Krooninen sairaus

tiivistelmä

tavoite

Tämä on tutkia roolia Mas liittyvän geenin (MRG) C patogeneesissä ja hoidossa luun syöpäkivun (BCP).

Methods

BCP hiirimallissa määritettiin osteosarkooman soluinokulaation. Pain-liittyvä käyttäytyminen arvioitiin kanssa spontaani nosto- käyttäytymisen testi ja mekaaninen allodynia testi. Ekspressiotasot MrgC, Gi ja NR2B- selkäytimessä ei havaittu Western blot-analyysi ja immunohistokemia.

Tulokset

Pain liittyvästä käyttäytymisestä testit osoittivat merkitsevästi lisääntynyt spontaani flinches (NSF) ja väheni käpälän poisvetämisen mekaaninen kynnys (PWMT) hiirimalleissa BCP. Western blot-analyysi osoitti, että verrattuna kontrolliryhmään ja ennen mallinnusta, kaikki ekspressiotasot MrgC, Gi ja NR2B- selkäytimessä BCP hiiriä dramaattisesti koholla, joita erityisesti lisääntynyt päivänä 7 leikkauksen jälkeen ja sen jälkeen, vuonna aika-riippuvaisella tavalla. Lisäksi hoito MrgC agonistin BAM8-22 merkittävästi säädelty Gi ja alassäädetty NR2B- ekspressiotasot, selkäytimessä BCP hiiriä, on ajasta riippuva tavalla. Toisaalta, anti-MrgC merkitsevästi alassäädetty Gi ilmaisu, kun taas dramaattisesti sääteli NR2B- ilme, että BCP hiirillä. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin immunohistokemiallinen tunnistus. Tärkeää on, BAM8-22 vaimensi merkittävästi nociceptive käyttäytymistä BCP hiirillä.

Johtopäätös

tulokset osoittivat MrgC välittämää Gi ja NR2B- ilmaisun muutoksia BCP hiirillä, mikä saattaa edistää kipu yliherkkyyttä. Nämä havainnot voivat tarjota käyttöön uusi strategia hoitoon BCP klinikalla.

Citation: Sun Y, Jiang M, Hou B, Lu C, Lei Y, Ma Z, et al. (2016) Mas liittyvistä Gene (MRG) C Aktivointi Vaimentaa Luusyöpä Pain kautta Moduloiva Gi ja NR2B. PLoS ONE 11 (5): e0154851. doi: 10,1371 /journal.pone.0154851

Editor: Shao-Jun Tang, University of Texas Medical Branch, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 27 joulukuu 2015; Hyväksytty: 20 huhtikuu 2016; Julkaistu: 06 toukokuu 2016

Copyright: © 2016 Sun et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Natural Foundation of China (81400914, 81500954, 81371207, 81300950 ja 81500955), National Natural Foundation Jiangsun maakunnassa Kiinassa (RC2011006 ja XK201140), ja lääketieteellisen teknologian kehittämishanke Nanjing (YKK13068). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Bone syöpä kipu (BCP) on yksi hankalimmista tekijöistä kärsivillä potilailla ensisijainen luukasvaimet tai luumetastaaseja, joka vaikuttaa voimakkaasti potilaiden elämänlaatua [1]. Toistaiseksi mekanismi BCP ei ole vielä täysin selvitetty, ja nykyiset hoidot ovat aina väistämättä mukana merkittäviä haittavaikutuksia [2, 3]. Siksi on todella tärkeää ja kiireellistä kehittää uusia tehokkaita terapeuttisia strategioita BCP klinikalla.

