Krooninen sairaus

tiivistelmä

Taustaa Tavoitteet

Vaikka hepatosellulaarista syöpiä (HCC) usein syntyy asettaminen fibroosin ja maksan regeneratiivisen vastaus edellyttää uusien solujen kasvua, terapeuttisia strategioita näiden syöpien ole kohdistanut proteiinisynteesiä. Silvestrol, joka on rocaglate eristetty

Aglaia

foveolata

, voi estää proteiinisynteesiä moduloimalla translaation aloituksen kautta eukaryoottinen aloittamista tekijä 4A. Tässä tutkimuksessa arvioimme terapeuttinen teho silvestrol HCC.

Methods

tehoa silvestrol tutkittiin käyttäen ihmisen HCC soluja

vitro

käyttämällä potilaalle tehdä kasvainsolujen ksenograftimallia fibroottisessa maksassa. Vaikutus silvestrol maksassa arvioitiin

vivo

villityypin hiirillä.

Tulokset

Silvestrol esti solun kasvua, jonka IC50 on 12,5-86 nmol neljässä eri HCC solulinjoissa.

vitro

, silvestrol lisääntynyt apoptoosi ja kaspaasi 3/7 aktiivisuus liittyy mitokondrion kalvon potentiaalia ja vähentynyt ilmentyminen Mcl-1 ja Bcl-xL. Synergistinen vaikutus havaittiin, kun silvestrol yhdistettiin muiden terapeuttisten aineiden kanssa, joilla on annoksen vähentämistä indeksi 3,42-kertaiseksi sorafenibilla ja 1,75-kertaisesti rapamysiinin on murto vaikutus 0,5.

vivo

, antituumorivaikutusta havaittiin 0,4 mg /kg silvestrol verrattuna kontrolleihin viikon kuluttua, ja eloonjääminen kasvainta kantavien hiirten parantunut keskimääräinen eloonjäämisaika 42 ja 28 vuorokauden silvestrol ja kontrolliryhmissä, vastaavasti. Vaikutus eloonjäämiseen ei havaittu potilaalle tehdä vierassiirrännäiset kuin fibrotic maksa. Silvestrol hoito

vivo

ei muuttanut maksan rakenne.

Johtopäätökset

Nämä tiedot tunnistaa silvestrol uutena, rakenteellisesti ainutlaatuinen lääke, jolla on voimakas syövän vastaista aktiivisuutta HCC ja tukea mahdollinen arvo kohdistaminen translaation aloituksen hoidossa HCC.

Citation: Kogure T, Kinghorn AD, Yan I Bolon B, Lucas DM, Grever MR, et al. (2013) mahdollisesta terapeuttisesta Translation estäjä Silvestrol sisään Hepatosellulaarinen Cancer. PLoS ONE 8 (9): e76136. doi: 10,1371 /journal.pone.0076136

Editor: Manlio Vinciguerra, University College London, Iso-Britannia

vastaanotettu: 1. kesäkuuta 2013. Hyväksytty: 23 elokuu 2013; Julkaistu: 26 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Kogure et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain avustus rahoitusta National Institutes of Health, DK069370 (TP) ja National Cancer Institute, P01 CA125066 (ADK). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

suuri maailmanlaajuinen esiintyvyys ja kuolleisuus hepatosellulaaristen syöpä (HCC) korostetaan, että hoitoja, jotka ovat tehokkaita parantamaan selviytymisen [1]. HCC on erittäin refraktaarisia hoitomuodon, ja tarvitaan lisää tehokkaita terapeuttisia aineita hallita näitä syöpiä. Cure on mahdollista vain poistettu kirurgisella tai siirtoja, mutta nämä eivät ole mahdollista, että suurin osa potilaista, joilla tämä syöpä, joista monet läsnä kehittyneempää tautien. Viimeaikaiset tutkimukset ovat sekaantuneet useita erilaisia ​​signalointi mekanismeja molekyylitasolla patogeneesissä tämän syövän [2]. Niiden osuus heterogeenisyys vastauksista ja rajoittaa hyödyllisyys hoitointerventioiden tavanomaisilla strategioita, jotka pyrkivät muuntamaan tiettyjä molekyylikohteista [3,4]. Tällä hetkellä vain yksi edustaja, sorafenibi, on saatavilla systeeminen hoito vaatimattomia tuloksia parantamisessa eloonjääminen [5].

