Krooninen sairaus

tiivistelmä

hepariini-sitova epidermaalisen kasvutekijän kaltainen kasvutekijä (HB-EGF) on jäsen kasvutekijän perhe, ja on erilaisia ​​fysiologisia ja patologisia tehtäviä. Modulointi HB-EGF aktiivisuutta saattaisi olla terapeuttista potentiaalia onkologian alueella. Selvitimme terapeuttisten mahdollisuuksien mukaan kuvaavat

in vitro

biologista aktiivisuutta anti-HB-EGF monoklonaalinen vasta Y-142. EGF-reseptori (EGFR) ligandin ja lajispesifisyyksiä Y-142 testattiin. Neutraloiva toiminta Y-142 vastaan ​​HB-EGF arvioitiin EGFR ja erbB4 signalointi. Biologinen toiminta Y-142 arvioitiin syöpäsolujen lisääntymistä ja angiogeneesin määrityksiä ja verrattiin anti-EGFR-vasta-aine setuksimabi, HB-EGF estäjä CRM197, ja anti-endoteelikasvutekijä (VEGF) vasta-aine bevasitsumabi. Sitova epitooppi määritettiin alaniiniskannausta. Y-142 tunnustettu HB-EGF sekä EGFR ligandina amfireguliini, ja sitoutui spesifisesti ihmisen HB-EGF, mutta ei jyrsijän HB-EGF. Lisäksi Y-142 neutraloitua HB-EGF-indusoitu fosforylaatio EGFR ja erbB4, ja estänyt niiden alavirran ERK1 /2 ja AKT signalointi. Olemme myös havainneet, että Y-142 inhiboi HB-EGF-indusoidun syövän solujen proliferaatiota, endoteelisolujen proliferaation, putken muodostumiseen, ja VEGF: n tuotannon tehokkaammin kuin setuksimabin ja CRM197, ja että Y-142 oli parempi bevasitsumabille inhibitioon HB-EGF- aiheuttama putken muodostumiseen. Kuusi aminohappoa on EGF-kaltaisen domeenin havaittiin Y-142 sitova epitooppi. Niistä kuusi aminohappoa, yhdistelmä F115 ja Y123 määrittivät amfireguliini ristireaktiivisuus ja että F115 osuus lajin valikoivuus. Lisäksi ehdotettiin, että voimakas neutraloiva aktiivisuus Y-142 oli peräisin sen tunnustamista R142 ja Y123 ja on voimakkaasti HB-EGF. Y-142 on voimakas HB-EGF neutraloiva vaikutus, joka säätelee useiden biologisen toiminnan HB-EGF kuten syövän solujen lisääntymisen ja angiogeenisen toimintaa. Y-142 voi olla potentiaalia kehitetään terapeuttisena aineena hoidettaessa HB-EGF-riippuvaisten syöpien.

Citation: Sato S, Drake AW, Tsuji I, Fan J (2012) voimakas anti -HB-EGF monoklonaalinen vasta-aine Estää Cancer Cell Proliferation ja Multiple angiogeenisen toiminta HB-EGF. PLoS ONE 7 (12): e51964. doi: 10,1371 /journal.pone.0051964

Editor: Irina Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 23 elokuu 2012; Hyväksytty: 09 marraskuu 2012; Julkaistu: 14 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Sato et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: No current ulkopuolisen rahoituksen lähteet tässä tutkimuksessa.

Kilpailevat edut: kirjoittajat ovat seuraavat edut. Tämä Tutkimuksen rahoittivat Takeda San Francisco, Inc. ja Takeda Pharmaceutical Company Limited. Kaikki kirjoittajat olivat työntekijät Takeda San Francisco, Inc. tai Takeda Pharmaceutical Company Limited ja maksettiin sellaisenaan. Ei ole olemassa patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

hepariinia sitovat epidermaalisen kasvutekijän (EGF ) kaltainen kasvutekijä (HB-EGF) on jäsen, EGF-perheen kasvutekijöiden, joka sitoutuu EGF-reseptoriin (EGFR) ja erbB4 [1], [2]. HB-EGF syntetisoituu membraaniin sitoutunut muoto, proHB-EGF, jonka tiedetään olevan juxtacrine kasvutekijä [3], [4]. proHB-EGF läpikäy ektodomeeni irtoaminen proteaasien [5], ja verenvuodatusta nopeutuu kun proHB-EGF-ilmentäviä soluja altistetaan tietyille stressiolosuhteissa [6], [7]. Saatu liukoinen muoto HB-EGF: n (SHB-EGF) on voimakas mitogeeninen aktivoitumisen kautta EGFR [1]. Kun pilkkominen, HB-EGF C-terminaalinen fragmentti translokoituu tumaan ja indusoi geenin ilmentymisen cyclinA ja cyclinD2 tukahduttamalla toiminta PLZF ja Bcl6, vastaavasti [8], [9].

