Krooninen sairaus

tiivistelmä

pieneneminen lähes viisikymmentä prosenttia kuolleisuus suusyövän tarvitaan kiireellisesti . Parannuksia varhaisen diagnoosin ja tehokkaampia ennaltaehkäiseviä hoitoja voivat vaikuttaa tällaisen laskua. Tätä tarkoitusta varten olemme sitoutuneet ensimmäistä kertaa perusteellinen massaspektrometriaa perustuva kvantitatiivinen haulikko proteomiikan tutkimus ei-invasiivisesti kerätty suun harjalla koepaloja. Proteiinit eristetään harja koepalat tervettä normaalia kudosta, suun esipahanlaatuinen vaurio kudoksessa (OPMLs), suun levyepiteelisyöpä (OSCC) ja sovitetun kontrolli kudoksen verrattiin. Toistensa kopioita proteomic aineistoja, erittävien valkosolujen proteaasinestäjä (SLPI) proteiini erottunut perustuu sen lasku runsaasti sekä OPML ja OSCC leesio kudoksia verrattuna terveisiin normaalia kudosta. Western blotting ylimääräisiä harjattu biopsianäytteissä vahvisti suuntaus vähitellen laskeva SLPI runsaus terveiden normaalin ja OPML kudos, jossa on suurempi lasku OSCC leesion kudoksessa. Samanlainen SLPI vähenemistä

in vitro

vertaamalla mallin OPML- ja OSCC solulinjoissa. Lisäksi paisutettu suullinen solut potilaiden koko syljestä tappiollinen SLPI korreloi suullinen syövän etenemisessä. Nämä tulokset yhdistettynä proteomiikka tiedot osoittavat laskua SLPI in terveisiin ohjaus kudosta OSCC potilaista verrattuna kudokseen terveistä normaalia kudosta, ehdotti systeeminen lasku SLPI suun soluissa korreloi suullinen syövän kehittymisen. Lopuksi

in-vitro

kokeet osoittivat, että hoito SLPI vähentynyt merkittävästi NF-kB aktiivisuuden OPML solulinjassa. Tulokset osoittavat anti-inflammatorista aktiivisuutta OPML, joka tukee mekanistinen roolia SLPI vuonna OSCC etenemiseen ja viittaa sen mahdollisuudet ennaltaehkäisevän hoitoon riskiryhmään suun haavaumia. Yhdessä tuloksemme osoittavat ensimmäistä kertaa mahdollisuus SLPI mekanismina-pohjainen, ei-invasiivisia biomarkkereiden suusyövän etenemisen kanssa potentiaalia ehkäisevää hoitoa.

Citation: Yang Y, Rhodus NL, Ondrey FG, Wuertz BRK, Chen X, Zhu Y, et ai. (2014) Quantitative proteomiikan analyysi Suun Harjaa Biopsies Tunnistaa Sekre- Leukosyyttien proteaasinestäjä lupaavana, Mechanism-Based Oral Cancer biomarkkereiden. PLoS ONE 9 (4): e95389. doi: 10,1371 /journal.pone.0095389

Toimittaja: John M. Koomen, Moffitt Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 03 tammikuu 2014; Hyväksytty 25 maaliskuuta 2014; Julkaistu: 18 huhtikuu 2014

Copyright: © 2014 Yang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain avustusta 1R01DE017734 National Institutes of Health (USA) ja TJG ja tutkimus Apurahat 81000439 ja 81271134 National Natural Science Foundation of China Y.Y. ja Y.Z. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Valitettavasti eloonjäämisaste ihmisten diagnosoitu suullinen syöpä, pääasiassa muodossa suullisen okasolusyöpä (OSCC), on vain hieman parempi kuin 50% [1]. OSCC edeltää esiintyminen suullisen premaligni vaurio, yleisesti leukoplakia, joka muuntuu invasiivisia syövän 5%: sta 17%: ssa tapauksista [2], [3]. Jos todetaan varhain, ennaltaehkäisevät hoidot ovat tehokkaampia, lisäämällä eloonjäämisaste 80% tai paremmat [4]. Näin ollen on olemassa pakottava tarve parempia tapoja diagnosoida ja hoitaa riskiryhmiin OPML- ja /tai alkuvaiheen OSCC suun haavaumia [2].

