Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

toistumisen peräsuolen syöpä (CRC) on usein sisällä ensimmäisen vuoden parantava resektio leikkauksen ja saattaa olla väistämätön. MikroRNA on ehdotettu pelata rooleja syövän synnyn ja syövän uusiutumiseen. Olemme hiljattain tunnistettu microRNA-29c (miRNA-29c) ennustajana varhaisen uusiutumisen CRC. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme edelleen tutkineet toimintoja ja seerumin miRNA-29c suhteen alussa toistumisen CRC.

Methods

Ensin vahvistivat lisäksi yli-ilmentymisen miRNA-29c ei- varhainen uusiutuminen aiheita. Gain-of-function

in vitro

tutkimuksissa käytettiin vaikutuksen arvioimiseksi miRNA-29c soluproliferaatioon, muuttoliike, invaasio, ja solusyklin etenemisen. Paksusuolen syöpä solulinja Caco2 ja vakaa klooni yli-ilmentävät miRNA-29c olivat ksenosiirrettyjä arvioida

in vivo

vaikutus miRNA-29c in null hiirillä. Lopulta kiertävä miRNA-29c tutkittiin mahdollisena biomarkkeri tunnistamiseksi varhain uusiutumisen.

Tulokset

miRNA-29c ilmaisu laskivat merkittävästi alkuvuodesta uusiutumisen verrattuna ei-aikaisin uusiutumisen UICC vaiheen II ja III CRC potilaat (

P

= 0,021).

In vitro

tutkimukset osoittivat, että yli-ilmentyminen miRNA-29c esti solujen proliferaatio ja migraatio. Solusyklin tutkimukset paljastivat, että miRNA-29c aiheutti kertymistä G1 ja G2 väestöstä.

In vivo

miRNA-29c tukahdutti kasvaimen kasvua null hiirillä. Seerumin miRNA-29c kasvoi merkittävästi alkuvuonna uusiutunut potilailla verrattuna ei-aikaista Kulunut potilailla (

P =

0,012).

Johtopäätökset

miRNA-29c esittää anti-tuumorigeneesiä aktiivisuutta, ja ennen leikkausta kiertävä miRNA-29c tasoja voidaan käyttää ennustamaan postoperatiivisen varhainen uusiutuminen CRC.

Citation: Yang IP, Tsai HL, Huang CW, Huang MY, Hou MF, Juo S-HH, et al . (2013) toiminnallinen merkitys MicroRNA-29c potilailla, joilla on peräsuolen syövän: Mahdolliset Kiertävä biomarkkeri ennustaminen Early Relapse. PLoS ONE 8 (6): e66842. doi: 10,1371 /journal.pone.0066842

Editor: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Espanja

vastaanotettu: 3. joulukuuta 2012 Hyväksytty: 10 toukokuu 2013; Julkaistu: 28 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Yang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta National Science neuvosto Kiinan tasavallan (NSC 99-2320 B-037-014-MY3); Kaohsiung Medical University Hospital (KMUH98-8I04, KMUH100-OR 16); BioSignature in paksusuolen syövän Academia Sinica, Taiwan; ja Excellence for Cancer Research Center Grant rahoittama Department of Health, Executive Yuan, Taiwan, Kiinan tasavalta (DOH102 TD-C-111-002). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

korkea ilmaantuvuus ja kuolleisuus paksusuolen syöpä (CRC) aiheuttaa merkittävä kansanterveydellinen ongelma maailmanlaajuisesti [1]. Vaikka kirurginen resektio voi olla erittäin tehokas lokalisoitu sairaus, 30-40% potilaista kehittää uusiutumisen leikkauksen jälkeen [2] ja 40-50% uusiutumista näkyviin ensimmäisten vuoden kuluttua alkuperäisen kirurgisen resektion [3], [4]. Aika alkuperäisestä hoidon kehittämiseen toistuminen on raportoitu olevan vahvasti liittyvän selviytymisen, erityisesti potilailla, vuoden kuluessa niiden poistettu kirurgisella [5]. Jatkuva on pyritty etsimään yksinkertaisia ​​ja luotettavia menetelmiä /biomarkkeri varhaista havaitsemista kasvaimia ja CRC ennustetta, jotta aikaisin, riittävät ja tehokasta hoitoa.

Kypsät microRNA (miRNA) on pienet, ei-koodaavaa RNA: ta, joka sisältää noin 20 nukleotidia ja se voi lähettää transkription säätelemään useita kohdegeenien samanaikaisesti [6]. Tuumorigeneesiä CRC käsittää monivaiheisen genomista muutoksia, mukaan lukien aktivoituminen onkogeenien ja inaktivaation tuumorisuppressorigeeneille [7]. miRNA on ehdotettu pelata rooleja syövän kehittyminen, mukaan lukien syövän synnyn, etenemisen ja uusiutumisen [7] – [10]. Useimmat julkaistut tutkimukset ovat keskittyneet kudospohjaisia ​​miRNA ilmaisun [8], [11], [12], ja vain harvat tutkimukset ovat tutkineet verenkierrossa miRNA potilaalla on CRC [13] – [15]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että seerumin tiettyjen miRNA voivat toimia mahdollisina biomarkkereita erilaisiin syöpiin [16] – [18].

