Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

D-vitamiini sitova proteiini-makrofagi aktivoivan tekijän (DBP-MAF) on voimakas estäjä kasvaimen kasvua. Sen toiminta on kuitenkin katsottu johtuvan välilliset järjestelmät kuten tehostaa immuunivasteen aktivoimalla makrofageja ja estävät verisuonten kasvua tarvitaan kasvainten kasvua.

menetelmät ja havainnot

Tässä tutkimuksen osoitamme ensimmäistä kertaa, että DBP-maf esittelee suora ja voimakas vaikutus eturauhasen tuumorisoluihin puuttuessa makrofageissa. DBP-MAF osoittivat estävää aktiivisuutta leviämisen tutkimuksissa sekä LNCaP ja PC3 eturauhassyövän solulinjoissa sekä metastaattisen klooneja näiden solujen. Virtaussytometria tutkimukset anneksiini V ja propidiumjodidilla osoitti, että tämä inhiboiva aktiivisuus ei johdu apoptoosia tai solujen kuolemaan. DBP-MAF oli myös kyky estää migraation eturauhassyöpäsolujen

in vitro

. Lopuksi, DBP-MAF osoitettiin aiheuttavan vähenemistä urokinaasin plasminogeeniaktivaattorin reseptorin (uPAR) ilmentyminen eturauhas- syöpäsoluihin. On todisteita siitä, että tämän reseptorin aktivaation korreloi kasvaimen etäpesäkkeitä.

Päätelmät

Nämä tutkimukset osoittavat, voimakas estävä aktiivisuus DBP-maf eturauhasen tuumorisoluihin riippumaton sen makrofagiaktivaation.

Citation: Gregory KJ, Zhao B, Bielenberg DR, Dridi S, Wu J, Jiang W, et al. (2010) D-vitamiini sitova proteiini-makrofaagianalyysi aktivoiva tekijä estää suoraan solujen lisääntymisen, migraation ja uPAR Expression eturauhassyöpäsolujen. PLoS ONE 5 (10): e13428. doi: 10,1371 /journal.pone.0013428

Editor: Joseph Najbauer, City of Hope National Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 21. 2010 Hyväksytty 10 syyskuuta 2010 Julkaistu: 18 lokakuu 2010

Copyright: © 2010 Gregory et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat puolustusministeriön (DOD) avustus PC030286 ja tutkimuksen sokeuden estämiseksi Challenge Grant. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

D-vitamiinia sitovan proteiinin (DBP) on tärkein kuljettaja D-vitamiinin verenkiertoon. Se on molekyylipaino välillä 52-59 kDa, ja on todettu, että verenkiertoon tasolle välillä 300-600 ug /ml [1], [2]. DBP on vanhempi molekyyli DBP-MAF [3]. DBP-MAF on tuotteen selektiivisen deglykosylaatio DBP ja sen on osoitettu olevan voimakas angiogeneesin vastainen ja antitumorigenic molekyylin [4] – [6]. Olemme osoittaneet aiemmin vierassiirrännänmallissa hiirimallissa että DBP-MAF on voimakas estäjä ihmisen haiman kasvaimia ja että sen kyky estää kasvaimen kasvua

in vivo

johtuu osittain sen antiangiogeeninen ominaisuudet [4] . Tässä tutkimuksessa osoitettiin, että DBP-MAF on antiangiogeeninen perustuu vähentämiseen alusten poikasen rakkokalvon, ja perustuvat alennetaan mikroverisuonitiheys kasvaimissa. On ehdotettu muissa tutkimuksissa, että sen ensisijainen tuumorin vastaista mekanismit ovat immunologisia, koska sen makrofagien aktivoituminen. Viimeaikaiset kliiniset tutkimukset Yamamoto

et al

ovat osoittaneet voimakkaita antituumorivaikutuksen sekä tehoaa HIV [7] – [10]. Tämä aktiivisuus mitattiin funktiona pienentää seerumin entsyymin α-N-acetylgalactosaminidase (nagalase). Nagalase deglykosylaatio DBP estää sitä aktivoimalla makrofagien ja näin ollen tukahduttaa immuunivastetta [11]. Perusmekanismi Ehdotettu kaikissa tapauksissa on pitkälti makrofagien aktivoituminen ja sitä seurannut immuunivastetta. HIV on ehdotettu, että viallisia antigeenin esittelyä on tekijä immuunikato [12]. Koholla olevista nagalase plasmassa HIV-potilaiden viittaa siihen, että makrofagien aktivaatio voidaan estää näillä potilailla [13]. Lisäksi, nagalase on osoitettu olevan olennainen komponentti vaippaproteiini edistää fuusion aloittamiseksi infektion [11]. Plasman nagalase potilailla, joilla on systeeminen lupus erythematosus havaittiin myös olevan koholla. Vuonna lupus, autovasta muodostaa patogeenisten immuuni komplekseja ja laskeutuvat kudoksissa. Puhdistuma Näiden kompleksien makrofagien estyy jos makrofagiaktivaatio on häiriintynyt [14]. Syöpäsolut on osoitettu tuottavan nagalase [15] ja kohonneet pitoisuudet seerumissa on tallennettu useita syövän potilaille, jotka kärsivät melanooma [16], eturauhasen, peräsuolen, ja metastaattisen rintasyövän [7] – [9]. Perusteellinen ymmärtäminen DBP-MAF aktiivisuus on vielä saavutettu, mutta sen potentiaalia antiangiogeenisen ja immunogeeninen hoito on selvä.

