Krooninen sairaus

tiivistelmä

tietämyksen rooli caveolin-1 (Cav-1) proteiinin endoteelin syöpäsolujen tarttumista on epäselvä. Tämä tutkimus osoitti, että Cav-1 näyttelee negatiivinen sääntelyn rooli syövän endoteelin vuorovaikutus. Endogeeninen Cav-1: n osoitettiin alas-säädellä aikana solujen irtoaminen ja taso tällaisen proteiinin päinvastoin liittyy kasvaimeen endoteeliadheesion. Lisäksi ektooppinen yliekspressio Cav-1 heikennetty kyky syöpäsolujen kiinni endoteeliin, kun taas shRNA-välitteistä Cav-1 knock-down esillä päinvastainen vaikutus. Huomasimme, että solujen irtoaminen lisääntynyt solujen vetyperoksidia ja hydroksyyli radikaali sukupolven ja kuten reaktiivisen hapen (ROS) olivat vastuussa kasvava vuorovaikutus syöpäsoluja ja endoteelisolujen kautta verisuonen endoteelin adheesiomolekyyli-1 (VCAM-1). Tärkeää on, Cav-1: n osoitettiin tukahduttaa vetyperoksidia ja hydroksyyli radikaalien muodostumista ylläpitämällä tasolla aktivoidun Akt, joka oli kriittinen rooli Cav-1 vaimentamiseen soluadheesion. Yhdessä tässä tutkimuksessa paljastui uuden roolin Cav-1 ja taustalla olevaa mekanismia kasvainten tarttuvuus, jotka selittävät ja korostavat tärkeä rooli Cav-1 keuhkojen syöpäsolumetastaasi.

Citation: Chanvorachote P, Chunhacha P ( 2013) Caveolin-1 säätelee endoteeliadheesion keuhkosyöpään solujen kautta reaktiivisia happiradikaaleja riippuva mekanismi. PLoS ONE 8 (2): e57466. doi: 10,1371 /journal.pone.0057466

Editor: Chih-Xin Tang, Kiina Medical University, Taiwan

vastaanotettu: 18 lokakuu 2012; Hyväksytty: 21. 2013 Julkaistu: 27 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Chanvorachote, Chunhacha. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukevat avustusta Thaimaa Research Fund (P. Chanvorachote) ja tutkijatohtorin (Ratchadaphiseksompot Endowment Fund, Chulalongkorn University). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Äskettäin roolit caveolin-1 (Cav-1) sääntelyssä syövän etenemisen ja etäpesäkkeiden eri syöpätyyppien on paljastunut [1] – [4] ja tällainen proteiini ehkä saanut eniten huomiota syöpätutkimukseen. Vaikka jotkut tutkimukset viittaavat siihen Cav-1 voi olla rooli estämällä syövän etenemisen tietyissä syövissä [5], keuhkosyövän, Cav-1 voimistaa syöpää aggressiivisuutta sekä etäpesäkkeiden [6]. Yhdessä että Cav-1 ilmentyminen keuhkosyöpä osoitettiin liittyvän huonoon ennusteeseen [2], ja suurin osa syöpään liittyvän kuoleman tämä syöpä osoitettiin linkittää etäpesäkkeitä, se on hyvin kiinnostavaa tutkia koko sääntelevä rooli tämän proteiinin syövän etäpesäkkeitä [7]. Etäpesäke on monivaiheinen prosessi syöpäsolujen leviämistä niiden alkuperäisestä paikoissa kaukaisilla toissijainen sivustoja. Alkaen syöpäsolun irrottautuminen niiden primäärikasvain solut hyökkäävät verisuonen seinämään, matkustaa verenkiertoelimistön, ja noudattaa endoteelin muodostamaan toissijainen kasvaimia. Vaikka roolit Cav-1 keuhkosyöpäsolua käyttäytymistä on intensiivisesti tutkittu, rooli tällaisen proteiinin keuhkosyöpä solun tarttumista endoteeliin pinta ei juuri tunneta. Me ja muut ovat ehdottaneet tärkeä rooli Cav-1 in tekee syöpäsolujen resistenttejä anoikis Solun irrotuksen jälkeen [6], [8], [9], [10], parantaa hyökkäys ja muuttoliike [11], ja helpottaa kasvua kiinnittämisestä riippumattomalla tavalla [12]. Endogeeninen Cav-1 tason osoitettiin edellisen tutkimukset ohjata reaktiivisia happiradikaaleja (ROS). Erillisissä solu kunnossa, vetyperoksidi havaittiin lisäävän solutasolla CAV-1 estämällä sen hajoamista [6]. Vaikka kiinnittyneet solut, hydroksyyliradikaali osoitettiin olevan avainasemassa ylös säätelevä Cav-1 ilmentymisen ja lisääntynyt solujen vaeltaminen [11]. Nämä havainnot korostettiin säätelevän roolin ROS on Cav-1 ilmentymisen ja niiden mukana roolit syövän etäpesäkkeitä.

