Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tavoitteet

Rasvakudos sisältää asukkaan multipotentteihin rasvakudoksen kantasoluilla (ASC: tä), jotka muodostavat kasvain strooman ja voi edistää syövän etenemiseen. Koska korkea munasarjasyöpä etäpesäke on omental rasvakudoksesta, me arveltu, että omental johdettuja ASC voi myötävaikuttaa munasarjasyövän kasvua ja levittämistä.

Materiaalit ja menetelmät

eristetty ASC: hen päässä omentum kolmen munasarjasyöpäpotilaalle, joissa (O-ASC4, O-ASC5) ja ilman (O-ASC1) omental etäpesäke. BM-MSC: t, SQ-ASC: tä, O-konttinosturia karakterisoitiin geeniekspressiota paneelit ja metabolisen analyysi. Stromasoluja vaikutuksia munasarjasyöpäsoluja lisääntymistä, chemoresistance ja säteilyn kestävyys arvioitiin käyttämällä yhdessä viljelemisen testeissä, joissa lusiferaasia leimattua ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa. TranswellTM muuttoliike määritykset suoritettiin vakioitua elatusainetta O-konttinosturia sekä ohjaus solulinjoissa. SKOV3- solut intraperitionally ruiskutetaan tai ilman O-ASC1 seurata

in vivo

siirteen.

Tulokset

O-ASC: hen merkittävästi edistänyt

vitro

jakaantumiseen, kulkeutumiseen kemoterapiaa ja säteily vaste munasarjasyövän solulinjoissa. O-ASC4 oli selvempi vaikutuksia muuttoliikettä ja kemoterapiaa vastausta OVCA 429 ja OVCA 433 soluja kuin O-ASC1. Analyysi microarray data paljasti, että O-ASC4 ja O-ASC5 on samanlaiset geeniekspressioprofiilit, toisin kuin O-ASC1, joka oli samanlainen kuin BM-MSC: ja ihonalainen ASC-solujen hierarkkisessa klusterointi. Ihmisen O-konttinosturia havaittiin strooman ihmisen munasarjasyövän hiiren ksenograftien mutta ei uninvolved munasarjat.

Johtopäätökset

ASC: hen johdettu ihmisen omentum voi edistää munasarjasyövän solujen lisääntymisen, migraation chemoresistance ja säteilyn kestävyys

in vitro

. Lisäksi kliininen O-konttinosturia isolaatit osoittavat heterogeeninen vaikutuksia munasarjasyöpä

in vitro

.

Citation: Nowicka A, Marini FC Solley TN, Elizondo PB, Zhang Y, Sharp HJ et al. (2013) Human Omental-Derived Adipose Kantasolut lisätä munasarjasyövän solujen lisääntymisen, migraation ja Chemoresistance. PLoS ONE 8 (12): e81859. doi: 10,1371 /journal.pone.0081859

Editor: Pranela Rameshwar, Rutgers – New Jersey Medical School, Yhdysvallat

vastaanotettu: 9. elokuuta, 2013 Hyväksytty 16. lokakuuta 2013 Julkaistu: 02 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Nowicka et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat tutkimusapurahoja The University of Texas MDAnderson Cancer Center NCI Erikoistunut ohjelmat Research Excellence (SPORE) munasarjasyövässä Developmental Research Award (DRP) (Grant nro CA83639) [https://www.mdanderson.org/Departments/ovarianspore /] ja avustukset R01CA133057 National Institutes of Health [www.nih.gov]. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Huomaa, että yksi yhteistyössä kirjailija, PBE, on tällä hetkellä töissä Asuragen Inc. Austin, Texas. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Munasarjasyöpä on kaikkein vaarallisin gynecologic maligniteetti, jolloin 16000 kuolemantapausta vuodessa United States [1]. Kuolleisuus ja sairastavuus munasarjasyövän johtuu korkea vatsaonteloon levittämistä ja kehittämistä kemoterapiaa kestäviä kasvaimia huolimatta aluksi chemoresponsive tauti.

vatsaonteloon levittäminen munasarjasyövän johtaa usein muodostumista etäpesäke omentum, hyvin vascularized ja innervated rasvakudokseen, joka sijaitsee yli suoliston. Syy siihen, miksi omentum on parempi ”maaperä” metastaattisen munasarjasyövän soluja edelleen tuntematon. Vastaus munasarjasyövän etäpesäke omentum kemoterapialle on itsenäinen ennustaja kuoleman munasarjasyövän, mikä viittaa siihen, että vuorovaikutukset munasarjasyöpä ja omental microenvironment ovat tärkeä veturi kliinisen tuloksen [2].

