The saatu pelletti hajotettiin jääkylmällä lyysipuskurilla (50 mM Tris pH 8,0, 150 mMNaCl, 5 mM EDTA, 1% v /v Nonidet P-40, 1 mM PMSF ja 1% (v /v) proteaasiestäjäseostabletit) ja pidettiin 30 minuutin ajan jäillä, joiden välissä on salakuuntelu jälkeen 5 minuutin välein. Lysaatteja sentrifugoitiin 12000 g: llä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja supernatantti kerätään immunoblottauksella [38]. Supernatantti joten kerätään kvantitatiivisesti käyttäen bikinkoniini- happoa määritystä (BCA määritys) Kitin Thermo Scientific. Western blot-analyysi, 50 ug kokonaisproteiinia erotettiin SDS-PAGE: 60 V, ja sitten elektro siirrettiin PVDF-kalvolle yön yli 4 ° C: ssa 30 V virtaa. Ei-spesifinen sitoutuminen proteiineihin blokattiin 5% rasvatonta maitoa Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa, joka sisälsi 0,1% Tween-20 (TBST), 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Blotit tutkittiin ensiö- hiiri /kani /vuohen anti-ihmis-vasta-aineita 2 tuntia ja pestiin kolme kertaa TBST: llä. Blotteja inkuboitiin sitten piparjuuriperoksidaasiin konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita 1 tunnin ajan, pestiin jälleen kolme kertaa TBST: llä ja havaitsemat signaalit, käyttäen ECL plus kemiluminoinnilla kit koskevasta röntgenfilmille [38].

PKM2 aktiivisuusmääritys

PKM2 aktiivisuus mitattiin spektrofotometrillä-fotometrisesti (UV-1800, Shimadzu, Japani), käyttämällä NADH /laktaattidehydrogenaasin (LDH), joka on kytketty määrityksessä kuten aiemmin on kuvattu [39].

Statistical analyysi

tiedot suoritettujen kokeiden kolminkertaisena ilmaistiin keskiarvona +/- SD, ellei toisin mainita. Vertailut tehtiin välillä kontrolli- ja testiryhmään, käyttämällä Yksisuuntainen ANOVA (Dunnettin tai Tukey) ja P-arvot 0,01 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

In vitro

yhdistelmä tutkimuksia gemsitabiinin kanssa betuliinihappoa ja thymoquinone

kemiallis-herkkyyden haimasyövän solulinjoissa, MIA PaCa-2 ja PANC-1, kohti huumeiden GCB ja ravinnon molekyylit, BA tai TQ, näkyi solujen kasvun estäminen, lasketaan IC

50 (50% kasvun inhibitio) 48 tuntia; ja verrataan aluksi saadut arvot ohjaus- solulinjassa, FR2. IC

50-arvoja riippumaton hoito kolmessa solulinjoissa, MIA PaCa-2, PANC-1 ja FR2, kerrotaan yksityiskohtaisesti taulukossa 1 (BA: 25 ± 0,9 uM, 23,5 ± 3,5 uM, 50 ± 1 uM; TK 36 ± 0,28 uM, 23 ± 2 pM ja 77 ± 2 pM; GCB 1 ± 0,66 uM, 5,5 ± 2,5 uM ja 0,025 uM). Tulokset analysoitiin Yksisuuntainen Annova-Dunnettin osoittaa merkittävää (p-arvo 0,01) vaikutus hoidettujen, annoksesta riippuvaisella tavalla (kuva 1). Näiden tulosten perusteella, kiinteä lääke suhde valittiin (GCB: BA tai GCB: TK) laajalla lääkeainepitoisuuksien ja käytetään edelleen kokeiluja (kuva 2). Yhdistelmä-indeksi (CI) käytettiin analysoimaan ja vahvistamaan synergiaa havaittiin esikäsittelyn jälkeen solujen ravinnon molekyyli, jonka jälkeen altistuminen GCB 48 tuntia (GCB: BA ja GCB: TK). Cl-arvot, joka tarjoaa kvantitatiivinen mitta aste Lääkeyhteisvaikutuksen, laskettiin CalcuSyn- ohjelmistoa, osoitteessa Fa arvoja 0,50, 0,75, ja 0,90 (taulukko 2). Isobologrammit rakennettu näiden arvojen, jotka edustavat 50%, 75% ja 90% kasvun eston tässä järjestyksessä, niin MIA PaCa-2 ja PANC-1-soluissa (kuvio 3) ja Fa-CI juoni, palvelee Kuva S1. Taulukko 3 esittää CI-arvot Fa 0,50-0,90 ruokavalioon molekyylien (BA tai TQ) ja huumeiden (GCB). Vertailu monoterapian (BA, GCB, TQ) yhdistelmähoitoa (CI

