Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Eturauhassyöpä (CAP) on toiseksi suurin syy syövän kuolemaan American men. Androgeenien puute hoito on aluksi tehokas Cap hoitoa, mutta CaP toistuu huolimatta kastraattimäärät kiertävän androgen. Jatkuva ilmentyminen androgeenireseptorin (AR) ja sen ligandien on yhdistetty kastraatio-toistuvien kasvuyhtiöt.

Keskeiset löytäminen

Tässä raportissa ligandista riippuvan dominanttinegatiivivaikutus ARΔ142-337 (ARΔTR) ilmennettiin kastraatio-toistuvat CWR-R1 solu- ja kasvainmuodoista valaista rooliin AR signalointi. Expression of ARΔTR laski CWR-R1 kasvaimen kasvua läsnä ollessa ja puuttuessa eksogeenisen testosteronin (T) ja paransi eloonjäämistä, kun läsnä on eksogeenisiä T. oli näyttöä negatiivinen valinta ARΔTR siirtogeenin T-käsitellyissä hiirissä. Massaspektrometria paljasti kastraatio-toistuva CaP dihydrotestosteronin (DHT) tasot riittävä aktivoimaan AR ja ARΔTR. Koska eksogeenisen testosteronin, CWR-R1-ARΔTR ja ohjaus solut osoittivat muuttunut androgeenireseptorin profiilien osallinen epiteelisolujen CaP solujen lähteenä kasvaimensisäisenä AR ligandien.

Johtopäätös

Tutkimus tarjoaa

in vivo

todisteita siitä, että aktivointi AR signaloinnin kasvaimensisäisiä AR ligandeja tarvitaan kastraatio-toistuvia kasvuyhtiöt ja että epiteelin CaP solut tuottavat riittävästi aktiivisia androgeenien Cap uusiutumisen aikana androgeenien puute hoidon. Kohdistaminen intracrine T ja DHT synteesin pitäisi antaa mekanismi estää AR ja kasvua kastraatio-toistuvien korkki.

Citation: Titus MA, Zeithaml B, Kantor B, Li X, Haack K, Moore DT, et al. (2012) Dominant-Negative androgeenireseptorin esto Intracrine androgeeniriippuvaisen kasvu kastraatio-Toistuva Eturauhassyöpä. PLoS ONE 7 (1): e30192. doi: 10,1371 /journal.pone.0030192

Editor: Shree Ram Singh, National Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 14 syyskuu 2011; Hyväksytty 15 joulukuuta 2011; Julkaistu: 17 tammikuu 2012

Copyright: © 2012 Titus et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tukivat PO1-CA77739 ja 2RO1 DK058702-10 National Cancer Institute ja National Cancer Institute Cancer Center Support Grants CA016156 ja CA034026 Roswell Park Cancer Institute ja University of North Carolina, vastaavasti US Public Health Service avustukset HD16910 National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health (NIH), ja Department of Defense Eturauhassyöpä tutkimusohjelma W81XWH-10-1-0273. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (CAP) on yleisin ei-ihosyöpä diagnosoidaan American men. Huolimatta aiemmin havaita ja hoito on kehittynyt, yli 33000 kuolemantapausta ennakoidaan vuonna 2011 [1]. Vuosikymmeniä, androgeenien puute hoito on ollut ensisijainen hoito paikallisesti levinnyt tai metastaattinen korkki. Androgeenien puute hoito on tehokas aluksi mutta remissions ovat väliaikaisia. Korkki, joka toistuu reagoi epätarkasti useimmat hoidot ja lähes kaikki miehet periksi tauti. Molekyyli- rooli androgeenireseptorin (AR) siirtymisessä kastraatio-toistuva korkki on tuettu jatkuva ilmaus AR [2] – [4] ja androgeenin geenien [5].

Monet mekanismit edistää AR transaktivaatiota huolimatta kastraattimäärät kiertävän kivesten androgeenien (tarkastelleet Feldman [6]). Kuitenkin muut tutkimukset myös meidän omat ovat osoittaneet, että kastraatio-toistuvat CaP ylläpitää kudosten tasojen dihydrotestosteroni (DHT) riittävä aktivoimaan AR [4], [7] – [9]. Pysyvät kudoksen testosteroni (T) ja DHT aikana androgeenien puute hoidon voi johtua lisämunuaisen androgeenit, kuten dehydroepiandrosterone (DHEA) ja androsteenidionin [7], mistä androstaanidioli takaoven kautta reitin DHT synteesi [10], [11] ja /tai

de novo

tuotannon kolesteroli [12]. In kastraatio-toistuvat korkki, AR indusoi androgeeniriippuvaisen ilmentymistä eturauhasen antigeeni ja transmembraanisen proteaasi, seriini 2-v-ETS erytroblastoosin virus E26 onkogeeni homologin, TMPRSS2:ERG [13]. Tuoreessa raportissa osoitettiin, että 70% miehistä kastraatio-toistuva CaP vastasi abirateronin asetaatti, sytokromi P450 17α-hydroksylaasin /lyase (CYP17A1) androgeenin biosynteesin estäjä. Antituumorivaikutuksen abirateronin asetaattia kliinisissä tutkimuksissa viittaa siihen, että sytokromi P450 17α-hydroksylaasin /lyaasia (CYP17A1) pienenee ligandi-aktivoitujen AR signalointi kastraatio-toistuvat CaP [14].