Viimeaikaiset tutkimukset ovat paljasti erilaisia ​​fysiologisia toimintoja HB-EGF, mukaan lukien kudoksen kehittäminen [10] – [12], ihon haavan paranemista [13], ja raskaus [14], [15]. HB-EGF on myös havaittu olevan yhteydessä patologisissa prosesseissa, mukaan lukien sydämen hypertrofia [16], keuhkoverenpainetauti [17], ateroskleroosi [18], [19], ja onkogeeninen transformaatio [20]. Viime aikoina yhä enemmän todisteita on osoittanut, että HB-EGF yli-ilmentyy useissa syöpien [21] – [25], ja yli-ilmentyminen on osoitettu korreloivan huonon ennusteen [24], [26], [27 ]. Johtuen nämä havainnot, anti-HB-EGF aineita on aktiivisesti terapeuttisiin sovelluksiin. HB-EGF estäjä difteriatoksiinimutantti, CRM197, on faasin I kliinisessä kehityksen edenneen munasarjasyövän syöpiä [28]. Anti-HB-EGF-vasta-aineita U3-1565 ja KHK2866 hetkellä faasin I kliinisissä kokeissa kiinteiden syöpien [29]. Anti-HB-EGF terapeuttinen monoklonaalinen vasta odotetaan pidempi puoliintumisaika verrattuna CRM197 [30], [31], mutta sukupolven voimakas anti-HB-EGF-vasta-aineita on ollut haastava ja muutama anti-HB-EGF monoklonaalisia vasta-aineita, joilla on toimiva aktiivisuus on raportoitu [29], [32], [33]. Äskettäin raportoimme sukupolven neutraloivan anti-HB-EGF monoklonaalisia vasta-aineita [34]. Tässä tutkimuksessa me raportoimme luonnehdinta yksi anti-HB-EGF monoklonaalisia vasta-aineita, Y-142, analysoimalla sen toiminnallista aktiivisuutta, ja sitova epitooppi. Voimakas biologinen aktiivisuus Y-142 oli verrattiin anti-EGFR-vasta-aine setuksimabi, HB-EGF-inhibiittorin CRM197, ja anti-VEGF-vasta-aine bevasitsumabi.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Ihmisen, hiiren ja rotan SHB-EGF, ja EGFR-HFC aiemmin valmistettiin viljelmän supernatantista 293F-soluja (Invitrogen) transfektoitiin kunkin ekspressioplasmidin [34]. EGFR: n ligandien, anti-amfireguliini (anti-ARG) monoklonaalinen vasta-aine, anti-EGFR-, anti-erbB4, anti-HB-EGF ja anti-ARG polyklonaalisia vasta-aineita, FITC-leimattu anti-CD31, anti-VEGF, biotinyloitu anti-VEGF- piparjuuriperoksidaasi-leimattua (HRP-leimattu) ja anti-fosfotyrosiini vasta-aineet hankittiin R todellakin osoitimme, että Y-142 voi neutraloida SHB-EGF-indusoitu fosforylaation endogeenisesti ilmaisi erbB4 on T47D-soluissa (kuvio. 3C). Tärkeää on, että neutraloivan aktiivisuuden Y-142 vaikuttavat EGFR alavirran signalointitapahtumia. Kuten kuvioissa. 3D ja 3E, Y-142 neutraloitua SHB-EGF-indusoitu fosforylaatio ERK1 /2 ja AKT, vastaavasti. Yhdessä tuloksemme osoittivat, että SHB-EGF sitoo ja aktivoi EGFR ja erbB4, ja että Y-142 voi neutraloida SHB-EGF aiheuttama EGFR ja erbB4 signalointi.