Kasvaimen kasvu vaatii uusia proteiinisynteesiä ja näin ollen liittyy lisääntyminen proteiinia käännös. Suoraan kohdistaminen käännös voisi olla hyödyllinen terapeuttinen strategia, ja optio vastike HCC [6,7]. Useissa tutkimuksissa on raportoitu kasvaimia aiheuttavalle vaikutukselle johtuvat ektooppinen ilmentyminen eukaryoottisten initiaatiofaktoria eIF-4E, joka on nopeutta rajoittava tekijä kääntämisen esto [6]. Lisäksi kasvaimen vastaisen vaikutuksen kohdennetun alas-säätely eIF-4E on osoitettu useissa tutkimuksissa käyttäen erilaisia ​​-tuumoriksenografti malleja. Kohdistaminen muut proteiinin translaatiokoneisto ovat olleet myös tehokkaita moduloimaan tuumorin solujen kasvua. Vaatimaton tuumorin vastaista tehokkuutta HCC on osoitettu käyttäen estäjät nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR) polku, joka on osallisena proteiinien synteesiä [8-10].

rocaglate silvestrol on syklopenta [b] bentsofuraani flavagline päässä

Aglaia

suvun perheen Meliacae [11-13]. Jäsenenä uusi luokka lääkkeitä, joilla on ainutlaatuinen rakenne, silvestrol on houkutteleva yhdiste, kohdistaa HCC [14]. Silvestrol on omaisuutta moduloivan käännöksen estämällä ribosomien kuormaamista mRNA malleja kohdistamalla eukaryoottinen initiaatiofaktoria, eIF-4A [15,16].

In vivo

antituumorivaikutus on esitetty silvestrol hematologisissa syöpäsairauksista, kuten krooninen lymfaattinen leukemia, akuutti lymfosyyttinen leukemia ja Manttelisolulymfooman [16-18], todennäköisesti läpi ehtyminen lyhyt puoliintumisaika pro- kasvua tai pro-eloonjääminen proteiineja kuten sykliini D ja Mcl-1. Eläinkokeissa käytetään Eμ-myc malli, silvestrol voi parantaa herkkyyttä standardin aineita, kuten doksorubisiini [15]. Niinpä teimme prekliinisissä tutkimuksissa arvioitiin roolia tämän ainutlaatuisen yhdisteen hoitoon HCC. Tuloksemme osoittavat, että silvestrol on tehokas sytostaattinen ja sytotoksinen aine HCC-soluissa sekä

in vitro

ja potilaalle tehdä kasvainsolun ksenograftien

in vivo

, ja tukevat edelleen kehittämistä tämän aineen terapeuttisena varten HCC.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Kaikki eläinkokeet suoritettiin seuraavat Institutional animal Care ja käyttö komitean menettelytapoja ja ohjeita Ohio State University hyväksytyn protokollaa.

solulinjat

Ihmisen HCC solulinjat, PLC /PRF /5 (PLC), HepG2, Hep3B ja Huh7 saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA) ja viljeltiin vähintään essential medium 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja 1% antimykoottista /antibiootti sekoitetaan. Luciferase ilmentäviä PLC (PLC-luc), joka muodostettiin stabiileja transfektoimalla lusiferaasia ekspressoivan phCMV plasmidi, joka sisälsi koodaavan cDNA tulipalon fl y lusiferaasigeenistä, ystävällisesti toimitti Dr. Ching-Shih Chen (College of Pharmacy, Ohio State University, Columbus, VAI NIIN). Solulinja todennus suoritettiin Genetica DNA labs (Cincinnati, OH).

Sytotoksisuusmääritys

Solujen elinkelpoisuus arvioitiin käyttämällä CellTiter 96 Aqueous iinianalyysikitissä (Promega, Madison, WI). Solut (5000 /kuoppa) maljattiin 96-kuoppaisille levyille (BD Biosciences, Rockville, MD) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa yön yli ennen kuin lisättiin kokeellisen aineita. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin 72 tunnin kuluttua. IC

50-arvot laskettiin käyttäen XLfit ohjelmistoa (IDBS, Burlington, MA). Lääkeaineinteraktioita arvioitiin käyttämällä kiinteää suhdetta pitoisuuksia. Tulokset analysoitiin käyttämällä mediaani vaikutusten analysointi ja yhdistäminen (CI) saadaan käyttämällä CalcuSyn ohjelmisto (Biosoft, Cambridge, Yhdistynyt kuningaskunta).

Apoptosis Analyysit

Soluja viljeltiin 4 kuoppaiset kammio diat (5 x 10

4 solua per kuoppa) 500 ui alustaa ja inkuboidaan 37 ° C: ssa 5% CO

2. 100 nM silvestrol lisättiin ja missä määrin solun apoptoosi arvioitiin 24 tunnin kuluttua. Solujen morfologiset muutokset apoptoottisen solukuoleman kvantitoitiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia värjäyksen jälkeen 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI). Kaspaasi-3/7 määritykset, soluja viljeltiin 96-kuoppalevyillä (5 x 10