CWR-R1-solut, joita käytetään Tässä tutkimuksessa johtuvat kastraation-toistuvat CWR22 vierassiirrettä [15], ilmaista AR-H874Y mutantti [16] ja lisääntyä androgeenin riistää ympäristössä. AR koostuu NH

2-terminaalin transaktivaatiodomeenin, keskeinen DNA: ta sitova domeeni ja karboksyyli-pään ligandia sitovan domeenin (LBD) [17]. AR on täyspitkä in CWR-R1-soluja, jotka ovat peräisin CWR22 ihmisen eturauhassyöpäksenograftista, mutta on altis proteolyyttiselle hajoamiselle uuton aikana merkittävään -80 kDa: n muotoon [18]. AR transkriptionaalinen aktiivisuus välittyy aktivaatiofunktioita NH

2-terminaalin ja LBD. Ainutlaatuinen ominaisuus AR on, että T tai DHT indusoi NH

2- ja karboksipään (N /C) vuorovaikutus [19] välittyy NH

2-terminaalin FXXLF motiivi [20], joka hidastaa ligandi dissosiaatiota ja AR hajoamista. Rooli NH

2-terminaali verkkotunnus geenisäätelyn [21] – [24] on myös raportoitu ei-genomista AR signalointi [25].

Tässä tutkimuksessa, CWR-R1 solut suunniteltu käyttäen lentivirusta yli-ilmentämään ihmisen AR deleetio NH

2-terminaalista aktivointi tähteet 142-337, joka johtaa transkriptionaalisesti inaktiivinen dominantti negatiivinen AR. Ihmisen AR deleetiomutantti ARΔ142-337 (ARΔTR) sitoutuu ligandiin korkealla affiniteetilla, mutta on transkriptionaalisesti aktiivinen puuttuessa tai läsnä androgeenin [26]. Mekanismi hallitseva negatiivinen aktiivisuus on hetero- endogeenisen AR estää transaktivaation kohdegeenien [27]. Tulokset viittaavat siihen, että kasvaimeen T ja DHT synteesi indusoi dominantti negatiivinen ARΔTR esto AR riippuvainen CWR-R1 kasvaimen kasvua. Androgen profiilia ΔTR Transdusoimattomia CWR-R1 kasvaimia puuttuessa T tukevat oletusta, että epiteelin CaP solut tuottavat AR ligandien hiirimallissa matalasta havaittavissa lisämunuaisen androgeenien.

Tulokset

ARΔTR estää AR transaktivaatiota ja CWR-R1 soluproliferaation

vaikutus intracrine androgeenin synteesin ja ARΔTR inhibition endogeenisen AR ja kastraatio-toistuvat CaP kasvu määritettiin CWR-R1-soluja, jotka ovat peräisin kastraation-toistuvat CWR22 ihmisen CaP ksenograftin. CWR-R1-solut oli transdusoitu lentiviruksen ilmentävät ARΔTR tai LacZ kurissa CMV-promoottorin, joissa esiintyi voimakasta ilmentymistä (Fig. 1). Tehoa ARΔTR inhibition AR-transkriptionaalisen aktiivisuuden määritettiin käyttäen MMTV-Luc transfektoitiin lentivirus-transdusoitujen CWR-R1-solujen puuttuessa ja läsnä ollessa 0,1 nM DHT koska prostataspesifinen antigeeni-lusiferaasireportterigeenillä vain heikosti aktivoidaan endogeenisen AR [10], [21], [28]. Lisäksi 0,1 nM DHT LacZ-transdusoitujen CWR-R1-solujen määrä nousi lusiferaasiaktiivisuutta 3-kertaiseksi (Fig. 2). Samoissa olosuhteissa, lusiferaasiaktiivisuuden ARΔTR Transdusoimattomia CWR-R1-soluissa oli alhainen tai ilman 0,1 nM DHT, androgeenien pitoisuus maksimaalisesti stimuloi androgeenisäädellyn geenien CWR-R1 soluihin [29]. Tulokset osoittavat, dominantti negatiivinen vaikutus ARΔTR endogeenisen AR transaktivaatiota MMTV-luc puuttuessa ja läsnä ollessa DHT.

Western blot-analyysi CWR-R1-proteiinin lysaatit (20 ug) osoitti, että endogeeninen AR (M

r 110 kDa, kaistat 1-2) havaitaan sekä ARΔTR ja LacZ transdusoitiin CWR-R1-soluihin käyttämällä AR vuohen polyklonaalista vasta-ainetta. LacZ (M

r 60,5 kDa, kaista 1) ekspressio havaitaan vain LacZ-transdusoitujen CWR-R1-soluissa käyttäen LacZ kanin polyklonaalista vasta-ainetta ja ARΔTR (M

r 84 kDa, vyöhyke 2) ekspressio havaitaan käyttämällä AR vuohen polyklonaalinen vasta-aine in ARΔTR Transdusoimattomia CWR-R1-soluja. Endogeeninen β-aktiini havaittiin käyttäen β-aktiini AC-15 hiiren monoklonaalinen vasta-aine (M

r 43 kDa, kaistat 1 ja 2) ja toimi lastaus ohjaus sekä ARΔTR ja LacZ-transdusoitujen CWR-R1-soluja.

