Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tarkoitus

ilmentyminen desmogleiineiksi (DSGs), joiden tiedetään olevan ratkaiseva perustamisesta ja ylläpidosta solu-solu tartunta vaaditaan kudoksen eheys, on ollut hyvin tunnettu orvaskeden karvatupen; kuitenkin, niiden ilmaisunvapautta muissa epiteelikudoksissa kuten eturauhasen ymmärretään huonosti. Vaikka downregulation klassisen kadheriinien, kuten E-kadheriinin, on kuvattu eturauhassyövän kudosnäytteistä, ilmaus desmogleiineiksi on vain aiemmin raportoitu eturauhassyövän solulinjoissa. Tässä tutkimuksessa tunnettu desmogleiini ilmentymisen normaalissa eturauhasessa kudoksissa, ja tutki tarkemmin sitä desmogleiini 2 (DSG2) lauseke nimenomaan voi toimia mahdollisena kliininen ennustetekijä potilaille diagnosoitu primääri eturauhassyöpää.

Experimental Suunnittelu

Hyödynsimme immunofluoresenssilla tutkia DSG2 ilmentymisen normaalissa eturauhasessa (

n

= 50) ja kliinisesti hyvin tunnettu kohortti eturauhassyövän potilailla (

n

= 414). Korrelaatio DSG2 ilmaisun kanssa kliinis-patologinen ominaisuudet ja biokemiallisten toistuminen analysoitiin arvioida sen kliinistä merkitystä.

Tulokset

Nämä tutkimukset paljastivat, että DSG2 ja DSG4 olivat erityisesti ilmaistu eturauhasen onteloerityssolut, kun taas pohjapinta soluista puuttuvat niiden ilmaisua. Sen sijaan, DSG1 ja DSG3 ei ole ilmaistu normaalin eturauhasen epiteelissä. Lisäanalyysit DSG2 ilmentymisen eturauhassyövän paljasti, että alennettuja tämän biomarkkereiden oli merkittävä riippumaton markkeri huonosta kliinisen tuloksen.

Johtopäätös

Kirjoittajat raportoivat ensimmäistä kertaa, että alhainen DSG2 ilme fenotyyppi on hyödyllinen ennustetekijöiden biomarkkereiden kasvaimen aggressiivisuus ja voi toimia apuvälineenä tunnistamisessa potilaalla on kliinisesti merkittävä eturauhassyöpä.

Citation: Barber AG, Castillo-Martin M, Bonal DM, Rybicki BA, Christiano AM, Cordon -Cardo C (2014) karakterisointi desmogleiini ekspressio Normaali Eturauhasen Gland. Desmogleiini 2 on itsenäinen ennustetekijä varten Aggressiivinen eturauhassyöpä. PLoS ONE 9 (6): e98786. doi: 10,1371 /journal.pone.0098786

Editor: Craig N. Robson, Northern Institute for Cancer Research, Yhdistynyt Kuningaskunta

vastaanotettu: 17 helmikuu 2014; Hyväksytty: 7. 2014; Julkaistu 4. kesäkuuta 2014

Copyright: © 2014 Barber et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ on osittain tuettu National Institutes of Health myöntää P01-CA087497 (CCC ja MCM) ja R01-ES11126 (BAR). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

desmosomeja ovat eräänlainen solu-solu ankkurointi risteyksessä löytyy kudoksissa, jotka läpikäyvät suurta mekaanista rasitusta, ja menetys desmosomien tarttuvuus liittyy sairauksien iho, hiukset, ja sydän [1] – [ ,,,0],13]. Vuonna Desmosomi, kadheriinin proteiinien perhe edustaa niin kutsuttu ”ei-klassinen” kadheriinien, jotka sisältävät desmogleiineiksi (DSG 1-4) ja desmocollins (DSC 1-3) [14]. Desmogleiineiksi ja desmocollins kahtalainen rooli muodostumista Desmosomien. Solunulkoisessa tilassa, desmogleiineiksi ja desmocollins vastakkaisilla solut ovat vuorovaikutuksessa on heterofiilisten kalsiumista riippuvaisesti kautta kadheriinin toista verkkotunnuksia. Solunsisäisesti, kadheriinien sitoutuvat plakoglobin ja plakophilin, jotka puolestaan ​​sitoutuvat desmoplakin. Desmoplakin sitoutuu sitten väli säikeitä, näin varmistamaan koko rakenteen solun tukirangan [15], [16]. Vaikka selvästi tärkeää säilyttää eheyden aikuisen kudoksissa, rooli desmosomien kadheriineja syövän etenemisen on vähemmän ymmärretään hyvin. Menetys Heterotsygoottisuuden lähellä geenivirhe sisältävä desmosomiproteiinin kadheriinin geeni klusteri on raportoitu ruokatorven syövän sekä pään ja kaulan okasolusyöpä [17], [18]. Muutokset ilmaus desmogleiineiksi on raportoitu erilaisia ​​syöpiä. Alennettu ilmentyminen DSG2 on raportoitu mahan ja haiman karsinoomat [19] – [21]. Kääntäen, yliekspressio DSG2 ja DSG3 on raportoitu okasolusyöpää ihon sekä pään ja kaulan alueen syöpä, vastaavasti [22], [23].

