Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Tyhjennä solu munuaissyövän (ccRCC) on yleisin munuaissyöpäsolujen. Yksi prosessien häiriintynyt tässä syöpä tyyppi on vaihtoehtoisen silmukoinnin, vaikka ilmiöt taustalla nämä häiriöt eivät ole tiedossa. Vaihtoehtoinen silmukointi koostuu selektiivisen poiston intronit ja liittyä jäljellä eksonien ensisijaisen transkriptio tuottaa mRNA-molekyylien eri järjestyksessä. Jatkaminen poikkeamia saattaa johtaa kasvaimen muutoksen takia synteesi heikentynyt silmukointivarianteista onkogeenisella potentiaalia. Tässä tutkimuksessa arveltu, että häiriintynyt vaihtoehtoisen silmukoinnin ccRCC voi aiheutua epäasianmukaisesta ilmentymä liitos tekijöistä, välittäjiä liittämiseen reaktioita.

Menetelmät /Principal Havainnot

Käyttämällä reaaliaikainen PCR ja Western-blot analyysissä analysoidaan ilmentyminen seitsemän liitos tekijät kuuluvat SR proteiinien perhe (SF2 /ASF, SC35, SRp20, SRp75, SRp40, SRp55 ja 9G8), ja yksi ei-SR tekijä, hnRNP A1 (heterogeeninen ydin- ribonukleoproteiini A1) 38 paria kasvain-ohjaus ccRCC näytteitä. Lisäksi olemme analysoineet silmukointi malleja viisi osallistuvien geenien syövän synnyn ja osittain säätelevät analysoitiin silmukoinnin tekijät: RON, CEACAM1, Rac1, Caspase-9, ja GLI1.

Johtopäätökset /merkitys

Löysimme että mRNA ilmentyminen silmukoinnin tekijöiden häiriintynyt kasvaimissa verrattuna pariksi valvontaa, samoin kuin tasot SF2 /ASF ja hnRNP A1 proteiineja. Korrelaatiokertoimet välinen ekspressiotasot spesifisten liitos tekijöitä korotettiin Tuumorinäytteissä. Lisäksi vaihtoehtoisen silmukoinnin viiden analysoitu geenien myös häiriintyy ccRCC näytteitä ja silmukoinnin kaksi niistä, kaspaasi-9 ja CEACAM1 korreloi ilmaus SF2 /ASF kasvaimissa. Olemme päätellä, että häiriintynyt ilmentyminen silmukoinnin tekijöiden ccRCC mahdollisesti voivat johtaa heikentyneeseen vaihtoehtoisen silmukoinnin säätelevien geenien kasvaimen kasvua ja näin edistää prosessia syövän.

Citation: Piekielko-Witkowska A, Wiszomirska H, ​​Wojcicka , Poplawski P, Boguslawska J, Tanski Z, et al. (2010) Disturbed ilmentäminen Jatkaminen tekijät Munuaisten syöpä vaikuttaa vaihtoehtoiset jatkaminen Apoptosis Regulators, Onkogeenit, ja tuumorisuppressoreilla. PLoS ONE 5 (10): e13690. doi: 10,1371 /journal.pone.0013690

Editor: Juan Valcarcel, Centre de Regulació Genòmica, Espanja

vastaanotettu: 30 kesäkuu 2010; Hyväksytty: 07 lokakuu 2010; Julkaistu: 27 lokakuu 2010

Copyright: © 2010 Piekielko-Witkowska et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tukivat: Puolan valtion komitean tieteellisen tutkimuksen Avustukset NN401354733 (APW) ja NN401073636 (AN), ja The Medical Centre jatkokoulutuksen myöntävät 501-2-25-01 /09 (APW). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

munuaissolukarsinooma (RCC) on yleisin kiinteä vaurion munuaisten ja edustaa ~ 3% kaikista ihmisen syöpäsairauksia. Euroopassa vuosittain noin 40 000 uutta tapausta, RCC diagnosoidaan ja noin 20 000 potilasta kuolee tautiin [1]. Suurin osa (80%) RCC tapauksissa histologisesti luokitella selvää solun munuaiskarsinoomia (ccRCC), joka on peräisin proksimaalitiehyeet munuaisissa. Molekyylitasolla ccRCC ei ole täysin ymmärretty. Vaikka useat molekyylimarkkerit on ehdotettu, kumpikaan heistä on hyväksytty rutiinikäyttöön kliinisessä käytössä [2].