CWR-R1-solut transfektoitiin lyhytaikaisesti MMTV-lusiferaasireportteri- ja lusiferaasiaktiivisuus läsnä ollessa ja poissa ollessa DHT. Kun läsnä on 0,1 nM DHT, CWR-R1 solut, jotka ilmentävät LacZ-siirtogeenin osoitti kasvua MMTV-lusiferaasi-reportteriaktiivisuuden kontrollisoluihin verrattuna ilman DHT. Expression of ARΔTR vähentää MMTV-lusiferaasireportteri aktiivisuuden puuttuessa tai läsnä ollessa 0,1 nM DHT verrattuna LacZ-transdusoitujen kontrollisoluihin. Pylväät edustavat keskiarvoa lusiferaasiaktiivisuus suhteellisissa valoyksiköitä 3 erilliselle kokeelle; baareja ± keskihajonta.

esto endogeenisen AR transaktivaatiota ARΔTR ilman lisättyä DHT nosti esiin mahdollisuuden, että endogeenisen AR-ligandien indusoimaa ARΔTR dimerisaatio [30] ja hetero- välillä ARΔTR ja täyspitkän endogeenisen AR [31]. Nestekromatografia tandem-massaspektrometrialla analyysi osoitti, 3,38 ± 0,26 fmol T /miljoonaa solua (n = 4), ja 1,84 ± 0,16 fmol DHT /miljoonaa solua (n = 4) (Fig. 3). Koska AR dimeroituminen ja DNA: ta sitovan ovat androgeeni-riippuvaisia ​​[30], tulokset ehdottivat, että ARΔTR inhiboiva aktiivisuus voi toimia korvikkeena indikaattorina solunsisäistä aktiivisen androgeenien.

DHT mitattiin CWR-R1-soluja kasvatettiin ilman media täydentää tai eksogeeninen T käyttämällä nestekromatografia tandemmassaspektrometrian. Tyypillinen kromatogrammi DHT (vasen paneeli, DHT piikki 7,26 min) käyttäen 10000000 CWR-R1-soluja (n = 4). Keskimääräinen pitoisuus DHT oli 1,84 ± 0,16 fmol /miljoonaa CWR-R1 soluissa. Ohjaus kalibraattori kromatogrammi DHT standardi osoittaa piikki 7,29 min (oikea paneeli).

vaikutus ARΔTR androgeenista riippuvainen Nkx3.1 geenin ilmentymistä [32] arvioitiin edelleen luonnehtia estoaktiivisuus ARΔTR on AR signalointi. Lisäksi DHT laski Nkx3.1 proteiinin tasot ARΔTR Transdusoimattomia CWR-R1-solut (Fig. 4), mutta lisääntyi Nkx3.1 proteiinin LacZ-transdusoitujen CWR-R1 kontrollisoluihin. Lisäksi DHT kasvoi CWR-R1-LacZ soluproliferaatiota, mutta ei ollut lisäystä ARΔTR Transdusoimattomia CWR-R1 solujen lisääntymistä. Ilman lisättyä DHT, sekä LacZ- ja ARΔTR Transdusoimattomia CWR-R1-solut osoittivat vähäistä lisääntymistä (Fig. 5).

immunoblot-analyysi CWR-R1 solun proteiinin lysaatit (20 ug) määritettiin Nkx3.1 proteiinin ilmentymisen käyttäen vuohen polyklonaalista vasta-ainetta läsnä ollessa tai poissa ollessa 1,0 nM DHT. Nkx3.1 (M

r 35,5 kDa) proteiinin lisääntynyt LacZ-transdusoitujen CWR-R1-soluja, joihin on lisätty DHT (kaistat 1 ja 2). ARΔTR Transdusoimattomia CWR-R1-solut osoittivat laski Nkx3.1 proteiinin ilmentymisen läsnä ollessa DHT (kaistat 3 ja 4). Endogeeninen β-aktiini (M

r 43 kDa) käytettiin latauskontrollina (kaistat 1-4).

Solujen proliferaatio määritettiin käyttäen XTT

R määritys ja seuraamalla absorbanssia 490 /690 nm kolmena kappaleena päivästä 1 päivään 8 (keskiarvo ± keskihajonta). CWR-R1 solut, jotka ilmentävät ARΔTR (solid timantti ja musta viiva) tai LacZ (täytetty neliö ja harmaa viiva) siirtogeenin puuttuessa 0,1 nM DHT osoitti samanlaista kasvukäyrät (ylempi paneeli). Kun läsnä on 0,1 nM DHT, ARΔTR Transdusoimattomia CWR-R1 solujen kasvua laski verrattuna LacZ-transdusoitujen ohjaus CWR-R1-soluja (alempi paneeli).