Olemme hiljattain käytetty yhdistelmä bioinformatiikan ja kokeellisten tutkimusten ennustaa ja vahvistaa miRNA-29c ehdokkaaksi biomarkkereiden liittyy CRC toistumisen [19]. Nykyisessä tutkimuksessa, ensin käytetään suuren datajoukon vahvistaa suhdetta miRNA-29c ilmaisun ja varhaisen CRC toistumisen. Sarja

in vitro

ja

in vivo

kokeet suoritettiin kuvaamaan toiminnallista roolia miRNA-29c CRC kasvainten synnyssä. Myöhemmin selvitimme onko seerumin miRNA-29c voidaan käyttää biomarkkerina ennustaa aikaisin CRC toistuminen.

Methods

Potilaat ja näytteet

Jotta mahdolliset vaikutus neoadjuvantti- hoidon miRNA ilmaisun, potilaat suljettiin pois, jos niitä oli neoadjuvant hoidon joko kemoterapian tai sädehoidon ennen leikkausta. CRC kasvainnäytteet saadaan 107 primaarisessa CRC on UICC vaiheissa II /III (56 kuin alussa uusiutunut potilailla ja 51 varhaisen uusiutunut potilailla jälkeen radikaali resektio). Näistä 107 potilasta, miRNA-29c tiedot 68 koehenkilöä (27 ei-aikaista uusiutunut potilaista ja 41 varhainen uusiutunut potilasta) on raportoitu meidän läpäisevää paperia [19]. CRC varhainen uusiutuminen määriteltiin paikallisen uusiutumisen tai kaukana etäpesäke, joka tapahtuu 1 vuoden kuluttua radikaali resektio [5], [20], [21], ja potilaat, jotka uusiutunut ensimmäisen vuoden jälkeen eikä relapsin aikana tutkimuksen oli luokiteltu ei-aikaista uusiutunut ryhmä. Koska CRC toistumisen määrä I vaiheessa on suhteellisen alhainen, ja potilailla, joilla on vaiheen IV CRC jo metastaattinen yksiköt [19], [20], tässä tutkimuksessa vain palvelukseen CRC potilasta vaiheessa II ja vaiheen III. CRC kudokset jäädytettiin nopeasti nestetypessä jälkeen kirurgisen resektion. Seerumi näytteet 61 CRC primaarisessa CRC at UICC vaiheissa II /III (41 ei-aikaista uusiutuneen ja 20 aikaisin uusiutunut potilasta), ennen kuin he saivat leikkausta kerättiin ja seerumi miRNA-29c mitattiin. Seerumin miRNA-29c tasot mitattiin myös 23 tervettä koehenkilöä (14 naista ja 9 miestä). Sekä seerumin että CRC kasvainnäytteet saatu 38 aiheita tässä tutkimuksessa. Kaikki koehenkilöt eivät liittyneet kiinalaisten asuvat Taiwanissa. Kirjallinen suostumus saatiin kultakin kohteelta hakemaan kliinisissä näytteissä ja julkaisemaan nämä runko-osat ja kaikki potilastiedot olivat anonymisoidaan. Tutkimuksen protokolla hyväksyi Kaohsiung Medical University Hospital Institutional Review Board (Protocol Number: KMUH-IRB-990343).

RNA uutteita Tissue

Noin 100 mg kutakin kudosta homogenoitiin käyttäen penkki-top-homogenisaattorilla (Polytron PT1600E, Kinematica AG, Luzern, Sveitsi) ja kokonais-RNA, kuten mRNA ja miRNA, puhdistettiin käyttämällä Qiagen RNAeasy järjestelmä (Qiagen, Hampuri,

Saksa

) mukaan valmistajan ohjeet.

miRNA-29c eksressoitumistasojen varhaisen ja Non-aikaista Relapsivaiheessa CRC Potilaat

mittaamiseksi miRNA-29c ekspressiotasot, miRNA-29c cDNA syntetisoitiin 20 ng kokonais-RNA kanssa ainutlaatuinen aluketta (Applied Biosystems Inc., CA) ja TaqMan miRNA RT-qPCR (Applied Biosystems Inc.) käytettiin. Suhteellinen ekspressiotasot miRNA-29c kudoksissa normalisoitiin kuin U6b sisäisenä kontrollina kaavalla: log

10 (2

-ΔCt), jossa ACt = (Ct

miRNA-29c – ct

U6b). Keskiarvo ja keskihajonta (SD) arvot log

10 (2

-ΔCt) laskettiin.