biologia, negatiivista palautetta määräyksiä, joilla estetään liiallinen ärsykkeet. Samoin Cav-1-proteiinin osoitettiin tukahduttaa aiheuttamaa oksidatiivista stressiä vetyperoksidin altistus [13]. On kuitenkin vielä tiedetä Cav-1 säätelee ROS tasolla irrotettuja soluja, ja tällainen sääntely on kriittinen syövän liimaominaisuus. Käyttämällä farmakologinen ja geneettisiä lähestymistapoja esillä Tutkimus osoitti, että Cav-1 on avainasemassa estyminen syöpää endoteelin tarttumista lieventävien vetyperoksidia ja hydroksyyli radikaali sukupolvien Solun irrotuksen jälkeen. Esillä Tutkimuksessa todettiin myös, että Cav-1 tukahdutetaan niin ROS muodostumisen Akt-riippuvaisen mekanismin. Yhdessä havainto, että Cav-1 väheni ajasta riippuva muoti Solun irrotuksen jälkeen huomasimme, että myöhemmin-ajankohtina, syöpä-endoteeli tarttumista huomattavasti samanaikainen mainitun Cav-1 ehtyminen. Siten tutkimuksemme paljastaneet uutta mekanismia syöpäsolujen tarttumista koskevat Cav-1, joita voidaan hyödyntää etäpesäkkeitä ja lääkekehityksessä.

Materiaalit ja menetelmät

Solut ja reagenssit

Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solun (NSCLC) -H460 ja verisuonten endoteelin Human (HUV-EC-C) solut saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). H460-soluja viljeltiin RPMI 1640: ssä, kun taas HUV-EC-C-soluja viljeltiin M199. RPMI 1640 on täydennetty 5% naudan sikiön seerumia (FBS), 2 mM L-glutamiinia, ja 100 yksikköä /ml penisilliiniä /streptomysiiniä. M199 on täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 10 mM L-glutamiinia, ja 100 yksikköä /ml penisilliini /streptomysiiniä, 0,1 mg /ml hepariinia, 0,05 mg /ml endoteelisolujen kasvun täydennysosa (EKG). Kaikki viljelmää inkuboitiin 5% CO

2 ympäristössä lämpötilassa 37 ° C. 2 ’, 7’-dikloorifluoresiinidiasetaattia (DCFH

2-DA), dimetyylisulfoksidi (DMSO), kaveoleja eristyspakkausta, Calcein AM, Heparin natrium- saatiin Sigma Chemical, Inc. (St. Louis, MO); Kani caveolin-1-vasta-aine ja peroksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta Abcam (Cambridge, MA); Hydrophenyl fluoreseiini (HPF), LY294002, Amplex Red, Lipofectamine 2000 oli Invitrogen (Carlsbad, CA); Vasta-aine β-aktiini Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA); Vasta-aine yleiseurooppalaiseen Akt, p473-Akt, PTEN, EGFR, Phospho-PTEN (Ser380 /Thr382 /383) olivat Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA); Endoteelisolukasvua täydennys oli peräisin Millipore Corporation (Billerica, MA).

Plasmidi ja transfektio

Cav-1 ekspressioplasmidin pEX_Cav-1 ja sen valvonta vektori; pDS_XB-YFP hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA) ja Cav-1 Knockdown plasmidia shRNA-Cav-1 ja sen valvonta vektori; ohjaus shRNA plasmidista saatiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Vakaa transfektiosta Cav-1 ekspressioplasmidin tai Cav-1 Knockdown plasmidia muodostettiin viljelemällä H460-soluja 6-kuoppalevyllä, kunnes ne saavuttivat 60% konfluenssiin. 15 ui Lipofectamine-reagenssia ja 2 ug Cav-1, ja shRNA-CAV-1-plasmidi käytetään transfektoimaan solut seerumin poissa ollessa. 12 tunnin kuluttua kasvualusta korvattiin kasvualustalla, joka sisälsi 5% naudan sikiön seerumia. Noin 36 h kuluttua alusta transfektion jälkeen solut hajotettiin 0,03% trypsiiniä, ja solususpensiot maljattiin 75 ml: n viljelypulloihin ja viljeltiin 24-28 päivää G418 tai puromysiinin valintaa varten Hcav-1 ja shCav- 1, vastaavasti. Vakaa transfektantit yhdistettiin ja ilmentymistä Cav-1 proteiinin transfektanttien vahvistettiin western blottauksella. Soluja viljeltiin antibioottia RPMI 1640 väliaineessa vähintään kaksi kohtaa ennen käytetään kussakin kokeessa.