3 solua kuoppaa kohti) ja ne olivat 100 nM silvestrol jopa 24 tuntia). Kaspaasi 3/7 aktiivisuus arvioitiin käyttäen luminometrisellä määritystä (kaspaasi-Glo 3/7 määritys, Promega Corp., Madison, WI).

mittaus mitokondrion kalvon Mahdolliset

Mitokondrioiden kalvojännite havaittiin käyttämällä JC-1 (APO LOGIX ™ JC-1, Peninsula Laboratories Inc., San Carlos, CA). Sillä fluoresenssimikroskopian, soluja viljeltiin 4 sekä kammion luistin (5 x 10

4 solua per kuoppa) fluoresenssimikroskopian, tai 96-kuoppalevyille (5 x 10

3 solua per kuoppa) fluorometristä havaitsemiseen. Soluja inkuboitiin 100 nM silvestrol 24 tunnin ajan, sitten 5 mg /ml JC-1 37 ° C: ssa 15 minuutin ajan. Ehjä mitokondriot havaitaan punaisina aggregaatteja emissio 590 nm ja mitokondrion kalvon depolarisoitumisen havaittiin vihreänä fluoresenssin emissio 530 nm: ssä.

Western-blottaus

Solut kasvatettiin 6-kuoppaisilla levyillä pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja lysoitiin inkuboimalla 30 minuuttia 600 ul: aan solujen hajotuspuskuria, jossa proteaasi-inhibiittoreita (Complete lysis-M EDTA-vapaa Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Saksa). Lysaattia proteiinia mitattiin käyttäen bikinkoniini- happoa määrityskittiä (Protein Assay Kit, Pierce Biotechnology, Rockford, IL). ~ 25 mg proteiineja sekoitettiin NuPAGE LDS Sample Buffer (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja proteiinit erotettiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) käyttämällä NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris -geeleillä (Invitrogen). Elektroforeesin jälkeen, proteiinit geelit siirrettiin polyvinylideenidifluoridi (PVDF) kalvolle (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Membraanit blokattiin 5% naudan seerumin albumiinia (BSA) Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa, ja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla ja IRDye700- ja IRDye800-leimattuja sekundaarisia vasta-aineita (Rockland, Gilbertsville, PA) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Mielenkiinnon kohteena oleva proteiini visualisoitiin ja kvantitatiivisesti käyttäen LI-COR Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Bioscience, Lincoln, NE).

induktio maksafibroosin nude-hiirissä

Kuuden viikon -old uros imunodeficient hiiriä (NCR nude) saatiin Taconic (Hudson, NY) ja ruokitaan ruokaa ja vettä

halun

. Hiiriä pidettiin mukaisesti Institutional Animal Care ja käyttö komitean menettelytapoja ja ohjeita hyväksytyn protokollan. Maksafibroosi indusoitiin nude-hiirissä ihonalaisella 0,4 g /kg kehon painoa hiilitetrakloridia (CCl

4) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) kaksi kertaa viikossa. CCI

4 laimennettiin oliiviöljyssä (CCI

4: oliiviöljy = 1: 7) ja steriloidaan käyttäen 0,22 mm: n suodattimen ennen käyttöä. Validointitutkimuksia tarkistaa ja kvantitointiin maksafibroosi, CCI

4 oli ylläpitäjä nude-hiiriin kahdesti viikossa. Kun 6, 9 tai 12 viikkoa, maksa uutettiin ja kiinnitettiin formaliinilla patologinen tutkimus. Värjäyksen jälkeen maksakudosta Massonin trikromilla, vähintään viisi satunnaisesti valittua mikroskooppikuvia kudosleikkeiden kustakin hiirestä valokuvattiin käyttämällä digitaalista kuvankäsittelyohjelma (NIS-elementit, NIKON, Tokio, Japani) ja prosentuaalinen alue maksafibroosin kvantitatiivisesti käyttäen NIH ImageJ ohjelmistoa (National Institute of Health, Bethesda, MD).

Orthotopic HCC solun ksenograftimallia

CCI

4 tai laimentimen ihonalaisesti kahdesti viikossa 10 viikon ajan kuten edellä, jota seuraa suora intrahepaattista injektio PLC

luc

solujen luoda potilaalle tehdä kasvainsolujen ksenograftien immuunivajaissa hiirillä seuraavasti. Laparotomy suoritettiin käyttäen isofluraanianestesian ja vasen maksalohko paljastui. PLC-luc-soluja (10