Oletimme että omentum on vieraanvarainen ympäristö muodostumista munasarjasyöpä etäpesäkkeiden takia asukkaan kasvain tropiikin mesenkymaalisten kantasolujen omental rasva. Viime aikoina olemme tunnettu populaation multi-voimakas rasva-johdettujen mesenkymaalisten kantasolujen omentum (O-ASC-soluja) ja kaksi potilasta, joilla omental tauti ja yksi ilman. Kukin isolaatti vahvistettiin omaavan usean voimakas eriytyminen potentiaali odotetusti MSC. ASC: tä muistuttavat luuytimestä peräisin mesenkymaaliset kantasolut (BM-MSC), joilla on kyky siirtää kasvaimia ja voi on osoitettu edistävän kasvaimen aloittamista, kasvu, vaskularisaatiota, etäpesäke, ja kestävyys kemoterapian monissa kasvainmalleissa [3-6 ]. Olemme tutkineet vaikutukset O-ASC: iden potilaiden kanssa ja ilman omental etäpesäke on munasarjasyövän solulinjoissa.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

Ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa OVCA 429, OVCA 433, ja A2780 saatiin tri Samuel C. Mok (University of Texas MD Anderson Center, Houston, TX). OVCA 429 ja OVCA 433 solulinjat perustettiin johdetut solulinjat potilaalla on loppuvaiheen vakavien munasarjojen adenokarsinoomat, kuten ovat kuvanneet Bast et al [7]. Ihmisen munasarjasyöpäsolulinjoihin SKOV3 ja A2780 ja ihmisen BM-MSC: hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). Kaikkia solulinjoja pidettiin yllä DMEM: ssä (Mediatech, Inc., Manassas, VA), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (HyClone, Logan, UT) ja 1% penisilliiniä ja streptomysiiniä (Mediatech, Manassas, VA) 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä 5% CO2: ta.

Ihmisen O-konttinosturia sekä SQ-ASC-nosturin eristäminen

Under The MD Anderson Institutional Review Board-hyväksytty protokolla, törkeästi normaali-näkymästä ihmisen omentum ja ihonalainen rasvakudos saatiin aikana lavastus menettelyjä potilaiden munasarjasyöpä. Tietoon perustuva suostumus kudosten pankki- saatiin kunkin potilaan. Kaikki kliiniset tutkinnan suorittamisen kautta rehtorien ilmaistu julistuksen Helinskin. Kirjallinen suostumus saatiin kunkin potilaan. O-konttinosturia sekä SQ-ASC-nosturin eristettiin mukaan aiemmin julkaistujen menetelmien [8]. O-ASC1 eristettiin potilaasta (painoindeksi (BMI) = 25,2 kg /m

2), jossa toistuvat endometriod adenokarsinooma kohdun limakalvon ja munasarjojen ilman omental etäpesäke. O-ASC4 ja O-ASC5 eristettiin potilaista, joilla korkealaatuisesta serous munasarjasyöpä kanssa omental osallistumista. BMI potilaille, joilta O-ASC4 ja 5 olivat peräisin olivat 32,4 kg /m

2 ja 22 kg /m

2, vastaavasti. O-ASC5 käytettiin geenien ilmentymisen array ja solunpintamarkkeria ilmaus mutta katosi sen jälkeen sarja siirrostamalla

in vitro

ja täten voinut käyttää funktionaalisissa määrityksissä. Eristetty O-konttinosturia sekä SQ-ASC-nosturin viljeltiin α-MEM (Mediatech, Manassas, VA), jossa 20% FBS (HyClone, Logan, UT) ja 1% penisilliini streptomysiiniä ja L-glutamiinia (Mediatech, Manassas, VA ).

O-konttinosturia line luonnehdinta

Eristyksen jälkeen solut laajennettiin

in vitro

in α-MEM (Mediatech, Manassas, VA). Solunpintamarkkeria ilmentymistä leimasi virtaussytometrialla analyysi. O-ASC: tä karakterisoitiin varhain passage (enintään 5) käyttäen spesifisiä vasta-aineita seuraavia merkkiaineita: CD11, CD29, CD34, CD44, CD45, CD 90, EpCAM (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), ja CD105 (BioLegend, San Diego, CA).

Vahvista adipogeenisissä potentiaalia O-konttinosturia sekä BM-MSC inkuboimme 10

5 solua adipogeenisessä induktion media (DMEM 10% FBS, 45 g /l glukoosia, L-glutamiinia, 1% penisilliiniä ja streptomysiiniä, 10 ug /ml insuliinia, 500 uM 3-isobutyyli-1-metyyliksantiini, 1 uM deksametasonia, ja 200 uM indometasiinia). 72 tunnin jälkeen, elatusainetta (DMEM Mediatech, Manassas, VA), jossa oli 10% FBS: ää, 45 g /l glukoosia, L-glutamiinia, 10 ug /ml insuliinia, 1% penisilliiniä ja streptomysiiniä), lisättiin soluihin. Ylläpito väliaine vaihdettiin 2 kertaa viikossa aikana 10 päivää inkuboinnin jälkeen. Ilmoitettuina aikoina, teimme oil red O (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) histokemiallisella sytoplasmisen sulkeumat neutraalien lipidien toiminnallisten adiposyyttien.

osteoblastien erilaistumista O-ASC-soluja ja BM-MSC: t oli suoritettiin käyttäen 5 x10