ilmentyminen desmosomien kadheriineja on perusteellisesti tunnettu iho, karvatupen ja arachnoidal kudosta. Vaikka ekspressio DSG2 tiedetään olevan läsnä kaikissa Desmosomi-muodostavien kudosten, ilmaisu jäljellä desmosomien kadheriinien ulkopuolella orvaskeden ja karvatupen ymmärretään huonosti [24]. Tekemästä tutkimuksesta Whittock ja Bower vuonna 2003 käytettiin RT-PCR analysoida ilmaus

DSG4

paneelissa kudosten ja totesi, että

DSG4

voitiin havaita useissa kudoksissa kuten eturauhasen, mikä viittaa että desmogleiini ilmentyminen profiilin eturauhasen voi ulottua arjen ilmaus DSG2 [25]. Vaimennussäätely tai menetys solu-solu-adheesio proteiinien – kuten klassisen kadheriinin, E-kadheriinin – on yhteinen piirre erilaisia ​​syöpiä, mukaan lukien eturauhassyöpä, ja voi aiheuttaa erilaisia ​​mekanismeja, [26], [ ,,,0],27]. Toisaalta, vaikka poikkeava ekspressio desmogleiineiksi on raportoitu useiden syöpätyyppien, ilmentymistä näiden kadheriineja eturauhasen syöpä on raportoitu vain solulinjoissa mennessä [28] – [30]. Tässä tutkimuksessa luonnehtia ensimmäisen kerran ilmentymisen desmogleiineiksi normaaleissa ihmisen eturauhasen kudosnäytteitä ja määrittää tietyn solutyypin, joissa eturauhasen desmogleiineiksi ilmaistaan. Sitten analysoida ilmaus DSG2 on hyvin tunnettu eturauhassyövän potilaan kohortin ja tutkia yhdistyksen välillä DSG2 ilmaisun ja potilaiden kliininen tulos. Tuloksemme osoittavat, että DSG2 ja DSG4 on erityisesti ilmaistu onteloerityssolut normaalin ihmisen eturauhasen, kun taas DSG1 ja DSG3 eivät ilmenny eturauhasen epiteelissä. Lisäksi, vähentynyt ilmentyminen DSG2 havaittiin itsenäisesti liittyy lyhyempi biokemiallisia toistuminen, tuodaan esiin mahdollisen käyttökelpoisuuden ja DSG2 ilmentymisen ennustetyövälineenä biomarkkeri eturauhassyövän aggressiivisuuden.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausuma

Frozen normaalin ihmisen eturauhasen kudosta dioja vastaa eturauhasen siirtymä- vyöhykkeellä histologisesti vahvistettu alueita normaalin rauhaset potilailta, joille tehtiin eturauhasen saatiin anonyymisti Columbia Kasvain Bank Service mukaiset Institutional Review Board of Columbia University Protocol # AAAB2447. TMA Tässä tutkimuksessa käytettiin rakennettiin Cordon-Cardo laboratorio, ja muodostettiin 414 eturauhasen tapauksissa perin kerättiin syyskuun 2000 ja tammikuussa 2005 Henry Ford Health System Detroit, jälkeen Institutional Review Board hyväksymät protokollan # 1018 [31]. Kukin osallistuja suorittanut lyhyt puhelinhaastatteluna (demografiset ja terveystiedot), ruoka taajuus kyselylomake, ja face-to-face haastatteluun työhön liittyvä vastuita. Lisäksi kaikki osallistujat edellyttäen verinäytteestä geneettisiä analyysejä ja PSA testaus. Ilmoittautuminen suljetaan keväällä 2005, ja IRB pysyy auki PSA seurantaa (ei potilas yhteyttä) varten koehenkilöistä.