neljä eturauhassyövän solulinjoja käytettiin tässä tutkimuksessa lisäämällä siihen; androgen herkkä (LNCaP) ja tunteeton (PC3M) linjat sekä erittäin metastaattinen linjat (LNCaPLN3 ja PC3MLN4) johdettu kunkin vanhempien linja, vastaavasti.

Kyky DBP-MAF on suora vaikutus kasvainsoluissa ei ole raportoitu. Tässä tutkimuksessa tutkittiin miten DBP-MAF suoraan esto, kuten solujen lisääntymisen, migraation ja ilmentyminen uPAR, jotka liittyvät kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden.

Materiaalit ja menetelmät

synteesi DBP-MAF

(a) valmistus (1-3) β-D-galaktosidaasi-agaroosi-helmiä.

valmistaminen helmet tehtiin käyttämällä muunnelmaa menetelmästä, Yamamoto

ym

[17]. Syanogeenibromidiaktivoituja helmiä (0,5 g), pestiin 1 mM HCl: llä (3 x 10 ml pesua kohti) käyttäen imusuodatuksella. Helmet pestiin sitten DDI vedellä ja suspendoitiin uudelleen 2 ml: aan kytkentäpuskuria (0,1 M NaHCO

3, 0,5 M NaCl, pH 8,3). (1-3) β-D-galaktosidaasi (1000 yksikköä) lisättiin helmiä /kytkimen puskuria ja sitten ravisteltiin yli ja alle sekoittimessa 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Helmet pestiin sitten kytkimen puskurilla ja suspendoitiin uudelleen estopuskuriin (kytkentä puskuria plus 0,2 M glysiini). Suspensiota ravisteltiin yön yli 4 ° C: ssa. Helmet pestiin sitten kytkimen puskurilla ja sen jälkeen 0,1 M natriumasetaattia, 0,5 M NaCl, pH 4,0, ja pesut toistettiin yhteensä neljä kertaa. Helmet pestiin viimeinen pesu kytkennän puskurissa sentrifugoitiin ja suspendoitiin uudelleen 1,0 M NaCl: a.

(b) määrittäminen (1-3) β-D-galaktosidaasi-agaroosihelmille aktiivisuutta.

määritys helmi aktiivisuus tehtiin käyttämällä muunnelmaa menetelmästä, Yamamoto

et ai

[17]. Jotta voidaan määrittää aktiivisuuden (1-3) β-D-galaktosidaasi-agaroosihelmet, 50 ui helmisuspensiota lisättiin 0,95 ml: aan määrityspuskuria, joka /kromogeenisen substraatin (PBS, 3 mM 2-nitrofenyyli-β- D-galaktopyranosidi, 10 mM MgCl

2, 0,1 mM β-merkaptoetanolia), ja suspensiota sekoitettiin huoneenlämpötilassa 15 minuutin ajan. Reaktio pysäytettiin 33 ul: aan 1 M natriumkarbonaattia, ja absorbanssi mitattiin 405 nm: ssä. Aktiivisuus ilmaistiin yksiköinä /ml helmisuspensiota, jossa 1 yksikkö määritellään useita umol p-nitrofenolia muodostettu per minuutti. Molaarinen absorbtivity on 18380 l /mol cm, ja reitin pituus 0,25 cm, joka vastaa 200 ui tilavuuteen 96-kuoppaisen levyn käytettiin pitoisuuden laskemiseksi p-nitrofenolia.

(c) Deglykosylaatio DBP kanssa (1-3) β-D-galaktosidaasi-agaroosi-helmiä.