(A) inhiboiva aktiivisuus Y-142 SHB-EGF-sitoutumisen EGFR. EGFR-HFC inkuboitiin anti-ihmis-IgG: n Fc-vasta-aine-pinnoitettu levy. Y-142 inkuboitiin sitten pitoisuutena 6,7 ​​nM, kun läsnä oli 0,63 nM biotinyloitua SHB-EGF 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. SHB-EGF sitoutuu EGFR-HFC havaittiin HRP-leimattu streptavidiini. SHB-EGF-sitoutumisen EGFR-HFC läsnäollessa Y-142 laskettiin prosenttiosuutena ”valvonta” SHB-EGF-sitoutumisen EGFR, joka tapahtui ilman Y-142. Data pistettä edustavat keskiarvoa + SD arvojen hankittujen kolmena kappaleena. (B) neutralisoiva aktiivisuus Y-142 vastaan ​​EGFR fosforylaatiota. SK-OV-3-soluja käsiteltiin 10 nM SHB-EGF: n ja 67 nM Y-142. Solulysaatit inkuboitiin anti-EGFR-vasta-aine-pinnoitettu levy, jota seurasi inkubaatio HRP-leimatun anti-phosphorytosine vasta-aine. EGFR fosforylaatiota läsnäollessa Y-142 laskettiin prosenttiosuutena ”valvonta” EGFR fosforylaatiota joka tapahtui ilman Y-142. Data pistettä edustavat keskiarvoa + SD arvojen hankittujen kolmena kappaleena. (C) neutraloidaan aktiivisuus Y-142 vastaan ​​erbB4 fosforylaatiota. Solulysaatteja T47D solut valmistettua kuvassa. 3A inkuboitiin anti-erbB4-vasta-päällystetylle levylle. Fosforylaatio erbB4 havaittiin jonka sulfo-merkityn anti-fosfotyrosiinivasta-ainetta. ErbB4 fosforylaatio läsnä ollessa Y-142 laskettiin prosenttiosuutena ”valvonta” erbB4 fosforylaatio, joka tapahtui ilman Y-142. Data pistettä edustavat keskiarvoa + SD arvojen hankittujen kahtena kappaleena. (D) ja (E) Neutraloiva aktiivisuus Y-142 vastaan ​​(D) ERK1 /2-fosforylaation ja (E) AKT-fosforylaation. In (D) ja (E) SK-OV-3-soluja käsiteltiin 10 nM SHB-EGF: n ja 200 nM Y-142 värjättiin anti-fosforyloitu ERK1 /2-vasta-aineen tai anti-fosforyloitu AKT-vasta-ainetta, vastaavasti, minkä jälkeen Alexa488-leimattua anti-kani-lgG-vasta-ainetta. Fosforyloituu ERK1 /2 ja fosforyloidun AKT havaittiin molemmat kanssa ImageXpress Micro väline ja lasketaan prosentteina ”valvonta” fosforylaatio tasoja, jotka tapahtuivat ilman Y-142. Data pistettä edustavat keskiarvoa + SD arvojen hankittujen kahtena kappaleena. (F) neutralisoiva aktiivisuus Y-142 ARG. SK-OV-3-soluja käsiteltiin 10 nM ARG sekä erilaisia ​​pitoisuuksia Y-142 (2 nM, 6,7 nM, 20 nM, ja 67 nM). Anti-ARG monoklonaalinen vasta-aine (67 nM) käytettiin positiivisena kontrollina. Solulysaatit inkuboitiin anti-EGFR-vasta-aine-pinnoitettu levy, jota seuraa inkubointi HRP-leimattu anti-phosphorytosine vasta-aine. EGFR fosforylaatiota laskettiin prosenttiosuutena ”valvonta” EGFR fosforylaatiota joka tapahtui ilman Y-142. Data pistettä edustavat keskiarvoa + SD arvojen hankittujen kolmena kappaleena.

sitoutumisspesifisyys- testi, Y-142 tunnustettu ARG sekä SHB-EGF, jotka molemmat ovat EGFR: n ligandien (Fig. 1A) . Sitten testattava, jos Y-142 voi neutraloida biologinen aktiivisuus ARG. Oletimme, että Y-142 voisi neutraloida toiminnallisuutta ARG, koska se on neutraloivaa aktiivisuutta SHB-EGF: n ja ristireaktiivisuutta ARG. Kuitenkin pystyimme osoittamaan, että fosforylaatio EGFR aiheuttama ARG vain osittain neutraloida Y-142 (Fig. 3F), kun taas Y-142 esti täydellisesti SHB-EGF-indusoitu EGFR fosforylaatiota (kuvio. 3B). Nämä tulokset viittaavat siihen, Y-142 voi neutraloida sekä SHB-EGF ja ARG toiminnallista aktiivisuutta, vaikkakin ARG aktiivisuus EGFR on vain osittain tukossa Y-142.

vertailu SHB-EGF neutralointiaktiivisuus Y-142 kanssa niille setuksimabi, CRM197, ja Bevasitsumabilla

neutraloiva aktiivisuus Y-142 vastaan ​​SHB-EGF verrattiin kahta tunnettua inhibiittorit EGFR reitin: setuksimabi ja CRM197. Setuksimabi, anti-EGFR-monoklonaalinen vasta-aine käytetään syövän terapeuttisen aineen, estää EGFR-riippuvaista syöpäsolujen kasvua estämällä EGFR aktivointi. CRM197, mutantti difteriatoksiini, sitoutuu proHB-EGF: n ja myöhemmin sisäistämisen CRM197 aiheuttaa proteiinisynteesin inhibitio. Kuten on esitetty kuviossa. Kuten on esitetty kuviossa.