Soluviljely ja RNA: n eristäminen

hyvänlaatuinen eturauhasen epiteelisolujen BPH- 1 solulinja (antelias lahja tri Ralph Buttyan, ja kaupallisesti saatavilla Saksan kerääminen mikro-organismien ja Cell Cultures, DSMZ, Braunschweig, Saksa) viljeltiin RPMI 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Kolme ihmisen metastaattinen eturauhassyövän solulinjoja käytettiin tässä tutkimuksessa: DU145, PC3 ja LNCaP. DU145 solulinja (ATCC, Manassas, VA) viljeltiin MEM: ssä, jossa oli 10% FBS: ää (Invitrogen, Carlsbad, CA). PC3 solulinja (ATCC, Manassas, VA) viljeltiin F12K 10% FBS (Invitrogen, Carlsbad, CA). LNCaP-solulinja (ATCC, Manassas, VA) viljeltiin RPMI: ssä, jossa oli 10% FBS: ää (Invitrogen, Carlsbad, CA). RNA: n eristämiseksi, solut pestiin 1 x PBS, trypsinoitiin, ja pelletoitiin sentrifugoimalla. Soluja kasvatettiin neljä päivää aiemmin konfluenttisuuden ennen RNA: n eristämistä, koska se on aiemmin raportoitu, että niiden täysi desmogleiini mentymisprofiili saavutetaan tänä ajankohtana [32]. Solupelletit suspendoitiin uudelleen 1 x PBS: ssä ja pelletoitiin sentrifugoimalla pestä. Tämä pesuvaihe toistettiin kahdesti poistamaan kaikki jäljet ​​median ennen sadonkorjuuta RNA. RNA sitten talteen käyttämällä RNeasy Mini Kit ja QIAshredder seuraten valmistajan protokollaa nimeltä ”puhdistaminen Total RNA Animal Cells Käyttämällä Spin Technology” (Qiagen, Valencia, CA).

Vasta

Anti -DSG3 (klooni 5H10) ja DSG1 (klooni 27B2) hiiren monoklonaalisia vasta-aineita on kuvattu aikaisemmin, ja annettiin meille antelias lahja tohtori James Wahl; molempia käytettiin laimennoksena 1:10 [33]. Anti-DSG2 hiiren monoklonaalinen vasta-aine (klooni 10G11) hankittiin ARP, Inc (Belmont, MA) ja käytettiin laimennoksena 1:50 ja immunofluoresenssianalyysillä normaalin eturauhasen kudosta ja solulinjoissa; anti-DSG1 /2-hiiren monoklonaalinen vasta-aine (klooni DG3.10) hankittiin Fitzgerald (Acton, MA) ja käytettiin laimennoksena 1:20 TMA. Anti-DSG4 marsu polyklonaalista vasta-ainetta tuotettiin Dr. Lutz Langbein ja annettu meille antelias lahja, tämä vasta-ainetta käytettiin laimennoksena 1:2000. Anti-sytokeratiini 14 (CK14) kanin polyklonaalinen vasta-aine hankittiin Covance (Princeton, NJ) ja käytettiin laimennoksena 1:1000. Anti-PSA hiiren monoklonaalinen vasta-aine hankittiin Dako (Carpinteria, CA) ja käytettiin laimennoksena 1:20. Anti-PSA kanin monoklonaalinen vasta-aine hankittiin Abcam (Cambridge, MA) ja käytettiin laimennoksena 1:200. Anti-sytokeratiineja 8/18 (CK8 /18) marsu polyklonaalinen vasta-aine hankittiin Progen (Heidelberg, Saksa) ja käytettiin laimennuksessa 1:100. Alexa Fluor 594 tai Alexa Fluor 488-vasta-aineita ostettiin Invitrogen (Carlsbad, CA) ja käytettiin laimennuksessa 1:600.

RT-PCR

Kokonais-RNA ihmisen normaalista ihosta ja normaalissa eturauhasessa (molemmat hankittu yhdeltä luovuttajalta) ostettiin kaupallisesti (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA). Ensimmäisen juosteen cDNA valmistettiin käyttäen Oligo-dT ja SuperScript II ensimmäisen-Strand Synthesis System (Invitrogen, Carlsbad, CA) seuraten valmistajan ohjeita. PCR suoritettiin käyttäen Platinum PCR Supermixiä (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja alukkeet selostukset kohteisiin (tiivistetysti taulukossa S1). Seuraavat PCR protokollan: vaihe 1: 94 ° C 3 min; vaihe 2: 94 ° C 30 sekuntia, 56 ° C 45 sekuntia, 72 ° C 2 min; vaihe 3: 72 ° C: ssa 10 min; Toista vaihe 2 34 sykliä. PCR-tuotteet ajettiin elektroforeesissa 1% agaroosi /1 x TBE geelillä, joka sisälsi etidiumbromidia ja visualisoitiin Kodak Elektroforeesi dokumentointi ja analysointi System 120 Kamera (Kodak, Rochester, NY).

qRT-PCR

RNA kerättiin solulinjojen kohteisiin, kuten on kuvattu. Ensimmäisen juosteen cDNA valmistettiin käyttäen Oligo-dT ja SuperScript III ensimmäisen-Strand Synthesis System (Invitrogen, Carlsbad, CA) seuraten valmistajan ohjeita. qRT-PCR suoritettiin Stratagene Mx3005P koneen ja analysoitiin käyttäen Stratagene MxPro QPCR-ohjelmisto (Stratagene, Santa Clara, CA). Kaikki reaktiot suoritettiin käyttäen QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen, Valencia, CA), 200 nM alukkeita (esitetty taulukossa S1), ja 10 ng cDNA: ta 20 ul: n reaktiotilavuudessa. Seuraavat PCR-reaktiota käytettiin: vaihe 1: 95 ° C: ssa 10 min; vaihe 2: 95 ° C 15 sekuntia, 60 ° C 1 min; Toista vaihe 2 40 sykliä. Kaikki näytteet ajettiin neljänä ja näytteet normalisoitiin vastaan ​​endogeenista sisäisen valvonnan, β-aktiini.