4 solut. 3 viikon kuluttua inkuboinnin osteoblastien induktioalustassa (NH OsteoDiff keskikokoinen, Bergisch Gladbach, Miltenyi Biotec GmbH, Saksa), solunulkoinen kalkkeutumista värjättiin Alizarin Red S (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

vahvisti solujen rustosoluiksi potentiaaliset 10

6-solut, jotka inkuboitiin 2 ml: ssa kondrogeenisen väliaineen (DMEM, jossa 45 g /l glukoosia, L-glutamiinia, 1% penisilliiniä ja streptomysiiniä, 50 ug /ml askorbiinihappoa, 100 nM deksametasonia, 10 ng /ml transformoiva kasvutekijä β). Elatusaine vaihdettiin kolme kertaa viikossa. Jälkeen 21 päivää, solut kerättiin, upotettiin parafiiniin ja värjättiin 1% Alcian Blue (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 5% etikkahappoa. Sininen väri kuvan edustaa sulfated proteoglykaanien talletukset, jotka ilmaisevat toiminnallisia kondrosyyttien.

Nimblegen ihmisen ilmentymistestissä HG18

mRNA kopioiminen O-ASC1, O-ASC4, O-ASC5, ihonalainen ASC: tä (SQ-ASC: tä), ja BM-MSC: t suoritettiin käyttäen Qiagen RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) valmistajan protokollaa. Nimblegen (Madison, WI) HG18 72 k mikrosiruja, jotka sisältävät 72000 pitkiä oligonukleotideja (60-meeri), joka laatta ihmisen genomin käytettiin geenin ilmentymisen array profilointia. Geeniekspressioprofilointi suoritettiin vähintään kaksi kertaa kunkin solulinjoja. Microarray kuvia käsiteltiin NimbleScan v2.3 (Nimblegen, Madison, WI). Normalisointi tehtiin käyttäen vankka usean erilaisia ​​analyysi algoritmia oletusasetuksilla.

Expression analyysin ohjelmisto

Voit suorittaa klusterin analyysi näytteen ja ilmaisun profilointi analyysi geenien BRB Array Tools versio 4.2. 1 (Richard Simon ja Amy Peng Lam, National Cancer Institute, Bethesda, MD) käytettiin. Näytteet kerättiin ryhmäksi käyttäen ilman valvontaa hierarkkinen klusterointi oletusasetuksilla. Class vertailut käyttäen univariate

t

-testi satunnainen vaihtelu mallin RMA (Robust Multi-array keskiarvo) normalisoitu tietoja käytettiin tunnistamaan geenejä, joita on huomattavasti ilmentyvät eri. Merkitsevyystasolla p = 0,001 nimettiin kullekin yksiulotteista testiä.

Metabolinen määrityksissä

Solut maljattiin 50.000 solua kuoppaa kohti 12-kuoppalevyillä 48 tunnin ajan. Supernatantit kerättiin solunulkoisen metabolisen analyysi ja solujen pelletit hajotettiin RIPA puskuriin proteiinin analyysiin. Glukoosinkulutusta arvioitiin Wako glukoosi pakki ja määritykset tehtiin mukaan valmistajan protokollaa. Solusupernatantit lisättiin 96-kuoppaisen levyn täytetään sekoitetun Wako glukoosi-reagenssia (Wako Chemicals, Richmond, VA). Seuraavaksi levyä inkuboitiin 37 ° C: ssa ja ravisteltiin samanaikaisesti. Absorbanssi havaittiin 505nm ja 600 nm spektrofotometrillä (SpectraMax

® M5, Molecular Devices) mittaamaan glukoosia sisällön näytteistä. Tulokset ilmaistaan ​​umol /mg proteiinia [9].

laktaatti sisällön näytteistä mitattiin Trinity laktaatti mukainen kitti valmistajan protokollaa. Lyhyesti, solut supernatantti laimennettiin 1:10 PBS: llä ja laimennettiin sitten näytteet lisättiin 96-kuoppalevylle täytetty saatettua Trinity laktaatti reagenssia. Valmistettua 96-kuoppaisen levyn oli suojattu valolta ja inkuboitiin 37 ° C: ssa yhden tunnin ajan. Absorbanssi havaittiin 540 nm: ssä spektrofotometrillä (SpectraMax

® M5, Molecular Devices) mittaamiseksi laktaatti sisällön näytteistä. Pyruvaattimääritys mukana kolorimetrinen nikotiiniamidiadeniinidinukleotidi (NADH) kvantifiointi. Laktaattidehydrogenaasin (LDH) katalysoi pyruvaatin osaksi laktaattia kanssa kustannuksella NADH. Lyhyesti, NADH: n liuos valmistettiin liuottamalla NADH (Sigma Aldrich) Tris-liuosta (pH = 7,0). Laktaattidehydrogenaasin (LDH) rekonstituoitiin 50% glyserolia ja laimennettiin Tris-liuosta (pH = 7,0). NADH-liuosta lisättiin 96-kuoppaiselle levylle ennen kuin lisättiin solujen supernatantista. Valmistettua levyä inkuboitiin 37 ° C: ssa viisi minuuttia ja sekoitettiin. Absorbanssi luettiin 340 nm: ssä spektrofotometrillä (SpectraMax