ARΔTR estää CWR-R1 kasvaimen kasvun

LacZ tai ARΔTR Transdusoimattomia soluja injektoitiin paljaisiin hiiriin tuottaa CWR-R1 kasvaimia arvioida ARΔTR kasvaimen kasvua ja endogeenisen AR signalointi. Kasvaimen kasvunopeudet muuttunut ARΔTR ilme. Tiukka sekoitettu mallinnus tilastollinen analyysi, joka käsitteli yksittäisen kasvaimen kehityskaaret osoittaneet merkittäviä eroja 4 ryhmää (Fig. 6). Kasvunopeus LacZ valvonnan erimielisiksi eksogeenisen T (p = 0,04) (Fig. 6A ja 6B), joka osoitti erilaisia ​​tarkastuksia tarvittiin kaksi ARΔTR koeryhmään. ARΔTR vähensi kasvainten kasvu kontrolleihin verrattuna, vaikutus, joka oli samanlainen ilman (p = 0,01) tai eksogeenisen T (p = 0,0004) (Fig. 6C ja 6D). Tulokset olivat samanlaisia, kun kasvaimen kasvu arvioitiin käyttämällä kahta lisäparametreja. LacZ ja LacZ + T valvontaa erosivat kulmakerroin (p = 0,01) ja kaksinkertaistaa ajan (p = 0,02), mikä vahvisti tarvetta eri säädöt kaikille ARΔTR koeryhmän. T täydentää optimoida ARΔTR toiminto laski kasvaimen kasvua verrattuna kontrolleihin rinne (p = 0,004) ja kaksinkertaistaa ajan (p = 0,0007). Ilman T lisäravinteet, kasvaimen kasvua kulmakerroin (p = 0,07) ja kaksinkertaistaa ajan (p = 0,37) olivat samanlaiset. Tarkastus yksilön tuumorin liikeradat ja todellisen kasvainten ehdottivat, että vaikutus ARΔTR oli yhdistelmä hidastaa kasvunopeuden ja puhkeamisen viivyttämiseksi kasvaimen kasvua, ja että tämä vaikutus esiintyi useammin, kun eksogeenistä T on järjestetty voimistaa ARΔTR (Fig. 6E).

Kasvaimet mitattiin käyttämällä digitaalista jarrusatulat ja tilavuudet lasketaan päivästä 14 päivään 160 jälkeen CWR-R1 soluinokulaation. Tuumoritilavuudet, LacZ (A, n = 22), LacZ + T (B, n = 21), ARΔTR (C, n = 21) tai ARΔTR + T (D, n = 21), on esitetty päivästä 21, kun kasvu alkoi kautta päivä 96, jonka jälkeen vain 1 hiiren kussakin ryhmässä säilyi. Mixed mallinnus tilastollinen analyysi osoitti tilastollisesti merkittävää eroa välillä 4 ryhmää. ARΔTR Transdusoimattomia CWR-R1 kasvaimen kasvu oli vähäisempää kuin LacZ ohjaa puuttuessa (p = 0,01, paneeli A vs. C) tai läsnä ollessa (p = 0,0004, paneeli C vs. D) T. (E) Ennustettu keskimääräinen CWR-R1 kasvainten (cm

3) piirrettiin kun ensimmäinen kasvain sadon LacZ + T (avoimet neliöt), LacZ (avoimet vinoneliöt), ARΔTR + T (kiinteät ympyrät) ja ARΔTR (avoimet ympyrät) ryhmät . ARΔTR-ilmentävät CWR-R1 kasvaimet (ympyrät) osoittavat laski kasvu verrattuna LacZ-transdusoitujen CWR-R1 kontrollisoluihin.

ARΔTR aiheuttamat muutokset kasvaimen kasvu vaikutti myös Lopetusajankohtana määräytyy kasvaimen koko on suurempi kuin 1,5 cm

3 (Fig. 7, Kaplan-Meier juoni, taulukko 1, Log rank analyysi, p = 0,009). 95%: n luottamusväli keskimääräinen aika eutanasia päivinä ja alueella kunkin ryhmän oli LacZ (71, 68-84 päivää), LacZ + T (63, 57-68 päivää), ARΔTR (75, 68-89 päivää) ja ARΔTR + T (89, 68-105 päivää). ARΔTR lisäsi aika isännöidä mediaani eutanasia 36% läsnä eksogeenisten T, mutta oli vähän vaikutusta ilman eksogeenista T. Mediaaniaika eutanasia kasvoi 5% ilman eksogeenisten T, ero, joka ei ollut tilastollisesti merkitsevä.

Day eutanasian perustui 1,5 cm

3 kasvaimen koon hiirissä LacZ + T (katkoviiva, n = 21), LacZ (katkoviiva, n = 22), ARΔTR (yhtenäinen viiva, n = 21) tai ARΔTR + T (katkoviiva, n = 21) ryhmät. Keskimääräinen elinaika oli erosivat ryhmissä, jotka saivat eksogeenistä T (katkoviiva vs. katkoviivalla, p = 0,008), mutta ei ryhmissä ilman T (yhtenäinen viiva vs. pisteviiva, p = 0,34).