Lukuisat tutkimukset osoittavat, että jyrsijöillä, mas liittyvä geeni (MRG) C, tuntohermosolun-erityisiä GPCR, osakkeita olennaisesti homogeeniseksi, ja sen ihmisen homologi, MrgX1, jossa on noin 45-65%: n aminohapposekvenssi-identtisyys [4]. MrgC sijaitsee nimenomaan pieni halkaisijaltaan takajuuren hermosolu (DRG) hermosolujen, jotka ovat oletettavasti nociceptive. On osoitettu, että intratekaalinen injektio MrgC agonisti, so BAM8-22 ja γ2-MSH, voisi tuottaa antinosiseptiivisia vaikutuksia ja vaimentavat lämpöä hyperalgesia akuutin kivun malleissa [5-7]. Lisäksi, julkaisemattomia tietoja meidän lab on myös osoittanut, että potilaille annettiin intratekaalisesti MrgC agonistin BAM8-22 lieventäisi BCP hiirimallissa, annoksesta riippuvalla tavalla.

NR2B on yksi alayksiköistä NMDA-reseptorin , jonka on osoitettu olevan osallisena kivun asetuksessa eri vammoja [8, 9]. Tyrosiinifosforylaation NR2B selkäytimessä liittyy Keski herkistyminen, lisäämällä selkä sarvi excitability ja helpottaa aistiärsykkeisiin, joka voi olla vastuussa BCP [10, 11]. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että NMDA-reseptorin antagonistit (kuten ketamiinin) ja NR2B-selektiivisiä antagonisteja (esimerkiksi ifenprodiili ja Ro25-6981) voitaisiin käyttää voimakkaita analgeettisia vaikutuksia eläinmalleissa BCP [12, 13]. Nämä antagonistit on myös osoitettu olevan yhteydessä sietämättömiä haittavaikutuksia, kuten muistin heikkeneminen ja psykotomimeettistä vaikutuksia. Siksi on erittäin tärkeää tutkia uusia keinoja säädellä NMDA-reseptorien, vaikuttamatta pohjapinta-reseptorin aktiivisuutta, saavuttaa parempia kipua lievittävä vaikutus.

Tässä tutkimuksessa hiirimallissa BCP perustettiin rokotus of luusarkoomasoluissa, ja rooli MrgC patogeneesissä ja hoidossa BCP tutkittiin. Pain-liittyvä käyttäytyminen arvioitiin näissä hiiren malleissa, ja ekspressiotasot Gi ja NR2B selkäytimessä havaittiin myös, ennen ja jälkeen manipuloinnin MrgC.

Materiaalit ja menetelmät

Eläimet ja soluviljelmissä

aikuinen mies C3H /HeJ hiiriä, 4-6 viikon ikäisiä, paino 18-22 g, ostettiin Vital River Experimental Animal Center, Peking, Kiina. Nämä eläimet totutettiin yksittäin alle 12/12 h valo /pimeä sykli, tasaisessa huoneen lämpötilassa 24 ° C, jossa on vapaa pääsy ruokaan ja veteen. Kaikki eläinkokeiden menettelyjä hyväksymiä Animal Care ja käyttö komitean Affiliated Drum-torni Hospital Medical College of Nanjing University. Fyysistä kuntoa Hiiriä seurattiin ennen kutakin käyttäytymistä testejä, ja mikään näistä hiiret kuolivat odottamatta ennen kokeellista päätepisteen.

Fibrosarcoma NCTC 2472-soluja (2087787; American Type Culture Collection, ATCC, Manassas, VA, USA ) viljeltiin NCTC 135 väliaineessa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), jossa oli 10% hevosen seerumia (Gibco, Grand Island, NY, USA) 5% CO

2, 37 ° C: ssa inkubaattorissa .

eläinten ryhmittely ja mallinnus

BCP kautta luotiin mukaisesti aiemman menettely Schwei

et al

. [14]. Lyhyesti, hiiret nukutettiin kanssa injektoimalla vatsaonteloon 50 mg /kg pentobarbitaalinatriumilla (1% suolaliuoksessa) ja pinnallinen tehtiin viilto ihossa päällä oikealla articulatio genu. Gonarthrotomy suoritettiin paljastamiseksi reisiluu kondyylit, joka alistettiin sitten valoa masennuksen aiheuttama hampaiden poranterä. Cortex oli lävistetty 30-neula. Sillä hiiret mallissa ryhmässä (n = 60), 20 ui α-MEM, joka sisälsi 2 x 10