Deglykosylaatio DBP tehtiin käyttämällä muunnelmaa menetelmästä, Yamamoto

et ai

[17]. DBP (CalBiochem, San Diego, CA) lisättiin loppupitoisuudeksi 0,05 mg /ml PBS: ssä, pH 6,0, 10 mM MgCl

2, jossa on 0,007 U (1-3) β-D-galaktosidaasi-agaroosia ja 0,004 U neuraminidaasin-agaroosia (Sigma, St. Louis) ja ravisteltiin huoneenlämpötilassa 4 tuntia. Reaktion kokonaistilavuus oli 1 ml. Sitten helmet sentrifugoidaan pohjaan ja poistetaan. DBP-MAF säilytettiin erinä -20 ° C: ssa.

DBP-MAF peptidi

14 aminohappoa DBP-MAF peptidi syntetisoitiin (Ana Spec, Fremont, CA) kanssa amino posekvenssi: Ac-TPTELAKLVNKRSE. Puhtaus oli yli 90-%.

Soluviljely

PC3M, PC3MLN4, LNCaP ja LNCaPLN3 solut ystävällisesti toimitti Dr. Curtis Pettaway ja Dr. Isaiah J. Fidler (MD Anderson Cancer Center ). PC3M solulinja eristettiin maksametastaaseista tuotettu nude-hiirissä sen jälkeen pernansisäistä injektiota androgeenin epäherkkä PC3 ihmisen eturauhasen karsinooma solulinjassa [18]. Metastaattisen alalinjoja, PC3MLN ja LNCaPLN, luotiin injektoimalla emosoluilta ortotooppisesti selän etu- rauhasen lohkoon nude-hiirten ja viljelemällä soluja, jotka oli metastasized Sentinel (paraaortic) imusolmuke. Viljelyn jälkeen 3-5 kohtia, nämä solut uudelleen injektoidaan eturauhasen myöhemmin nude-hiirissä. Tämä prosessi toistettiin 3 jaksoa luoda metastaattisen linja, LNCaPLN3 ja neljä kierrosta luoda metastaattisen linja, PC3MLN4 [18]. Kaikki kasvainsoluja viljeltiin RPMI 1640 (Invitrogen), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (FBS), penisilliiniä (100 U /ml) /streptomysiiniä (100 ug /ml), ja L-glutamiinia ja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 10% CO

2.

hapan fosfataasi kolorimetristä

päätteeksi kunkin kokeessa soluja pestiin PBS sitten 450 ui happo fosfataasipuskurilla (10 mM p-nitrofenolifosfaattia, 0,1 M natriumasetaatti, 0,1% Triton X-100, pH 5,8) lisättiin kuhunkin kuoppaan. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 45 minuutin ajan. Viisikymmentä ui 1 N NaOH: ta lisättiin kuhunkin kuoppaan reaktion lopettamiseksi, ja absorbanssi mitattiin 405 nm: ssä [19], [20]. Solujen määrä kunkin solutyypin kalibroitiin absorbanssi käyttäen hemasytometriä sen varmistamiseksi, että happaman fosfataasin tasot korreloivat lineaarisesti solujen määrä. Analyysit ja piirtämistä kaikille määritykset tehtiin käyttäen Alkuperä Pro 8 (Northampton, MA).

Cell muuttoliike määrityksiä

Migration analyysit suoritettiin käyttäen modifioitua Boyden kammion Millicell kulttuuri insertit (Millipore, Billerica, MA) 8 um huokosia [20] – [22]. Ylempi kalvot esi-inkuboitiin yön yli fibronektiinin kanssa (10 ug /ml PBS: ssä), joka imettiin kaivoista seuraavana aamuna. Solut (150000 solua /kuoppa) maljattiin peruselatusaineessa with.010% gelatiinia tai ilman DBP-MAF tai DBP. Jotkut näytekaivoja värjättiin vuoden loppuun itämisaika, jotta soluadheesiota ylemmissä kalvot oli yhdenmukainen kaikissa olosuhteissa. Basal väliainetta lisättiin pohjaan kuoppiin kanssa tai ilman 10% FBS: ää. Soluja inkuboitiin kuusi tuntia 37 ° C: ssa, 10% CO

2. Solut, jotka eivät muuttaneet poistettiin kalvon yläosaan ja siirtynyt solut kvantitoitiin käyttäen happaman fosfataasin kolorimetrisellä määrityksellä.

Proliferaatiomääritykset

Kasvaimen soluja pidettiin RPMI 1640 (Invitrogen) 10% FBS, penisilliini /streptomysiiniä ja L-glutamiinia ja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 10% CO

2. Solut trypsinoitiin ja lisättiin 24-kuoppaisille levyille (5000 solua /kuoppa) 0,5 ml: ssa viljelyalustaa. Soluja seerumin puutteessa yön yli, sitten elatusaine korvattiin RPMI 1640, 1% FBS, penisilliini /streptomysiiniä ja L-glutamiinia, ja inkuboitiin 72 tuntia tai ilman DBP-maf tai DBP [23]. Proliferaatiota arvioitiin käyttäen hapan fosfataasi kolorimetristä [4], [23].