ROS Detection

Solunsisäinen ROS määritettiin virtaussytometrialla käyttämällä DCFH

2-DA kuten fluoresoiva koetin. Lyhyesti, soluja inkuboitiin 10 uM DCFH-DA, HPF 30 min ajan 37 ° C: ssa, minkä jälkeen ne pestiin, trypsinoitiin, suspensoitiin uudelleen fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen, ja analysoidaan välittömästi fluoresenssi-intensiteetti FACScan-virtaussytometrillä (Beckton Dickinson, Rutherford, NJ) käyttäen 488 nm virityssäteen ja 538 nm kaistanpäästösuodattimen. Mediaani fluoresenssi-intensiteetti kvantitoitiin CellQuest-ohjelmaa (Becton Dickinson) analyysi tallennetun histogrammien.

H

2O

2 määritettiin Amplex Red reagenssia (Invitrogen). Lyhyesti, reaktioseos, joka sisälsi 50 uM Amplex Red reagenssia ja 0,1 U /ml HRP Krebs-Ringer fosfaatti (KRPG) lisättiin kuhunkin mikrolevyn hyvin. Sen jälkeen, 20 ui 1,5 x 10

4 H460-solut suspendoitiin KRPG lisättiin reaktioseokseen. 30 minuutin inkuboinnin fluoresenssisignaali saatu fluoresenssi mikrolevynlukijaa varustettu viritykseen alueella 530-560 nm ja emissio havaitseminen 590 nm seurattiin ja mitattiin yli 3 tunnin jälkeinen irtoaminen.

Yksikerroksinen Soluadheesiokoe

HUV-EC-C stimuloitiin 10 ng /ml IL-1

β

varten 0-4 h. H460-soluja (2,5 x 10

4 solua /ml) värjättiin 15 uM kalseiini AM: n (Sigma) 45 min 37 ° C: ssa ja 5% CO

2, sitten lisätään päälle semi-konfluentti yksikerrosviljelmä ja HUV-EC-C, inkuboitiin 20 minuutin ajan 37 ° C: ssa samalla pyörittäen 120 rpm, ja pestiin huolellisesti sulkea pois epäspesifisen solujen kiinnittymistä. Määrä kiinnittyneitä soluja laskettiin suoraan fluoresenssimikroskoopilla kuten on raportoitu aiemmin [14]. Vasta-aineen välittämä esto soluadheesion, IL-1β stimuloduista HUV-EC-C-inkuboitiin vasta-aineen kanssa VCAM-1, ICAM-1 ja E-selektiini (lopullisessa laimennoksena 1:400 jokaista vasta-aineiden) ja 3 h 37 ° C: ssa kostutetussa CO 2-inkubaattorissa, ja tämän jälkeen H460-soluja lisättiin.

kaveoleja eristäminen

kaveoleja eristettiin shCav-1, H460 ja Hcav-1-soluissa käyttämällä kaveoleja eristäminen kit (Sigma). ShCav-1, H460 ja Hcav-1-solut otettiin talteen ja lyysattiin lyysipuskurissa, joka sisälsi 1% Triton X-100. Lysaatteja sentrifugoitiin 10000

g

15 min. Pesuaine hylkivä fraktiot eristetty OptiPrep ™ Density Gradient Medium (0, 20, 25, 30, ja 35%). Kaveoleja kerättiin caveolin-1-fraktiolla, joka on käytetty tutkimuksen CAV-1 ja PTEN-ilmaisun.

Western-blottaus

jälkeen erityisiä hoitoja, soluja inkuboitiin lyysipuskuriin joka sisälsi 20 mM Tris-HCI (pH 7,5), 1% Triton X-100, 150 mM natriumkloridia, 10% glyserolia, 1 mM natriumortovanadaattia, 50 mM natriumfluoridi, 100 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, ja kaupallinen proteaasiestäjäseostabletit (Roche Molecular Biochemicals) 30 min ajan jäissä. Solulysaatit kerättiin ja määritettiin proteiinipitoisuus käyttäen Bradford-menetelmällä (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Sama määrä kunkin näytteen proteiinit (40 ug) denaturoitiin kuumentamalla 95 ° C: ssa 5 minuutin ajan Laemmlin latauspuskuria, ja sen jälkeen ladattiin 10% SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Erottamisen jälkeen, proteiinit siirrettiin 0,45 um nitroselluloosakalvoille (Bio-Rad). Siirretyn kalvoja blokattiin 1 tunnin ajan 5% rasvatonta kuivamaitoa TBST (25 mM Tris-HCI (pH 7,5), 125 mM NaCl, 0,05% Tween 20) ja inkuboitiin sopivan primaarisen vasta-aineita, 4 ° C: ssa yön yli. Membraanit pestiin kaksi kertaa TBST: llä 10 min ajan, ja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasiin kytketty isotyyppispesifisessä sekundaarisia vasta-aineita 1 tunti huoneen lämpötilassa. Immuunikompleksien havaittiin tehostettu kemiluminesenssi alustaan ​​(SuperSignal West Pico, Pierce) ja kvantifioidaan analyytikko /PC densitometria ohjelmisto (Bio-Rad).