6), suspendoitiin 20 ml: aan seerumitonta elatusainetta, joka sisälsi 50% Matrigel (BD Bioscience, San Jose, CA), ja hitaasti ruiskutetaan tälle maksalohko käyttäen 28 gaugen neulaa . Poistamisen jälkeen neulan, puristus levitettiin injektiokohdassa vanupuikolla välttää verenvuotoa. Vatsan lihakset ja iho suljettiin jatkuvalla ommelta absorboituva materiaali. Kymmenen päivän kuluttua tuumorisoluinjektion bioluminesenssin kuvantaminen käyttäen IVIS kuvantamisjärjestelmä (Xenogen Corp., Alameda, CA) aloitettiin seurata perustamiseen ja kasvainten kasvua. Hiiret nukutettiin isofluraanilla ja D-lusiferiinin (Gold Biotechnology, St. Louis, MO) liuotettuna PBS: ssä intraperitoneaalisesti (150 mg /kg hiiren ruumiinpainoa). 10 minuutin kuluttua hiiret kuvaamisen jossa on erittäin herkkä, jäähdytetty CCD-kamera valoa tiukka yksilö kammioon (IVIS200, Xenogen). Hankinta ja quanti fi ointi bioluminenssin signaaleja suoritettiin käyttäen Living Image ohjelmisto (Xenogen). Jos alustavasti tutkia, viisi hiiret tapettiin sen jälkeen, kun vähintään neljän viikon seurannan. Bioluminesenssi kuvantaminen korreloi maksan kasvainten arvioida käyttäen mittaharppimittauksilla ja vakiomuotoinen: 1/6 * leveys * pituus * syvyys. Sillä

in vitro

bioluminesenssi kuvantaminen, solut laskettiin ja maljattiin (40-10240 solut) mustalla 96-kuoppalevylle. D-lusiferiini (150 ug /ml) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja kuvantaminen suoritettiin 10 minuutin kuluttua käyttäen IVIS.

Hoito tutkimuksessa ksenograftimallia

hoito Tutkimus tehtiin potilaalle tehdä vierassiirrännäiset nude-hiirissä tai ilman induktion maksan fibroosin. Sen jälkeen intrahepaattinen PLC-luc soluistutusryhmä, bioluminesenssi seurattiin tarkkailemaan kasvaimia. Kun bioluminesenssi intensiteetti ylitti 10 miljoonaa fotoni /s, hiirten potilaalle tehdä ksenograftit satunnaistettiin saamaan silvestrol (0,4 tai 1 mg /painokilo ip) tai kontrolli (0,5 ml /painokilo 0,1% DMSO suolaliuoksessa) 5 päivän ajan viikossa neljän viikon ajan. Terapeuttinen vaste määriteltiin 30% vähennys bioluminenssin intensiteettiä lähtötasosta. Hiiriä kuvattiin viikossa 10 viikon hoidon aloittamisesta.

Maksatoksisuus tutkimuksen villityypin hiirissä

Kuuden viikon vanha, naispuolinen, C57BL /6-hiiriä hoidettiin 0 (ajoneuvon kontrolli) tai 1,5 mg /kg silvestrol (n = 7 ryhmää kohden) joka 48. tunti 28 päivän ajan vatsaonteloon. Ruumiinavauksessa veri kerättiin mitata seerumin alaniini (ALT) ja aspartaatti (ASAT) aminotransferaasien, kun taas maksan kiinnitettiin upottamalla neutraalipuskuroituun 10% formaliiniin. Histopatologisten vaurioiden kiinteissä, parafinoidut, hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 0,1% kaikissa tutkimuksissa. Z-VAD-FMK saatiin Promega (Madison, WI) B

Tilastollinen

Aineisto analysoitiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA) seurasi post hoc menettely. Analysoitaessa selviytymisen, selviytymisen käyrät luotiin Kaplan-Meier menetelmällä ja verrattiin log-laiha testi. Monimuuttujalähettimet analyysi suoritettiin Coxin suhteellista vaaraa regressio. Tilastollinen merkitsevyys hyväksyttiin arvossa

p

0.05.

Ethics selvitys

Kaikki eläinkokeet suoritettiin seuraavat Institutional Animal Care ja käyttö komitean menettelytapoja ja ohjeita Ohio State University hyväksytyn protokollan.

Tulokset

silvestrol estää ihmisen HCC solujen kasvua

in vitro

potentiaalin tutkimiseksi kasvainten vastaisen vaikutuksen silvestrol aloitimme tutkimalla vaikutuksesta silvestrol solujen kasvuun

in vitro

käyttäen paneelin erilaisten pahanlaatuisten ihmisen maksasolujen solulinjoissa. Inkubointi silvestrol johti pitoisuudesta riippuva vaikutus vähentää solujen kasvua kaikissa tuumorisolulinjoja tutkitut, jonka IC50 on 23,9 nM PLC /PRF /5, 12,5 nM Hep3B, 14,6 nM Huh 7 ja 86 nM HepG2-soluissa (Kuvio 1). Nämä tiedot osoittivat, että silvestrol oli erittäin voimakas syövän vastaisen vaikutuksen ihmisen HCC-soluissa.