Yksi soluprosesseja, usein häiriintynyt syöpiä, on vaihtoehtoisen silmukoinnin, prosessi selektiivisen poiston intronit ja yhteenliittämisen jäljellä eksonien, jossa mRNA-molekyylien eri sekvenssit tuotetaan. Poikkeava vaihtoehtoinen silmukointi voi johtaa kasvaimen muutoksen [3]. Heikentynyt vaihtoehtoisen silmukoinnin useiden geenien raportoitiin myös ccRCC. Esimerkiksi edellisessä työssä löysimme ccRCC erityisiä epätasapainoinen ilmentymisen tyypin 1 iodothyroine deiodinase (DIO1) silmukointivariantit [4], [5] ja transloimattomilta alueilta tyroidihormonireseptorin TRβ1 [6]. Useat muut raportit osoittavat ccRCC erityisiä häiriöitä vaihtoehtoisen silmukoinnin sisältävät muutoksia mRNA käsittelyä Mcl-1 [7], TCF-4 [8] surviviiniperäiset [9], ja OGG1 [10]. Poikkeuksellisen jatkettuja muunnoksia yllä kuvatuista geeneistä ovat harvoin vaikutuksia mutaatioita koodaavien geenien saumattu transkriptien ja lähteet häiriöiden vaihtoehtoisen silmukoinnin ovat yleensä tuntemattomia.

Vaihtoehtoinen silmukointi on monimutkainen prosessi, johon liittyy huomattava määrä proteiineja, mukaan lukien liittämiseen tekijät kutsutaan seriini-arginiini runsaasti proteiineja (SR proteiinit) [11]. Perhe SR proteiinien koostuu vähintään kaksikymmentä jäsentä, joista seitsemän: SF2 /ASF (koodaa geeni: SFRS1), SC35 (geeni: SFRS2), SRp20 (geeni: SFRS3), SRp75 (geeni: SFRS4), SRp40 (geeni : SFRS5), SRp55 (SFRS6), ja 9G8 (SFRS7) muodostavat ryhmä ”klassisen” SR proteiineja. Nämä tekijät sitoutuvat sekvenssit kutsutaan liittämiseen parantajia, joka sijaitsee eksonit (paikkansapitävyys, eksoni liittämiseen tehostajat) tai intronien (ISES, introni liittämiseen parantajia). Sitoutuminen SR proteiinien liittämiseen parantajia edistää eksonin osallisuutta. Silmukointikoneisto reaktio säätelee myös suuri joukko ei-SR tekijät, kuten hnRNPs (heterogeeninen ydin- ribonukleoproteiineissa) joka pääasiassa sitoutuvat sekvenssit liitos äänenvaimentimet ja toimia liitos repressorit [12]. Täten lopputulos vaihtoehtoisen silmukoinnin on vaikutus konsertti toiminnan antagonistisesti toimiva liitos tekijöitä. Yksi pari liitos tekijöistä esillä päinvastainen toiminta on SF2 /ASF (SR proteiini) ja hnRNP A1 (heterogeeninen ydinaseiden ribonukleoproteiini- A1, ei-SR proteiini) [13]. Ylimäärä SF2 /ASF edistää proksimaalisen 5 ’silmukoitumiskohta valikoima taas on hnRNP A1 suosii distaalinen 5’ silmukointikohtaan. Erityisiä jäsenet SR perhe voi myös toimia antagonistisesti (esim SF2 /ASF ja SRp20 [14], tai SF2 /ASF ja SC35 [15]). Näin ollen, suhteellinen, spesifisten liitos tekijät vaikuttavat asetuksen vaihtoehtoisen silmukoinnin, joka on spesifinen kudoksen tyypin ja kehitysvaiheessa.

On tunnettua, että häiriöt vaihtoehtoisen silmukoinnin voi edistää syövän synnyn, koska tuotannon kasvaimen suppressoiva tai onkogeenisten variantit geenin transkriptien, jotka vaikuttavat leviämisen, solun liikkuvuus, ja apoptoosin alttius [16]. Väärin saumattu transkriptivariantissa voi toimia myös kasvaimen biomarkkereita [17]. Kasvava todistusaineisto viittaa siihen, että liitos tekijät voivat olla suoraan mukana prosessissa Karsinogeneesin toimii esikasvaintekijät [18] tai säännellä silmukointi ja toimintaa esikasvaintekijöiden [19], tuumorisuppressorit [18] ja apoptoosisäätelijät [20 ]. Häiriintynyt ilmentyminen liitos tekijöiden raportoitu useita erilaisia ​​syöpiä [11]. Meidän viime paperi osoitimme, että ilmaisu kahden liitos tekijää, SF2 /ASF ja hnRNP A1 häiriintyy ccRCC [4], mutta tietojemme ilmaus silmukoinnin tekijöiden ryhmänä ollut koskaan analysoitu ccRCC.

tässä tutkimuksessa arveltu, että havaittu häiriöitä vaihtoehtoisen silmukoinnin ccRCC voi olla seurausta muutoksista ilmentymisen silmukoinnin tekijät, erityisesti poikkeavuuksien määrällisten välisiä suhteita. Tämän ongelman, analysoimme ilmentyminen seitsemän klassisen silmukoinnin tekijät: SF2 /ASF, SC35, SRp20, SRp75, SRp40, SRp55, 9G8 ja ei-SR tekijä, hnRNP A1. Lisäksi, tutkimaan vaikutuksia häiriintynyt ilmentyminen liitos tekijät, olemme analysoineet olemassaolo ja ilmentyminen transkriptien viisi geeniä kasvaimien syntyyn liittyvien, joiden tiedetään olevan vaihtoehtoisesti liitettyjä ja osittain säätelee analysoitiin liittämiseen tekijöitä. Olemme havainneet, että ilmaus silmukoinnin tekijät sekä vaihtoehtoisia silmukoinnin analysoitiin geenien häiritä useimmissa analysoitiin kudosnäytteistä. Olemme päätellä, että häiriintynyt ilmentyminen silmukoinnin tekijöiden ccRCC mahdollisesti voivat johtaa heikentyneeseen vaihtoehtoisen silmukoinnin säätelevien geenien kasvaimen kasvua ja siten edistää prosessia syövän.