® M5, Molecular Devices) skannata pohjapinta tasoilla NADH. Seuraavaksi LDH lisättiin ja levyä valolta suojattuna, ja inkuboitiin 37 ° C: ssa yhden tunnin ajan. Lopullinen tasot NADH mitattiin samalla aallonpituudella. Menetys NADH absorbanssi vastaa pyruvaatti sisällön näytteistä. Solunsisäinen ATP sisällöt mitattiin eri solutyyppejä käyttäen Cell Titer-Glo Luminescent solunelinkykyisyysmääritys (Promega). Solut ympättiin 96-kuoppalevyille (valkoinen) on 8000 solua kuoppaa kohti 24 tunnin ajan. Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin, soluja inkuboitiin 2 tunnin ajan joko läsnä oligomysiini (2,5 ug /ml) tai 2-deoksiglukoosi (100 mM). ATP pitoisuus havaittiin mukaan valmistajan ohjeiden spektrofotometrillä (SpectraMax

® M5, Molecular Devices).

Proliferaatiomääritys

OVCA 429, OVCA 433 soluja, A2780, ja SKOV3- solut transfektoitiin stabiilisti tulikärpäsen lusiferaasi-geeni käyttäen lentiviruksen menetelmää ja maljattiin 5000 solua /kuoppa BD Falcon 96-kuoppalevylle, yksin tai 1: 1 co-kulttuuri O-ASC1 tai O-ASC4. Co-viljelmät suoritettiin DMEM (Mediatech, Manassas, VA), jossa oli 10% FBS: ää ja 1% penisilliiniä ja streptomysiiniä. 24 tunnin kuluttua, 0,15 mg /ml D-lusiferiini, lisättiin ja inkuboitiin 1 tunnin ajan. Luminenssi mitattiin luminometrillä (Fluostar Omega, BMG Labtech, Offenburg, Saksa). Tiedotusvälineet uusittiin ja mittaukset toistettiin jopa 11 päivän viljelyn.

migraatiokokeessa

Solun muuttoliikettä analysoitiin käyttämällä medium (CM) syntyvät O-ASC1 ja O-ASC4 . O-ASC: tä viljeltiin 6-kuoppaisen levyn yhtenäisiksi α-MEM-alustassa (Mediatech, Manassas, VA), jossa 20% FBS: ää (HyClone), ja 1% penisilliini, streptomysiini ja L-glutamiinia (Mediatech, Manassas, VA). PBS-pesun jälkeen seerumittomassa DMEM, jossa oli 1% penisilliiniä ja streptomysiiniä (Mediatech, Manassas, VA), lisättiin kuhunkin kuoppaan. 36 tunnin kuluttua, O-ASC CM kerättiin. Munasarjasyövän solulinjoissa kiinnostavia maljattiin (seerumittomassa media) ylempään osaan 24-kuoppaisen transwell levy 8 um huokosia (Corning, Inc., Corning, NY), 500 ui O-ASC CM lisättiin alareunassa kunkin hyvin. Kaikki näytteet analysoitiin kahtena tai kolmena kappaleena. 24 tunnin kuluttua, siirrettyjä soluja värjättiin Hema 3 Stat Pack (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Optinen tiheys luettiin suoraan 96-kuoppalevylle 590 nm entsyymistä immunosorbenttimääritys (ELISA) lukulaite (BioTek Instruments, Winooski, VT).

radioherkkyyttä määritys

Luciferase -leimattuja A2780-solut maljattiin (tiheydellä 10000 solua /kuoppa) BD Falcon 96-kuoppalevylle, yksin tai 1: 1 tai 1:19 yhdessä viljelemisen O-ASC1 tai O-ASC4. Co-viljelmät suoritettiin DMEM (Mediatech, Manassas, VA), jossa oli 10% FBS: ää, 250 ug /ml G418: aa, 1% penisilliiniä ja streptomysiiniä. 24 tunnin kuluttua solut säteilytettiin 0 Gy, 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, ja 8 Gy kautta Cesium 137 sädehoito. Lusiferaasiekspressiota mitattiin 0,15 mg /ml D-lusiferiini. 1 tunnin inkuboinnin jälkeen 37 ° C: ssa, luminesenssi mitattiin spektrofotometrillä (Fluostar Omega, BMG Labtech, Offenburg, Saksa). Media korvattiin sitten uusi media, joka sisältää G418, ja mittaukset toistettiin joka toinen päivä, kunnes solut saavuttivat konfluenssin.