Cell Culture

Ihmisen koolonkarsinoomasolulinja Caco2, Lovo, SW480 ja SW620 (ATCC, Manassas, VA) viljeltiin DMEM (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA), johon oli lisätty 10% vasikan sikiön seerumia (FCS, Gibco-BRL) ja 100 U /ml penisilliiniä [21]. Soluja pidettiin 37 ° C: ssa ilmakehässä, jossa 5% CO

2.

rakentaminen Plasmidi varten yli-ilmentyminen miRNA-29c

pCDH vektori (System biotieteiden Mountain View, CA) käytettiin arvioimaan toiminnallisia seurauksia miRNA-29c yli-ilmentymisen. Olemme rakennettu pCDH- miRNA-29c plasmidiin lisäämällä miRNA-29c PCR-tuote otetaan monikloonauskohtaan alueilla pCDH. Sekvenssit monistamiseen käytetyt alukkeet miRNA-29c olivat tcctgaattcgaggatgccctggagtattcgg ja ctaggcggccgcgcatgatcttccttccctattc. Forward-aluketta jatkettiin 5′-päähän sisällyttää GAATTC-sekvenssi luoda

EcoR1

restriktiokohdan, ja reverse-aluketta pidennettiin 5′-päähän sisällyttää gcggccgc sekvenssin luoda

Not1

restriktiokohdan. Konstrukti varmistettiin suoralla DNA-sekvensoinnilla.

vakaiden kloonien

Caco2 soluja (5 x 10

5) ympättiin ja transfektoidaan 400 ng rakenteiden (joko negatiivinen salattu pCDH vektori tai pCDH-miRNA-29c plasmidi) käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Pysyvästitransfektoitu Caco2 soluja, jotka sisälsivät pCDH-NC-plasmidi (NC: negatiivinen kontrolli) tai pCDH-miRNA-29c plasmidi (O miRNA-29c: yli-ilmentymisen miRNA-29c) valittiin yli 4 viikon ajan käyttämällä standardia viljelyalustaa täydennetty 12 ug /ml puromysiiniä (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MI). Stabiili transfektio plasmideista vahvistettiin suorittamalla miR qRT-PCR-määritystä.

Analyysi Cell Proliferation

Caco2, stabiilien kloonien solut ympättiin ja inkuboitiin 22 h, sitten inkuboitiin edelleen vielä 2 h 1/10 tilavuudella WST-1-reagenssia (Roche Diagnostics, Corp., Indianapolis, IN) ennen absorbanssi 450 nm kvantitoitiin spektrofotometrillä [21].

edelleen tutkia roolia miRNA -29c lisääntymisessä, arvioimme vaikutus miRNA-29c yli-ilmentyminen kasvuun 3 eri syövän solulinjoissa (Lovo, SW480 ja SW620). Me Transition transfektoidut on-miRNA-29c miRNA (miR-29c matkivat, Ambion, USA) tai negatiivinen kontrolli (NC, Mirvana miRNA matkivat, Ambion, USA) osaksi Lovo, SW480 ja SW620-soluissa. Solut ympättiin, inkuboitiin 22 h, ja sitten edelleen analysoida läpäisevä kuvattu.

Cell Cycle Analysis

inkubaation jälkeen 36 h, solusyklin etenemistä kvantitoitiin propidiumjodidi (PI, Sigma -Aldrich Co.) värjäystä ja myöhemmin analyysi FACScan cytofluorimeter (Becton Dickinson, NJ) ja CellQuest ohjelmisto (BD Biosciences) mukaan valmistajan ohjeiden.

analyysi Cell Migration

Cell Migraatio arvioitiin käyttämällä Transwell polykarbonaattikalvon insertit (Millipore, GmbH, Schwalbach, Saksa) 24-kuoppaisilla levyillä. Solut (2 x 10

4) maljattiin 24-kuoppaisille millicells ja annettiin kulkeutua 24 h 37 ° C: ssa. Insertit huuhdottiin 1X PBS: ssä, ja solut poistettiin kalvoja 1% trypsiiniä soluviljelmässä hajotusreagenssia (Promega, Corp., Madison, WI, USA). Solumigraation arvioitiin määrällisesti vihreää fluoresenssia pCDH vektorin kuten aiemmin on kuvattu [21].

haavanparantumis- Pitoisuus

muodostamisen jälkeen yksikerroksinen, haavan luotiin solussa arkin manuaalinen kaavinta jo 200 ui mikropipetin kärki. Elatusaine korvattiin sitten ja soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa. Haavan seurattiin ja valokuvattiin eri ajankohtina (0, 24, ja 48 h) mikroskoopilla.

matrigeelin invaasiomääritys

Solun hyökkäystä analysoitiin käyttämällä 24-kuoppaista TranswellTM läpäisevä tuet ( BD Biosciences, San Jose, CA) ja 8-um huokosia polykarbonaatti kalvoinserteille. Solut (1 x 10

4) sijoitettiin ylempään kammioon ja sen annettiin hyökätä 24 tuntia. Soluinvaasion analysoitiin kuten aiemmin on kuvattu [21].