Ihmisen HCC-solut ympättiin 96-kuoppalevyille (5.000 solua /kuoppa) ja inkuboitiin eri konsentraatioita silvestrol tai ohjaus ( liuotin). Solujen elinkelpoisuus arvioitiin 72 tunnin kuluttua käyttäen metabolinen elävien solujen määrityksessä (CellTiter 96 AQ, Promega Corp., Madison, WI). Data edustaa keskiarvoa ja SD viiden erillisen määrityksen.

induktio solukuolema HCC-soluissa silvestrol

arveltu, että sytotoksisuus silvestrol tapahtui seurauksena apoptoosin induktio välittyy heikentynyt synteesi lyhytikäisiä apoptoosin säätelymolekyyleja kuten Mcl-1 [16,17]. Siten tutkimme apoptoosin PLC /PRF /5 ihmisen HCC-solujen kanssa inkuboinnin jälkeen 100 nM silvestrol. Kaspaasi 3/7 aktivaatio havaittiin luminometrisellä määritystä jossa kasvua aktiivisuudessa totesi 30 minuutin ja kestää enintään 6 tuntia (kuvio 2A). Vastaavasti, lisääntynyt pilkkominen polyADP-riboosi-polymeraasi (PARP), joka on substraatti kaspaasi aktiivisuuden, havaittiin myös yhdessä pilkkominen muiden kaspaasien, kuten kaspaasi 8 ja 9 (kuvio 2B). Pre-solujen inkubointi 30 minuutin ajan kaspaasiestäjä 50 uM zVAD-FMK vähentää sytotoksisuutta myöhemmistä inkuboitu 50 nM silvestrol 36,4 ± 3,5%: sta 17,6 ± 2,9% 24 tunnin kuluttua. Yhdenmukaisesti näiden muutosten 19,3% PLC /PRF /5-solut osoittivat morfologisia ominaisuuksia apoptoosin alaisten solujen 24 tunnin kuluttua (kuvio 2C). Nämä tutkimukset osoittavat, että morfologiset ja biokemialliset piirteet apoptoosin tapahtua varhain inkuboinnin aikana HCC solujen silvetrol.

PLC /PRF /5 HCC-solut ympättiin 4-Kaivokammio slide (25000 solua /kuoppa) ja inkuboitiin 100 nM silvestrol 24 tuntia. Apoptoottisia soluja havaittiin fluoresenssimikroskopialla jälkeen DAPI-värjäyksellä. Solujen osuus osoittaa morfologisia ominaisuuksia apoptoosin laskettiin. *,

p

0,05, t-testi.

Silvestrol muuttaa ekspression Mcl-1

oletettu, että vaikutus silvestrol voitaisiin välittämää vaikutusta modulaatio synteesin lyhyen puoliintumisajan sääntelyviranomaisten apoptoosin kuten Mcl-1 ja Bcl-X

L. Siksi arvioitiin vaikutusta silvestrol on Mcl-1-proteiinin ja mRNA: n ilmentymisen. Vähentäminen Mcl-1-proteiinin ilmentymisen kestää enintään 24 tuntia todettiin vastauksena silvestrol PLC /PRF /5-soluissa (kuva 3). Sitä vastoin ilmaus Mcl-1-mRNA oli merkittävästi lisääntynyt. Samanlaisia ​​muutoksia havaittiin HepG2-soluissa. Kuten Mcl-1 voi toimia antiapoptoottisena tekijä estää vapauttamista sytokromi C mitokondrioissa tutkimme vaikutus silvestrol mitokondrion eheyttä. Inkubointi 100 nM silvestrol 24 tuntia johtivat Mitokondrioiden kalvon potentiaalia arvioitiin fluoresenssimikroskopisesti värjäyksen jälkeen JC-1 in PLC /PRF /5-soluissa (kuvio 4A). JC-1 fluorenssisuhteessa (punaisesta vihreäksi) kasvoi 141% valvonnan PLC /PRF /5 soluja inkuboitiin silvestrol (kuva 4B). Siten mekanistinen vaikutus silvestrol on HCC solujen kasvu voi johtua tehostettu apoptoosin johtuvat vähenemisestä mitokondrion kalvon potentiaalia liittyy menetys Mcl-1 huolimatta parannettu Mcl-1 mRNA transkriptio kuvatulla CLL-soluissa [17].