(GCB: BA) ja CI

(GCB: TQ)) osoitti merkittävää eroa p-arvo 0,01. ED arvot isolobologram MIA PaCa-2 ja PANC-1 mainitaan taulukossa S1. In MIA PaCa-2-soluissa, herkistetty BA ja seurasi GCB altistuminen, CI

(GCB: BA) saadut arvot annoksina (6.25:0.082 ja 25:0.33) olivat 0,519, 0,889. Kanssa TQ, CI

(GCB: TK) annoksina (4.5:0.082, 9:0.15 ja 36:0.66) osoitti arvot 0,721, 1,050, 0,681. Kuitenkin PANC-1 CI

(GCB: BA) at (5:1.3 ja 20:5.2) annoksina osoitti 0,766, 0,429 ja TK CI

(GCB: TK) annoksina (6.25:1.3 ja 25:5.3), arvot olivat 0,736, 0,371. CI arvot 1; 0,5 ja 1, edusti synergismiksi epätehokkaalla ja antagonistinen vaikutus, vastaavasti. Synergiaa havaittiin laajalla konsentraatioalueella sekä tutkittiin haiman kasvainsolulinjat. Tehostemateriaalit lääkeyhdistelmä eli CI (yhdistelmä indeksi) CI

(GCB: BA) (25 + 0,33) ja CI

(GCB: TQ) (36 + 0,66) in MIA PaCa-2cell line ja CI

(GCB: BA) (20 + 5,25) ja CI

(GCB: TQ) (25 + 5,25) in PANC-1, joka edustaa Fa arvo 0,75 (näytetään 75% estäminen), käytettiin muualla määritykset . Kuitenkin normaali solulinja käytetään tutkimuksessa (FR2), vertailun kontrollina, osoitti inhibitiota Fa arvo 0,75-,90. Tuloksemme osoittivat, että vaikutus ravinnon molekyylien (BA tai TK) normaalissa soluissa havaittiin korkean pitoisuuden; kun taas vain minimaalinen annos GCB oli tarvitaan soluproliferaation inhibointi. Mikäli yhdistelmä tutkimusten kokonaisvastuut gemsitabiinin syöpäsoluihin oli vain 24 tuntia.

IC

50

arvo laskettiin

Ihmisen haima adenokarsinooma

solulinjoja (A) MIA PaCa-2 (B) PANC-1 ja (C) Normaali solulinjaa FR2: yksittäisten hoitoon Gemsitabiini Thymoquinone ja betuliinihappoa 48 tuntia (** merkittäviä kuten compaired ohjaamaan p-arvossa 0,01, n = 3) välissä kolmen solulinjoista.

(A) MIA PaCa-2 ja (B) PANC-1 solut altistettiin arvostellaan pitoisuuksia betuliinihapon, Thymoquinone tai gemsitabiini joko yksinään tai yhdistelmänä kiinteällä annoksella suhde betuliinihapon vs. gemsitabiini ja Thymoquinone vs. Gemsitabiini 48 tuntia. (Gemsitabiini

ottaa altistus 24 tunnin vain, jos yhdistelmä), gemsitabiini (neliöt),

betuliinihappoa ja Thymoquinone

(ympyrä) gemsitabiini + betuliinihappoa ja gemsitabiini + Thymoquinone (kolmio). (Mono terapia ( BA, GCB, TQ) Versus yhdistäminen (CI

(GCB: BA), CI

(GCB: TQ)) (**, merkittävää eroa p-arvo 0,01, n = 3).