In vivo Animal Studies

Neljän viikon ikäisiä Balb /c-nude-hiiret (kehon paino: 12,6-15,6 g) ostettiin BioLasco Taiwan Co, Ltd (Taipei, Taiwan) ja ylläpidetään tietty taudinaiheuttajista vapaassa ympäristössä (sertifikaatti no .: 26-99S029). 6 viikon iässä, kukin nude hiireen injektoitiin ihonalaisesti 1 x 10

7 Caco2 soluja (joko NC tai Omir-29c;

N

= 4 kohti transfektoitu solulinja) kaulan alueella. Kasvaimen halkaisija mitattiin ja kasvaimen tilavuus (cm

3) laskettiin käyttäen seuraavaa kaavaa: tilavuus = (leveys x pituus x korkeus) /2 [22]. Eläimet tapettiin 3 viikkoa sen jälkeen, kun kasvainsolujen injektion, ja kasvaimet tutkittiin ja laskettiin välittömästi ilman kiinnitystä. Ennen lopettamista noninvasive kuvantamisjärjestelmä (Ultra Sensitive Molecular Imaging System Berthold Nightowl, Berthold Technology, Oak Ridge, TN) käytettiin seurata syöpäsolut

in vivo

sekä vahvistaa, että miRNA-29c yliekspressoivia plasmidit oli vielä läsnä syöpäsoluissa. Tämä kuvantaminen strategia on noninvasive ja ultraherkät menetelmä havaitsemiseksi transfektoitu plasmideilla, jotka ilmentävät GFP. Eläinten käyttö protokollien hyväksymä Institutional Animal Care ja käyttö komitean Kaohsiung Medical University (IACUC Hyväksyntä nro: 99052) sopusoinnussa perusperiaatteiden kanssa Hoito ja käyttö Laboratory Animals.

Serum valmistelu, RNA ja miRNA-29c eksressoitumistasojen

laskimoverta saatiin ennen käyttöä. Verinäytteet sentrifugoitiin 3000 rpm: llä 15 minuutin ajan ja seerumi jaettiin 1,7 ml: n Eppendorf-putkiin. Koska hyvin dokumentoitu pysyvästi ilmensivät endogeenisen kiertävän miRNA palvelemaan normalisoinnin valvontaa,

C. elegans

synteettiset

lin-4

miRNA (Cel-lin-4, Part Number: 4398988, Invitrogen), joka lisättiin seerumin valmisteluun ennen RNA: n eristykseen käytettiin normalisointia ohjaus kuin aiemmissa tutkimuksissa [ ,,,0],23], [24]. RNA eristys seerumista, 300 ui seerumin homogenoitiin 900 ui Trizol LS ohjeiden mukaisesti valmistajan (Invitrogen) kanssa pieniä muutoksia: 6 ui 1 nM Cel-lin-4 lisättiin osaksi seeruminäytteistä. Sitten 250 ui kloroformia, lisättiin näytteeseen ja sekoitettua liuosta sentrifugoitiin. Sen jälkeen, kun ylimääräinen uuttaminen ja saostus kloroformilla isopropanolin, pelletti pestiin kahdesti sentrifugoimalla 70% etanolilla. RNA-pelletti kuivattiin 10 minuuttia huoneen lämpötilassa ja liuotettiin 30 ul: aan tislattua vettä. DNaasikäsittely (Qiagen) suoritettiin poistamiseksi kontaminoivan DNA.

mittaamiseksi miRNA-29c ekspressiotasot, miRNA-29c cDNA syntetisoitiin ja TaqMan miR RT-qPCR määritys esimuotoillut kuten läpäisevä kuvattu. Suhteellinen ekspressiotasot miRNA-29c seerumin normalisoitiin kuin Cel-lin-4 kaavalla: log

10 (2

-ΔCt), jossa ACt = (Ct

miRNA-29c – ct

Cel-lin-4). Keskiarvo ja keskihajonta (SD) arvot log

10 (2

-ΔCt) laskettiin.

Tilastollinen analyysi

Jatkuva muuttujat esitetään keskiarvona ± keskihajonta (SD) arvot, ja dikotomista muuttujat analysoitiin Pearsonin khiin neliö testi ja esitetään määrä ja prosenttiosuus arvoja. Analyysi kovarianssi suoritettiin käyttäen JMP-ohjelmistoa (versio 7.0.1, SAS Institute Inc., Cary, NC) verrata keskimääräinen miRNA-29c: n välillä aikaisin ja ei-aikaista uusiutunut CRC potilailla. Ikä, sukupuoli, ja vaihe CRC sisällytettiin covariables että tilastollisia malleja. 2-tailed