Tilastollinen analyysi

Mean tietoja itsenäisestä kokeesta normalisoitiin johtaa soluista valvonnassa. Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa. Tilastollinen analyysi kahden ryhmän välillä varmistettiin Studentin t-testiä, verrattuna useita ryhmiä, analyysi variantin (ANOVA), jossa jälkikäteen suoritettiin. Vahvuus suhteita, korrelaatiokerroin (

r

), jokaisen proteiinin tason irtoamisen jälkeen määritettiin SPSS version 16 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). P-arvo alle 0,05 katsotaan tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Caveolin-1 väheneminen Solun irrotuksen jälkeen Parantaa Tumor-endoteeli-Cell Adhesion

Cav-1 oli osoitettu liittyvän metastaattisen potentiaalit keuhkosyövän soluista [6], [12], kun taas sen roolia syöpäsolujen tarttuvuus on edelleen epäselvä. Tutkia roolin Cav-1 proteiinin syöpäsolujen tarttumista, ensin irrottaa syöpäsoluja matkia varhainen vaihe etäpesäkkeiden, ja arvioi ilmaisun profiilia Cav-1 Solun irrotuksen jälkeen ajat. Keuhkosyöpä H460 soluja viljellään ultralow kiinnityslevyt analysoitiin Cav-1-proteiinin ilmentyminen western blottauksella klo ilmoitettuina ajankohtina. Kuvio 1A esittää, että kun solu irtoamisesta Cav-1 vähitellen väheni ajasta riippuva muoti ja merkittävä väheneminen havaittiin jo 6 tunnin kuluttua solujen irtoaminen. Seuraavaksi keskeytettiin solut samanaikaisesti ajankohtina alistettiin yksikerroksista soluadheesioanalyysin kuvatulla

Materiaalit ja menetelmät

. Kuviot 1A ja B esittävät, että kun solu irtoamisesta Cav-1 ilmentymisen vähitellen pieneni ajan kanssa samanaikaisesti kasvua syöpäsolujen tarttuvuus endoteelin pinnoilla, mikä viittaa mahdollista roolia Cav-1 syövän liima sääntelyä. Olemme edelleen tuettu tällainen korrelaatio, luomalla korrelaatio juoni välillä Cav-1 ilmentymisen ja syövän soluadheesiota (Fig. 1 C). Ei ainoastaan ​​vähentäminen näiden proteiinien korreloivat hyvin tehostettua kyky syöpäsolujen kiinnittymään endoteeliin pinnoille, mutta juoni paljasti myös korreloi profiilin kanssa korrelaatiokerroin 0,922.

V:

H460-solut suspendoitiin poly-HEMA-päällystetyille levyille ja eri aikoina (0-12 h) ja Cav-1-ilmentyminen analysoitiin western blot -menetelmällä. Pylväät ovat keskiarvoja ± SD (

n =

5). *

P

0,05 vs.

aika 0. B:

Omakotitalo H460-soluja altistettiin yksikerrosviljelmä HUV-EC-C. Vuorovaikutus H460 ja HUV-EC-C-soluja tutkittiin, kun läsnä oli IL-1

β

(10 ng /ml). Phase-kontrasti mikroskooppinen kuvat edustavista kokeet näkyvät.

C:

korrelaatio analyysi solujen Cav-1 tason versus H460-HUV-EC-C tartunta (

n

= 5).

D:

Cav-1 yli-ilmentyy Hcav-1 tai lyhyt hiusneula Cav-1-transfektoiduissa shCav-1-soluja rakennettu ja analysoitiin Cav-1 ilmentymisen Western-blottauksella. Blotit uudelleen tutkittiin β-aktiini-vasta vahvistamaan yhtäläiset lastaus näytteitä. Immunoblot-signaalit kvantitoitiin densitometrillä, ja keskimääräinen tietoja itsenäisestä kokeesta normalisoitiin tuloksiin. Pylväät ovat keskiarvoja ± SD (

n =

3), *

P

0,05 vs. H460-soluissa.

E:

Hcav-1, H460, ja shCav-1 solut irrotettiin 3 h ja lisätään päälle kulttuurin HUV-EC-C. Pylväät ovat keskiarvoja ± SD (

n =

3), *

P

0,05 vs. H460-soluissa.