Immunofluoresenssikoe-Frozen sissa ja solulinjoissa

Jäädytetyt normaalin ihmisen eturauhasen kudosta dioja vastaa eturauhasen siirtymä- vyöhykkeellä histologisesti vahvistettu alueita normaalin rauhaset potilaista käytettiin luonnehtimaan vasta-ainetta desmogleiini ilme. Solulinjoja kasvatettiin lasipeitinlevyille (Fisher, Pittsburgh, PA) 6-kuoppaisille kudosviljelylevyille (BD Falcon, Bedford, MA). Dioja /peitelaseja fiksoitiin kylmässä 100% metanolia 15 minuutin ajan -20 ° C, minkä jälkeen kylmää 100% asetonia kiinnitys 2 minuutin ajan -20 ° C: ssa. Kalvoa /peitelasit pestiin 1 x fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) sekoittaen, läpäiseviksi 1% Triton-X100 1X PBS: ssä huoneenlämpötilassa 5 minuutin ajan, ja pestiin uudelleen 1 x PBS: ssä sekoittaen. Kalvoa /peitinlasit inkuboitiin 0,1% Triton X-100/1% naudan seerumin albumiinia (BSA) /1 x PBS-lohko huoneen lämpötilassa 1 tunnin ajan, minkä jälkeen primaarisen vasta-aineen inkubointi yön yli 4 ° C: ssa. Seuraavana päivänä levyt /peitelasit pestiin 1 x PBS sekoittaen, sitten 1:600 ​​laimennus sekundääristä vasta-ainetta, joko Alexa Fluor 594 tai Alexa Fluor 488 (Invitrogen, Carlsbad, CA), lisättiin ja levyt /peitinlasit inkuboitiin huoneen lämpötilassa 45 min. Dioja /peitelaseja pestiin sitten 1 x PBS sekoittaen, upotetaan hetkeksi veteen ja asennettu käyttämällä Vectashield kiinnitysväliaine DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA).

Immunofluoresenssikoe analyysi Tissue Microarray (TMA) Osiot

TMA rakennettiin seuraavasti: hematoksyliinillä Eosiini-värjättyä osastoja formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut (FFPE) eturauhasen näytteet tarkistetaan tunnistaa elävät, morfologisesti edustavalla normaalin eturauhasen rauhaset ja acinar adenokarsinooma, josta neula kairausnäytteitä voitaisiin ryhtyä. Kustakin näytteestä, rinnakkaiseen vieruskudos ytimiä, joiden läpimitta on 0,6 mm lävistettiin ja puettu päälle vastaanottaja parafiiniblokkiin käyttäen tarkkuusinstrumentti (Beecher Instruments, MD). Kaikki lyöntejä saatiin painopiste korkein Gleason pisteet, ja suurin osa lyöntejä otettiin hallitseva kasvain kyhmy – määritellään suurimmaksi kyhmy, jolla on korkein Gleason Pisteet ja vaihe tietyssä eturauhasen yksilö. Seuranta tiedot kaikista tapauksista koskevat todisteet biologisten toistumisen ollut saatavilla tämän tutkimuksen. Viiden peräkkäisen mikrometrin luvuissa TMA lohkojen käytettiin immunofluoresenssianalyysillä, ja ensimmäinen osa värjättiin hematoksyliinillä Eosiini toimia mallina morfologia. Objektilasit poistettiin parafiini ja rehydratoitiin, ja antigeeni haku suoritettiin kuumentamalla objektilasit höyrystimen sitraattipuskurissa, pH 6,0 15 minuuttia. Objektilasit pestiin sitten kerran 1 x PBS. Laseja inkuboitiin 0,1% Triton X-100/1% BSA /1 x PBS estää seerumia huoneenlämmössä 1 tunnin ajan, jota seuraa primaarisen vasta-aineen inkubointi yön yli 4 ° C: ssa. Seuraavana päivänä levyt pestiin 1 x PBS sekoittaen, sitten 1:600 ​​laimennus sekundääristä vasta-ainetta, joko Alexa Fluor 594 tai Alexa Fluor 488 (Invitrogen, Carlsbad, CA), lisättiin, ja laseja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 45 min . Objektilasit pestiin sitten kolme kertaa 1 x PBS + 0,1% Triton X sekoittaen, pestiin kolme kertaa 1 x PBS, upotetaan hetkeksi veteen ja asennetaan käyttäen Vectashield kiinnitysväliaine DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA). CK8 /18 ilmentymistä käytettiin tunnistamaan kaikki epiteelin alueita (sekä tuumori ja normaalit rauhaset) ytimien ja proteiinien ekspression kiinnostavia teki prosenttiosuuden määrittämiseksi kasvainsolujen immunoreaktiivisuus kohti kudosta ydin (0%: sta 100% ), ottamatta huomioon intensiteetti signaalin. Arviointi suoritetaan uropathologist (MCM) seuraavan aiemmin käytetty menetelmää: kasvain alueet ytimessä tunnistettiin ensin DAPI, vahvisti läsnäolo CK8 /18 ja sitten tekee perustamalla prosentteina kasvaimia solujen kalvo ilmaus DSG2 [ ,,,0],34] kantavassa keskiarvot edustajan ytimien kunkin potilaan näytteestä käytettiin sitten tilastollisia analyysejä. Positiivinen cut-off 60% käytettiin suorittamaan tilastollisia analyysejä korrelaatio kliinis-patologisia piirteitä ja eloonjäämisen koska tämä oli arvioitu mediaani ekspressioarvo havaittu DSG2 tässä eturauhassyövän kohortissa, kuten aiemmin raportoitu kirjallisuudessa [35].