P

arvo on vähemmän kuin 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Tilastollinen teho laskettiin verkossa DSS Research Statistical Virta Laskin (https://www.dssresearch.com/Home.aspx), seuraavin perustein: yksisuuntainen testi, alfa 0,05, seerumin 20 aikaisin uusiutunut potilailla ja 41 ei-aikaista uusiutunut potilailla ja empiirinen ekspressiotasot kussakin ryhmässä.

tulokset

Väestörakenteen Data

ominaisuudet 107 itsenäisen CRC potilasta (56 ei- aikaisin uusiutunut ja 51 aikaisin uusiutunut potilasta) on koottu taulukkoon S1. Keskimääräinen iät (vuotta) varhaisen uusiutunut ja ei-aikaista uusiutunut potilaista oli 67,20 ja 64,90, vastaavasti, jossa alueen ollessa 24-88 vuotta. Tiedot taudin vaiheessa, sukupuoli ja ikä alussa uusiutuneen ja ei-aikaista uusiutunut potilailla on esitetty taulukossa 1. Varhainen taudin uusiutumisen merkitsevästi yhteydessä kasvaimen tyyppi ja hermoa invaasio (

P

0,05, taulukko 2), mutta ikä, sukupuoli, kasvaimen koko, UICC vaihe potilaiden tai histologian jakaumat eivät olleet merkittävästi erilaiset varhaisen ja ei-varhainen uusiutunut potilailla (

P

0,05, taulukko 2).

Keräsimme seeruminäytteistä 61 CRC potilaista (41 ei-aikaista uusiutuneen ja 20 aikaisin uusiutunut potilasta), ennen kuin he saivat leikkausta. Ominaisuudet 61 CRC potilaita seerumin tutkimuksessa on koottu taulukkoon S2. Niistä 61 potilaalla oli ennen leikkausta seeruminäytteet, CRC kasvain näytteet olivat saatavilla myös 38 potilaalla (30 ei-aikaista uusiutuneen ja 8 varhaisen uusiutunut potilasta). Näin ollen sekä seerumin ja CRC näytteitä samanaikaisesti analysoitiin 38 potilasta tässä tutkimuksessa.

miRNA ilmentäminen Early ja Non-aikaista Relapsivaiheessa Potilaat

miRNA-29c ekspressiotasot 107 CRC kasvain näytteet olivat erilaiset varhaisen ja ei-aikaista uusiutunut potilailla. Keskiarvo log

10 (2

-ΔCt) oli 0,67 ei-varhainen uusiutunut ryhmä ja 0,37 alussa uusiutunut ryhmä (

P =

0,021, Fig. 1A). Siksi miRNA-29c tasot olivat alhaisempia näytteissä varhaisesta uusiutunut potilaista 2,00-kertainen verrattuna näytteissä ei-varhaisen uusiutunut potilailla. Tämä on samanlainen kuin edellisessä raportin 2,04-kertainen muutos [19]. Varhainen taudin uusiutumisen merkitsevästi yhteydessä hermoa invaasio, kasvaimen tyyppi ja pienempi ilmentyminen kasvaimen miRNA-29c mukaan yhden ja usean analyysit (taulukko 2), mutta miRNA-29c ekspressiotasot eivät merkitsevästi yhteydessä mihinkään kliinis vaihteleva (taulukko 3). Näin ollen ilmaus miRNA-29c on itsenäinen ennustaja tekijä havaitsemiseksi varhain uusiutumisen CRC. Nämä tulokset jälleen tarkistaa aiempien tietojen [19], ja tukea miRNA-29c mahdollisena ennustaja varhaisen uusiutumisen CRC leikkauksen jälkeen.

(A) miRNA-29c ilmentymistason 56 ei-aikaista ja 51 varhainen uusiutuminen CRC kasvainnäytteestä. Ilmaisu taso on merkittävästi vähentynyt alussa-uusiutumisen kasvaimet (

P =

0.021). (B) WST-1 määritys osoittaa, että miRNA-29c tukahduttaa kasvainsoluproliferaation (

P =

0,006). Omir-29c osoittaa Caco2 soluklooni vakaasti yli-ilmentävät miRNA-29c, ja NC osoittaa negatiivisen kontrollin vakaa klooni. (C) yli-ilmentyminen miRNA-29c aiheuttaa merkittävän kerääntymistä solujen G2-vaiheessa (

P =

0,02). Musta: G1 /G0 vaihe; vaaleanharmaa: S-vaiheessa; ja tummanharmaa: G2 vaihe. (D) TranswellTM määritys osoittaa, että yli-ilmentyminen miRNA-29c suppressoi kasvaimen solumigraation (

P

0,0001). (E) yli-ilmentyminen miRNA-29c ei vaikuta kasvainta soluinvaasiota (

P =

0,349). (F) yli-ilmentyminen miRNA-29c pienenee solumigraatio, kuten on osoitettu rako lisääntynyt leveys O miRNA-29c verrattuna NC 24 ja 48 tuntia. Valokuvat osoittavat tuumorin solumigraation saatiin haavoittaen parantavaa määrityksessä.