Varmista, että Cav-1 vaimenee syöpä solun tarttumisen endoteelisoluihin, selvitimme vaikutus eri ektooppisen Cav-1 ilmentymisen tasossa H460-solujen tarttumisen endoteeliin. Perustimme Cav-1 yliekspressoivia (Hcav-1) solujen lyhyen hiusneula (sh) -välitteisen Cav-1 taintumisen (shCav-1) solujen vakaa transfektiolla. Transfektantissa kloonit analysoitiin Cav-1 ilmentymisen verrattuna niiden vanhempien H460-soluissa Western-blottauksella (kuvio. 1 D). On huomionarvoista, että ohjaus transfektoituja soluja tuotetaan ohjaus plasmideista, pDS_XB-YFP ja ohjaus shRNA plasmidi A, arvioitiin myös CAV-1 ilmentymisen, mutta; taso proteiini oli verrattavissa H460-soluja (tietoja ei esitetty). CAV-1 yliekspressoituina CAV-1 knockdovvn, ja H460 solut irrotettiin ja niille endoteelin adheesiomäärityksessä ja syöpäsolut tarttuneiden HUV-EC-C endoteelisolujen havaittiin. Kuten odotettua, analyysi soluadheesion osoitti, että Cav-1 yli-ilmennetään soluissa, osoitti alimman kyky noudattaa HUV-EC-C-soluja, kun taas shCav-1-soluissa oli suurin kyky. Lisäksi, vektori transfektoidut solut arvioitiin samalla liima-ominaisuus, ja ei havaittu olevan merkittävää muutosta verrattuna, että vanhempien soluja (tietoja ei esitetty). Tämä osoittaa, että Cav-1 säätelee negatiivisesti syöpä soluadheesiota verisuonen endoteeli.

Caveolin-1 vaimentaa Vetyperoksidi ja hydroksyylitähdettä Generation Solun irrotuksen jälkeen

edellinen tutkimus on osoittanut, että noudatetaan kunnossa CAV-1-toiminto lieventävien aiheuttamaa oksidatiivista stressiä vetyperoksidikäsittely [13]. Näin ollen, on mahdollista, että Cav-1-proteiini voi toimia säätelemään redox tilan syöpäsolujen aikana etäpesäke. Tutkia vaikutuksen Cav-1 proteiinin irtoaminen aiheuttamaa ROS sukupolvi, Cav-1 yli-ilmentyy (Hcav-1), Cav-1 knock-down (shCav-1), ja valvonta-solut (H460) irrotettiin ja inkuboitiin tarttuvuus kestävä levyt kunnes tietyt ajankohtina. Keskeytetty solut analysoitiin sitten solunsisäisten ROS tasoilla virtaussytometrialla käyttämällä DCFH

2-DA kuin fluoresoiva koetin. Kuvio 2A osoittaa, että solu irtoaminen indusoi kasvua solujen ROS on ajasta riippuva tavalla linjassa edellisessä raportissa [6]. Tämä tutkimus paljasti ensimmäistä kertaa, että Cav-1 toimi vaimentamiseen irtoaminen aiheuttamaa ROS näissä soluissa. ShCav-1-solut, jolla on alhaisin Cav-1 ilmentymisen osoitettiin näytteille korkein ROS induktion ja tällainen induktio voitiin havaita jo 1 h kuluttua irtoaminen (Fig. 2A), kun taas solujen ROS Cav-1 yli-ilmentyy (Hcav- 1) soluja ei muuttunut vastauksena soluun irtoaminen.

V:

Cellular ROS taso irrallaan H460, shCav-1, ja Hcav-1-soluissa määritettiin virtaussytometrialla käyttämällä H

2DCF-DA kuin fluoresenssi anturi. Pylväät ovat keskiarvoja ± SD (

n =

3), *

P

0,05 vs.

aika 0. B:

H460, shCav-1, ja Hcav- 1-soluja käsiteltiin Mn (III) tetrakis (4-bentsoehappo) porfyriinin kloridi (MnTBAP, 50 uM), Katalaasi (Cat, 7500 U /ml), natrium- formaattia (NaF, 2,5 mM), tai deferoksamiini (DFO, 1 mM). Solunsisäinen ROS taso näiden solujen määritettiin H

2DCF-DA anturi. Pylväät ovat keskiarvoja ± SD (

n =

5), *

P

0,05 vs. liitteenä ohjaus (

aika 0

), ja #

P

0,05 vs. ei-käsiteltyjen valvontaa vastaavan ajan.

C:

Vetyperoksidi taso solujen määritettiin mikrolevynlukijaa käyttäen Amplex Red. Pylväät ovat keskiarvoja ± SD (

n =

3), *

P

0,05 vs. kontrolli solujen

aika 0. D:

hydroksyylitähdettä induktio määritettiin HPF. Pylväät ovat keskiarvoja ± SD (

n =

3), *

P

0,05 vs. kontrolli solujen

aika 0.