5 NCTC 2472 solua ruiskutettiin intramedullaarisessa tilaan oikean reisiluun käyttäen 25-ul mikroruisku. Hiiret, vale-ryhmässä (n = 20) injektoitiin α-MEM yksin. Injektio reikä suljettiin hammasamalgaamissa ja runsas kastelu toteutettiin suolaliuoksella ennen haavan päätettiin lopullisesti. Kaikki tarvittavat toimenpiteet tehtiin minimoimiseksi mahdollisten kipua ja kärsimystä. Esimerkiksi hiiret olivat nukutuksessa kun menettelyt suoritettiin. Kiristysside käytetään vähentämään verenvuotoa niin paljon kuin mahdollista. Infektio estettiin toimimalla steriileissä olosuhteissa ja steriilillä varusteet.

Pain liittyvästä käyttäytymisestä testejä

Kun mallinnus, spontaani nosto- käyttäytymisen testi ja mekaaninen allodynia testi tehtiin mitata spontaanien flinches (NSF) ja käpälän poisvetämisen mekaaniset kynnys (PWMT), tässä järjestyksessä. Kaikki testit tehtiin valoisan vaiheen aikana, ja hiiret annettiin mukautua vähintään 30 minuuttia ennen jokaista testiä. NSF ja PWMT tutkittiin ennen eläimen mallinnus (päivä 0), päivinä 3, 5, 7, 10, ja 14 jälkeen mallinnuksen, ja päivinä 1, 3 ja 7 lääkkeen annon jälkeen.

spontaani nosto käyttäytymisen testi, hiiren pidettiin yksittäisen pleksi osastoon (10 cm x 10 cm x 15 cm) 30 minuuttia, ja oikea takajalan NSF kirjattiin 2 min. Lift oikean takajalan eivät liity kävely tai grooming pidettiin yhtenä Flinch.

Toisaalta, mekaaninen allodynia Testi suoritettiin Von Frey filamentit (0,16-2,0 g Taivutusvoiman; Stoelting, Wood Dale, IL, USA), kuten ovat kuvanneet Chaplan

et ai

. [15]. Hiiri pantiin yksittäisen läpinäkyvä pleksi osaston (10 cm x 10 cm x 15 cm) on metalliverkolla kerroksessa 0,5 cm x 0,5 cm neliöitä. Säikeet suunnattu pystysuoraan vasten jalkapohjan pinta riittävällä voimalla aiheuttaa taivutus vastaan ​​eläimen tassu, joka pidettiin 6-8 s kerta, jossa on 10-min välein. Positiivinen vaste määriteltiin reipas peruuttamiseen tai tassu flinching, ja PWMT määritettiin käyttämällä peräkkäin lisäämällä ja vähentämällä ärsykkeen voimakkuus (eli ylös-alas-menetelmä). Kukin käpälä testattiin viisi kertaa per ärsyke voimaa, kunnes sulku voima 2,0 g. Pienin hehkulanka lujuus vähintään kolmella positiivisia vastauksia pidettiin PWMT.

Drug valmistelu ja hallinto

Lääkkeet valmistettiin ja annettiin mukaan aiemmin julkaistujen menetelmien [5]. BAM8-22 (SML0729; Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) ja anti-MrgC-vasta-aine (orb101320; Biorbyt, San Francisco, CA, USA) olivat molemmat liuotettiin suolaliuokseen. 14 päivän kuluttua mallinnus, hiiren mallia jaettiin satunnaisesti kolmeen ryhmään: (1) BCP-mallin kontrolliryhmä (n = 20), jossa tuumoreita kantavaa hiirtä sai vehikkeliä (suolaliuosta) pelkästään; (2) BAM8-22 ryhmä (n = 20), jossa BCP hiiriä käsiteltiin BAM8-22; ja (3) anti-MrgC ryhmä (n = 20), jossa BCP hiiriä käsiteltiin anti-MrgC. Sillä BCP + B ja BCP + A-ryhmien, 5 ui BAM8-22 (8,0 nmol) tai anti-MrgC (1/20, tilavuus /tilavuus) annettiin intratekaalisesti, kerran vuorokaudessa, 7 peräkkäisen päivän ajan [16].