Negatiivinen valinta ARΔTR in CWR-R1 kasvaimia

samanlainen aika eutanasian perustuu kasvaimen koon välillä CWR-R1-ARΔTR ja LacZ hiiret ilman androgeenin ehdotti, että ARΔTR solut valitsemalla vastaan ​​ARΔTR ilmaisu . Voit testata Tämän ARΔTR ja LacZ vektori kopioluku ja proteiinin ilmentyminen määritettiin CWR-R1 kasvaimia. ARΔTR tai LacZ vektorikopioiden numeroita ja proteiinin ilmentyminen määritettiin transdusoiduissa CWR-R1 solut ennen siirrostuksen ja aikaan kasvaimen satoa. ARΔTR tai LacZ vektorin kopiomäärän solua kohti mitattuna CWR-R1-transdusoidut solut ennen siirrostusta perustuva PCR-monistus Woodchuck hepatiittiviruksen posttranskriptionaalisella säädin elementti oli 5,46 ja 4,53, tässä järjestyksessä. Keskiarvo (± keskihajonta) vektorin kopiomäärä per solu ARΔTR ja LacZ Transdusoimattomia CWR-R1 kasvaimia aikaan sato oli 0,49 ± 0,58 ARΔTR + T ja 2,58 ± 1,68 varten ARΔTR (p = 0,001), ja 3,10 ± 1,77 LacZ + T ja 3,48 ± 1,45 LacZ (p = 0,4) (Fig. 8).

vector kopiomäärän solua kohti määritettiin käyttämällä kvantitatiivista PCR on Woodchuck hepatiittiviruksen transkription jälkeisen säädin elementti. Keskimääräinen vektori kopioluku solua kohti on 0,49 ± 0,58 ARΔTR + T, 2,58 ± 1,68 varten ARΔTR, 3,10 ± 1,77 LacZ + T ja 3,48 ± 1,45 LacZ kasvaimia. Tilastollisesti merkittävä väheneminen vektori kopioluku solua kohti havaittiin ARΔTR + T vs ARΔTR kasvaimet (p = 0,001), mutta ei LacZ + T vs. LacZ (p = 0,4) kasvaimia.

Luonnehtia edelleen vaikutusta ARΔTR annetun vektorin kopiomäärä, suhteet vektorin kopiomäärän solua kohti CWR-R1 solut laskettiin aikaan kasvaimen sadonkorjuun ja tuolloin ennen CWR-R1 soluinokulaation varten ARΔTR ja LacZ kasvaimia läsnä ja Koska T. tilastollinen analyysi mediaani vektorin kopiomäärä per kasvainsolu tunnusluvut ARΔTR ja LacZ ilmentävät vektorit osoittivat, että ARΔTR ekspressiovektorikasetin valittiin vastaan ​​(p = 0,006, Kuva. 9A). Samanlainen tilastollinen tulos saatiin mediaani vektorin kopiomäärä per kasvainsolu suhde ARΔTR ja LacZ ilmentävät vektorit läsnä ollessa T (p 0,0001, Fig. 9B). Kaiken ARΔTR Transdusoimattomia CWR-R1-solujen läsnä ollessa tai ilman eksogeenisiä T valitaan vastaan ​​ARΔTR vektori verrattuna LacZ vektori valvontaa.

suhteet (A) ARΔTR ja LacZ, ja (B) ARΔTR + T ja LacZ + T laskettiin käyttäen vektorin kopiomäärä mitattiin ajankohtana kasvaimen sadonkorjuun vs. vektorin kopiomäärä mitataan ennen siirrostusta. Yksittäiset kasvain vektori kopiomäärä per solu suhde kustakin kohortti esitetään käyttämällä avoimet ympyrät. Mediaani Vektori kopioluku suhde (kiinteä ympyrä) määritettiin ARΔTR (0,43), LacZ (0,64), ARΔTR + T (0,05), ja LacZ + T (0,6) kasvaimia. ARΔTR siirtogeeni valittiin vastaan ​​puuttuessa (p = 0,006) ja läsnä ollessa (p 0,0001) eksogeenisten T verrattuna LacZ ohjaa.

Muuttunut mediaani ARΔTR ja LacZ vektori kopioluku per kasvainsolu suhteet ehdotettu laski ARΔTR proteiinin ilmentymisen verrattuna LacZ valvontaa. Hakkuut CWR-R1 kasvaimista riittäviä määriä kudoksen (79 kasvaimet) analysointia varten endogeenisen AR ja ilmaisi ARΔTR tai LacZ-proteiinia analysoitiin immunobloteissa. Endogeenistä AR ja ARΔTR proteiinin osoitettiin pTK989-ARΔTR transdusoitujen CWR-R1-solujen kanssa ennen ihonalaista inokulaation jälkeen. ARΔTR Transdusoimattomia CWR-R1 kasvaimia läsnä T (Fig. 10 A), ilmaistuna endogeenisen AR kaikissa 22 CWR-R1-ARΔTR + T kasvaimien, vaikka AR proteiini oli alhainen havaittavissa 3 (näytteet 21-23). Sen sijaan, ARΔTR proteiini oli vähäistä tai sitä ei ole kaikissa CWR-R1-ARΔTR kasvaimia läsnä ollessa T täydentää.