Paklitakseli ja karboplatiini määritykset

Luciferase-leimattu OVCA 429, OVCA 433, A2780, ja SKOV3- solut maljattiin (tiheydellä 10000 solua /kuoppa) BD Falcon 96-kuoppalevylle, yksin tai 1: 1 co-kulttuuri O-ASC1 ja O-ASC4. Co-viljelmät suoritettiin DMEM (MediTech, Manassas, VA). 24 tunnin kuluttua, OVCA 429-0,5 uM paklitakselia 200 uM karboplatiini, OVCA 433-1 uM paklitakselia ja 100 uM karboplatiinin, A2780 20 uM paklitakselia 200 uM karboplatiinin ja SKOV3 50 uM paklitakselia ja 100 uM karboplatiinin olivat altistuneet. Lusiferaasiekspressiota mitattiin 0,15 mg /ml D-lusiferiini. 1 tunnin inkuboinnin jälkeen 37 ° C: ssa, luminesenssi mitattiin luminometrillä (Fluostar Omega, BMG Labtech, Offenburg, Saksa). Tiedotusvälineet sitten korvattiin uusilla median, joka sisältää nimetyn Paklitakselin pitoisuus ja karboplatiinin ja mittaus toistettiin yli 9 päivää.

O-ASC: hen

in vivo

engraftmentissa

onko O-ASC-solujen ympätä munasarjasyövän strooman, 5 nude-hiiriin injektoitiin intraperitoneaalisesti (IP) kanssa 5 x 10

6 lusiferaasia ilmentävät SKOV-3 kasvainsolujen kanssa tai ilman sama määrä RFP-leimatun O-ASC1. Vertailuryhmä koostui hiiri injektoitiin vain O-ASC1. Kasvaimen kasvua seurattiin kanssa

in vivo

bioluminescent kuvantaminen. Hiiret tapettiin 53 päivää. Kaikki hiiret lopetettiin protokollan hyväksymän MD Anderson Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC). Kasvaimen ja munasarjat kiinnitettiin ja parafiiniin histologista analyysiä. Immunofluoresenssikoe suoritettiin munasarjat havaitsemiseksi RFP ilmentävät O-ASC kaikkien hiirten. Kaikki eläin työ tehdään mukainen hyväksytyn Hiiren protokolla MD Anderson Cancer Center. Hiiren protokolla hyväksyi MD Anderson Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC). Hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 0.05 .. Kaikki kaaviot osoittavat keskiarvo ± SEM.

Tulokset

karakterisointi O-ASC: iden

O-konttinosturia eristettiin kolmesta munasarjasyöpäpotilaalle. O-ASC1 saatiin omental rasvakudos potilaan kohdun limakalvon ja munasarjasyövän adenokarsinooma ilman omental etäpesäke. O-ASC4 ja O-ASC5 eristettiin selvästi normaalilta näyttäviä omentum on saatu potilaalta, jolla vakavien munasarjasyövän omental etäpesäkkeitä. Erilaistuminen analyysit osoittivat, että O-ASC: tä, kuten BM-MSC erilaistua Adipogeeniset, kondrogeenisten, ja osteogeeninen mesenkymaaliset suvusta (kuva S1). Solunpintamarkkereiden karakterisoitiin virtaussytometrialla (kuvio S2). O-ASC1 ja O-ASC4, samanlainen kuin BM-MSC: ille ilmaistaan ​​CD29, CD44, CD73, CD90, ja CD105. Ne eivät ilmaisseet CD11, CD34, CD45 tai EPCAM. Pintamerkkiaine CD34 (läpäisevä glykoproteiini ilmaistu varhain hematopoieettisten ja johtosolukko) ilmaisi 10% O-ASC1s verrattuna 0,2% BM-MSC: ja 1,42% O-ASC4. Endogliiniksi (CD105) ja CD44 olivat lähes yleisesti ilmaistu BM-MSC: (99,34% ja 100% soluista, vastaavasti), mutta ilmaistiin alemmilla tasoilla O-ASC1 (87,24% ja 46,1% soluista, vastaavasti), tai O- ASC4 (7,98% ja 30% soluista, vastaavasti). Muita markkereita ilmaistiin samalla tasolla kaikissa solulinjoissa.

Geenien ilmentyminen

Geenien ilmentyminen O-ASC1, O-ASC4, O-ASC5 vertailussa SQ-ASC ja BM-MSC kartoitettiin Nimblegen paneelit. Hierarkkinen klusterointialgoritmi käytettiin ryhmään näytteitä perustuu samankaltaisuus ilmaus kaikkien 24000 geenejä. Dendrogrammissa perustuu valvomatta klustereiden erotettu näytteet kahteen päähaaraan; 1) O-ASC4 ja O-ASC5, joka eristettiin potilaista, joilla etäpesäke osaksi omentum, ja 2) SQ-ASC-soluja, ja O-ASC1) ja BM-MSC: t (kuvio 1A).

valvomaton klusterointi suoritettiin luoda dendrogrammi avulla keskus korrelaatio ja keskimääräinen vivusto (A) (O-ASC1, O-ASC4, O-ASC5, BM-MSC: n = 2, SC-ASC: n = 4). IPA-analyysi osoitti, reitit merkittävästi erilainen ilmaisu välillä O-ASC1 ja O-ASC4 (B). Toiminnot on listattu merkittävimmät (korkeammat palkit) vähiten merkitsevä (alempi baaria), ja kohtisuorassa keltainen viiva tarkoittaa kynnystä merkitys (P = 0,05).