Materiaalit ja menetelmät

Tissue yksilöitä

otettiin kudosnäytteet yksipuolisista nephrectomies suoritettiin potilailla, joilla on selkeät cell munuaissyövän (38 potilasta) luvalla eettisen komitean Human Studies (Medical Centre of jatkokoulutus). Näytteet jaettiin kahteen ryhmään: syöpäkudoksissa (n = 38, T) ja valvonta kudoksissa (pariksi normaalin kudoksen vastakkaisesta napa pahanlaatuisten munuaisten ilman histologiset kasvaimen; n = 38, C). Tyhjennä solu munuaissyövän diagnosoitiin histologia mukaan WHO: n kriteerien [21]. Kasvaimet jaettiin kolmeen ryhmään, riippuen arvosana erilaistumisen: G1 (no eriytetty), G2 (väli-tason eriyttäminen), G3 (huonosti eriytetty syövät).

RNA: n eristys

Yhteensä RNA eristettiin -100 mg jäädytettyä kudosta käyttäen GeneMATRIX Universal RNA Purification Kit (EURx, Gdansk, Puola), mukaan valmistajan protokollaa.

Käänteinen transkriptio

600 ng kokonais-RNA: käänteistranskriboitiin käyttäen RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Vilna, Liettua) ja oligo-dT-alukkeita mukaan valmistajan protokollaa. Myöhemmin PCR-analyysi 1 ui cDNA: ta käytettiin. Reaaliaikaista PCR-reaktiot 1 ui 5x laimennettua cDNA otettiin.

PCR-analyysi vaihtoehtoisen silmukoinnin

PCR-reaktio suoritettiin 1 ui 5x laimennettua cDNA käyttäen Jatkuva OptiTaq DNA Polymerase Hot Start ( EURx, Gdansk, Puola) olosuhteissa 95 ° C, 10 min. (Alkudenaturaatio), jota seurasi 35 sykliä: [95 ° C, 30 s; 58 ° C, 30 s; 72 ° C, 30 s], lopullinen venymä: 61 ° C, 10 min. Sekvenssit spesifisiä alukkeita (taulukko S1) otettiin aiemmin julkaistu raportteja: RON [19], kaspaasi-9 [22], CEACAM-1 [23], Rac1 [24], ja GLI1 [25]. PCR-tuotteet ajettiin elektroforeesilla 1-2% agaroosigeelissä värjätty etidiumbromidilla.

Reaaliaikainen PCR

Semikvantitatiivisilla reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen LightCycler® 480 DNA SYBR Green I Master (Roche Diagnostics, Mannheim, Saksa) kolmena kappaleena mukaan valmistajan protokollaa. Alukkeiden sekvenssit on esitetty taulukossa S2. Edellytykset real-time PCR olivat seuraavat: alkudenaturaatio: 95 ° C, 10 min., 45 sykliä: (95 ° C, 15 s, 57 ° C, 15 s; 72 ° C, 15 s); jonka jälkeen sulamiskäyräanalyysillä: (95 ° C, 5 min, 65 ° C, 1 min; jatkuvan lukemisen fluoresenssin 65 ° C: sta 97 ° C: 0,11 ° C /s muutosnopeus ja 5 yritysostojen kohden ° C). Tulokset normalisoitiin ilmentymisen 18sRNA isäntä-geenin

RN18S1

. Vakautta ilmaus 18sRNA oli validoitu ja vahvistettiin alustava ennalta analyysi 32 paria ohjaus ja kasvaimen näytteissä verrattuna ACTB ilme (kuva S1). ACTB Alukkeet julkaistu muualla [6].

Proteiinin uutto ja Western blot-analyysi

Western-analyysiä, kaksitoista edustaja paria kasvain ja valvonnan näytteitä otettiin. Kudosnäytteet homogenoitiin puskurissa, joka sisälsi 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 50 mM Tris-HCI, pH 8,0, proteaasiestäjäseostabletit (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO), ja 0,5 mM PMSF: ää. Homogenaatti inkuboitiin ravistellen 2 tunnin ajan 4 ° C: ssa ja sentrifugoitiin 12000 rpm 20 min, 4 ° C: ssa. Saatu supernatantti käytettiin proteiinipitoisuus analyysiä Thermo Scientific Piercen BCA Protein Assay (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) standardin protokollan. Proteiiniuutoksia jaettiin 30 ul: n eriä ja säilytettiin -70 ° C: ssa.