Virtaussytometria

Solut kasvatettiin -80% konfluenssiin 100 mm

2 ruokia. Soluja käsiteltiin tai ei DBP-MAF (1 ug /ml) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 48 tunnin ajan. Solut trypsinoitiin, sentrifugoitiin, jaettiin osiin putkiin ja leimattu anneksiini V ja propidiumjodidi käyttämällä apoptoosin havaitsemiseen kit (APOAF, Sigma, St. Louis, MO). Anneksiini V: ja PI-värjäys suoritettiin noudattaen valmistajan suosituksia. Virtaussytometria-analyysi suoritettiin käyttäen Cytomation MoFlo solulajittelijaa noudattaen valmistajan suosituksia.

Käänteinen transkriptio ja reaaliaikainen kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (RTQPCR) B

Kokonais-RNA uutettiin ihmisen soluista käyttäen Trizol reagenssia (Invitrogen) valmistajan suositusten ja käsiteltiin RNaasi-vapaata DNaasia (Ambion). RNA eheys ja laatu arvioitiin kautta 1% agaroosigeelielektroforeesilla ja pitoisuudet määritettiin spektrofotometrisesti (NanoDrop 1000 Spektrofotometri V3.7, ThermoFisher Scientific). Kokonais-RNA (1 ug), tehtiin käänteistranskriptio kuten aiemmin on kuvattu [24] käyttämällä qScript cDNA SuperMix (Quanta Biosciences). RT tuotteet (cDNA) monistettiin reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR (Applied Biosystems 7900 HT Fast Real-Time PCR-järjestelmä) Power SYBR vihreä Master Mix. Oligonukleotidialukkeita spesifinen ihmisen uPAR variantin 1 (Genebankin liittymisen nro NM-002659, eteenpäin 5’CAACGAGGGCCCAATCCT -3 ’ja reverse 5′-GTAACACTGGCGGCCATTCT -3’), uPAR variantti 2 (Genebankin liittymisen nro NM-001005376, eteenpäin 5 ”- CAACGAGGGCCCAATCCT -3 ’ja reverse 5’CACTGGCGGCCATTCTG -3’), uPAR variantti 3 (Genebankin liittymisen nro NM-001005377, eteenpäin 5’GCCGTTACCTCGAATGCATT -3” ja kääntää 5’GGCCCCTCTCACAGCTCAT -3 ’), ja 18S rRNA (eteenpäin 5’-CGCAGCTAGGAATAATGGAATAGG-3 ’ja reverse 5′-GCCTCAGTTCCGAAAACCAA-3’) käytettiin. QPCR sykliolosuhteet olivat 50 ° C 2 min, 95 ° C: ssa 10 min, mitä seurasi 40 sykliä kaksivaiheista vahvistusta ohjelman (95 ° C 15 s ja 58 ° C 1 min). Lopussa vahvistus, sulamiskäyräanalyysillä sovellettiin käyttäen dissosiaatio protokollan Sequence Detection järjestelmä jättää saastumisen epäspesifiset PCR-tuotteet. PCR-tuotteet varmistettiin myös agaroosigeelillä ja osoitti vain yhden tietyllä taajuusalueella, ennustetun koon. Negatiivisia kontrolleja ei RT tuotteita käytettiin templaatteina qPCR eikä bändi havaittiin geelillä.

suhteellinen ilmauksia kohdegeenien määritettiin 2

-ΔΔCt menetelmä [25]. Käsittelemättömistä soluista valittiin kalibraattorit.

immunoblottauksella

Immunoblottaus suoritettiin käyttämällä muunnelmaa menetelmästä, Besch

et ai

[26]. Soluja viljeltiin 100 mm

2 ruokia ja kasvatettiin -80% konfluenssiin sitten seerumia yli yön. Kasvualusta korvattiin RPMI (1% FBS). DBP tai DBP-MAF lisättiin ilmoitettuina pitoisuuksina. Soluja inkuboitiin 24 tai 72 tuntia 37 ° C: ssa sen jälkeen hajotettiin käyttämällä HTG-puskuria (20 mM HEPES, pH 7.4,10% glyserolia, 1% Triton X-100) ja kerättiin käyttämällä solukaavinta. Phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) lisättiin (100 uM). Lysaatit erotettiin SDS-PAGE: lla. Kaistat normalisoitiin käyttäen yhtä suurta proteiinia lastaus (40 ug /kaista). Proteiini-tasot määritettiin käyttäen BCA-määrityksellä (Pierce, Rockford, IL). Juovat siirrettiin PVDF-kalvolle. Kalvo blokattiin yön yli 10% jauhettua rasvatonta maitoa ja 0,10% Tween 20 PBS: ssä. Kalvo hybridisoitiin anti uPAR-vasta-ainetta (Santa Cruz, CA), jota seurasi hybridisaatio piparjuuriperoksidaasiin liittyy sekundaarisen vasta-aineen ja visualisoitiin käyttäen kemiluminesenssi. Vinkuliini käytettiin latauskontrollina.