Lisäksi erityinen ROS inhibiittoreita käytettiin arvioida erityisiä ROS jotka säädelty näissä soluissa. CAV-1 yli-ilmentyy, CAV-1 kaataa, ja H460-soluja esikäsiteltiin erityisiä ROS-estäjiä, jotka olivat MnTBAP (a superoksidianionin estäjä), katalaasin (vetyperoksidia estäjä), deferoksamiinia (hydroksyyliradikaali estäjä) ja natriumformiaattia ( hydroksyyliryhmä radikaalinsieppausaineen), ja ROS tasot irtoamisen jälkeen 0-3 h määritettiin. Kuvio 2B osoittaa, että hoito katalaasi, natriumformaattia, ja deferoksamiini voivat estää induktio ROS näissä soluissa, mikä viittaa siihen, että vetyperoksidi ja hydroksyyli radikaali oli primäärinen ROS säädelty Solun irrotuksen jälkeen.

vaikutus CAV-1 vetyperoksidin ja hydroksyyliradikaalin nämä solut tuottivat oli seuraava arvioitiin. Amplex punainen, erityinen detektiokoetinta vetyperoksidia, ja HPF, erityinen detektiokoetinta varten hydroksyylitähdettä, käytettiin määrittämään tällaisia ​​erityisiä ROS irrotetuista soluista. Luvut 2C ja D osoittavat, että solujen irtoaminen lisääntynyt signaalit vetyperoksidin ja hydroksyyliradikaalin spesifisiä koettimia on ajasta riippuva tavalla. Tärkeää on, että signaali joko vetyperoksidia tai hydroksyyliradikaali oli tuskin havaittavissa Cav-1 yli-ilmennetään soluissa, kun taas tällaista ROS signaalit tehostua ilmentävien solujen alhainen Cav-1. Nämä tulokset osoittivat, että Cav-1 heikennetty vetyperoksidia ja hydroksyyli radikaali sukupolvien keskeytettyjä keuhkosyövän soluja.

Vetyperoksidi ja hydroksyylitähdettä Asetus Cancer Cell Adhesion endoteelisoluihin kautta VCAM-1-riippuvaisen mekanismin

ROS näytettiin monissa tutkimuksissa avainasemassa säätelyssä syöpäsolun käyttäytymistä [11]. Yhdessä edellä havainto osoittaa, että Cav-1 heikennetty vetyperoksidia ja hydroksyyli radikaali muodostelmia aikana solujen irtoaminen, me tutkimme, vetyperoksidia ja hydroksyyli radikaali rooli säätelyssä syöpäsolun tarttumista. Keuhkosyövän soluja inkuboitiin erilaisten tunnettujen erityisten ROS moduloivat aineet, kuten on kuvattu, ja solut altistettiin adheesion määritykset. Kuvio 3A osoittaa, että solujen käsittelyä, jossa on superoksidin inhibiittorin MnTBAP oli vain vähäinen ja merkityksetön vaikutus syöpäsolujen liima aktiivisuutta, kun taas lisäämällä katalaasia, deferoksamiini ja natriumformiaatin estivät merkittävästi adheesiota H460-solujen endoteeliin pinnalle. Nämä tulokset viittaavat siihen, vetyperoksidia ja hydroksyyli radikaali, mutta ei superoksidianionia ovat ROS tehostavien liima kyky näiden syöpäsolujen verisuonten endoteelisolujen.

V:

H460-soluja jätetään hoitamatta tai esikäsitellä Mn (III) tetrakis (4-bentsoehappo) porfyriinin kloridi (MnTBAP, 50 uM), Katalaasi (Cat, 7500 U /ml), natrium- formaattia (NaF, 2,5 mM), tai deferoksamiini (DFO, 1 mM), sitten irrotetaan 3 h ennen adheesiomäärityksellä. Pylväät ovat keskiarvoja ± SD (

n =

3), *

P

0,05 vs. ei-käsitelty kontrolli.

B:

H460-soluja käsiteltiin 100 uM H

2O

2 tai 100 uM H

2O

2 ja 50 uM FeSO

4 ja alistettiin HUV- EC-C-pinta, joka on estänyt VCAM-1, ICAM-1, tai E-selektiinin vasta-aineita. Phase-kontrasti mikroskooppinen kuvat edustavista kokeet näkyvät. Sarakkeet ovat keskiarvoja ± SD (

n =

3), *

P

0,05 vs. ei-käsiteltyyn kontrolliryhmään.

Todisteita ovat ehdottaneet, että endoteelisolujen adheesiomolekyylien (ECAMs) on tärkeä rooli syövän-endoteelisolujen vuorovaikutusta [15]. Aktivoitumisen endoteelisolujen IL-1

β

indusoidun ilmentymisen ECAMs nimittäin VCAM-1, ICAM-1 ja E-selektiinin endoteelisolujen pinnoilla, ja nämä proteiinit helpottaa sitoutumisen syöpäsolujen [15]. Vahvista rooli vetyperoksidia ja hydroksyyli radikaali syöpää endoteelisolujen vuorovaikutusta ja määritellä vaikuttaa adheesiomolekyylien, me estetty endoteelipinnoilla erityisiä vasta-aineet VCAM-1, ICAM-1 ja E-selektiinin, ennen syöpäsolujen tarttumista . Myös syövän soluja käsiteltiin eksogeenisen vetyperoksidin läsnä ollessa tai ilman ferrosulfaatin vahvistaa roolia vetyperoksidia ja hydroksyyli radikaali, vastaavasti.