SF2 /ASF Western blotting, 30 ug proteiinia uutos erotettiin 10% SDS-PAGE. Elektroforeesin jälkeen proteiinit siirrettiin nitroselluloosakalvoille, jotka tämän jälkeen tukittiin yli yön 8 ° C: ssa 5% rasvatonta maitoa TBS-T-puskuria (10 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, 0,1% Tween-20, pH 7,6) . Membraanit pestiin kolme kertaa TBS-T: 10 min ajan huoneenlämpötilassa, ja inkuboitiin yön yli 8 ° C: ssa anti-SF2 /ASF-vasta-ainetta (Cat. Nro .: 32-4500, Invitrogen, Carlsbad, Ca) laimennettuna 1: 500 TBS-T-puskuria 5% rasvatonta maitoa. Pesun jälkeen 3 kertaa 10 minuutin ajan TBS-T: n, membraaneja inkuboitiin 1 tunnin ajan RT: ssä piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua vuohen anti-hiiri-vasta-ainetta (1:10000, DakoCytomation, Glostrup, Tanska), ja pestiin 3 kertaa 10 min TBS-T.

Western blottaus hnRNP A1 suoritettiin kuten SF2 /ASF-analyysi käyttäen 15 ug proteiinia ote ja anti-hnRNP A1-ainetta (cat. no .: ab10685, Abcam plc, Cambridge, UK).

proteiinit havaittiin vahvistetulla-kemiluminesenssidetektiojärjestelmää (SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate, Pierce Biotechnology, Rockford, IL) standardimenetelmien mukaan. Tämän jälkeen kalvot irrotettiin, estettiin ja inkuboitiin anti-β-aktiini-vasta-ainetta (Cat. No. Ab6276, Abcam plc, Cambridge, UK) laimennettuna 1:10000 TBS-T-puskurissa 1 tunti huoneenlämpötilassa, pestiin kolme kertaa TBS-T-puskuria, ja käsitellään edelleen kuten on kuvattu SF2 /ASF menettelyä.

määrää spesifisen proteiinin arvioitiin densitometrisesti normalisoinnin jälkeen ilmentymiseen β-aktiini.

Prediction liitos tekijä sitovat motiivit

analyysi CEACAM1 eksoni 7 sekvenssi suoritettiin ESE Finder ohjelmisto [26]. Ennustamiseen SF2 /ASF sitoutumiskohtia, kahta matriisia käytettiin: ”SF2 /ASF /IgM, BRCA1” ja ”SF2 /ASF”. Nämä kaksi matriisia saatiin eri yhteydessä (eri minigeenit ja koko satunnaisessa järjestyksessä kirjastojen SELEX [27]). Kynnysarvot käytetään ennustamiseen olivat: 1,956 (SF2 /ASF), 1,867 (SF2 /ASF /IgM, BRCA1), 2,383 (SC35), 2.670 (SRP40), ja 2,676 (SRp55). Sekvenssi eksonista 7 oli peräisin CEACAM1 transkriptio variantti 1 (Acc. No. NM_001712.3).

Tilastollinen

Shapiro-Wilk testiä käytettiin määrittämään normaalius tietojen jakaminen. Normaalisti jakautunut tulokset analysoitiin pariksi t-testi ja epäparametrinen tietoja Wilcoxonin pareittain testi.

p

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Visualisointi korrelaatiomatriisin tehtiin käyttämällä corrplot T alustalla [28].

Tulokset

mRNA ilmentyminen silmukoinnin tekijöiden häiriintyy vähintään puolet ccRCC näytteistä

Jatkaminen tekijät, jotka kuuluvat ryhmään SR proteiinit käsittävät suuren määrän rakenteellisesti ja toiminnallisesti siihen liittyvät proteiinit [11]. Tutkimuksessamme olemme keskittyneet ryhmään ”klassisen” SR proteiinit eli SF2 /ASF (koodaama geeni: SFRS1), SC35 (SFRS2), SP20 (SFRS3), SRp75 (SFRS4), SRp40 (SFRS5), SRp55 (SFRS6 ), ja 9G8 (SFRS7). Olemme myös analysoida ekspression ei-SR silmukoinnin tekijä, hnRNP A1, joka on yleisesti uskotaan toimivan antagonistina SR proteiineja.

käyttäminen reaaliaikainen PCR-huomasimme, että kuvio ilmentymisen liitos tekijöiden vaihteli välillä yksittäisille potilaille, välillä sekä ohjaus- ja kasvaimen näytteitä tietyn potilaan. mRNA ilmaus Kaikkien analysoitujen liitos tekijöiden häiriintynyt noin 50-60% (riippuen silmukointi tekijä analysoitu) kasvaimen näytteistä verrattuna pariksi normaaleissa kudoksissa (Fig. 1). Nämä muutokset ilmaisun johtui alas- tai ylössäätely analysoitiin geenien ja antanut meille mahdollisuuden jakaa kaikki kasvain näytteet kolme allasta: D, U, ja N, jossa geenien ekspressiota säädeltiin vähentävästi, upregulated tai ei ole muuttunut, vastaavasti. Suunta muuttuu eivät korreloineet kasvaimen erilaistumista (Fig. 1A).