(A ja B) Näytetään isolobolograms analyysi yhdistelmä gemsitabiinin, betuliinihappo tai Thymoquinone in, (A) MIA PaCa-2-solut, joilla on kiinteä lääkeaineen suhde 1:0.01 of GCB : BA ja GCB: TQ

(B) PANC-1-solut kiinteällä lääkeaineen suhde 1:0.2 of GCB: BA ja GCB: TQ. Yksittäiset annokset gemsitabiinin, betuliinihappoa ja Thymoquinone, saavuttaa 90% (suora viiva) kasvun esto (Fa = 0,90), 75% (väliviivalliset viiva) kasvun esto (Fa = 0,75), ja 50% (ristit) kasvun estäminen ( fa = 0,50) on piirretty x- ja y-akselit. Yhdistelmä-indeksi (CI) arvot laskettiin käyttäen CalcuSyn- ohjelmistoa edustaa pistettä edellä (indicating- vastakkainasettelusta huumeet) tai alapuolelle rivit (indicating- synergia). (X symboli) ED 50, (plusmerkki) ED75 ja (avoin pisterengasta) ED90 (Monoterapia (BA, GCB, TK) verrattuna yhdistelmät (CI

(GCB: BA), CI

(GCB: TQ)) (***, merkittävää eroa p-arvo 0,001, n = 3).

mitokondrion kalvon potentiaalia

BA tai TQ esikäsitelty MIA PaCa-2 ja PANC-1-soluissa yhdessä GCB, yhdessä ja erikseen, kun analysoitiin Rh-123 oton virtaus cytometery, näytetään menetys 11% ja 17% mitokondrio kalvo Potential (MMP) , in MIA PaCa-2-soluja käsiteltiin 0,33 uM ja 0,66 uM GCB, vastaavasti. Vaikka yhdistelmä, CI

(BA: GCB), thedecrease oli 77% verrattuna kontrolliin (p-arvo 0,001) (kuvio 4A). kuitenkin PANC-1-solut, jotka ovat suhteellisen resistenttejä GCB verrattuna MIA PaCa-2, laskua oli 74% BA yksinään ja yhdistelmänä, CI

(GCB: BA), vähennys oli up to46%, verrattuna kontrolliin (p-arvo 0,001). käsittely yksittäisten annos GCB eli 5,25 uM, väheni jopa 13% (kuvio 4B). TQ yksin tai yhdessä GCB ei osoittanut mitään muutosta MMP sekä solulinjoissa. Ilmeisesti BA equi-voimakkaasti kohdistettu mitokondrioiden toimintoja kuin TQ ja GCB, molemmissa solutyypeissä. Kun käsittelemätön kontrolli solut, lähes kaikki solut olivat bio-energeettisesti aktiivinen, mistä on osoituksena suuri Rh-123 fluoresenssin.

(A) MIA PaCa-2: betuliinihappo

yksin ja yhdistettynä CI

(GCB: BA) kanssa Gemsitabiini aiheuttama mitokondrion kalvon potentiaali (ψ), jota ei ole havaittu Thymoquinone ja Gemsitabiini ei yksinään eikä yhdistelmänä CI

(GCB: TQ). Solut värjättiin rodamiini-123 (5 mg /ml) 1 tunnin ajan ja analysoitiin FL-1 kanava virtaussytometrin. Data kaikissa kuvioissa edustavat yksi kolmesta vastaavia kokeiluja. (B) Vastaavat tutkimukset suoritettiin PANC-1-solulinjassa, betuliinihappo yksinään indusoi enemmän mitokondrion kalvon kuin yhdistettynä Gemsitabiini CI

(GCB: BA) myös menettämättä mitokondrion kalvon havaittiin, kun hoidettiin Thymoquinone ja gemsitabiini yksin tai yhdessä CI

(GCB: TQ) 48 tunnin ajan. (valvonta jakeet Monoterapia (BA, TQ, GCB) ja valvonnan jakeet yhdistäminen (CI