selkeyttämiseksi roolia miRNA-29c ilmentymistä alussa uusiutunut potilailla, me edelleen verrattuna miRNA-29c ilme välillä uusiutunut

vs.

ei uusiutunut ryhmiä. Seitsemän potilasta ei-aikaista uusiutunut ryhmä oli uusiutunut kuluttua ensimmäisen vuoden; siten, valittiin uudelleen luokiteltiin uusiutunut ryhmä. Mirna-29c ekspressiotasot välillä uusiutunut ja ei-uusiutunut potilasta ja keskimääräinen log

10 (2

-ΔCt) oli 0,65 ei-uusiutunut ryhmä ja 0,43 Uusiutuneessa ryhmässä (

P

= 0,099, Kuva. ei ole esitetty).

yli-ilmentyminen miRNA-29c Vaikutteet Cell Proliferation ja solusyklin etenemisen

Jotta voidaan tutkia roolia miRNA-29c kasvainten synnyssä, arvioimme vaikutus miRNA-29c kasvuun Caco2 soluja. Olemme perustaneet Caco2 vakaa klooni (Omir-29c) yli-ilmentävät miRNA-29c. Keskimääräinen miRNA-29c tasolla Omir-29c oli 0,45 (ilmaistuna log

10 (2

-ΔCt)), joka oli korkeampi kuin keskimääräinen taso miRNA-29c in negatiivisen kontrollin (NC) klooni by 2.82-kertainen. Kuten on esitetty kuviossa. 1B, leviämisen nopeus Omir-29c oli vain 58,7%: n osuus NC kuluttua 24 h (

P =

0,006). Koska osa ennustetun miRNA-29c kohdegeenien liittyvät solusyklin etenemisen ja solujen kasvua, arvioimme onko miRNA-29c vaikuttaa solusyklin virtaussytometrialla. Tuloksemme osoittivat, että Omir-29c huomattavasti kertyminen G2 solupopulaation (19,4% Omir-29c

vs

. 14,7% NC,

P =

0.02; Fig. 1 C) hieman lisääntynyt kertyminen G1 /G0 väestöstä (47,1% vuonna Omir-29c

vs

. 43,1% NC,

P =

0,43), ja väheni kertyminen S- vaihe väestöstä (33,48% vuonna Omir-29c

vs

. 42.21% NC,

P

= 0,14). Nämä havainnot ehdotti, että yli-ilmentyminen miRNA-29c estää niiden kasvun koolonkarsinoomasoluissa laskusta johtuen S-vaiheeseen ja asiakkuutta G2 pidätykseen.

leviämisen analyysin siirtymisen transfektoitu on-miRNA-29c miRNA (miRNA-29c matkivat ) tai negatiivinen kontrolli (NC, Mirvana miRNA matkivat) osaksi Lovo, SW480 ja SW620-soluissa, havaitsimme, että leviämisen nopeus miRNA-29c yli-ilmentyminen soluissa laski selvästi 50,9% (Lovo) ja 51,9% (SW480) on nopeudella NC kuluttua 24 h (

P =

0,016 ja 0,009, vastaavasti, kuvio. S1). Kuitenkin leviämisen nopeus SW620 ei esitetty merkittävästi erilainen (alas 92,4%) kun miRNA-29c over-ilmentyminen soluissa. Sen lisäksi, että Caco2 miRNA-29c myös tukahduttaa kasvua koolonsyöpäsolulinjaa: Lovo ja SW480, mutta ei SW620.

Effects of miRNA-29c Yliekspressio Cell Migration

tiedot Transvvell- määritystä (Fig. 1 D) osoitti, että Omir-29c näkyy hitaammin muuttoliike kuin teki NC 56% (

P

0,0001). Esto Migraatio arvioitiin myös haavan paranemista määritystä, jossa leveys haava oli 800 um. Leveydet aukkoja NC ja Omir-29c olivat 100 ja 180 nm 24 tunnin, vastaavasti, ja oli 0 ja 100 pm 48 h. Nämä havainnot ehdotti, että solujen vaeltaminen väheni merkittävästi Omir-29c. Nämä analyysit osoittivat johdonmukaisesti, että solujen vaeltaminen dramaattisesti vähentynyt, kun miRNA-29c yliekspressoitui (Fig. 1 F).