eturauhassyöpä Colson ja kliinis-patologinen ominaisuudet

tässä tutkimuksessa analysoitiin kohortin 414 potilailla on diagnosoitu primääri eturauhassyöpää. Kliinis-patologisia piirteitä näistä potilaista on koottu taulukkoon 1. keski-ikä diagnoosin ajankohtana oli 61 vuotta (vaihteluväli: 41-+74,7vuosi). Suurin osa potilaista oli valkoinen (56%) tai Afrikkalainen Amerikan (43%). Keskimääräinen seuranta-aika oli 56,8 kuukautta (vaihteluväli: 1,4-123,6kuukautta). Vain 98 (24%) potilaista osoitti biokemiallinen uusiutumisen, määritellään siten, että kahden peräkkäisen havaittavissa nouseva PSA-tasot ( 0,2 ng /ml) neljä viikkoa tai leikkauksen jälkeen. Biokemiallinen toistumisen elinaika käyrät vastaavat tunnettu kliinis-patologisia riskitekijöitä kuten Pre-kirurginen PSA, patologinen Stage, Gleason Score, Angiolymphatic Invasion ja hermoa Invasion, näkyvät kuvassa S1.

Tilastollinen analyysi

tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS-v18.0 (IBM, Armonk, NY). Studentin t-testiä käytettiin vertaamaan ekspression kiinnostavan proteiinin primaarinen eturauhassyövän ja normaalin eturauhasen kudosta. Spearmanin listalla korrelaatio käytettiin analysoimaan korrelaatio kiinnostavia proteiineja ja kliinis-patologisia piirteitä. Biokemiallinen toistumisen elinaika analysoitiin Kaplan-Meier selviytymisen käyrät, ja käyrät verrattiin käyttäen log-rank-testi. Monimuuttujamenetelmin lukien DSG2 ilmaisun ja kliinis-patologisten parametrit tehtiin käyttämällä Coxin suhteellisten riskien mallia.

P

-arvo ≤0.05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

desmogleiineiksi ovat Tarkemmin ilmaistuna Luminal Solut Ihmisen normaalin eturauhasen

Koska ilmaus desmogleiineiksi eturauhanen ei ollut ominaista tasalla, aloitimme tämän tutkimuksen tutkimalla koko desmogleiini ilmentymisprofiilin normaaleissa ihmisen eturauhasen kudosta, käyttäen RT-PCR ja immunofluoresenssimenetelmällä analyysejä. RT-PCR-analyysi osoitti, että useimmat desmogleiineiksi voitiin helposti havaita normaalissa ihmisen eturauhasessa RNA-tasolla, lukuun ottamatta

DSG1

, joka osoitti vain heikko mRNA: n ilmentymisen (kuvio 1A). Immunofluoresenssilla analyysi paljasti, että vain ilmaus DSG2 ja DSG4 voisi olla helposti ja johdonmukaisesti havaita eturauhasen epiteelissä proteiinin taso (kuvio 1 B-C), kun taas DSG1 ja DSG3 ei osoitettavissa normaalin eturauhasen epiteelissä (kuvio S2).

(A) Clear ilmentymistä mRNA voidaan havaita useimpien desmogleiineiksi, lukuun ottamatta

DSG1

joka osoittaa vain heikko ilme. (B-C) edustaja immunofluoresenssimenetelmällä analyysit DSG2 (B) ja DSG4 (C) solun reunassa normaalin ihmisen eturauhasen rauhasepiteeliin. Alkuperäinen suurennus: 200X. Mittaviivat vastaavat 100 pm.