Tilastollinen

The effect of DBP-MAF testattiin erikseen solujen vaeltamiseen ja proliferaatiomäärityksissä. Yksipuolinen t-testiä käytettiin mittaamaan tilastollista merkitystä vähennykset kasvaimen kasvun eri tasoilla. Kaksipuolinen Z-testiä käytettiin mittaamaan vaikutuksen DBP-MAF apoptoosin tai nekroosin. Kaikki analyysit tehtiin käyttäen SAS-tilasto-ohjelmiston versio 9.1 (SAS Institute, Cary, North Carolina) ja

P

-arvo ≤0.01 käytettiin tunnistamaan tilastollista merkittävyyttä.

Tulokset

DBP-MAF estää kasvainsolujen vaeltamista

Invasion ja kasvainsolujen vaeltamista ovat tärkeitä askeleita kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden. DBP-MAF testattiin sen vaikutuksen soluvaelluksen neljä kasvaimen lines- kaksi vanhempien eturauhassyövän linjat (LNCaP ja PC3M) ja kaksi metastasoitunut klooneja näiden linjojen (LNCaPLN3 ja PC3MLN4), käyttäen muunneltua Boyden kammion. Pohjapinta siirtymän tason keskenään vanhempien linja ja sen vastaavan metastasoituneen klooni pysyi ennallaan. Kaikilla tutkituilla annoksilla, inhibitio muuttoliikkeen havaittiin (kuva 1).

LNCaP (A), LNCaPLN3 (B), PC3M (C) tai PC3MLN4 (D) soluja lisättiin (150000 /kuoppa), että top kammio modifioidun Boyden-kammio (+/- DBP-MAF) 10% FBS alaosaan. 6 tunnin jälkeen solut poistettiin, jotka eivät olleet vaeltaneet, ja jäljellä olevat solut kvantifioitiin käyttäen happaman fosfataasin määritys. Tulokset normalisoitiin hallita. Kokeet suoritettiin vähintään kolme kertaa, ja virhe on esitetty +/- SD. Verrattuna solujen kasvua ilman DBP-MAF, lisäämällä DBP-MAF oli tilastollisesti huomattavaa vähentämistä solumigraation 30% (P = 0,0003) ja yhdistetyn neljän kasvainsolutyypit. Yksittäiset merkittävä väheneminen hinnat havaittiin kullakin näistä kasvainsolutyypit. Kontrolliin verrattuna, merkittävä väheneminen nähtiin DBP-MAF (A) 20% P = 0,0022 (B) 20% P = 0,0029 (C) 10% P = 0,0045 (D) 30% P = 0,0094. n = 3.

DBP-MAF peptidi inhiboi kasvainsolun muuttoliike

valmistelu DBP-MAF liittyy monivaiheinen entsymaattisia prosesseja. Valikoiva Deglykosylaatiota on välttämätön vaihe, koska ilmaus DBP-MAF E. colissa tuotti proteiinia, jolla ei ole aktiivisuutta [4]. Aktiivinen mutta helpommin muotoiltu versio molekyylin tekisi valmistukseen DBP-MAF helpompaa ja halvempaa. Näistä syistä DBP-MAF peptidi syntetisoitiin käyttäen sekvenssin vanhemman molekyyli, joka oli osoittanut aktiivisuutta muissa tutkimuksissa [27]. Peptidi testattu sellaisenaan mahdollisesti estää kasvaimen solujen vaeltamiseen. Kuten kuviossa 2 on esitetty, peptidi osoitti merkittävää kykyä estää siirtymistä kaikkien tuumorilinjoja. Estovaikutus ei lisännyt suuremmilla annoksilla, mikä viittaa sen IC

50 oli pienempi kuin testatulla annosalueella.