Käyttäen paketti tilastollisten työkalujen, tunnistimme 415 merkittävästi ilmentyvät eri geenien välillä O-ASC1 ja O-ASC4. Viisikymmentä kuusi prosenttia yli-ilmentyvien geenien (vähintään 10x-kertainen muutos) O-ASC4 suhteessa O-ASC1 koodattuja tuotteita, joiden lopullinen lokalisointi on solukalvon tai solunulkoiseen tilaan. Kekseliäisyyttä Pathways Analysis (IPA) analyysi osoitti, että suurin osa näistä geeneistä ovat mukana solun liikkuvuus, kasvua ja lisääntymistä ja syövän tai pienen molekyylin metaboliaa (kuvio 1 B). Taulukossa 1 luetellaan alkuun 25 geenit (fold muutos katkeamisen 4 ja p-arvo 0,001), joiden ilmentyminen vaihteli huomattavasti OSC4 ja OSC1.

Symbol

Liittymisnumero

Entrez geenin nimi

Sijainti

Tyyppi

kertaluokkamuutos

Parametrinen p-arvo

ACANNM_001135, NM_013227AggrecanExtracellular spaceOther116.511.20E-06VNN1NM_004666Vanin 1Plasma membraneEnzyme0. 0327.20E-06GPR116NM_015234G proteiiniin kytketty reseptori 116Plasma membraneG-proteiiniin kytkeytynyt receptor23.811.02E-05GRIK2NM_021956, NM_175768Glutamate reseptori, ionotrooppisia, kainaatti- 2Plasma membraneIon channel21.191.02E-05NRCAMNM_001037132Neuronal soluadheesiota moleculePlasma membraneOther0.0331.13E-05C1QL3NM_001010908Complement komponentti 1, q-alaosa kaltaisia 3Extracellular spaceOther0.0421.24E-05ITGA8NM_003638Integrin, alfa 8Plasma membraneOther51.011.35E-05CADM3NM_021189Cell adheesiomolekyyli 3Plasma membraneOther0.0491.51E-05NEBLNM_006393NebulettePlasma membraneOther0.0582.17E-05GJA5NM_005266Gap liitoksen proteiini, alfa-5, 40 kDaPlasma membraneTransporter24.452.27E-05NPTX1NM_002522Neuronal pentraksiini IExtracellular spaceOther35.62.51 E-05AIF1LNM_001002260Allograft inflammatorisen tekijän 1-likePlasma membraneOther12.842.73E-05F11RNM_016946F11 receptorPlasma membraneOther0.0983.18E-05PF4NM_002619Platelet tekijä 4Extracellular spaceCytokine0.0973.39E-05OXTRNM_000916Oxytocin receptorPlasma membraneG-proteiiniin kytkeytynyt receptor14.553.63E-05PCDH10NM_032961Protocadherin 10Plasma membraneOther57.293.83E-05SGCANM_000023Sarcoglycan, alfa ( 50 kDa: n dystrofiini liittyvä glykoproteiini) Plasma membraneOther10.434.00E-05SORBS1NM_001034954Sorbin ja SH3 domeenin, joka sisältää 1Plasma membraneOther30.084.00E-05CXCL5NM_002994Chemokine (CXC-motiivin) ligandi 5Extracellular spaceCytokine0.124.15E-05ESM1NM_007036Endothelial cell-molekyyliksi 1Extracellular spaceGrowth factor20.674.34E-05CCBP2NM_001296Chemokine sitova proteiini 2Plasma membraneG-proteiiniin kytkeytynyt receptor0.134.39E-05IL13RA2NM_000640interleukin 13-reseptorin alfa-2Plasma membraneTransmembrane receptor0.0684.60E-05MMP7NM_002423Matrix metallopeptidaasi 7 (matrilysiini, kohdun) Extracellular spacePeptidase0.14.68E-05WFDC1NM_021197WAP neljän disulfidi ydindomeenin 1Extracellular spaceOther19.454.75E-05Table 1. Luettelo 25 geenejä, joiden ilmentyminen oli tilastollisesti merkitsevää eroa O-ASC4 vs. O-ASC1.