. Ilmentymisen muutosten erityisesti paria ohjaus ja kasvainnäytteet. Kaaviossa suoritettiin perustuen datan reaaliaikainen PCR-analyysi (kuvio S2). Värit ovat ilmentymisen suhde ohjaus ja kasvaimen näytteitä. Vihreä: downregulation Tuumorinäytteissä. Red: kiihdytyssäätely Tuumorinäytteissä. Valkoinen: eroa ekspressiotasoja. Kasvaimen luokittelu (G1, G2, G3) on esitetty. B. jakautuminen muutosten mRNA: n ilmentymisen silmukointipaikoista tekijöistä. D: ryhmä näytteiden kasvainspesifisten downregulation ilmaisun; U: Näyteryhmä tuumoriperäisten erityisiä voimistumista ilmaisun; N: Näyteryhmä jotka eivät eronneet ilmaisun välillä ohjaus ja kasvaimen näytteitä. Kynnys 30% ero ilmaisun välillä ohjaus ja kasvaimen näytteitä käytettiin luokittelemaan näytteitä.

näytteiden määrä kussakin allas vaihteli n = 8 D ja n = 14 U (varten hnRNP A1) n = 17 D ja n = 4 U (for SRp40) (Fig. 2). Sillä suurin osa näytteistä, joilla on muuttunut ilme, allas D oli runsain (34-45% kaikista analysoiduista näytteistä). Ainoa poikkeus oli ilmaus hnRNP A1 joka vaimentua vain 21% näytteistä ja säädellään ylöspäin 37% kaikista analysoiduista näytteistä. Downregulation geenien altaat D vaihteli 1,9 kertaiseksi (SRp20) 2,6 kertaiseksi (SC35 ad SRp75) verrattuna kontrollinäytteitä. Geenit altaissa U oli voimistunut 1,4 kertaiseksi (9G8) 2,4 kertaiseksi (SF2 /ASF) verrattuna kontrollinäytteestä.

Expression kunkin liitos tekijän on esitetty kaksi ryhmää näytteet: tuumoriperäisten erityisiä downregulation (D) (vasemmalla) ja säätelyä (U) (oikealla). Kynnys 30% ero ilmaisun välillä ohjaus ja kasvaimen näytteitä käytettiin luokitella näytteitä. C: kontrollinäytteitä, T: kasvain näytteet. Tiedot esitetään keskiarvona ± S.E. .. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen parillista t-testiä. * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001.

Quantitative suhteiden liitos tekijöiden vaihtelevat kasvaimen ja kontrollinäytteiden

Jotta tutkia, ovatko muutokset ilmentyminen silmukoinnin tekijät korreloivat, analysoimme suhdeluvut välillä ekspressiotasot liitos tekijöistä sekä suhdelukua erityisiä parien liitos tekijöiden (Fig. 3). Olemme havainneet, että kuvio korrelaatiot vaihteli ohjaus ja kasvainnäytteet, jossa yleinen suuntaus lisätä korrelaatiokertoimet Tuumorinäytteissä (Fig. 3A). Vahvin muutokset korrelaatio havaittiin hnRNP A1. Esimerkiksi, ei ollut merkitsevää korrelaatiota hnRNP A1 ja SRp20, hnRNP A1 ja SRp75, ja hnRNP A1 ja 9G8 kontrollinäytteissä, kun taas tuumorin näytteiden näiden geenien ilmentymistä korreloi merkittävästi. Myös korrelaatio SF2 /ASF ja jäljellä kuusi analysoitu liitos tekijöitä oli vahvempi Tuumorinäytteissä.

. Taulukko, jossa korrelaatiokertoimet välillä mRNA ilmentyminen analysoitiin liitos tekijöistä. Juoni luotiin perusta Pearsonin korrelaatiokertoimet välillä ilmaus arvojen silmukointipaikoista tekijöistä. Potilaiden määrä 16 poistettiin analyysin takia poikkeama normaalijakaumaa. For SC35 (gene: SFRS2) Spearman nonparametric korrelaatiota käytettiin tietoja ei jakautunut normaalisti tässä ryhmässä. Arvot Pearson tai Spearman r on annettu alla piste kaavion. Jatkaminen tekijät ”geeni nimet näytetään suluissa. P 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. B. mRNA: n ilmentymisen suhde liitos tekijöiden tiedetään vaikuttavan antagonistisesti. Tiedot esitetään keskiarvona ± keskivirhe (For SF2 /ASF: hnRNP A1 ja hnRNP A1: SC35) tai mediaaniarvot ja 95%: n luottamusväli (for SC35: SRp55 koska tietoja ei jakautunut normaalisti tässä ryhmässä). Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen parillista t-koe (for SF2 /ASF: hnRNP A1 ja hnRNP A1: SC35) tai Wilcoxonin pariksi-koe (SC35: SRp55). n = 37 C, n = 37 T, ** p 0,01.