LNCaP (A), LNCaPLN3 (B), PC3M (C) tai PC3MLN4 (D) soluja lisättiin (150000 /kuoppa) yläkammioon modifioidun Boyden-kammio (+/- DBP-MAF) 10% FBS alaosaan. 6 tunnin jälkeen solut poistettiin, jotka eivät olleet vaeltaneet, ja jäljellä olevat solut kvantifioitiin käyttäen happaman fosfataasin määritys. Tulokset normalisoitiin hallita. Kokeet suoritettiin vähintään kolme kertaa, ja virhe on esitetty +/- SD. Verrattuna maahanmuuttoa ilman DBP-MAF, lisäämällä DBP-MAF oli tilastollisesti merkittävä väheneminen siirtolaisuuden 40% (P 0,0001) yhdistelmälle kaikkien neljän kasvainsolutyypit. Yksittäiset merkittävä väheneminen hinnat havaittiin kullakin näistä kasvainsolutyypit. Kontrolliin verrattuna, merkittävä väheneminen nähtiin DBP-MAF (A) 30% P = 0,0038 (B) 40% P = 0,0016 (C) 20% P = 0,0038 (D) 40% P = 0,0005. n = 3.

DBP-MAF inhiboi kasvainsoluproliferaation

neljä solulinjat testattiin sitten määrittää niiden herkkyys DBP-MAF jakautumisväliaineessa tutkimuksissa. Kuten kuviossa 3A on esitetty, DBP-maf 1 ug /ml vähensi leviämisen lähtötasolle tai sen alle kaikissa solulinjoissa lukuun ottamatta PC3M. Oli mielenkiintoista, että vaikka PC3M solut eivät olleet herkkiä DBP-MAF tässä määrityksessä metastaattisen klooni PC3MLN4 oli kehittynyt herkkyyttä sitä.

LNCaP (A), LNCaPLN3 (B), PC3M (C) tai PC3MLN4 (D) soluja siirrostettiin 24-kuoppaisille maljoille yön yli, sitten alustalle +/- DBP-maf lisättiin 1% FBS: ää. 72 tunnin jälkeen solut kvantifioitiin käyttäen happaman fosfataasin määritys. Tulokset normalisoitiin hallita. Kokeet suoritettiin vähintään kolme kertaa, ja virhe on esitetty +/- SD. Kontrolliin verrattuna, merkittävä väheneminen nähtiin DBP-MAF (A) 50% P = 0,0001 (B) 50% P = 0,0001 (C) merkittävää vähentämistä (D) 40% P = 0,0073. n = 3.

1 ug /ml, DBP-MAF oli tilastollisesti merkittävä väheneminen solujen kasvua 40% (P = 0,0073) ja yhdistelmä kaikkien kasvainsolutyypit. Yksittäiset merkittävä väheneminen hinnat (ilman DBP-maf vs.1 ug /ml), havaittiin myös näistä kasvainsolutyypit paitsi PC3M, jossa ei ole merkittävää vähenemistä havaittu (kuvio 3).

leviämisen tutkimukset käyttäen DBP- maf peptidi ei havaittu vähenemistä leviämisen tahansa solulinjoista (tietoja ei esitetty). Tämä viittaa siihen, että kyky inhiboida maahanmuuton ja proliferaatiota voivat sijaita eri alueita proteiinin, ja että tämä peptidisekvenssi voi olla mitään roolia proliferaation estossa. On myös mahdollista, että sivusto vastuussa koko DBP-maf toiminta on monimutkainen ja vaatii selektiivisesti deglykosyloituneen proteiinin sekvenssiä on läsnä.

Sen määrittämiseksi, onko tuumorin solujen lisääntymisen johtui solukuoleman tai apoptoosin, virtaussytometria-analyysi tehtiin käyttämällä propidiumjodidia ja anneksiini V markkereita. Näissä tutkimuksissa ei havaittu joko merkittävän solukuoleman tai aiheutuva toksisuus DBP-MAF käsiteltyjä soluja (taulukko 1), ja lukuun ottamatta, että PC3M emolinjan, vähensi.

RT-PCR esittää vähentäminen uPAR ilmentymisen soluissa, joita käsiteltiin DBP-maf