(A) PLC /PRF /5 HCC-solut ympättiin 96-kuoppalevylle (5000 solua /kuoppa) ja inkuboitiin 100 nM silvestrol jopa 24 tuntia. Kaspaasi 3/7 aktivaatio arvioitiin käyttäen luminometrisellä määritystä (kaspaasi-Glo 3/7 Pitoisuus, Promega Corp., Madison WI). Aineisto edustaa keskiarvoa ja SD kolmen erillisen määrityksen. (B) PLC /PRF /5-soluja siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille (20000 solua /kuoppa) ja inkuboitiin 100 nM silvestrol (100 nM) enintään 24 tunnin ajan. Solut otettiin talteen osoitettuina aikoina, ja immunoblot-analyysi apoptoosin liittyvät proteiinit tehtiin. *,

p

0,05, ANOVA, Fisherin PLSD (C) PLC /PRF /5-soluissa ja HepG2-solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja niitä inkuboitiin 100 nM silvestrol jopa 24 tuntia. Expression of Mcl-1-proteiini määritettiin immunoblottauksella. (D) RNA uutettiin kunakin ajankohtana ja Mcl-1-mRNA: n ekspression taso arvioitiin kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR: llä. Arvot on ilmaistu suhteessa ilmentymistä ei-hoitoa ohjaus jälkeen normalisoinnin käyttäen GAPDH sisäisenä kontrollina. Aineisto edustaa keskiarvoa ja SD. *,

p

0,05, ANOVA, Fisherin PLSD.

, PLC /PRF /5-solut ympättiin 4-Kaivokammio slide (25000 solua /kuoppa) ja inkuboitiin 100 nM silvestrol 24 tuntia. Solut värjättiin JC-1, ja mitokondrioiden läpäisevyys havaittiin käyttäen fluoresenssimikroskopiaa. Soluilla punaisen fluoresenssin perusolosuhteissa, mutta vihreän fluoresenssin seuraava muutos mitokondrion kalvon potentiaalia. B, PLC /PRF /5-soluja ympättiin 96-kuoppalevylle (5000 solua /kuoppa) ja inkuboitiin 100 nM silvestrol 24 tuntia. Solut värjättiin JC-1 ja suhde vihreästä punaiseksi fluoresenssi määritettiin fluorometrisesti (keskiarvo ± SD). *,

p

0,05, t-testi.

Silvestrol säätelee herkkyyttä kemoterapiaa

Koska voimakasta kiinnostusta kehittää uusia terapeuttisia aineita HCC, on todennäköistä, että kliiniseen käyttöön silvestrol voisi liittyä sen käyttää yhdessä muiden terapeuttisten aineiden kanssa. Sorafenibi on suullinen multi-estäjä, joka on hiljattain arvioinut ja hyväksynyt käytetään kehittyneissä HCC. Vaikka se on voimakas aktiivisuus RAF /MEK /ERK-reitin, terapeuttinen teho HCC voi sisältyä muita reittejä. mTOR signalointi usein hyperactivated HCC, ja kohdistaminen mTOR on houkutteleva terapeuttinen strategia [19]. Tutkimme vuorovaikutukset silvestrol ja joko sorafenibille tai mTOR-estäjä rapamysiini. PLC /PRF /5-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla silvestrol yhdessä sorafenibin tai rapamysiiniä, ja sytotoksisuus arvioitiin 72 tunnin kuluttua. Yhdistelmä joko sorafenibin tai rapamysiinin silvestrol lisääntynyt solukuolema, että viimeksi mainittu (kuvio 5A ja 5B). Huumeiden vuorovaikutus arvioitiin mediaanivaikutus analyysi Chou ja Talalay vastasivat synergistisen vuorovaikutuksen kasvun esto näillä yhdistelmillä (kuvio 5C) [20]. Lisäksi yhdessä silvestrol johti suotuisa pienennettyä annostusta indeksin sekä sorafenibin (3,42-kertainen pieneneminen) ja rapamysiini (1,75-kertainen pieneneminen) (kuvio 5D). Näin ollen, silvestrol voi toimia synergistisesti muiden kemoterapia-aineiden, joita voidaan käyttää HCC.

PLC /PRF /5-soluja ympättiin 96-kuoppalevyille (5000 solua /kuoppa) ja inkuboitiin 72 tunnin ajan eri pitoisuudet silvestrol (SVL) ja (A) sorafenibille (SRF) on kiinteä suhteessa SVL: SRF 1: 250 tai (B) rapamysiini (RPM) tietyssä suhteessa SVL: RPM 1: 2,5. Solujen elinkyky arvioitiin käyttämällä metabolisen määritystä (CellTiter 96 AQ, Promega Corp., Madison, WI). Mahdollisia interaktioita silvestrol ja sorafenibille tai rapamysiini arvioitiin käyttämällä mediaani vaikutusten analysointi Chou ja Talalay johtamiseksi (C) yhdistelmä indeksi ja (D) annoksesta vähentäminen indeksi yhdistelmiä.