paria liitos tekijöitä, joiden tiedetään toimivan antagonistisesti [13] – [15], [29] . Siksi olemme analysoineet suhteet seuraavat erityiset silmukoinnin tekijät: SF2 /ASF: hnRNP A1, SF2 /ASF: SRp20, SF2 /ASF: SC35, SRp40: SRp55, SC35: SRp55, ja hnRNP A1: SC35. Huomasimme, että kolmen paria silmukoinnin tekijöitä suhteita erosivat merkittävästi Tuumorinäytteissä verrattuna kontrolli näytteitä (Fig. 3B). SF2 /ASF: hnRNP A1 suhde pieneni Tuumorinäytteissä noin 26% (1,07 ± 0,06 S.E. C vs 0,78 ± 0,06 S.E. T; p = 0,0022). Suhde SC35: SRp55 nostettiin Tuumorinäytteissä noin 40% (mediaani 1,12, alue 0,60-5,91 C, mediaani 1,57, alue 0,59-12,29 T; p = 0,0073). Sillä suhde hnRNP A1: SC35 oli pieni (15,3%), mutta tilastollisesti merkittävä kasvu kasvainten verrattuna kontrollinäytteisiin (0,77 ± 0,05 SE C vs 0,89 ± 0,064 SE T; p = 0,0197).

proteiini ilmentyminen SF2 /ASF ja hnRNP A1 häiriintyy ccRCC

Voit tarkistaa, ovatko muutokset mRNA tasolla tuloksen samanaikaisen häiriöitä proteiinin ilmentymisen suoritimme Western blot-analyysi kahden liitos tekijää, SF2 /ASF ja hnRNP A1 kahteentoista edustajan paria ohjaus ja kasvaimen näytteitä (Fig. 4). Itse asiassa huomasimme merkittäviä eroja proteiinin tasojen liitos tekijöitä ohjaus ja kasvaimen näytteitä. Samalla tavoin kuin siinä tapauksessa, että mRNA: n analyysi, muutokset olivat vaihtelevia, mutta ei korreloinut mRNA: n ilmentymisen. Kun useimmissa analysoitu pariksi kudosnäytteiden ilmentyminen silmukoinnin tekijän vähennettiin näytteistä T verrattuna näytteiden C (SF2 /ASF: 9 paria; hnRNP A1: 8 paria).

Kasvain laadut erilaistumisen esitetään ( G1, G2, G3). Western-blotit SF2 /ASF (A) ja hnRNP A1 (B) käytettiin semikvantitatiivinen analyysi proteiinivyöhykkeet normalisoinnin jälkeen on P-aktiini. Harmaat pylväät edustavat kontrollinäytteistä. Mustat palkit kasvain näytteissä.

useita näytteitä lisä- tai siirtynyt bändejä näkyi erityisesti blots on SF2 /ASF (Fig. 4A). Tällainen kuva on ominaista eri fosforyloidun molekyylien SF2 /ASF-proteiinia [30].

vaihtoehtoinen silmukointi geenien kasvainten synnyssä ja säätelevät liittämiseen tekijät häiriintyy ccRCC

SF2 /ASF säätelee vaihtoehtoisen silmukoinnin merkittävä määrä geenejä, mukaan lukien RON esikasvaintekijän [19], apoptoosin säädin kaspaasi-9 [22], ja Rac1, jäsen Ras perheen esikasvaintekijöiden (säädellään SF2 /ASF ja SRp20) [14 ]. Tutkia muutoksia määriä silmukoinnin tekijöistä seuraa muutoksia vaihtoehtoisia käsittely kohdegeenien, analysoimme niiden liitos kuvioita (Fig. 5). Lisäksi olemme analysoineet silmukoinnin profiilit kaksi geeniä: GLI1 onkogeenin [25] ja CEACAM1 tuumorisuppressorigeenin [23], jonka häiriintynyt silmukoinnin tiedetään osaltaan kasvaimen etenemistä.

. PCR-analyysi vaihtoehtoisen silmukoinnin kuvioita kaksitoista paria ohjaus (C) ja kasvaimen (T) kudosnäytteistä. 1) RON; 2) CEACAM-1; 3) Rac1; 4) Kaspaasi-9; 5) GLI1. Kannat alukkeita käytettiin PCR: ään on esitetty suhteessa eksonit. Vaihtoehtoisesti saumattu eksonit varjostetaan. Luottamuksellisuusluokitukset kasvaimen erilaistumiseen näkyvät (G1, G2, G3). B. Kaavio ilmaus suhdeluvut silmukointivarianteista määritettynä densitometrisellä analyysiin elektroforeesilla PCR-tuotteiden. Huomaa eri akselin mittakaavoissa. Harmaat pylväät edustavat kontrollinäytteistä. Mustat palkit edustavat kasvaimen näytteitä.