Western blot-analyysi

Hiiret tapettiin katkaisemalla kaula, kun syvä anestesia 100 mg /kg pentobarbitaalinatriumia. Lannerangan L

3-L

5 segmenttejä poistettiin ja varastoitiin nestemäisessä typessä. Kudosnäytteet homogenisoitiin lyysipuskurilla, jota seurasi sentrifugointi (4 ° C) 13000 rpm: ssä 10 min. Proteiinipitoisuus määritettiin BCA Kit (Thermo Fisher Scientific Life Science Research, Shanghai, Kiina). Proteiini näyte erotettiin SDS-PAGE ja sen jälkeen siirrettiin polyvinylideenidifluoridi (Millipore, Billerica, MA, USA). Kun oli salvattu 5% rasvatonta maitoa huoneenlämmössä 1 h, kaivoa inkuboitiin kanin anti-hiiri-anti-MrgC polyklonaalista vasta-ainetta (1: 500 laimennos, orb101320, Biorbyt), hiiren anti-hiiri-anti-NR2B-monoklonaalinen vasta-aine (1: 1000 laimennos, ab93610, Abcam, Cambridge, MA, USA), ja kanin anti-hiiri-anti-Gi polyklonaalista vasta-ainetta (1: 500 laimennos, ab140333, Abcam), vastaavasti. Pesun jälkeen kaivoa inkuboitiin vuohen anti-kani IgG: tä (1: 5000 laimennos, ab6721, Abcam) tai vuohen anti-hiiri-IgG: tä (1: 5000 laimennos, ab6789, Abcam). Proteiini bändi visualisointi saavutettiin ECL-menetelmällä (Santa Cruz, Santa Cruz, CA, USA), ja proteiini kvantifiointi suoritettiin IPLab ohjelmisto (Scanalytics, Fairfax, VA, USA). β-aktiini käytettiin vertailuohjaussignaalit.

immunohistokemia

Immunohistokemiaa lannerangan selkäytimen L

3-L

5 segmenttejä perfusoitiin 4% paraformaldehydi 0,1 M fosfaattipuskuria (pH 7,4), päivänä 3 lääkkeen antamisen jälkeen. Kudokset leikattiin 25 um: n leikkeitä liukuvalla mikrotomi. PBS-pesun jälkeen, leikkeet blokattiin 10% (v /v) normaalia naudan sikiön seerumia huoneenlämmössä 1 tunti. Sitten leikkeitä inkuboitiin kaniinin anti-hiiri-anti-MrgC polyklonaalista vasta-ainetta (1: 250 laimennos, orb101320, Biorbyt) tai hiiren anti-hiiri-anti-NR2B-monoklonaalinen vasta-aine (1: 500 laimennos, ab93610, Abcam) 4 ° C: ssa 48 h. Pesun jälkeen leikkeitä inkuboitiin Alexa Fluor 594 vuohen anti-kani-IgG: tä (1: 500 laimennos, ab150084, Abcam) ja Alexa Fluor 488 vuohen anti-hiiri-IgG (1: 500 laimennos, ab150117, Abcam) 4 ° C: ssa yön yli . Sulkemisen jälkeen, leikkeet kuvattiin 200-kertainen suurennus Leica TCS SP2 multiphoton -konfokaalimikroskoopilla (Leica Microsystems, Wetzlar, Saksa), ja kuvat analysoitiin Image-Pro Plus ohjelmisto (Media Cybernetics, Rockville, MD, USA) .

tilastollinen

tiedot ilmaistiin keskiarvona ± SD. Yksisuuntainen ANOVA suoritettiin vertailuihin, LSD jälkikäteen testi kun havaittu merkitseviä eroja.