ilmentyminen urokinaasin plasminogeeniaktivaattorin reseptorin (uPAR) on osoitettu korreloivan kasvoi etäpesäke tuumorisoluissa [28] – [30] ja lääkeresistenssin [31] (katso katsaus [32]). RT-PCR suoritettiin kaikissa solutyypeissä käyttämällä kolmea tunnettua isoformeja uPAR esiasteiden, kuten liukoinen reseptori, isoformin 2 (katso menetelmät). Kuten on esitetty kuviossa 4D, vähentää RNA ilmentyminen havaittiin LNCaPLN3 läsnä ollessa DBP-maf sekä 0,001 ja 1 ug /ml DBP-MAF sekä uPAR1 ja uPAR2 isoformit. Isoformeja uPAR2 ja uPAR3 osoittivat samanlaisia ​​vähentäminen lausekkeen DBP-MAF hoidossa PC3M soluja. Mielenkiintoista on, että vaikka PC3MLN4 solut osoittivat merkittävää vaste DBP-MAF (kuvio 5D), oli tilastollisesti merkittävä väheneminen uPAR2 kanssa DBP 1 ug /ml. Lähes kaikissa tutkituissa olosuhteissa, 72 tunnin jälkeen uPAR tasot olivat palanneet kontrolliarvoihin (tuloksia ei ole esitetty). Peptidi testattiin myös käyttämällä solulinjaa (LNCaPLN3), joka toimi kaikissa määrityksissä ja (PC3M), joka toimi aktiivisesti maahanmuuttoa, mutta ei leviämistä. Ne eivät osoittaneet merkittäviä muutoksia tahansa uPAR isoformin tasot peptidillä (kuvio 6A ja 6B). Kasvain linjat testattiin tarkkailla vaikutusta DBP-MAF on uPAR ilmaisun proteiinitasolla. Solut kerättiin 24 tunnin kuluttua ja lysaatit immunoblotattiin. Kuten on esitetty kuviossa 4, DBP-maf ei ilmentymisen inhiboimiseksi uPAR tahansa solulinjoissa 24 tunnin kuluttua (kuvio 7A), mutta vähennys havaittiin 72 tunnin kuluttua vain LNCaPLN3 soluissa (kuvio 7B). DBP käsitellyt solut eivät osoittaneet mitään merkittävää muutosta reseptorin ilmentymisen.

LNCaP ja LNCaPLN3, soluja käsiteltiin DBP: tä tai DBP-MAF (0,001 ja 1 ug /ml) ja inkuboitiin 24 tunnin ajan, sitten kerätään. RT tuotteet (cDNA), tunnistettiin uPAR1, 2, ja 3, monistettiin reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR: llä.

PC3M, ja PC3MLN4 soluja käsiteltiin DBP tai DBP-MAF (0,001 ja 1 ug /ml) ja inkuboitiin 24 tunnin ajan, sitten kerätään. RT tuotteet (cDNA), jotka on nimetty uPAR1, 2, ja 3, monistettiin reaaliaikaista kvantitatiivista PCR: ää. p 0,05.

LNCaPLN3 (A) ja PC3M soluja (B) käsiteltiin DBP: tä tai DBP-MAF (0,001 ja 1 ug /ml) ja inkuboitiin 24 tunnin ajan, sitten kerätään. RT tuotteet (cDNA), jotka on nimetty uPAR1, 2, ja 3, monistettiin reaaliaikaista kvantitatiivista PCR: ää. p 0,05.

LNCaP, LNCaPLN3, PC3M, ja PC3MLN4 käsiteltiin DBP: tä tai DBP-maf ja inkuboitiin 24 tunnin ajan (A), sitten talteen ja immunoblot käyttämällä anti-uPAR-vasta-ainetta. LnCaPLN3-soluilla 72 tuntia (B). p 0,05.

Keskustelu

D-vitamiinia sitovaan proteiiniin DBP-MAF, on osoitettu estävän sekä kasvaimen ja verisuonten kasvua. Osoitamme tässä, ensimmäistä kertaa, on suora vaikutus syöpäsolujen puuttuessa makrofagien, lisätä mahdollisuuksia DBP-MAF pidemmälle jo osoittanut antiangiogeenistä ja immuniteettia moduloivia ominaisuuksia. DBP-MAF osoittivat voimakas esto sekä lisääntymistä ja kasvainsolujen vaeltamista.

On mielenkiintoista huomata vastetta vanhempien PC3M solujen verrattuna metastaattisen klooni. PC3M solut eivät näytä herkkyyttä DBP-MAF lisääntymismäärityksissä, mutta muuttoliikkeen estyi DBP-MAF. Oli vähentäminen uPAR ilmentyminen havaittiin RT-PCR: llä, mutta proteiinin ilmentyminen uPAR isotyyppien testattu ilmestyi ennallaan. Lopuksi, DBP-MAF aiheutti hieman enemmän menetyksistä apoptoosin tai nekroosin (taulukko 1), kun taas muut solulinjat osoittivat vähentynyttä apoptoosia tai kuolion. Metastaattista klooni PC3MLN4 näytteillä voimakas hoitovastetta sekä proliferaatio ja migraatio jopa pienellä annoksella (1 ng /ml), mutta osoitti ei vähentynyt uPAR ilmaisun joko mRNA tai proteiini tasolla. Muita leviämisen tutkimukset tehtiin onko ristiriita vastauksena välillä vanhempien ja metastaattisen klooni johtui yleisestä muutoksesta solun herkkyyttä. Kalsitriolin todettiin aiheuttavan voimakas ja johdonmukainen estäminen kaikkien solutyyppien sisällä sama annos vaihtelee. PC3M ja PC3MLN4 solut testattiin myös etoposidia ja niiden vasteet olivat samanlaiset (tietoja ei esitetty), mikä viittaa siihen, että metastaattinen klooni sai herkkyys DBP-MAF että vanhempien linja ei osoittaa. Vaikutus DBP-MAF on PC3MLN4 soluihin aiheutti eniten merkittävä väheneminen hinnat proliferaatio ja migraatio verrattuna muihin solulinjoihin. Tutkimukset osoittivat kaikki tuumorisolulinjat olevan herkkä DBP-MAF siirtymätesteissä määrityksissä.