Huomasimme, että tasot eri silmukoivia muunnoksia analysoitiin geenien vaihteli suurin kahdentoista analysoitiin paria ohjaus ja kasvaimen näytteitä, joissa proteiinin taso SF2 /ASF ja hnRNP A1 analysoitiin (kuvio. 5B). Expression of RON esikasvaintekijän silmukoitumisvariantit Ron ja ΔRon vaihteli näytteiden spesifisten laatujen erilaistumista. Kaikissa G3 kasvain näytteet suhde ΔRon /Ron oli korkeampi kuin pariksi kontrollinäytteiden. Näytteissä G1 kasvainspesifisen suhde ΔRon /Ron on suurempi tai samanlainen verrattuna kontrollinäytteisiin. Otetuissa näytteissä potilasnumero 13 molemmat isoformit olivat poissa kasvaimen ja kontrollinäytteiden. Tuumorinäytteissä luokiteltu G2 suhde ΔRon /Ron oli vaihteleva: kahdessa Tuumorinäytteissä se oli samanlainen kuin pariksi valvonta, yhdessä näytteessä se oli korkeampi kuin pariksi ohjaus ja yhdessä näytteessä se oli pienempi kuin pariksi kontrolli. Jatkaminen malleja CEACAM1 ei riipu erilaistumiseen luokan kasvaimen näytteen. Seitsemän näytettä paria suhde CEACAM1-S /CEACAM1-L oli suurempi kasvaimia kuin kontrollinäytteestä. Kahdessa näytteessä paria CEACAM1-S ei havaittu. Silmukoinnin Rac1 oli samanlainen useimmissa tutkituissa näytteissä. Suhde Rac1b /Rac1 oli korkeampi kontrollinäytteiden kuin pariksi kasvainten yksitoista analysoiduista kudoksen paria. Seitsemän analysoidun näytteen paria paljasti suurempi suhde kaspaasi-9b /kaspaasi-9 kasvaimissa kuin kontrollinäytteiden riippumattomasti erilaistumisen laadut. Silmukoinnin GLI1 oli kaikkein muuttuja. Suhde GLI1-FL /GLI1-Dn seitsemässä Tuumorinäytteissä oli korkeampi kuin pariksi valvontaa. Kaksi paria näytettä ei ollut eroja suhde analysoitiin silmukointivarianttien; kuitenkin muita bändejä oli nähtävissä, mikä viittaa läsnäolo ei tunnistettu silmukointivariantit.

Jotta voitaisiin löytää mahdollinen yhteys ilmentymisen muutosten SF2 /ASF ja silmukoinnin SF2 /ASF geenien suoritimme Pearsonin korrelaatio analyysi välillä ilmaus liitos tekijät ja kohde eksonin silmukoinnin (Fig. 6). Positiivinen korrelaatio (r = 0,6915, p = 0,0127) välillä kaspaasi-9a ja SF2 /ASF-proteiini havaittiin kasvain, mutta ei kontrollinäytteiden (r = 0,004644, p = 0,9886). Olemme myös löytäneet positiivinen korrelaatio (r = 0,6187, p = 0,0320) välillä CEACAM1-L ja SF2 /ASF proteiini kasvaimissa mutta ei kontrollinäytteiden (r = 0,4482, p = 0,1439). Emme löytäneet korrelaatiota ilmentymisen SF2 /ASF (tai hnRNP A1) proteiineja ja silmukointivariantit Ron, Rac1 tai GLI-1 (tietoja ei esitetty).

Pearson korrelaatio analyysi suoritettiin tietojen kahdentoista paria ohjaus ja kasvain kudosnäytteitä. P 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Vaikka tiedetään, että SF2 /ASF säätelee silmukoinnin kaspaasi-9 [22], ei ole olemassa tietoja, jotka osoittavat, että CEACAM1-L on tavoitteeksi SF2 /ASF tai muun liitos tekijöitä. Kuitenkin todettiin, että eksoni 7 CEACAM1 sisältää cis-vaikuttavan silmukoinnin säätelyelementtejä [23]. Siksi olemme analysoineet sekvenssin CEACAM1 eksonin 7 matriisien avulla ennustamiseen tarvittavat sekvenssit sitoutumisen liittämiseen factors SF2 /ASF, SC35, SRp40 JA SRp55 (Fig. 7). Tämä analyysi paljasti useita korkea-pisteet motiivit SF2 /ASF, kaksi motiivit SC35, kolme aihepiiriin SRp40, ja yksi motiivi SRP55.

ennustaminen motiivien suoritettiin ESE Finder ohjelmisto [26] avulla matriiseja ennustaminen tarvittavat sekvenssit sitoutumisen liittämiseen tekijöistä. Ennustamiseen SF2 /ASF sitoutumiskohtia, kahta matriisia käytettiin: ”SF2 /ASF /IgM, BRCA1” (valkoiset pylväät) ja ”SF2 /ASF” (harmaat palkit). Nämä kaksi matriisia saatiin eri yhteydessä (eri minigeenit ja koko satunnaisessa järjestyksessä kirjastojen SELEX [27]). Vain korkea-pisteet motiiveja edellä kynnykset SF2 /ASF (1,956), SF2 /ASF /IgM, BRCA1 (1,867), SC35 (2,383), SRP40 (2.670), ja SRp55 (2,676) on esitetty. Nukleotidisekvenssi CEACAM1 eksonin 7 on esitetty x-akselilla.