Todettuaan ilmentymistä desmogleiineiksi normaaleissa ihmisen eturauhasessa, pyrimme määrittämään solutyypin konkreettisena ilmentymänä DSG2 ja DSG4. Rauhas kudos eturauhasen koostuu kanavista ja acini, jotka on vuorattu yksinkertaisella cuboidal epiteelin päin ontelon rauhaset. Tämän lisäksi sekretorisen komponentin, kaksi muuta erikoistuneita soluja ovat olennainen osa eturauhasen rauhasrakenteet, eli tyvisolut ja neuroendokriinisoluissa [36], [37]. Luminaali- solut erittävät, muun molekyylejä, eturauhasen spesifisen antigeenin (PSA) ja ovat tärkein toiminnallinen yksikkö elimen. Nämä solut muodostavat jatkuvan kerroksen, joka sijaitsee yläosassa tyvisolut. Tyvisolut on ominaista, että ne ilmentävät suuren molekyylipainon sytokeratiineja (CKS) – kuten CK14 – ja p63. Hajallaan rauhasrakkuloissa on kolmas solu väestön neuroendokriinisoluissa, alkuperä ja toiminta, joka on normaalissa eturauhasessa ei ole vielä määritelty.

Co-immunofluoresenssianalyysillä suoritettiin tutkimaan lokalisointi DSG2 ja DSG4 jossa CK14 erityisiä tyvisolusyöpä markkeri sekä luminaaliselle spesifistä proteiinia, PSA. Co-immunofluoresenssimenetelmällä analyysi DSG2 ja CK14 osoittaa, että DSG2 on voimakkaasti ilmaistu onteloerityssolut eturauhasen ja että tämä ilmaus harvoin lokalisoituu, että pohjapinta CK14 ilmentymisen (kuvio 2A-C). Analyysi DSG2 ja PSA ilmaisu paljasti kolokalisaation sekä biomarkkereiden luminaalisessa soluissa (kuvio 2D-F). Ilmaus DSG4 oli hyvin samanlainen kuin DSG2, osoittaa voimakasta ekspressiota luminaalisessa soluissa, harvoin co-paikallistamiseksi, jossa pohjapinta CK14 ilmentymistä (kuvio 2G-I), mutta yhdessä paikallistamiseksi kanssa luminaaliseen PSA ilmentymistä (kuvio 2J-L). Lisäksi ilmaus DSG2 osoitti lähes täydellisen kolokalisaation kanssa, DSG4, useimmat onteloerityssolut esittää vielä ilmentymistaso sekä desmogleiineiksi ja jotkin solut esittää hieman korkeampi ekspressiotaso yhden verrattuna muihin (kuvio 2M- O). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että ilmentyminen DSG2 ja DSG4 rajoittuu pääasiassa luminaaliseen soluja ihmisen eturauhasen epiteelin rauhaset.

(A-C) DSG2 ilmaistaan ​​luminaaliseen solujen eturauhasen rauhaset ja tämän ilmaisu harvoin lokalisoituu tyvisolusyöpä CK14 ilme. (D-F) DSG2 lokalisoituu PSA ilmentyminen luminaalisessa osastoon rauhanen. (G-I) DSG4 on myös ilmaistu onteloerityssolut ja harvoin lokalisoituu tyvisolusyöpä CK14 ilme. (J-L) DSG4 ilmaisu lokalisoituu luminal solujen PSA ilme. (M-O) ilmentymistä DSG4 osoittaa myös lähes täydellinen kolokalisaation kanssa, DSG2 että onteloerityssolut. Alkuperäinen suurennus: 200X. Mittaviivat vastaa 100 um.

DSG2 on ilmaistuna in Human Prostate Cancer Cell Lines

Kun tunnettu ilmentymistä desmogleiineiksi normaaleissa ihmisen eturauhasen kudosta, halusimme keskittyä DSG2 varten loput tutkimuksen, koska tämä on yleisin ilmaistuna desmogleiini isoformia – näytetään läsnä ilmentymistä kaikissa Desmosomi muodostavien kudosten. Sen jälkeen meidän edellinen löytö että DSG2 ilmentyy normaaleissa ihmisen eturauhasen epiteelin, me kysyi, onko tämä proteiini ilmentyy myös ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa. Tarkastella tätä kysymystä, qRT-PCR suoritettiin RNA: lle kolme kaupallisesti saatavilla ja hyvin tunnettu metastaattinen ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa (kuvio 3A). Syöpä solulinjoja käytetään tämän osan tutkimuksessa ovat LNCaP-solulinja, joka oli peräisin eturauhassyövän metastasized imusolmukkeesta; PC3-solulinjassa, joka oli peräisin eturauhassyövän etäpesäkkeitä luuhun; ja DU145-solulinja, joka oli peräisin eturauhassyövän etäpesäkkeitä aivoissa [38] – [40]. BPH-1-solulinjassa toimi kontrollina tässä tutkimuksessa, koska se on kuolemattomaksi, ei-tuumorigeenisiä eturauhasen epiteelisolujen, joka on peräisin potilaasta, jolla hyvänlaatuinen eturauhasen liikakasvu, joka on tila, joka ei liity pahanlaatuisen eturauhassyövän transformaatio [41]. Tulokset tästä qRT-PCR-analyysi osoitti, että