laskemiseksi tilastollisen merkittävyyden, käytimme Opiskelijan

t

-testi. CSV Lataa CSV

Metabolinen määrityksissä

Stroma on osoitettu edistävän pahanlaatuinen etenemisen muuttamalla syövän solujen aineenvaihduntaa. Mukaan ”käänteinen Warburg vaikutus”, stroomasolut säädellä lisäävästi glykolyysin, lisäämällä laktaatin tuotantoa, jota erittyy ja kulutetaan vierekkäisten syöpäsolujen polttoaineen oksidatiivinen fosforylaatio (OXPHOS) [10]. Oletimme, että pro-proliferatiivisia ja muuttavien vaikutusten OSC voi selittyä metabolisen erojen strooman isolaateissa. SQ-ASC oli korkein glukoosin oton ja laktaatti eritys verrattuna BM-MSC ja O-ASC-nosturin (kuvio 2A ja 2B). Niistä O-ASC: tä isolaatit, O-ASC4 oli merkittävästi korkeampi Glykolyysivaiheen ja laktaatin eritystä kuin O-ASC1 (kuvio 2A ja 2B). O-ASC4 oli korkeampi pyruvaatin oton kuin O-ASC1 joka todennäköisesti muutetaan laktaatti sillä on korkeampi glykolyyttisen aktiivisuuden O-ASC4 (kuvio 2C). Vakaa tila ATP tuotanto oli suurempi O-ASC4 kuin O-ASC1 (kuvio 2E-F). ATP tuotanto johtuu glykolyysin määritettiin estämällä F1F0-ATP-SYNTAASI kanssa oligomysiini kun taas ATP oksidatiivinen fosforylaatio (OXPHOS) mitattiin estämällä glykolyysiin reitti, jossa 2-deoksiglukoosi (2DG). Nämä tulokset osoittivat, että O-ASC4 tuotettu ATP edullisesti glykolyysissä, kun taas O-ASC1 tuotettu ATP OXPHOS (kuvio 2 E ja F).

Metabolinen analyysi suoritettiin BM-MSC, SC-ASC ja O-ASC1 ja 4, mukaan lukien glukoosin otto (A), laktaatti eritystä (B), pyruvaattia oton (C), endogeeninen ATP-tuottamista (D), ATP johdettu glykolyysin (E) ja ATP: tä, jotka ovat peräisin oksidatiivinen fosforylaatio (OXPHOS) (F). Tiedot esitetään keskiarvona ± S.E.M. * P 0,05, ** p 0,01 ja *** p 0,001 parittomia 2-tailed Studentin t-testiä (n = 8).

O-konttinosturia vaikutuksia munasarjasyövän soluproliferaatioon

Koska erottelu O-ASC1 ja O-ASC4 osalta geeniekspressioanalyysissä ja aineenvaihdunnan määritykset, me arveltu, että nämä isolaatit voi olla erillisiä vaikutuksia munasarjasyöpä biologia. Tämän testaamiseksi vaikutukset O-ASC1 ja O-ASC4 on munasarjasyövän solujen lisääntymisen, migraation ja chemsensitivity verrattiin. Ensinnäkin, sen määrittämiseksi, onko O-ASC-solut vaikuttavat munasarjasyövän solujen aineenvaihduntaa, leimaamatonta O-ASC-soluja, ja lusiferaasi-ilmentävien munasarjasyövän solulinjoissa (OVCA 429, OVCA 433, A2780, ja SKOV3) oli yhdessä viljeltiin 1: 1-suhteessa, kunnes solu tuli konfluentteja 11 päivää sen jälkeen pinnoituksen. OVCA 429 ja OVCA 433 solua proliferaatio oli lisääntynyt 7 (p 0,001 ja p 0,5 vastaavasti), 9 (p 0,0001 molemmissa solulinjoissa) ja 11 päivää (p 0,0001 ja p 0,001 vastaavasti) kun viljeltiin yh- O-ASC1 kontrolliin verrattuna. Merkittävät pro-proliferatiivisia vaikutuksia O-ASC4 nähtiin OVCA 429 soluissa 9 päivän kuluttua (p 0,01) ja OVCA 433 solua 11 päivänä yhteistyön kulttuuri (p 0,001). O-ASC4 lisääntyvän leviämisen SKOV3- solujen 7 (p 0,001), 9 (p 0,01) ja 11 päivää (p 0,01). Mielenkiintoista on, että O-ASC1 ja O-ASC4 tukahdutti leviämisen A2780 ihmisen munasarjan karsinooman solut (p 0,01 päivinä 7, 9, ja 11) (kuvio 3). Vaikutusten arvioimiseksi alemman suhteen ASC-solujen, suoritimme proliferaatiomäärityksillä kanssa 1:19 O-ASC: hen: syöpäsolujen suhteen (kuva S3). Ei ollut merkittävää eroa leviämisen korko OVCA 429, OVCA 433, A2780 ja SKOV3 solulinjat kun viljeltiin yhdessä O-ASC: hen tämän suhteen.

Luciferase ilmentävät munasarjasyövän solulinjoissa viljeltiin yksin tai 1: 1-suhteessa leimaamattoman O-ASC: hen. Merkittävä ero kontrolleihin (syöpäsolujen viljelty yksin) ja syöpäsolujen viljeltiin yhdessä O-ASC: hen on esitetty: *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001; ****, P 0,0001 (n = 5). ANOVA kanssa Bonfferoni monivertailuja testi.