(GCB: BA), CI

( GCB: TQ)), (***, merkittävää eroa p-arvo 0,001, n = 3).

virtaussytometrinen analyysi-pisteytys apoptoottisten solujen, käsiteltiin BA, TQ ja GCB, yksin ja yhdessä

parannettu sytotoksisuus BA tai TQ esikäsittelyn aiheuttaman apoptoosin oli vastattava kysymykseen. BA tai TQ esikäsitelty solut yhdessä GCB, yhdessä ja erikseen, annosvasteisesti riippuvainen kasvu apoptoottisten ja post apoptoottisten solupopulaation sekä haimasyövän solulinjoissa, MIA PaCa-2 ja PANC-1. in MIA PaCa-2, riippumaton hoito BA (25 uM), TK (36 uM) ja GCB (0,33 uM ja 0,66 uM) johti 7%, 5%, 1% ja 2% apoptoosin, vastaavasti. Yhdistelmänä CI

(GCB: BA), tuotti 11% ja CI

(GCB: TQ) tuotti 6% (p-arvo 0,001) apoptoosin, whencompared kontrolloida (kuvio 5A). Samoin PANC1 solulinjassa, BA (20 uM), TK (25 uM) ja GCB (5,25 uM), erikseen tuotettu 9%, 8%, 7% apoptoosin, vastaavasti. Vaikka yhdistelmä, CI

(GCB: BA), ja CI

(GCB: TQ), määrä kasvoi 11% ja 12% (p-arvo 0,001), vastaavasti verrattuna kontrolliin (kuvio 5B) . Hoidossa yhdistelmähoito oli kasvua määrä apoptoosia sekä solulinjoissa. BA tuotti enemmän apoptoottisia vaikutuksia erikseen ja yhdessä GCB kuin GCB ja TQ yksin tai TK yhdistettynä GCB in MIA PaCa-2; kun taas käänteinen havaittiin PANC-1-soluissa.

(A) MIA PaCa-2-soluja (1 x 10

5) inkuboitiin ilmoitetuilla pitoisuuksilla Betuliinihapon, Thymoquinone ja gemsitabiini

yksinään ja yhdistelmänä CI

(GCB: BA), ja CI

(GCB: TQ) varten

48 tuntia ja analysoitiin anneksiiniV-FITC /PI-värjäyksellä määrittää apoptoottista solupopulaatioiden kuvatulla Materiaalit ja menetelmät jaksossa. (B) Vastaavat tutkimukset suoritettiin in PANC-1-solujen hoidon jälkeen osoitetun annoksilla Betuliinihapon, Thymoquinone ja gemsitabiini yksin ja yhdistelmänä CI

(GCB: BA), ja CI

(GCB: TQ) 48 h. (valvonta versus monoterapia (BA, TQ, GCB) ja ohjaus vs. yhdistelmät (CI

(GCB: BA), ja CI

(GCB: TQ)), (***, merkittävää eroa p-arvo 0,001, n = 3).

PKM2 ilmaisun ja Activity

BA tai TQ esikäsittelyä synergistinen annoksella Fa 0,75 ohella GCB yhdistelmänä (CI

GCB: BA ja CI

GCB: TK) 48 tuntia molemmissa haimasyövän solulinjoissa, MIA PaCa-2 ja PANC-1, osoitti laskua inPKM2 proteiinin taso (kuva 6A ja B). Vaikka klo Fa 0.5 eli solut esikäsiteltiin BA (5 uM) ja TK (6,25 uM) yhdessä GCB (1,3 uM) 48 tunnin, laskua havaittiin prokaspaasia 3 ilmaisun ja PARP; ilman mitään vaikutusta on PKM2 lauseke, paitsi maltillinen lasku ilmaisun PKM2 kanssa TQ (kuvio 6C). aktiivisuus PKM2 kuitenkin kasvoi inuntreated MIA PaCa-2-soluissa ja väheneminen käsitellyissä soluissa BA (25 uM) , TQ (36 uM) ja GCB (0,33 uM ja 0,66 uM); joka parannettu yhdistelmä (CI

GCB: BA ja CI

GCB: TQ) (kuvio 7A). Kun taas, jos PANC-1-soluissa, tulokset joten Saatiin päinvastainen un-käsitellyissä soluissa, jotka osoittivat alentunutta aktiivisuutta PKM2 ja lisätä toiminnan käsitellyissä soluissa yksinään tai yhdistelmänä (kuvio 7B).