DSG2

ilmentyy eri tasoilla kaikissa solulinjoissa tutkittiin. Mielenkiintoista on, että ilmaus

DSG2

on suurempi kaikissa metastaattisen eturauhassyövän solulinjoissa tutkittiin kuin se on ei-tuumorigeenisen BPH-1 ohjaus.

(A) DSG2 ilmentymistä havaitaan kaikki solulinjat tarkasteltu, kuten normaali kuolemattomaksi eturauhasen solulinja BPH-1. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD. ** P 0,01; *** P 0,001. (B-E) DSG2 ilmentyy solussa rajalla LNCaP ja DU145 soluja; kuitenkin, solu raja ilmentymistä ei havaita PC3-soluissa vain joissakin soluissa osoittaa heikko, pistekeratopatiaa, ja hajanainen värjäytymistä (insert suurennus; esitetty 2.5X). Alkuperäinen suurennus: 200X. Mittaviivat vastaa 100 um.

Seuraavaksi immunofluoresenssianalyysillä käytettiin ekspression tutkimiseksi DSG2 näissä metastaattisen ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa proteiini tasolla (kuvio 3B-E). Cell raja ilmentyminen DSG2 havaittiin BPH-1, LNCaP ja DU145 soluja. Kuitenkin PC3-solujen puuttui ilmaus DSG2 solun reunassa, kun taas pieni populaatio soluista osoitti vain hajanainen rakeinen värjäystä DSG2 sytoplasmassa (katso insertti suurennos kuvassa 3D). Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​ja tarkentaa tulokset edellisen tutkimuksen Lang

et al.

Jossa spesifistä vasta-ainetta sekä DSG1 ja DSG2 käytettiin tutkimaan desmogleiini ilmaisun LNCaP, PC3 ja DU145 solut [ ,,,0],29], [42]. Tulokset qRT-PCR: n ja immunofluoresenssianalyysillä osoittavat, että ekspressio

DSG2

on läsnä kaikissa eturauhassyövän solulinjoissa ja että kaksi kolmesta eturauhassyövän solulinjoissa tutkittiin, DSG2 paikantuu solun rajan viittaa siihen, että desmosomien muodostuminen pysyy useimmissa metastaattisen eturauhassyövän solulinjoissa tutkittiin

in vitro

.

matala DSG2 Fenotyyppikuvaus liittyy syövän etenemisen primaarisessa eturauhassyövän

kuten edellä mainittiin, kun taas menetys klassisen kadheriinin ilmentyminen on kuvattu eturauhassyövän, tähän mennessä ekspressio desmosomien kadheriineja eturauhasen syöpä kudosnäytteistä ei ole raportoitu. Arvioida solujen prosenttiosuus positiivisia DSG2 ekspressiota eturauhasen syöpä verrattuna normaalin eturauhasen kudosta, immunofluoresenssianalyysillä on DSG2 ilmentyminen suoritettiin eturauhaskarsinooman TMA (

n

= 414) sekä normaalissa eturauhasessa TMA (

n

= 50). Sen lisäksi, että vasta-ainetta mielenkiinnon kohteena olevan proteiinin, vasta-ainetta CK8 /18 – sytokeratiineja löytyy sekä normaalissa eturauhasessa luminaalisen epiteelisolujen ja adenokarsinoomasoluja – oli myös kunkin TMA keinona tunnistaa epiteelisolujen kussakin näytteessä.

pienenee merkittävästi prosenttiosuuden positiivisten solujen DSG2 ekspressio havaittiin eturauhaskarsinoomien verrattuna normaalissa eturauhasessa (taulukko 2 ja kuvio S3). Normaalin eturauhasen epiteelissä oli ominaista suuri osuus positiivisten solujen DSG2 lauseke (tarkoittaa ilmaus 81,1%, mediaani 84,5%), kun taas eturauhaskasvainnäytteissä, oli huomattavasti alhaisempi DSG2 positiivisten solujen (keskimääräinen ekspressio 57,5%, mediaani 66,7%;

P

= 0,0002). Cut-off-arvo on 60% DSG2 positiivinen solu ilmaisua käytettiin, koska tämä oli arvioitu mediaani ekspressioarvo havaittu DSG2 eturauhasen syöpä kohortti, ja mediaani on aikaisemmin ja laajalti käyttää suorittamaan selviytymisen analyysit [35]. Käyttämällä tätä raja-arvon, havaitsimme, että 96% normaalin eturauhasen kudosnäytteitä pidetään positiivisena DSG2, verrattuna vain 46% eturauhasen syöpä näytteet tutkittiin. Huomattavaa on, että solujen määrä, jotka olivat positiivisia solun raja-ilmentymisen DSG2 oli yleensä korkeampi ja eriytetty alueilla kasvain, kun taas solujen määrä osoittaa tämän ilmaisun on usein paljon pienempi huonosti eriytetty alueilla kasvain (kuvio 4A-L ), päätelmä oli vielä vahvistanut Spearmanin rank korrelaatio (taulukko 3).