Effects of miRNA-29c ilmentymisen vaikutus Kasvainsolun Invasion

Tiedot Matrigel hyökkäyksen määrityksessä ei todettu merkittäviä eroja Omir-29c ja NC klooneja koskevat niiden kykyä hyökkäystä. Tämä havainto viittasi siihen, että yli-ilmentyminen miRNA-29c ei vaikuttanut hyökkäystä kasvaimen solut (

P =

0,349, Fig. 1 E).

vaikutus yliekspressio miRNA-29c nude-hiirissä

edelleen vahvistaa anti-kasvaimen kehittymisen vaikutusta miRNA-29c, tutkimme vaikutus miRNA-29c ilmentymisen vaikutus kasvaimen kasvuun

in vivo

. Sen jälkeen, kun ihon alle injektiota Omir-29c ja NC kloonien kaulan nude-hiirten, kasvainmassat tuli tunnettavissa 7 päivää inokulaation jälkeen ja annettiin kasvaa, kunnes loppuun kolmannen viikon (Fig. 2A). Hiiret, jotka saivat Omir-29c soluissa oli merkittävästi pienempi syöpä kokkareita kuin teki ne, jotka saivat NC solut (

P =

0,018; Fig. 2B ja 2C). Tiedot Ultra Sensitive molekyylikuvantamisen Strategia vahvisti yli-ilmentymisen miRNA-29c on Omir-29c klooni 3 viikkoa ymppäyksen jälkeen kasvainsolut ilmaisinlaitteistolla vihreän fluoresenssin

proteiinia

(Fig. 2D). Tulokset

in vivo

kokeessa edellyttäen tukevat edelleen sitä, että yli-ilmentyminen miRNA-29c johtaa hidastanut kasvaimen leviämisen koe-eläimillä.

Omir-29c on Caco2 klooni vakaasti yli-ilmentävät miRNA-29c, ja NC on ohjaus vakaa klooni. (A) Valokuvia nollahiiriä injektoidaan subkutaanisesti NC soluja (

N =

4, ylempi paneeli) tai Omir-29c solut (

N =

4, alempi paneeli) otettiin 21 päivää injektion. (B) Kasvaimen kokkareita olivat pienempiä Omir-29c ryhmä (alempi paneeli) kuin NC ryhmässä (ylempi paneeli) 21 päivän jälkeen. (C) Kasvaimen (cm

3) kasvukäyrät Omir-29c (- – -, harmaa) ja NC-solut (-, musta) yli 21 päivää (

P =

0,018). (D) käyttäminen Ultra Sensitive Molecular Imaging strategian lusiferaasiaktiivisuuden kokkareita voidaan skannata ilman invaasion valokuvia nollahiiriä injektoidaan subkutaanisesti Omir-29c solujen otettu 21 päivää injektion jälkeen.

kiertävä miRNA Expression varhaisen ja non-aikaista Relapsivaiheessa potilaat

Preoperatiivisen seerumin miRNA-29c tasot olivat merkittävästi erilaisia ​​varhaisen ja ei-aikaista uusiutunut potilailla. Keskiarvo log

10 (2

-ΔCt) oli -3,841 ei-aikaisen uusiutumisen ryhmä ja -3,216 alussa-uusiutumisen ryhmä (Fig. 3A). Seerumin miRNA-29c tasot eivät olleet merkittävästi erilaiset terveillä vapaaehtoisilla koehenkilöillä ryhmä ja ei-aikaisen uusiutumisen ryhmä (

P

= 0,256), mutta miRNA-29c kasvoi merkittävästi alkuvuonna uusiutunut potilailla verrattuna terveisiin koehenkilöihin ryhmä ja ei-varhainen uusiutunut ryhmä (

P

0,0001 ja

P =

0,012, tässä järjestyksessä). Perustuen seerumin tietojen meidän otoskoko 61 saavutti tilastollisen tehon 83,1%. Toistuvuustaso analyysi varhaisen uusiutunut (tyhjä rivi) ja ei-varhainen uusiutunut (harmaa viiva) ryhmät arvioitiin Kaplan-Meier menetelmää ja toistumisen kuvioita kuvassa. 3B.

(A) Ilmaus Veren miRNA-29c on vapautettu seeruminäytteistä 23 terveillä koehenkilöillä, 41 ei-aikaista ja 20 aikaisen uusiutumisen CRC potilaille. Seerumin miRNA-29c tasot eivät olleet merkittävästi erilaiset terveillä vapaaehtoisilla koehenkilöillä ryhmä ja ei-aikaisen uusiutumisen ryhmä (

P

= 0,256). Ilmaisu taso on merkittävästi lisääntynyt seeruminäytteistä varhaisen uusiutumisen potilailla verrattaessa terveisiin henkilöihin ryhmän (

P

0,0001) ja ei-aikaisen uusiutumisen ryhmä (

P =

0,012 ). (B) toinen toistuminen analyysi CRC potilailla arvioitiin Kaplan-Meier menetelmää ja malleja varhaisen uusiutunut (tyhjä rivi) ja ei-varhainen uusiutunut (harmaa viiva) ryhmät näytettiin.

Keskustelu

lisääminen tutkimuksen funktio miRNA on luonut uuden aikakauden, jossa kasvainten synnyssä voidaan paremmin ymmärtää. Kuitenkin rooli miRNA toistumiseen CRC, etenkin alussa uusiutunut CRC, jää epäselväksi. Äskettäin käyttäen laskennallisen analyysin mRNA: n ekspression profiileja, me raportoitu, että miRNA-29c on ennustaja alussa uusiutunut CRC [19]. Tässä tutkimuksessa käytimme lisääntynyt otoskoko vahvistaa, että miRNA-29c ilmentyminen kasvainkudoksessa ja seerumin voidaan ennustaa CRC aikaisin toistuminen, ja teimme sarjan

in vitro

ja

in vivo

toiminnallinen selvittämiseksi edelleen roolia miRNA-29c CRC kasvainten synnyssä.