(A) MIA PaCa-2 ja (B) PANC-1 synergisistä annokset Fa 0,75 Betuliinihapon ja Thymoquinone käytettiin yksinään ja yhdistelmänä CI

(GCB: BA) ja CI

(GCB: TQ), jossa Gemsitabiini.

From blotit havaittiin, että oli laskua ilmaus PKM2, jotka saivat samanaikaisesti annoksina. (C) PANC1 solulinjassa annokset Fa 0,5 Betuliinihapon, Thymoquinone ja gemsitabiini käytettiin yksinään ja yhdistelmänä, ja blotit havaitsimme, että oli laskua prokaspaasia 3 seurasi lasku PARP ja lievää laskua havaitaan Thymoquinone kohdellaan PKM2.

(A) MIA PaCa-2-solut käsiteltiin betuliinihappoa, Thymoquinone ja gemsitabiini yksin ja yhdistelmänä, CI

(GCB : BA) ja

CI

(GCB: TK) 48 tuntia. Pieneneminen aktiivisuuden käsitellyissä soluissa seurannut

lisää

pienentää

yhdessä (s), CI

(GCB: BA) B

ja CI

(GCB: TQ),

verrattuna kontrolli havaittiin;

(B) B

In PANC-1 solulinja päinvastoin oli havaittu. Ohjaus versus monoterapia (BA, TQ, GCB) ja valvonnan versus yhdistelmät (CI

(GCB: BA) CI

(GCB: TQ)), (***, merkittävää eroa p-arvo 0,001, n = 3)

keskustelu

Haiman kasvaimia, jotka reagoivat huonosti Gemsitabiinihoidon haasteen onkologit. Hoitomuodot, jotka ovat käytössä hoitoon haimasyövän ovat osoittaneet pettymyksen teho; ja hankinta lääkeresistenssin kemoterapian aikana on merkittävä haaste. Näin uudet strategiat on otettava käyttöön, jotta voitaisiin kehittää uusia Chemo-ennaltaehkäisevän ja /tai kemoterapia aineina, jotka parantaisivat kliininen tulos tästä taudista. Kasvava todistusaineisto kannustaa käyttämään ruokavalion molekyylien ja ravintolisistä sisällä ruokavalio täydennyssiirrosta vaste standardin kemoterapeuttisia syöpälääkkeitä. Aikaisemmin, flavonoideja on raportoitu inaktivoimiseksi usein vapautettu reittejä, kuten Akt: n ja NF-KB: n, haimasyövän, edistää solujen kasvua, metastaasin ja Chemo vastus. Genisteiini, ravinnon yhdiste, on osoitettu lisäävän antituumorivaikutuksen erlotinibin ja gemsitabiinin kokeellisissa järjestelmissä haimasyövän [40]. Aiemmin se on myös osoitettu, että Garcinol, ravinnon molekyyli, synergizes gemsitabiinihoito estävän solujen lisääntymistä ja indusoi apoptoosia MIA PaCa-2-solujen merkittävää modulaatio keskeisten syövän sääntelyviranomaisten, kuten

PARP

,

VEGF

,

MMP

,

IL:

, kaspaaseiksi, ja

NF-KB

[

41

]. Curcumin, ravinnon komponentti, herkistää haimasyövän gemsitabiiniannokseen

in vitro

ja

in vivo. In vitro

, kurkumiini on osoitettu estävän leviämisen eri haimasyövän solulinjoissa, voimistamaan indusoimaa apoptoosia gemsitabiini, ja estämällä konstitutiivinen NF-KB: n aktivaation soluissa.