Kuvio 3B osoittaa, että vetyperoksidi ja hydroksyyli radikaali tehostaa merkittävästi syöpä solun tarttumisen endoteelisoluihin, vahvistaa tehtävän mainittujen ROS syövän soluadheesiota. Mielenkiintoista on, estämällä endoteelin kanssa VCAM-1-vasta-aineita voitaisiin poistaa vaikutusta vetyperoksidin ja ferrosulfaatti on tartuntaominaisuus näiden syöpäsoluja ja vasta-aineita ICAM-1 ja E-selektiinin ei ollut merkittäviä vaikutuksia. Nämä tulokset osoittivat, että vetyperoksidi ja hydroksyyli radikaali voi, ainakin osittain, säätelevät vuorovaikutusta syöpäsolujen endoteelisolujen pinnan kautta VCAM-1-riippuvaisen mekanismin. Myös Cav-1 voi vähentää liiman ominaisuus syöpäsolujen lieventävien vetyperoksidia ja hydroksyyli radikaali.

Cav-1 vaimentaa ROS Generation Solun irrotuksen jälkeen läpi PI3K /Akt Pathway

oltuaan että Cav-1 heikennetty syövän kyky liittymään vaihtoehtoiseen endoteeliin vähentämällä solujen vetyperoksidia ja hydroksyyli radikaali up-asetukset, ja näytön mukaan Cav-1 säätelee useiden solun käyttäytymistä aikana solun irtoaminen kautta PI3K /Akt-reitin [11]. Edelleen vahvistaa roolia Cav-1 Akt signalointi, me seuranneet Akt aktivoinnin kannalta fosforyloidun (seriini 473) Akt. Suostumuksella edelliset havainnot [16], löysimme tehostetun Akt aktivaation Hcav-1 soluja verrattuna, että H460- ja shCav-1-solut (Fig. 4A). Lisäksi olemme havainneet, että solujen irtoaminen merkittävästi vähentynyt taso aktivoitua Akt lähes kaikissa soluissa. Vaikka fosforyloidun (seriini 473) Akt in shCav-1-soluissa havaittiin eniten vaikuttaa sellaisen solun irtoaminen, taso aktivoitua Akt in Hcav-1 oli tuskin muuttunut (Fig. 4A).

V:

H460, shCav-1, ja Hcav-1 solut irrotettiin ja suspendoitiin poly-HEMA levyillä 0-3 tuntia. p473-Akt ja pan-Akt tason näissä soluissa määritettiin spesifisten vasta-aineiden p473-Akt ja pan-Akt. Pylväät ovat keskiarvoja ± SD (

n =

3), *

P

0,05 vs. H460-solujen

aika 0

,

#P

0,05 vs. vastaava valvonta solujen

aika 0

.

B:

lysaatin H460, shCav-1, ja Hcav-1 soluja käytettiin tutkinnassa PTEN, fosfo-PTEN (Ser380 /Thr382 /383) ilmaisua. Kaveoleja mikrosomaalinen fraktio (M) valmistettiin, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät ja jota käytetään tutkimuksessa PTEN (M). EGFR käytettiin merkkiaineena kaveoleja osa. Pylväät ovat keskiarvoja ± SD (n = 3), *

P

0,05 vs. H460-soluissa.

C:

H460-solut jätettiin käsittelemättä tai esikäsiteltiin 2 h 10 ja 50 uM LY294002 sitten solut irrotettiin 3 tuntia ja analysoitiin p473-Akt ja Akt tasolla. Pylväät ovat keskiarvoja ± SD (

n =

3), *

P

0,05 vs. ei-käsitelty kontrolli.

D:

H460-soluja käsiteltiin LY294002 ja määritetään ROS, hydroksyyli radikaali, ja vetyperoksidin tuotantoon DCFH

2-DA, HPF, Amplex Red, tässä järjestyksessä. Pylväät ovat keskiarvoja ± SD (

n =

4), *

P

0,05 vs. ei-käsiteltyjen valvonta

aika 0

, #

P

0,05 vs. ei-käsiteltyjen valvonta

3 h. E:

ShCav-1 ja Hcav-1-soluja käsiteltiin LY294002 ja analyysejä solujen ROS käyttäen DCFH

2-DA. Pylväät ovat keskiarvoja ± SD (

n =

3), *

P

0,05 vs. ei-käsitelty kontrolli.