P

0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Pain liittyvä käyttäytyminen BCP hiirillä

arvioimiseksi kipuun liittyvä käyttäytyminen oikeaan takajalan BCP hiirissä spontaanien flinches (NSF) ja käpälän poisvetämisen mekaaniset kynnys (PWMT) mitattiin ennen mallintaminen (päivä 0) ja päivinä 3, 5, 7, 10, ja 14 jälkeen malli perustamisen. Tuloksemme osoittivat, että ei ollut merkittävää eroa NSF ja PWMT välillä huijausta ja malli ryhmiä ennen mallintamista (kuvio 1). NSF, että huijausta ryhmässä NSF oli merkittävästi kohonnut päivänä 3 leikkauksen jälkeen (

P

0,05), joka palasi tasolle verrattavissa ennen mallintamista 5. päivänä leikkauksen jälkeen ja sen jälkeen (kuvio 1A). Toisaalta, mallissa ryhmässä, verrattuna ennen mallinnusta, NSF oli myös merkittävästi kohonnut päivänä 3 jälkeen mallintaminen (

P

0,05), ja väheni sitten hieman 5. päivänä mallinnuksen jälkeen. Kuitenkin NSF mallissa ryhmä jatkoi kasvuaan päivinä 7, 10 ja 14 jälkeen mallinnus, joka oli huomattavasti korkeampi kuin ennen mallintaminen (kaikki

P

0,05) (kuvio 1A). Sillä PWMT, että huijausta ryhmässä, PWMT merkittävästi vähentynyt päivänä 3 leikkauksen jälkeen (

P

0,05), joka sitten palautetaan vastaavalle tasolle, ennen mallinnus 2 päivää myöhemmin ja sen jälkeen (kuvio 1 B). Mallissa ryhmässä, verrattuna ennen mallinnuksen PWMT merkittävästi vähentynyt päivänä 3 jälkeen mallintaminen (

P

0,05), ja sitten hieman koholla 2 päivää myöhemmin. Kuitenkin PWMT mallissa ryhmässä pidetään laskussa päivinä 7, 10 ja 14 jälkeen mallinnus, mikä oli merkittävästi pienempi kuin ennen mallintaminen (kaikki

P

0,05) (kuvio 1 B). Yhdessä nämä tulokset osoittavat perustamisen onnistuminen hiirimallissa BCP, jotka soveltuvat seuraaviin tutkimuksen.

NSF (A) ja PWMT (B) arvioitiin huijausta ja BCP malli ryhmät (n = 8) ennen eläimen mallinnus (päivä 0) ja päivinä 3, 5, 7, 10, ja 14 jälkeen malli perustamisen. Verrattuna ennen mallinnusta, *

P

0,05; verrattuna huijausta ryhmän vastaaviin ajankohtana,

#

P

0.05.

Up-säänneltyjen ilmentymä MrgC, Gi, ja NR2B- selkäytimen BCP hiirten

ilmentymisen tutkimiseksi tasoa MrgC, Gi ja NR2B- selkäytimessä BCP hiirillä, Western blot-analyysi suoritettiin. Tuloksemme osoittivat, että verrattuna huijausta ryhmän ja ennen mallinnusta, kaikki ekspressiotasot MrgC, Gi ja NR2B- että BCP hiiriä dramaattisesti koholla jälkeen mallinnus, joita varsinkin yhä 7. päivänä leikkauksen jälkeen ja sen jälkeen, on aika -riippuvaista tavalla (kaikki

P

0,05) (kuvio 2). Nämä tulokset viittaavat siihen, ilmentymistasojen MrgC, Gi ja NR2B- selkäytimessä ovat säädellään ylöspäin BCP hiirillä, mikä edistää patogeneesiin ja kehittämiseen BCP.

(A) Ilmentymistasoja of MrgC, Gi ja NR2B- selkäytimessä on huijausta hiirillä ja BCP hiiret tunnistettiin Western blot-analyysi ennen eläimen mallinnus (päivä 0; D0) ja päivinä 3, 5, 7, 10, ja 14 (D3- D14) jälkeen malli perustamisen. (B-D) tilastotiedot MrgC (B), Gi (C), ja NR2B- (D) selkäydin näennäistä ja BCP hiiriä (n = 6). Verrattuna ennen mallinnusta, *

P

0,05; verrattuna huijausta ryhmä,

#

P

0.05.