Western blot -analyysi suoritettiin käyttäen proteiini lysaatit eristetty CWR-R1 kasvaimia kerätään aikaan kasvaimen sato. CWR-R1 kasvain endogeenistä AR (M

r 110 kDa), ja transdusoitu ARΔTR (ARΔ142-337, M

r 84 kDa) ja LacZ (M

r 60,5 kDa) proteiinin arvioitiin. (A) Immunoblotit AR ja ARΔTR läsnä ollessa T (kasvaimen numerot 2-23) tai (B) ei ole T (kasvaimen numerot 24-29, 31-35, 38, 39, 43 ja 44). (C) immunobloteista LacZ (M

r 60,5 kDa) proteiinin T (kasvain numerot 47-68) tai ilman T (kasvain numerot 69-91) ja tyhjän vektorin valvonta (kasvain numerot 92-95). LacZ ilmaistiin yhtä lukuun ottamatta kaikissa 42 CWR-R1 kasvaimia. LacZ proteiini ilmaistaan ​​pTK1027 transdusoiduissa CWR-R1 solut ennen ihonalaista inokulaation hiirillä käytettiin valvontaa. HEK-293T-soluja käytettiin negatiivisina kontrolleina ja lastaus ohjaus LacZ immunobloteilla oli glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasin (GADPH, M

r 36 kDa).

Koska täydentäviä T, AR proteiinin itsepintaisesti 10 15 CWR-R1-ARΔTR kasvaimet (kasvain numerot 28, 29, 31, 32, 34, 35, 38, 39, 43 ja 44), ja endogeenisen AR ei havaittu 5 kasvaimia, joita ei myöskään express ARΔTR (näytteet 24-27 ja 33) (Fig. 10B). CWR-R1-ARΔTR kasvaimia 32 ja 35 ilman T lisä ilmaistaan ​​AR muttei ARΔTR. ARΔTR koekspressoitiin 8 CWR-R1 kasvaimia (kasvain numerot 28, 29, 31, 34, 38, 39, 43 ja 44).

Sen sijaan, LacZ proteiini ilmentyy kaikissa kasvaimia, paitsi kasvaimen 72 puuttuessa ja läsnä T (Fig. 10C). Tyhjä vektorisäätö CWR-R1 kasvaimista T (näytteet 92 ja 93) ja ilman T (näytteet 94 ja 95) ja 293T-solut eivät esittäneet LacZ tai ARΔTR proteiinia. Johdonmukainen ilmentyminen LacZ-proteiinin vastasi vektorin kopioluku laskettiin LacZ-transdusoitujen tuumorien.

Tulokset viittaavat siihen, negatiivinen valinta ARΔTR ei rajoitu CWR-R1-ARΔTR kasvaimia kasvatettiin hiirissä täydentävien T. ARΔTR -transduced kasvaimet ilman täydentävää T, ARΔTR valinta oli vähemmän mahdollisesti vähäisen seerumin T- ja /tai muuttunut intracrine T biosynteesiä.

Intracrine synteesi aktiivisen androgeenien kastraatio-toistuvat CaP

puuttuminen CYP17A1 hiiren lisämunuaiset [33] tarjoaa mallin testata onko kastraatio-toistuvat CaP tuottaa intracrine androgeenien. Sukupolven CWR-R1-ARΔTR kasvaimet tarjosi mahdollisuuden tutkia vaikutusta AR signalointia intracrine aktiivinen androgen biosynteesiä. Samanlainen CWR-R1-ARΔTR kasvaimen kasvun, kasvaimen kaksinkertaistaa kertaa ja rinteitä ja ilman T, ja mittaukset DHT CWR-R1-soluja viittasi siihen, että CWR-R1 kasvaimia tuotettu aktiivinen androgeenien poissa ollessa kiertävän T.

tunnistaa mahdolliset erot androgeenireseptorin profiilien välillä CWR-R1-ARΔTR ja LacZ kasvaimia, T, DHT, androsteenidionin ja androsterone mitattiin käyttäen nestekromatografia tandemmassaspektrometrian. Tasot kudoksissa 0,32 nM DHT (p = 0,59) ja 0,05 nM androsterone (p = 0,23) mitattuna tuumorin sadonkorjuun olivat samanlaisia ​​ARΔTR ja LacZ-transdusoitujen tuumorien (taulukko 2) ja riittävä aktivoimaan endogeenisen AR ja ARΔTR (ks

in vitro

tuloksia; Fig. 2). Lisäksi 3,25 nM T LacZ kasvaimissa oli samanlainen T tasoja kastraation-toistuvat CaP [4], [9], joka oli riittävä aktivoimaan endogeenisen AR-H874Y [29]. Kuitenkin CWR-R1-ARΔTR kasvaimet, T tasot olivat ~ 4 kertaa pienempi kuin LacZ kasvaimia, joka ehdotti muutosta T biosynteesiä hallitseva negatiivinen AR. Alentuneeseen T-biosynteesin ARΔTR Transdusoimattomia CWR-R1 kasvaimia korreloi kertyminen ~ 1 nM androsteenidionin, androgeenien prekursori T. Sen sijaan, CWR-R1-LacZ kasvaimia sisälsi 1,05 nM androsteenidionin. Kvantitointi 5α-vähennetty ja tyydyttymättömiä androgen lähtöaineiden ARΔTR ja LacZ Transdusoimattomia CWR-R1 kasvaimia ehdotti intracrine androgeenien biosynteesissä osaltaan AR-riippuvaisia ​​kastraatio-toistuvat kasvuyhtiöt.