In vivo

, kasvaimia nude-hiirissä injektoitiin haimasyöpäsoluissa ja käsiteltiin yhdistelmällä kurkuma ja gemsitabiinin osoittivat merkittävää vähenemistä volyymi (

P

= 0,008 vs kontrolli;

P

= 0,036 vs gemsitabiini yksin) [42]. Meidän kokeissa yhdistetty vuorovaikutus Betuliinihapon (BA) tai thymoquinone (TQ), kaksi neutraceuticals gemsitabiinin (GCB), in GCB-herkkien-MIA PaCa-2 ja GCB-resistenttejä-PANC-1 – haimasyövän solulinjoissa osoitti synergiaa. Elinkelpoisuus määritys paljasti Sytotoksisen vuorovaikutusta GCB ja BA tai GCB ja TK sekä GCB-herkkä ja kestävä solulinjoissa, määritettynä DRI (Dose Reduction Index) on 1 saatu CalcuSyn- [43]. Mekanistisesti, GCB välittää sen sytotoksisia vaikutuksia estämällä korjaus synteesin vaiheessa kautta kanteen ribonukleotidiin-reduktaasi-inhibiittori, heikentävien solunsisäinen deoksi-nukleotidi-altaat, ja parantaa mahdollisuuksia oman sisällyttäminen juuri syntetisoidun DNA: n. Kun sisällytetty DNA, analoginen aiheuttaa päättyminen DNA-synteesiä ja on vastustuskykyinen poiston ekso-nukleaasien, jolloin DNA-säikeen katkoksia. [44] Betuliinihappo (BA), nutraceutical, on osoitettu aiheuttavan apoptoosia mitokondrion polkuja, jos tämän prosessin aikana, sekä mitokondrioiden ulomman ja sisemmän kalvot läpäiseviksi, mikä johtaa vapautumisen liukoisten proteiinien, kuten sytokromi c, Smac tai AIF, mistä mitokondrioiden välitilan sytosoliin [45]. BA myös indusoi deathin useita eri syöpäsolulinjoissa läpi useita reittejä, jotka sisältävät p53-riippumattoman induktion p21 /Waf1, säätely ylöspäin kuolemareseptorien esto spesifisyys proteiinia (Sp) transkriptiotekijöitä [46]. Vastaavasti Thymoquinone (TQ) indusoi apoptoosia kasvainsoluissa useilla mekanismeilla, kuten NF-kB tukahduttaminen, Akt aktivointia ja solunulkoisen signaalin säädelty kinaasi signalointireittien, ja myös estämällä kasvaimen angiogeneesiä [47]. Perusteella ED

50, ED

75 ja ED

90 lääkkeen yhdistelmä, isobologrammit syntyi ja synergian arvioitiin käyttäen CalcuSyn-. Betuliinihappo (BA) tai Thymoquinone (TK) yhdessä gemsitabiinin (GCB), useilla lääkeainepitoisuudet, osoitti, että GCB herkkien-MIA PaCa-2 ja GCB vastustuskykyisten-PANC-1-soluissa, yhdistelmä-indeksi (CI) oli alle 0,88 Fa 0,75 (75%: n vähennys solujen kasvun) in MIA PaCa-2-soluissa. Ottaa huomioon, että kyseessä on PANC-1, yhdistelmä-indeksi (CI) oli alle 0,76 klo Fa 0,5. Biologinen perusta tätä synergiaa oli selvä ero muutoksia apoptoosin sekä ravinnon molekyylit. Vaikka mekaanisesti meidän yhdistelmät ovat ”toisensa ei-yksinomaisen” luonteeltaan mutta sekä ravinnon molekyylit osoittivat merkittävää eroa quantum sytotoksisuuden induktio verrattuna yksinään GCB. Osuus kuitenkin apoptoosin induktion BA yhdistelmänä GCB oli tehokkaampi sekä solulinjoissa, kuin TQ yhdistettynä GCB. Myös vähenevän transmembraaninen mitokondrioiden potentiaali (Ψ) havaittiin, kun BA yksin tai yhdessä GCB toimitettiin sekä solulinjoja. Ei muutosta kuitenkin havaittiin transmembraaninen mitokondrioiden potentiaali (Ψ) kun syöpä solulinjoja käsiteltiin GCB yksin.