huomautuksia viljelemällä näitä soluja että metastaattisen kloonit sekä PC3M ja LNCaP olivat herkempiä Trypsinisaation kuin vanhempien linjat. Monet tekijät voivat säädellä solujen kulkeutumista ja vaikka uPAR on mahdollista välittäjänä, se ei voi olla ainoa mekanismi, jolla DBP-MAF inhiboi muuttoliikettä. Peptidi oli tehokas maahanmuuton tutkimuksissa mutta eivät osoittaneet kykyä vaikuttaa leviämiseen tai uPAR ilme. Koska peptidi edustaa vain osaa proteiinin sillä ei ole kaikkia domeeneja natiivin DBP-MAF, kuten D-vitamiinin sitova alue. On mahdollista, että kyky säädellä maahanmuuttoa ja lisääntymistä asuu erillisten verkkotunnusten proteiinin. Vaikka kaikki solulinjat vastasi DBP-MAF yhden tai useamman määrityksissä vain LNCaPLN3 osoitti vähentäminen uPAR proteiinin tasolla. On kuitenkin mahdollista, että vasta-aine ei tunnista kaikkia isomuotoa uPAR.

Nyt on yleisesti hyväksytty, että kasvain microenvironment, eikä vain kasvain solun yksin, on tehokas tavoite terapiaan. Lisäksi tutkinnassa antituumorivaikutuksia, toimitustapa näiden lääkkeiden tutkitaan. Hyötyosuus on keskeinen osa mitä tahansa terapeuttista strategiaa. Huono imeytyminen, sisäistämisen, lyhyt puoliintumisaika verenkierrossa, ja useita muita puutteita voi tehdä hoito, joka on osoittanut suuren lupauksen

in vitro

, tehoton klinikalla. Efektiivinen

in vivo

annoksina DBP-MAF (pg-ng) ovat yleensä olla pienempi kuin

in vitro

annoksina (ng-ug alue) [4], [6] – [10]. Ehkä tämä johtuu useiden mekanismien sen toiminnan. Voi vaikuttaa verisuonten kasvua ja kasvaimen solujen kasvua sekä lisätä voimakas immuunivastetta makrofagiaktivaatio on vaikea mitata

vuonna toto

käyttämällä

in vitro

lähestymistapoja. Ne eivät kuitenkaan tarjota tapa luonnehtia näitä vaikutuksia erikseen.

The effect of DBP-MAF käsittely uPAR ilmaisun eturauhaskasvainsoluissa ei aiemmin tiedetty. uPAR ilmentyminen on korreloitu kasvaimen etäpesäke useissa kasvaimissa [26], [28] – [30], [32]. Tutkimukset ruokatorven kasvainten osoitti PAI-1 ja uPA ilmaistiin koko kasvaimia, mutta ei normaalissa ruokatorven kudosten ja että uPAR ilmaistiin kasvaimen rajoilla [33], [34]. Välinen yhteys haimasyövän ja uPA on osoitettu, mikä voisi selittää voimakas vaikutus DBP-MAF edellisessä haiman kasvain tutkimuksissa [33].

väliset suhteet plasmiini-sukuiset proteiinit PAI-1, uPA ja uPAR on monimutkainen [35]. Vaikka PAI-1 estää ilmaisun uPA, joka olisi ajatellut estää kasvaimen etenemistä, PAI-1 edistää myös kasvaimen kasvua ja angiogeneesiä omasta [36], [37]. Tässä mielessä terapia, joka vaimentaa uPAR ilmaisu edistämättä kasvaimen kasvu olisi arvokas. Koska etäpesäke on ensisijainen kuolinsyy syöpäpotilailla, uPAR herkkyys DBP-MAF voi edustaa houkutteleva avenue jatkotutkimuksiin.

Kiitokset

Kirjoittajat kiittää Jayakrishna Ambati ja Royce Mohan heidän hyödyllisiä keskusteluja.