vaikutukset MrgC agonistin ja anti-MrgC on Gi ja NR2B- ilmaisun selkäydin BCP hiirten

vaikutusten arvioimiseksi MrgC agonistin ja anti-MrgC ilmenemistä tasot MrgC, Gi ja NR2B- selkäytimessä BCP hiirillä, nämä eläinmalleissa ensin annettiin BAM8-22 tai anti-MrgC, ja sitten ekspressiotasot MrgC, Gi ja NR2B- selkäytimessä ei havaittu Western blot-analyysi ja immunohistokemia. Tuloksemme Western blot-analyysi osoitti, että verrattuna kontrolliryhmään (hiiri malleissa vastaanottaa ajoneuvoon), MrgC agonisti BAM8-22 merkittävästi sääteli ilmentymisen tasot MrgC ja Gi, samalla merkittävästi alas-säännelty NR2B ilmentymistaso, selkäytimessä BCP hiiriä, on ajasta riippuva tavalla (

P

0,05) (kuvio 3A-3D). Toisaalta, verrattuna kontrolliin (ajoneuvo) ryhmä, anti-MrgC merkitsevästi alassäädetty ilmentymisen tasot MrgC ja Gi, kun taas dramaattisesti ajan säännelty NR2B ilmaisun tasolla, selkäydin BCP hiiriä, joka aika-riippuvaisella tavalla (

P

0,05) (kuvio 3A-3D). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin immunohistokemiallinen havaitsemiseksi MrgC ja NR2B selkäytimessä BCP hiirillä. Kontrolliin verrattuna (ajoneuvo) ryhmä, ilmentymistasojen NR2B selkäytimessä merkittävästi laski BAM8-22 ja merkittävästi kohonnut anti-MrgC, että BCP hiirillä (molemmat

P

0,05) (kuvio 3E-3G). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että manipulointi MrgC voisi merkittävästi vaikuttaa ekspressiotasot Gi ja NR2B selkäytimessä BCP hiirillä.

(A) Ilmaus tasot MrgC, Gi, ja NR2B vuonna selkäydintä tunnistettiin Western blot analyysissä huijausta hiirillä, mallirastilla (Veh) hiiriä, ja malli hiirille annettiin BAM8-22 tai anti-MrgC, päivinä 1, 3 ja 7 lääkkeen annon jälkeen. (B-D) Tilastolliset analyysit MrgC (B), Gi (C), ja NR2B (D) ekspressiotasot lääkkeen antamisen jälkeen kuten Western blot -analyysillä (n = 6). (E) Expression of MrgC (punainen) ja NR2B- (vihreä) selkäytimessä ei havaittu immunohistokemia huijausta hiirillä, mallirastilla (ajoneuvo) hiiriä, ja malli hiiriä hoidettiin BAM8-22 tai anti-MrgC (x 200) . (F-G) Tilastolliset analyysit MrgC (F) ja NR2B (G) ekspressiotasot lääkkeen antamisen jälkeen kuten immunohistokemialla (n = 6). Verrattuna vehikkeliryhmässä,

P

0,05; verrattuna entiseen ajankohtana,

$

P

0.05.

MrgC agonisti vaimentaa nociceptive käyttäytymistä BCP hiirillä

Sen arvioimiseksi, onko MrgC aktivointi voisi käyttää kipulääke vaikutuksia BCP hiirillä, nämä eläinmalleissa annettiin kanssa BAM8-22 7 peräkkäisenä päivänä (alkaen päivänä 14 leikkauksen jälkeen), ja sitten nosiseptiivisen käyttäytymistä arvioitiin päivinä 1, 3 ja 7 lääkkeen annon jälkeen. Anti-MrgC käytettiin negatiivisena kontrollina. Tuloksemme osoittivat, että verrattuna kontrolliryhmään (hiiri malleissa vehikkeliä), BAM8-22 vähensi NSF ja lisäsi PWMT että samanpuoleiseen takakäpälään BCP hiirten (

P

0,05), joka aika-riippuvaisella tavalla (kuvio 4). Toisaalta, hoito anti-MrgC edelleen kasvanut dramaattisesti NSF ja laski PWMT näissä BCP hiirissä (

P

0,05), on ajasta riippuvalla tavalla (kuvio 4). Nämä tulokset viittaavat siihen, hoito MrgC agonistin voisi merkittävästi lieventää nosiseptiivisen käyttäytymistä näissä BCP hiirillä.