Hiiren potilaalle tehdä HCC ksenograftimallia

arvioimiseksi terapeuttista käyttöä silvestrol

in vivo

, perustimme uuden sairauden asianmukainen malli HCC mukaan potilaalle tehdä kasvainsolujen ksenograftin istutusta fibrotic tai ei-fibrotic maksa immuunipuutteisilla hiirillä . Suuri etu tämän lähestymistavan perinteisiin prekliinisen malleja kuten ihonalaisen kudoksen ksenografteja on, että se matkii natiivin kasvain microenvironment. Tämä mahdollistaa arvioinnin sairaudelle relevantit microenvironmental vaikutteita huumeiden herkkyys

in vivo

. Maksafibroosia kokeellisesti aiheuttama CCI

4 hallinto, ja läsnäolo fibroosia todentaa ja kvantitoitiin digitaalinen kuva-analyysi sen jälkeen, kun Massonin kolmivärimenetelmä värjäystä. Patologinen tutkimus osoitti tyypillistä fibroottisia muutoksia maksassa hiirten paksuuntumista porttikanavat ja kuromaan fibroosia (kuvio 6A). Prosenttiosuus fibroosin pinta kasvoi annoksen CCI

4 riippuvalla tavalla (kuvio 6B). Seuraavaksi PLC /PRF /5 solua konstitutiivisesti ilmentävät lusiferaasia (PLC

luc

) vahvistettiin vakaat transfektiolla käyttämällä GFP-lusiferaarikonstrukti. Bioluminisenssimääri- Näiden lusiferaasin ilmentävien PCL /PRF /5 stabiilit transfektantit (PLC-luc solut) todennettiin

in vitro

, jolla on vahva positiivinen korrelaatio havaittu bioluminenssin voimakkuuden ja solujen lukumäärä

in vitro

(kuvio 7A) (

r

2 = 0,973). Seuraavaksi ortotooppisten -ksenografteja perustettu intrahepaattinen injektio PLC-luc-soluja (10

6 solua) suoraan vasemman maksalohko nude-hiirten (8 viikon ikäisiä, miespuolinen, n = 5) ja bioluminesenssin kuvantamiseen suoritetaan seurata perustamista ja kasvua maksassa kasvaimen alkaen 10 päivää implantaation jälkeen (kuvio 7B). Bioluminisenssimääri- tapahtuu maksassa todettiin kasvavan ajan. Sen jälkeen, kun vähintään 4 viikkoa, hiiret tapettiin, ja tilavuus uutettu kasvainten saatiin mittaharpilla. Oli positiivinen korrelaatio bioluminisenssimääri- intensiteetti ennen maksakasvain louhinta in vivo, ja kasvaimen tilavuus (

r

2 = 0,638) (kuvio 7C). Nämä tutkimukset validoitu käyttö PLC-luc solujen ja bioluminesenssi kuvantamisen mitata kasvaimen kasvua

in vivo

.

Maksan fibroosia aiheutettiin nude hiiriin kahdesti viikossa injektiona hiilitetrakloridia (CCI

4) annostuksella 0,4 g /kg kehon painoa 6, 9, ja 12 viikkoa.

ja

B

, tyypillinen kuvia maksan histopatologia kanssa kolmivärimenetelmä värjäys (A, kontrolli, B, CCl4 12 viikkoa). Maksa kiinnitettiin formaliinilla ja värjättiin Masson n trichome.

C

, vähintään viisi kuvaa arvottiin kaapattu kustakin maksan osan ja pinta-alan prosenttiosuus fibroosin analysoitiin käyttämällä NIH ImageJ ohjelmistoa. Data edustaa prosenttiosuus kokonaisalasta fibroosia ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. *,

p

0,05, ANOVA, Fisherin PLSD.

,

vitro

bioluminenssin kuvantamiseen PLC

luc

solut. Solut laskettiin ja ympättiin mustalla 96-kuoppaisille levyille. D-lusiferiinin (150 ug /ml) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja kuvantaminen suoritettiin käyttäen IVIS. Bioluminesenssi piirretään solujen määrä.

B

,

vivo

bioluminesenssin kuvantamiseen. Orthotopic kasvaimia perustettu suoran sisäistä maksan injektion PLC

luc

soluja. Miljoona PLC

luc

solut ruiskutetaan vasempaan koru maksan. Kasvainten kasvua seurattiin bioluminescent kuvantamisen avulla IVIS. C, välinen suhde kasvaimen tilavuus ja bioluminesenssin. Sen jälkeen, kun vähintään 4 viikkoa seurannan hiiret tapettiin ja maksan kasvainten tilavuudet saatiin käyttäen paksuuden mittausta. Arvioitu volyymi kasvain jälkeen poiston piirretään bioluminesenssi määritettiin in situ.