In vitro,

osoitimme, että miRNA-29c näkyvästi estää paksusuolen syövän solujen proliferaatio ja migraatio, mutta ei hyökkäys. Yliekspressio miRNA-29c voi pidättää solusyklin G2 vaiheessa, mikä johtaa soluproliferaation inhibointi. Nude-hiirissä, koolonkarsinoomasoluissa yli-ilmentävät miRNA-29c näkyy huomattavasti hitaampi kasvuvauhti kuin teki kontrolli syöpäsoluja. Lisäksi ennen leikkausta seerumin miRNA-29c olivat näkyvästi liittynyt postoperatiivista aikaisin toistuminen. Siten meidän tulokset solu-, eläin- ja ihmisillä tehdyt tutkimukset osoittivat johdonmukaisesti, että miRNA-29c saa aikaan anti-kasvaimen kehittymisen vaikutus, ja se voi olla käyttökelpoinen biomarkkeri ennustamisessa alussa uusiutumisen CRC potilailla leikkauksen jälkeen.

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että miRNA-29c on mukana erilaisia ​​biologisia prosesseja, mukaan lukien karsinogeneesi erilaisten ihmisen syöpien, kuten krooninen lymfaattinen leukemia [25], keuhkosyöpä [26], eturauhassyöpä [27], ja invasiivisen rintasyövän [ ,,,0],28]. Kuitenkin paitsi meidän tuore julkaisu [19], liittyviä tutkimuksia rooli miRNA-29c CRC synnyssä ja toistuminen ovat rajalliset. Kriittinen rooli miRNA-29c sääntelyssä geenien ilmentymisen kasvainten synnyssä jää löytäjäänsä kautta kohdennettua mRNA profilointia. Tuumorinekroositekijä alfa-indusoidun proteiinin 3 (TNFAIP3), avainsäätelijä tulehduksessa ja immuniteetin, todettiin olevan käänteisesti verrannollisia miRNA-29c tasoilla ja tunnistettiin tavoitteeksi miRNA-29c [29]. Yliekspressio miRNA-29c hepatiitti B -viruksen liittyvät maksasyövän solut ehkäistä tehokkaasti TNFAIP3 ilmaisun ja HBV-DNA-replikaation, sekä solun uudiskasvun estämiseksi ja apoptoosin aiheuttamiseksi [29]. miRNA-29c voi vaikuttaa kasvaimen kehittymisen työskentelemällä rajoissa tunnettu kasvain vaimennin (eli p53) polkuja. Kasvain p53, jota koodaa

TP53

geeni, on tunnustettu valvojana ihmisen perimän, koska se säätelee monia loppupään geenejä hoitaa tehtäviään solusyklin etenemisen ja solukuolemaa. Kumar

et al.

Korosti, että ihmisen

TP53

geeni voidaan negatiivisesti säätelevät useat miRNA: miRNA-125b, miRNA-504, miRNA-25, ja miRNA-30d [30] . Tuore tutkimus on osoittanut, että miRNA-29 on mukana myös p53-reitin, ja miRNA-29 perheenjäsenet (miRNA-29a, miRNA-29b, ja miRNA-29c) voi ylössäätää p53 tasoja ja indusoi apoptoosia p53 riippuvaisesti suoraan tukahduttamalla p85 alfa (sääntely alayksikkö PI3 kinaasi) ja Cdc42 (a Rho perhe GTPaasina [31]. viimeaikaiset työ miRNA-29c kohdegeenien ehdotti, että DNMT3A, DNMT3B, ja p53 ovat todennäköisesti mukana mahdollisen reitin CRC kehittäminen [19]. edellä tutkimuksissa on osoitettu, että rooli miRNA-29c tukahduttamaan CRC etenemisen tai uusiutumisen. Samoin tuore tutkimus osoitti, että miRNA-29c on usein vaimentua kudoksissa vaikuttaa ruokatorven okasolusyöpä, ja miRNA-29c voi tukahduttaa kasvaimen kasvua indusoimalla solusyklin G (1) /G (0) pidättämään pääasiassa modulaation sykliini E ilmaisun [32]. Samoin olemme osoittaneet, että yli-ilmentyminen miRNA-29c voi inhiboida koolonkarsinoomasoluissa vähentämällä kertymistä S vaiheen väestöstä.

tulokset osoittavat, että miRNA-29c näkyvästi estää proliferaatiota ja migraatio koolonkarsinoomasoluissa, mutta sillä ei ole vaikutusta soluinvaasiota.