Keskustelu

tutkimukset tässä raportissa perustuivat olettamukseen, että hallitseva negatiivinen muoto AR kanssa poistetaan NH

2-terminaalin transaktivaatiodomeenin vaatii androgeenireseptorin dimeroimista [30] ja eston transkriptionaalista aktiivisuutta täyspitkän AR [27] . Olemme osoittaneet, että vakaa ilmentyminen hallitseva negatiivinen ARΔTR estää endogeenisen AR-H874Y transkriptionaalisen aktiivisuuden ja hidastaa tai viivyttää CWR-R1 kasvaimen kasvua puuttuessa ja läsnä täydentävää T. vallitsevat negatiiviset ARΔTR aktiivisuus osoitetaan myös lasku Nkx3.1 proteiinia ja lusiferaasireportteri- aktiivisuuden läsnä ollessa DHT.

tutkimuksen tulokset ovat osoittaneet, kaksi ylimääräistä tärkeitä havaintoja. Ensimmäinen oli olennaisesti 100% negatiivisen valinnan vastaan ​​dominantti negatiivinen muoto AR aikana kastraation-toistuvat CWR-R1 kasvaimen kasvua, kun läsnä on lisä- T. Tämä vastakohtana lähes 100% pysyminen LacZ valvonta-geenin. Molemmat hallitseva negatiivinen ARΔTR ja LacZ integroituu genomiin käyttäen lentivirus ilmaisua ja solun valinta ennen soluinokulaation ja kasvaimen kasvua. Toiseksi, noin 50% poissulkeminen vallitsevan negatiivisen AR tapahtunut CWR-R1-ARΔTR kasvaimia kasvatettiin ilman täydentävää T. Nämä tulokset yhdessä massaspektrometrian mittaukset T ja DHT viljellyissä CWR-R1 solut, anna näyttöä intracrine synteesi aktiivisten androgeenien tarvitaan AR signalointi korkki. Valikoiva menetys vallitsevan negatiivisen AR osoittaa geneettisen monipuolisuuden kastraation-toistuvien CaP solujen maksimoida AR signalointi.

Intracrine synteesi androgen kastraatio-toistuvat CaP

esto lusiferaasiaktiivisuuden CWR- R1 soluissa hallitseva negatiivinen ARΔTR puuttuessa eksogeenisen T ehdotti solunsisäistä synteesiä T. Tätä tukivat massaspektrometrialla mittaukset T ja DHT CWR-R1 soluissa. Meidän havainnot ovat yhtäpitäviä aikaisempien todisteita siitä, että androgeeni-ruokittu LNCaP syntetisoivat androgeenieritystä iältään

14C-asetaatti leimattu kolesteroli [34]. CaP solut muuttavat kolesterolin aineenvaihduntaan ja käsittelyn tukemiseen androgeenin biosynteesin [35]. Intracrine biosynteesissä androsteenidionin, DHEA ja T osoitettiin myös CWR-R1 ja PC-3-solut, ja sekaantunut CYP17A1 aktiivisuutta AR positiiviset ja negatiiviset CaP soluihin [36]. Kliinisistä näytteistä, kolesteroli ja androgeenireseptorin biosynteettistä entsyymit säädellään ylöspäin kastraatio-toistuvat CaP [12], [37], [38].

CWR-R1-LacZ kasvaimia, kasvaimeen T ja DHT tasot riittivät aktivoimaan AR-H874Y ja edistää kasvaimen kasvua. Kasvaimensisäistä DHT tasot ARΔTR ja LacZ transduktoitu- kasvaimet olivat samanlaiset. Kuitenkin ARΔTR Transdusoimattomia CWR-R1 ksenograftikasvaimissa, T tasot olivat alhaisemmat ja androsteenidionin tasot olivat suurempia kuin CWR-R1-LacZ kasvaimia. Alempi T tasot CWR-R1-ARΔTR kasvain ehdotti, että vallitsevan negatiivisen ARΔTR valittu vastaan ​​soluja, jotka ilmentävät aldo-keto-reduktaasin 1c3, entsyymi, joka vähentää androsteenidionin T kastraatio-toistuvia korkki, tai lisääntynyt hapetus T androsteenidionin NAD

+ riippuvainen 17β-hydroksisteroididehydrogenaasi-10 aktiivisuus [39]. Vähentynyt androsteenidionin muuttuessa T siirtäisi solunsisäinen ligandi profiilia kohti aktivoitumista mutantti AR-H874Y villityypin LBD AR ARΔTR. Intracrine metaboliaa kolesterolin aktiiviseen androgeenien voisi selittää alkuperäisen herkkyys kastraation-toistuvien CaP hoitoon abirateronin asetaatti [14].