O-konttinosturia vaikutuksia munasarjasyövän solujen vaeltamiseen

tutkimiseksi vaikutus O-ASC: iden on munasarjasyövän solujen vaeltamiseen, muunnetut Boyden kammio määritykset suoritettiin elatusaineessa (CM) O-ASC: hen. Lukumäärä siirtynyt syöpäsolujen (OVCA 429, OVCA 433, A2780, ja SKOV3) huomattavasti inkuboinnin jälkeen CM sekä O-ASC1 ja 4. O-ASC4 CM huomattavasti migraation OVCA 429, 433 ja A2780-soluissa verrattuna O-ASC1. (Kuva 4, Kuva S4).

Munasarjasyöpä vaeltaneet solut läpi 8 um huokosia, kun läsnä on valvonnan O-ASC elatusaine. Absorbanssi 590 nm: ssä kuvastaa solujen määrä, jotka läpi transwell kalvon. Merkittäviä eroja on merkitty seuraavasti: *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001 parittomia 2-tailed Studentin t-testiä (n = 3).

O-konttinosturia vaikutusta munasarjasyövän soluvasteen kemoterapiaa ja sädehoitoa

Voit selvittää läsnäolon O-ASC: iden vaikutus munasarjasyöpäsoluja vaste kemoterapialle, käsittelimme solut yksin ja viljeltiin yhdessä O-konttinosturia paklitakseliin tai karboplatiinia. OVCA 429 solua oli merkitsevästi enemmän selviytymisen hoidon jälkeen karboplatiinin tai taksolin kun viljeltiin yhdessä O-ASC4. OVCA 433 ja Skov-3 selviytymisen käsittelyn jälkeen karboplatiinin ja taksolin kasvanut yhdessä viljelemisen sekä O-ASC1 ja O-ASC4. A2780 eloonjääminen ei kuitenkaan vaikuttanut O-ASC co-kulttuuri (kuvio 5A). Sen määrittämiseksi, O-ASC: iden vaikutus säteilyn herkkyys, A2780-soluja viljeltiin yh- 1: 1 7 päivää O-ASC1 tai O-ASC4. Inkubaation jälkeen solut säteilytettiin 2, 4, 6, ja 8 Gy. Havaitsimme merkittävän kasvun selviytymisen jälkeen 4, 6, ja 8 Gy A2780 soluissa viljeltiin yhdessä O-ASC1 (p 0,05, p 0,0001 ja p 0,01, vastaavasti) ja O-ASC4 (p 0,01, p 0,01, vastaavasti) verrattuna kontrolliin (kuvio 5B). Radio-suojaava rooli rasvakudoksen kantasoluja ei ole selvästi esitetty samankaltainen koe suoritettiin 1:19 suhde O-ASC: iden solujen. syöpäsoluja (kuva S5).

munasarjasyöpä soluja viljeltiin kanssa tai ilman yhtä monta O-ASC ja käsiteltiin annoksilla paklitakselin ja karboplatiinin (n = 5) (A) tai säteilyn (n = 4) 0-8 Gray (B), kuten on esitetty. Merkittäviä eroja on merkitty seuraavasti: *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001; ****, P 0,0001 parittomia 2-tailed Studentin t-testiä.

O-ASC engraftmentissa

Seuraavaksi haluttiin selvittää, jos O-konttinosturia ympätä munasarjasyövän strooman ja normaaleissa kudoksissa, mukaan lukien munasarja. Nude-hiiriin injektoitiin intraperitoneaalisesti lusiferaasi ilmentävät SKOV-3 kasvainsolujen kanssa tai ilman yhtä monta RFP-leimatun O-ASC1. Kasvaimen kasvua seurattiin kanssa

in vivo

bioluminescent kuvantaminen. Jälkeen 7 päivää, lusiferaasin aktiivisuus oli merkitsevästi suurempi hiirissä, joita käsiteltiin O-ASC-solut, mutta sen jälkeen laski (kuvio S6). O-ASC: tä annettiin uusi injektio päivänä 25. Immunofluoresenssikoe suoritettiin 7 päivää myöhemmin havaita RFP ilmentävät O-konttinosturia sisällä munasarjasyöpiä ja uninvolved munasarja. RFP ilmentävät O-ASC: hen havaittu sisällä strooman munasarjojen ksenograftien muttei uninvolved munasarjat (kuvio 6A, 6B), jotka osoittavat kasvaimeen erityisiä engraftmentissa, kuten on raportoitu MSC muista lähteistä.

(A) Immunoflouresence suoritettiin havaitsemiseksi O-ASC munasarjojen SKOV3 ksenografteissa ja törkeän normaali munasarja. O-ASC havaitaan punaisina solujen strooman munasarjojen kasvaimia hiirissä injektoitiin RFP ilmentävät O-ASC. (B) H & E-kudosvärjäyksellä (20x suurennos).

Keskustelu

Lisäksi rasvasolut, The omentum on verta ja imusuonten sekä runsas tulehduskeräytymää jotka tekevät se eroaa ihonalainen rasvakudos.