BCP hiirille annettiin BAM8-22 tai anti-MrgC 7 peräkkäisenä päivänä (alkaen päivänä 14 käytön jälkeen ), ja sitten nosiseptiivisen käyttäytymistä arvioitiin päivinä 0, 1, 3, ja 7 (päivä 0 päivän 7) lääkkeen antamisen jälkeen. Tilastolliset analyysit NSF (A) ja PWMT (B) BCP hoidettujen hiirien BAM8-22 tai anti-MrgC. Verrattuna BCP mallin valvonnan vastaavan ajankohtana,

P

0.05.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa tuloksemme osoittivat, että BCP synnyssä liitettiin sääteli ilmentymä MrgC, Gi ja NR2B- selkäytimessä. Lisäksi MrgC agonisti BAM8-22, mutta ei anti-MrgC, voisi merkittävästi lieventää epänormaali kipu liittyvä käyttäytyminen, kautta säädellään Gi ja NR2B ekspressiotasot. Nämä tulokset saattavat antaa mahdollisen kipulääke strategia BCP klinikalla.

BCP on kliinisesti ominaista tulehdus, neuropaattinen vaikutuksia, ja tuumorigeenisia potentiaaliva- [17, 18]. On yleisesti hyväksytty, että NMDA-reseptorin (erityisesti NR2B alayksikköä) -riippuvaisella keskeinen herkistymistä tärkeä rooli kivun yliherkkyyden [19]. Vuonna postsynaptisiin tiheydet, NMDA-reseptorien on pakko rakennustelineet ja signalointi proteiineja, säätelemällä synapsitransmission [20]. Lisäksi NMDA-reseptorin voisi sitoutua Ca

2 + /kalmoduliinista riippuvan proteiinikinaasi II (CaMKII) ja jäsenet MAGUK perhe (kuten PSD-95). Tämä vuorovaikutus kytkee NMDA-reseptorivälitteisen Ca

2+ virtaa vaikuttaa solunsisäiseen efektoreja ja merkinanto entsyymejä, jotka edistävät NMDA-reseptorin riippuvainen keskustassa herkistymistä [21]. Aikaisemmat tutkimus on osoittanut, että fosforylaatiota NR2B selkärangan selkä sarvi BCP malleissa oli merkitsevästi sääteli jälkeen fibrosarcoma soluinfuusion johon liittyy ilmeinen kipua liittyvä käyttäytyminen [11]. Lisäksi säätely ylöspäin NR2B fosforylaation voitaisiin huomattavasti vähentää intratekaalinen injektio MrgC agonistin BAM8-22. Tuloksemme tässä tutkimuksessa kävi ilmi, että BAM8-22 tukahdutettu BCP aiheuttama hyperalgesia, säädelty Gi ja alassäädetty NR2B- ilmentymistä selkäytimessä, mikä osoittaa, että MrgC voitaisiin kytkeä Gi, asiakkuutta kivunlievitystä.

toiminnallinen merkitys Gi aktivaation DRG neuronien on aikaisemmin raportoitu [22, 23]. Näiden tulosten perusteella ja meidän, on olemassa mahdollisuus, että MrgC voisi säädellä kivun herkkyyttään aktivoimalla Gi signalointireitille. Tietenkin, lisätutkimuksia tarvitaan vielä vahvistaa tämän hypoteesin. Toisaalta, muut tutkimukset ovat osoittaneet, että BAM8-22 voi estää jatkuva tulehdus- ja kemialliset kipua, ja alas-säädellä ekspressiotaso c-fos selkäytimen [5, 6, 24]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että MrgC ligandit voisivat toimia antihyperalgeettisia aineita. Gi-proteiini on mukana stressin ja /tai tulehduksen aiheuttama esikäsittely [25], sekä opioidien aiheuttaman kivulle esikäsittely [26]. Gi aktivointi voisi edistää antinosiseptio of BAM8-22. BAM8-22 voisi annoksesta riippuen vähentää NMDA-herätti kipu käyttäytymistä rotilla [27], mikä viittaa siihen, että se voi aiheuttaa selkärangan kivunlievitys tukahduttamalla NMDA-reseptoriin liittyvä heräte. Se on hiljattain raportoitu, että aktivoitu MrgC hillitsevän säätely ylöspäin pro-nosiseptiivisen välittäjien (esim nNOS ja CGRP) ja estävät c-fos ilmentymistä tulehduksellisten kiputilat [5, 7].