Koska fosfataasi ja tensin homologin poistettu kromosomissa kymmenen (PTEN) on merkittävä negatiivinen säätelijä PI3K /Akt-signalointireitin, myös suoritti kokeen valaista rooli Cav-1 PTEN. Tuloksemme osoittivat, että PTEN oli säädellään ylöspäin sytoplasmisen osan (C), mutta alas-säädellä kaveoleja mikrosomaalisessa jae (M) Cav-1 yli-ilmentyy (Hcav-1) solujen verrattuna kuin H460-soluissa (kuvio. 4B ). Sen sijaan Cav-1-kaataa solut osoittivat päinvastainen profiilit, mikä viittaa siihen, että Cav-1 säännelty lokerointi PTEN. Jotta voitaisiin arvioida toiminnan PTEN, Western blot analyysi C-terminaali fosforyloitua PTEN at Ser380, Thr382, ja Thr383 jotka edistävät PTEN vakautta mutta pienentää PTEN toimintaa [17], suoritettiin. Kuvio 4B osoittaa, että aktivoitu PTEN on pienentynyt huomattavasti Hcav-1-soluissa havaintojen kanssa, että fosforyloitu PTEN (at Ser380, Thr382, ja Thr383) on merkittävästi lisääntynyt. Yhdessä sen havainnon kanssa, joka osoittaa, että fosforylaatiota tällaisen proteiinin ShCav-1-soluissa oli vähentynyt, Cav-1 osoitettiin, että läsnä tutkimuksessa, joka säätelee negatiivisesti aktivoitu tila PTEN ja tällainen asetus voisi ainakin osittain jatkuva taso fosforyloidun Akt.

sen testaamiseksi, muutoksen fosforyloidun Akt vaikuttaa solujen oksidatiivista stressiä, PI3K-estäjä LY294002 käytettiin tukahduttamaan Akt aktivointia. H460-soluja inkuboitiin PI3K-inhibiittori LY294002 pitoisuuksina 10 ja 50 uM, ja Akt ja fosforyloitu-Akt-tasot määritettiin western blottauksella (Fig. 4C). LY294002 10 ja 50 uM pystyivät vähentämään p473-Akt (Fig. 4C). Vaikutus LY294002 on ROS aiheuttama solujen irtoaminen seurattiin DCFH

2-DA, HPF ja Amplex punainen. Ilmeisesti PI3K estäjä lisäsi solujen oksidatiivista stressiä osoittamien merkittävää lisäystä DCF fluoresenssisignaalin. Lisäksi erityinen ROS eli hydroksyyliradikaali ja vetyperoksidi, todettiin huomattavasti vastauksena hoitoon PI3K estäjää H460-soluissa (kuvio. 4D).

Mielenkiintoista, hoitoon LY294002 10 ja 50 uM voisi käänteinen vaikutus Cav-1 tukahduttamaan ROS vähenemiseen Hcav-1-soluissa. Kuvio 4E esittää, että ROS signaali Hcav-1-soluja käsiteltiin LY294002 on huomattavasti lisääntynyt, verrattuna ei-käsitellyn Hcav-1-soluissa. Sen sijaan ROS tasolla shCav-1-solut tuskin vaikutti hoitoon LY294002. Yhdessä nämä havainnot ehdottivat, että Cav-1 säädellä ROS muodostumisen jälkeen solujen irtoamisen ylläpitämällä aktivoituminen PI3K /Akt-reitillä.

Keskustelu

Toistaiseksi useita syöpään liittyviä proteiineja, on tunnistettu ja käytetään tiettyihin sovelluksiin, kuten biomarkkereita varhaisen havaitsemisen, ennuste, ja molekyylitason tavoitteet syöpälääkkeen suunnittelu [18]. Mukaan laajalti hyväksytty hypoteesi, että kaikki primaaristen kasvainten pystyvät kiinnittymään endoteelipinnoilla, mutta tietyt syöpäsolut, joilla on synnynnäinen tai adaptiivisen kyky pystyvät kiinnittymään pintaan verisuonten endoteelisolujen ja muodostaa etäpesäkkeitä [19]. Monet säätelyproteiinit tunnistettiin tuumorisuppressoriproteiinia tai kasvaimen promoottori proteiinit; kuitenkin, kun kyseessä on Cav-1, molemmat toiminnot on raportoitu. CAV-1 oli ensimmäinen kuvattu tuumorisuppressoriproteiinia koska alas-säätely CAV-1 löydettiin aikana solutransformaatiota [7]. Sen sijaan Cav-1 on todettu lisäävän syövän etenemiseen ja yhä enemmän näyttöä on ilmoittanut rooliaan syövän promoottori [20]. CAV-1: n osoitettiin toimivan tärkeänä välittäjänä usean pro-selviytymisen signalointireittien [21] – [23]. Lisäksi CAV-1-ekspressio osoitettiin kasvavan useita erilaisia ​​ihmisen syövissä, mukaan lukien keuhko-, rinta-, eturauhas-, ja haiman syövät, ja tämän ajan asetus liittyy korkea etäpesäkkeiden [20], [24] – [28]. Vaikka Cav-1 on todettu lisäävän keuhkosyövän etäpesäke tehostamalla anoikis vastus [9] ja hyökkäyksen ja muuttoliike [11], tässä tutkimuksessa edellyttäen estävää vaikutusta Cav-1 syöpään endoteelin tartunta, jota ei ole osoitettu. <