AR-H874Y endogeeninen CWR-R1-solujen säilyttää korkean affiniteetin T ja DHT sitovia samanlainen villityypin AR. Kuitenkin H874Y-mutaatio stabiloi LBD ydin rakennetta siten, että T on yhtä tehokas kuin DHT edistämisessä transkriptionaalista aktiivisuutta [29]. Rakenne vakauttava vaikutus H874Y riittävät voittamaan haitallisia vaikutuksia toimintakyvyn menetystä aiheuttavat mutaatiot androgeenireseptorin sieto [40]. Vastaava teho T ja DHT kanssa AR-H874Y viittaa siihen, että intracrine synteesi T edistäisi LacZ Transdusoimattomia CWR-R1 kasvaimen kasvua. Solunsisäiset androsteenidionin T voisi olla merkittävä transkription vaikutusta AR-H874Y suhteessa villityypin AR [29]. Lisääntynyt ilmentyminen P160 steroidireseptoriperheen koaktivaattoreiden in kastraatio-toistuvat CaP [41], [42] osaltaan hypersensitization.

T:DHT suhdelukuja LacZ- ja ARΔTR Transdusoimattomia CWR-R1 kasvaimet olivat samanlaisia ​​kuin kastraatio-toistuvat CaP [4], [9], [43]. Aiemmat tutkimukset käyttämällä kliinisistä näytteistä osoitettiin laski 5α-reduktaasi-2-isoentsyymin mRNA [44] ja proteiini [45] ilmentymistä kastraatio-toistuva korkki, joka oli osittain menettämisen vuoksi eritettyjen stroomasolulinja tekijä signalointi [44], [46]. CWR-R1 kasvaimia myös saattaneet laskea 5α-reduktaasin-2 aktiivisuutta. Samanlainen DHT tasot LacZ ja ARΔTR kasvaimia osoittavat, että DHT biosynteesiä riippuu androsteenidionin sijasta T, koska androsteenidionin on parempi substraatti 5α-reduktaasi-1 kuin T [47]. Siirtyminen kohti androsteenidionin muuttuessa androstanedione [45] mukaan 5α-reduktaasi-1 ja edelleen aineenvaihduntaa DHT kalvoon sitoutunut NADPH riippuvainen 17β-hydroksisteroididehydrogenaasi-15 [48] voi selittää miksi miehet kastraatio-toistuvat korkki ja korkean perustason androsteenidionin tasot elivät pidempään hoidetuilla ketokonatsolia [49]. DHT tasot pysyvät samanlainen, vaikka T:androstenedione suhdelukuja LacZ ja ARΔTR kasvaimia käänteistä. Alhainen ja vastaavat DHT tasot (~ 10

-11) mitattiin LacZ ja ARΔTR Transdusoimattomia CWR-R1 kasvaimet voivat olla optimaalinen kasvaimensisäisenä konsentraatio CWR-R1 soluproliferaatiota [42] ja AR-H874Y koordinoitu DNA replikoinnin lisensointi [ ,,,0],50].

Negatiivinen valinta parantaa AR aktiivisuutta

kasvua inhiboivia vaikutuksia ARΔTR oli vaikeuttaa se, että ARΔTR siirtogeeni negatiivisesti valittu vastaan ​​aikana CWR-R1 kasvaimen kasvua eniten tehokkaasti läsnäolo täydentävää T. ilmentäminen ARΔTR siirtogeenin hävisi kaikissa 22 ARΔTR + T kasvaimia mennessä sadonkorjuun, kun taas ARΔTR siirtogeenin säilyi -50% kasvainten puuttuessa täydentävän T. kasvaimen keskimääräisen tilavuuden oli suurempi kuin ARΔTR + T kasvaimien, jotka saattavat liittyä osittain kytkimen T: stä androsteenidionin biosynteesin näiden kasvaimia. Vaikka ajoitus negatiivisen valinnan vastaan ​​ARΔTR siirtogeeni ei testattu, alustavat tutkimukset viittasivat menetys siirtogeenin tapahtui noin 10 päivää tuumorisolujen inokulaation jälkeen päivänä 23.

Negatiivinen valinta ARΔTR siirtogeenin tukivat vähentynyt genomiin vektorin kopioluvun sekä ARΔTR ja LacZ-transdusoitujen CWR-R1 kasvainten puuttuessa tai läsnä eksogeenisiä T. menetys siirtogeenin ilmentyminen on osoitettu tapahtuvan 10-15 päivä sen jälkeen, kun lentiviruksen transdusoitujen alkion karsinoomasolut [51]. Viive ARΔTR + T kasvaimen kasvua tukevat valinta vastaan ​​siirtogeenin kun 10 päivää CWR-R1 malli. Voidaan väittää, että menetys siirtogeenin johtui vektori paeta kirjavassa ja /tai sukupuuttoon tapahtumia. Toisaalta, satunnainen geeni tai kromosomaalinen deleetio ja siirtogeenin hiljentäminen [51] ei ole tuettu, koska oli lähes täydellinen säilyttäminen valvonnan LacZ siirtogeenin CWR-R1 kasvaimia.

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että CWR -R 1-solut, samoin kuin vanhempien CWR22 CaP ksenografteja, sisältävän replikaatiokykyistä retroviruksia identtinen ksenotrooppisen hiiren leukemia, jotka liittyvät viruksen (XMRV) löydetty ihmisen CaP soluihin [52], [53]. XMRV kehittynyt rekombinaation kahden -endogeenisten nude-hiirissä kuljettavat CWR22 ksenografteista [52], [53].