Tässä tutkimuksessa tuloksemme osoittivat, että MrgC aktivointi lievensi BCP liittyvään käyttäytymiseen, mikä oli linjassa aiempien havaintojen [11, 12, 28, 29]. Istuttaminen kasvainsolujen oikeaan reisi aiheuttama progressiivinen muutoksia NSF ja PWMT, osoittaa perustamisen onnistuminen BCP mallin. Samaan aikaan nämä BCP hiiriä liittyy huomattava lisääntynyt ekspressiotasot Gi ja NR2B selkäytimessä, jotka saattavat olla mukana kehittämässä ja ylläpitoon BCP. Lisäksi meidän havainnot kertoo vielä, että intratekaalinen anto MrgC agonistin BAM8-22 vaimenee tuntoon yliherkkyys ja kipua liittyvä käyttäytyminen on loukkaantunut tassu näiden hiiri malleja, ja moduloidaan ilmentymistasojen Gi ja NR2B selkäytimessä. Kuitenkin päinvastainen vaikutuksia havaittiin anti-MrgC. Nämä tulokset osoittavat, että MrgC, Gi, ja NR2B- voisivat osallistua sääntelyn kivun liittyvä käyttäytyminen näissä BCP hiirillä. Edelleen perusteellisia tutkimuksia tarvitaan edelleen tutkia yksityiskohtaisesti mekanismeja.

Tulokset osoittivat, että NSF lisättiin ja PWMT määrä väheni samanpuoleiseen takaraajan näistä BCP hiiriä, päivänä 7 jälkeen. Kuitenkin, vähentynyt PWMT päivänä 3 ja talteen käyttäytymistä päivänä 5 mallinnuksen jälkeen voi johtua toiminnallisen vaikutteita. Päivänä 14 leikkauksen jälkeen, BCP liittyvä käyttäytyminen oli ilmeinen ja näyttivät olevan vakaa. Niinpä päivä 14 leikkauksen jälkeen valittiin ajankohta huumeiden interventio näissä BCP hiirillä. Ottaen huomioon monimutkaisuus ja jatkuvuuden BCP, toistuvia lääkkeen annon levitettiin noin käyttää terapeuttisia vaikutuksia ja tutkia optimaalisen annostuksen kesto.

Yhteenvetona tuloksemme osoittivat, että ilmaisulla tasot MrgC, Gi, ja NR2B dramaattisesti koholla selkäydin BCP hiirillä. Lisäksi MrgC agonisti BAM8-22 merkittävästi säädelty Gi ja alassäädetty NR2B- ekspressiotasot. Tärkeää on, BAM8-22 voisi lieventää nosiseptiivisen käyttäytymistä näissä BCP hiirillä. Tuloksemme osoitti MrgC välittämää Gi /NR2B- ilmentymisen muutoksia BCP hiirillä, jotka voivat osallistua modulaatioon kivun yliherkkyyden. Nämä havainnot voivat tarjota käyttöön uusi strategia hoitoon BCP klinikalla.

Kiitokset

Tutkimus tukivat National Natural Foundation of China (81400914, 81500954, 81371207, 81300950 ja 81500955 ), National Natural Foundation Jiangsun maakunnassa Kiinassa (RC2011006 ja XK201140), ja lääketieteellisen teknologian kehittämishanke Nanjing (YKK13068).