(A-L) edustaja immunofluoresenssimenetelmällä analyysi DSG2 ja CK8 /18 eturauhassyövässä. (D, E-H) TMA osoittaa korkea DSG2 ilmentymistä solussa rajalle hyvin eriytetty alueilla kasvain (paneeli D, sisällä keltainen katkoviivalla). (D, I-L) TMA osoittaa alhainen DSG2 ilmentyminen huonosti eriytetty alueilla kasvain (paneeli D, näytetään jäljellä kasvaimen ulkopuolelle keltainen katkoviiva). Alkuperäinen suurennus: 200X. Mittaviivat vastaavat 100 pm. (M) Potilaat ilmentävät korkeampia tasoja DSG2 oli merkitsevästi pidempi toistumisen elinaika kuin ilmentävät alempien DSG2 (

P

= 0,01).

korrelaatio ilmaus DSG2 ja kliinis-patologinen ominaisuudet yleisimmin liitetty aggressiivinen eturauhassyöpä fenotyyppiin, kuten seerumin Pre-kirurgiset PSA-pitoisuus, Gleason Score, ja patologinen Stage jälkeen tutkittiin käyttämällä Spearmanin rank korrelaatio (taulukko 3). Kiinnostavaa, oli merkittävä negatiivinen korrelaatio DSG2 ilmaisun ja Pre-kirurgiset PSA-pitoisuus sekä Gleason pisteet. Nämä tulokset osoittivat, että matalan ja negatiivisten DSG2 ilmentyminen fenotyyppi liittyi lisääntynyt seerumin Pre-kirurginen PSA-pitoisuus tasoilla sekä korkean Gleason Scores.

Vähentynyt DSG2 Expression on itsenäinen tekijä, joka liittyy Huono kliiniset tulokset primaarista eturauhassyövän

Tutkittuaan korrelaatio DSG2 fenotyypin ja kliinis-patologisia riskitekijät eturauhasen syöpä, me seuraavaksi määritellään, onko DSG2 ilmentyminen liittyy biokemiallisia toistumisen vapaa elinaika. Mielenkiintoista, potilaat, joiden kasvaimet ilmaisivat ≥ 60% DSG2 oli pidempi toistumisen elinaika kuin ilmentävät 60%, ja ero näiden kahden ryhmän välillä oli tilastollisesti merkitsevä (kuvio 4 M,

P

= 0,01). Ajan mediaanin biokemiallisten uusiutuminen 103,7kuukausi (CI 95% väli: +87,7-+119,8kuukausi) havaittiin potilailla, joilla 60% DSG2 ilmaisun fenotyyppiä, kun taas ne, joilla on ≥60% DSG2 ilmaisua fenotyyppiä ei yltänyt ajan mediaani biokemiallisten uusiutumisen jälkeen seuranta-ajan 123,6 kuukautta. Mikä tärkeintä, kun suoritimme Monimuuttuja-analyysissä, havaitsimme, että DSG2 ilmentyminen oli riippumaton tekijä biokemiallisten toistumisen (HR = 1,579,

P

= 0,050), samoin kuin klassinen kliinis-patologisia piirteitä: Gleason Score ja patologinen Vaihe (taulukko 4). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että alennettu DSG2 ilme on itsenäinen biomarkkeri liittyy lyhyempi biokemiallisten uusiutuminen eturauhassyövässä, mikä paljastaa mahdollinen kliininen hyöty DSG2 ennustetyövälineenä biomarkkeri kasvain aggressiivisuutta kärsivien tällä esiintyvä tauti.

keskustelu

tulokset esitellään tässä tutkimuksessa ovat ensimmäinen molekulaarinen desmogleiini ilmentymisen normaaleissa ihmisen eturauhasessa, luonnehdinta DSG2 metastaattisessa eturauhassyövän solulinjoissa, ja ensimmäinen analyysi DSG2 ilmaisun kudosnäytteistä ensisijaisen eturauhassyövän. Tulokset täällä raportoitu paljastavat, että vaikka useimmat desmogleiineiksi ovat selvästi ilmaistu ihmisen eturauhasen RNA-tasolla, vain DSG2 ja DSG4 johdonmukaisesti tunnistetaan korkealla tasolla normaalissa ihmisen eturauhasessa proteiinitasolla.