Keskustelu

Tässä artikkelissa osoitetaan, että mRNA: n ilmentymisen kahdeksan liitos tekijöiden häiriintyy ccRCC. Proteiini ilmentyminen kaksi liittämiseen tekijöiden tiedetään vaikuttavan antagonisti-, SF2 /ASF ja hnRNP A1 on myös häiriintynyt. Nämä poikkeamiin liittyy heikentynyt vaihtoehtoisen silmukoinnin on SF2 /ASF riippuvainen geeneistä, RON, Caspase-9, ja Rac1. Kasvainspesifiset häiriöitä vaihtoehtoisen silmukoinnin löydettiin myös GLI1 onkogeeni ja CEACAM1 kasvaimia estävä.

Muutokset ennalta mRNA ovat yleinen ilmiö ihmisen syöpäsairauksia. Tutkimuksemme, improperties ilmentymisessä silmukoinnin tekijöitä esiintyy vähintään puolet (50-60%) analysoiduista näytteistä, vaikka häiriöt ovat monipuolisia ja johtuvat sekä ylä- ja downregulation liitos tekijöiden (Fig. 1 ja 2). Suunta muuttuu ei ole spesifinen kasvaimen laadut erilaistumisen koska sekä ylä- ja downregulation havaittiin kaikissa lajittelusta. On huomattava, että vaikka useimmat julkaisut viittaavat kasvainspesifisen kasvua liitos tekijöiden ilmentymisen, prosenttiosuus näytettä, jossa häiriintynyt ilmentyminen tapahtuu harvoin esitetty. Karnissa et ai. [18] on raportoitu, että yksi 50 analysoitiin ccRCC näytettä yli 2-kertainen yliekspressio SF2 /ASF-mRNA: ta havaittiin alle 5% näytteistä. Tehdyn analyysin prosenttiosuus näytteistä, joissa on enemmän kuin 2-kertainen yliekspressio oli hieman suurempi (8%), mutta tämä ero voi johtua suhteellisen pieni määrä analysoiduista näytteistä.

Kiinnostavaa kyllä, havaitsimme, että kuviot mRNA ja proteiinin ilmentymistä liitos tekijöiden vaihteli yksittäisten potilaiden välillä ja myös ohjaus ja kasvaimen näytteitä tietyn potilaan. Tämä on yhtäpitävä edellisessä tutkimuksessa osoittaa kasvainspesifisiä ja potilaskohtaista silmukointi malleja tyypin 1 jodityroniini deiodinase [4] sekä muista tutkimuksista, jotka osoittavat, että ccRCC on ominaista molekyylien heterogeenisyys ja voidaan erottaa geeniekspressiota alaryhmiin [31] – [33]. Tutkimuksessa Zhao et al. [33] nämä ilmaisua alaryhmien korreloi selviytymisen leikkauksen jälkeen, mutta, samoin kuin Tutkimuksessamme ei korreloinut kasvaimen laadut. Valitettavasti tapauksessa tutkimuksessamme potilaista ei ole seurattu siten ei voida analysoida välistä korrelaatiota ilmentymisen profiilien ja potilaiden eloonjäämisen. Klein et ai. [34] analysoitiin yksi jäljellä syöpäsolujen useita kasvaimia (mutta ei munuaisten alkuperää) ja todettu korkea heterogeenisuus geenin ilmentymisen välillä erityisesti syöpäsoluja. Ne solut olivat heterogeenisiä riippumatta siitä asuivat samassa osastossa tai sisällä eri itseohjautuva sivustoja. Potilaan erityinen vaihtelu geeniekspression raportoitiin myös rintasyövän ja eturauhassyövän [35], [36].

geenin ilmentyminen vaihtelu on mielenkiintoinen kysymys, ja ainakin kaksi mahdollista alkuperää on otettava huomioon: että muunnelmat heijastaa kasvaimen spesifisyyttä tai, että ne vastaavat yksittäisen potilaan ominaisuuksista, jotka johtavat tietyn kuvan geenin ilmentymisen kasvaimen. Ensimmäinen tilanne kuvattiin maksasyövän jossa erilliset kasvaimia yhdestä potilas osoitti dramaattisen eroja geeniekspressiomalleja [37]. Toisaalta, Perou et ai. [35] on raportoitu, että geeni-ilmentymisen kuviot eri rintasyöpäsolujen otettujen näytteiden yhden potilaan olivat keskenään samanlaisia ​​kuin otettujen muista potilaista. Ei ole selvää, mikä tilanne koskee myös tutkimuksessa analysoitiin yksittäisten näytteiden potilasta kohden. Kuten olemme hiljattain osoittaneet, kuitenkin, ccRCC kasvaimet voivat myös paljastaa enemmän homogeeninen geeniekspressiomalleja [6]. Tässä tutkimuksessa, jossa käytettiin osittain samaa materiaalia kuin tässä asiakirjassa, löydettiin erittäin tasainen ccRCC kasvain erityisiä häiriöitä kilpirauhashormonin reitin: lasku tyroidihormonireseptorin β1 (TRβ1) mRNA: ta ja proteiinia, menetys tyypin 1 iodothyonine deiodinase proteiinin ja alentuneita kilpirauhashormonin trijodityroniinin (T3).