Maksa fibroosia moduloi kasvainsolujen kasvua

Läsnäolo maksafibroosin on määräävä tekijä HCC kehityksen (kuva 8). Ensin tutkittiin vaikutuksia fibroosin kasvainten aloittamisesta ja kasvaimen kasvua. Yhdeksäntoista hiirtä kussakin ihonalaisesti 0,4 mg /kg kehon painoa joko CCI

4 (19 hiirtä) tai vehikkeliä (18 hiirtä) kahdesti viikossa 10 viikkoa. Intrahepaattinen kasvainsolun istutuksen jälkeen tehtiin 10 viikkoa, jolloin fibroosi on määritelty kaikissa hiirillä, jotka saivat CCI

4. Yksi hiirillä vehikkeliryhmässä kuolivat heti kasvainsolun istutuksen leikkausta. Neljä hiiret, yksi CCI

4 ryhmää ja kolme ajoneuvojen käsitellyssä ryhmässä, ei kehittynyt maksakasvain jälkeen vähintään 12 viikkoa istutuksen jälkeen. Yksi CCI

4 käsitelty hiiri, joka kehittyi mitattavissa kasvain kuoli ennen hoidon aloittamista. Loput 32 maksakasvain hiirille koostuu 17 CCI

4 käsiteltyihin hiiriin (fibrotic maksa ryhmä), ja 15 ajoneuvon käsitellyistä hiiristä (ei-fibroottisten maksa). Kun kasvaimen muodostumisen havaittiin, jossa bioluminenssina intensiteetti 10 miljoonaa fotoni /s kukin hiiri kussakin ryhmässä (fibrotic /ei-fibroottisten maksa) satunnaistettiin saamaan joko silvestrol (0,5 mg /kg tai 1 mg /kg) tai DMSO 0,1% (kontrolli) ip injektiona viitenä peräkkäisenä päivänä viikossa neljän viikon ajan. Yksi hiiri satunnaistettiin mutta kuoli ennen minkään injektioita ja ei sisällytetty analyysiin. Keskimääräinen kestoaika kasvainsolujen injektion satunnaistamista väheni huomattavasti hiirten maksan fibroosi verrattuna ei-fibroottisten hiiriä (14,2 päivää

vs

21,5 päivää, p = 0,0011, (kuvio 8A). Taajuus epäonnistumisen kasvaimen kehitys oli alhaisempi fibrotic hiirillä (1 19. hiirillä, 5,26%) kuin ei-fibroottisten hiirien (3 18 hiirillä, 16,7%) (kuvio 8B). ei ollut tilastollisesti merkitsevää eroa kumulatiivinen selviytyminen välillä ei-fibroottisten hiirien ja fibrotic hiiret vehikkelillä käsitellyssä kontrolliryhmässä (p = 0,59), ja mediaani elossaoloaika laskettavissa Kaplan-Meier menetelmä oli 25 päivää ei-fibroottisten hiirien, ja 28 päivää fibrotic hiirillä.

hiiret saivat 0,4 g /kg hiilitetrakloridi aiheuttaa maksafibroosia (n = 19) tai vehikkeli-injektiota (n = 18), kymmenen viikon ajan. Orthotopic kasvaimia jälkeen määritettiin suoralla sisäistä maksan injektio 10

6 PLC

luc

soluja. Kasvainsolulinja ksenografti kasvua seurattiin bioluminesenssi kuvantaminen ja havaittiin 18 hiirten fibrotic maksa ja 15 hiirtä ilman maksafibroosin. (A) aika vuorokausina (keskiarvo ± SE) maksan kasvainten kasvua tuumorisoluinjektion on bioluminenssin intensiteetti 10

7 fotoni /s näytetään. (B) tiheys epäonnistuminen kasvainten muodostumiseen (%). (C) vaikutus fibroosia kasvaimen kasvuun. Muutos bioluminenssina intensiteetin prosentteina perustason (keskiarvo ± SE) ajan funktiona. Kun bioluminesenssi ylitti 10

7 fotoni /s kukin hiiri satunnaistettiin hoitoryhmään ja vastaanottaa silvestrol tai laimentimen (kontrolli). D, Survival käyrä

ohjaus

ryhmä. Läsnäolo maksafibroosin ei vaikuttanut hiirten eloonjääntiin kasvaimen ksenografteja, jotka eivät saaneet mitään hoitoa. *,

p

0.05.

Silvestrol ei vahingoita normaalia hepatosyyttien

in vivo

Silvestrol annettavaksi tasolla 1,5 mg /kg joka toinen päivä 28 päivän ajan ei aiheuttanut näkyviä vaurioiden maksan parenchyma tahansa hiiri. Erityisesti kumpikaan kuolion eikä apoptoosin olivat havaittavissa maksasoluissa, sappitiehyen epiteelin tai asukas sinimuotoinen makrofageissa (ts Kupfferin solut). Suhteessa vertailuryhmään eläinten hoito silvestrol liittyi vaatimatonta nousua seerumissa toimintaan ALAT ja ASAT 3 7 hiirillä. *,

p