Invasiivisen incisional koepala seuraa histopatologia on nykyinen kultakanta suun kautta syövän diagnoosi [5]. Valitettavasti se on lukuisia rajoituksia. Invasiivisen ja kallista luonne johtaa harvemmin testaus epäilyttäviä leesioita, ja näin ollen, viivästynyt diagnoosi OSCC [6], [7]. Yksi retrospektiivinen tutkimuksessa havaittiin vain noin 14% seuranta-korko leikkausveitsellä koepaloja sisällä 3 vuoden aikana [2]. Lisäksi leikkausveitsellä koepala on altis alle näytteenottoa vaurioiden [8], [9], mikä johtaa virhediagnoosit.

Koska nämä rajoitukset skalpelli koepala, paljon huomiota on kiinnitetty tunnistaa molekyylitasolla biomarkkerit ohjeellinen taudin ei-invasiivisesti kerätään potilaan näytteitä [10]. Yksi lupaava ei-invasiivisia Näytteenottomenetelmää käyttö harjan koepaloja [11], [12]. Tässä suhteellisen harjaa käytetään varovasti kerätä näyte trans-epiteelisolujen suoraan suun kautta vaurio, tai sovitettu suun limakalvoille. Tämä kokoelma on yksinkertainen ja halpa, minimaalisella epämukavuutta potilaalle. Tärkeintä se tarjoaa potentiaalisesti tietoa sisältävä näytteenotto solujen suoraan leesio voidaan analysoida tarkemmin [11], [12].

Kehitetään ei-invasiivisesti kerätty molekyylitason biomerkkiaineissa harja koepaloja, lupaava ehdokas molekyylit näissä näytteet on ensin tunnistettava. Laajamittainen teknologia Molekyylien profilointiin (esim. Genomiikka, proteomiikka) voi tunnistaa tällaisia ​​ehdokkaita. Erityisesti analyysi käyttäen massaspektrometriaa-pohjainen proteomiikan voisi tarjota paitsi johtaakin käytännöllisiä proteiini biomarkkereita näistä näytteistä, mutta myös taustalla tietoa syövän etenemisen mekanismeja ja mahdolliset kohteet hoitoon. Kuitenkin proteomiikka analyysi suullinen harjalla koepaloja kautta MS-pohjainen proteomiikan on nähnyt vähän huomiota [13], [14], erityisesti käyttäen moderneimpia teknologiakeksintöihin. Tähän mennessä kukaan ei ole sovellettu määrällisiä haulikko MS-pohjainen proteomiikan, todennäköisesti kaikkein monipuolisin ja syvällistä menetelmässä luonnehtimiseksi proteomeja [15], suun harjalla koepala analyysi.

Tässä tutkimuksessa olemme hakeneet määrällisiä haulikko MS-pohjainen proteomiikan analyysiin harjan koepaloja kerättiin terveiltä normaaleista kudoksista, OPML, ja OSCC. Joukossa useita monistaa proteiinien osoittavat runsaasti eroja, erittävien leukosyyttien proteaasi-inhibiittori (SLPI) proteiini osoitti dramaattisen laskun suhteen normaaleissa kudoksissa korreloi vaiheet suun syövän etenemisessä. Tämä vähentynyt runsaasti SLPI varmistettiin kautta western blotting harja biopsianäytteissä, ja havaittiin myös kuorinnan soluissa kokonaan sylkeen OPML- ja OSCC potilaita. Yhdenmukainen potilaan tuloksiin, malli solulinjoja OPML ja OSCC myös väheni SLPI. Lisäksi käsittelemällä malli OPML- solulinjan SLPI osoitti NF-KB: n aktiivisuutta, transkriptiotekijä tunnetaan olevan rooli tulehdussairauksien mekanismit suun syövän kehittymisen. Yhdessä tuloksemme osoittavat ensimmäistä kertaa progressiivinen menetys SLPI runsautta siirryttäessä OPML ja OSCC, ja ehdottaa uutta roolia SLPI mekanismina sidottu, ei-invasiivisia biomarkkereiden suusyövän, jossa potentiaalia OPML hoito agentti.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat ja näytteet

tutkimus tehtiin tietoisen kirjallisen suostumuksen kaikista näytteen luovuttajien käyttäen ihmisen aihe protokolla hyväksymä Institutional Review Board at Minnesotan yliopistosta (IRB tutkimusnumero 0001M34501). Kaikki sylki kokoelmat tehtiin ilman stimulaatiota passiivisesti kuolaaminen, päivällä välillä tuntia 09:00 ja 17:00. Koko sylki ja harja biopsiat kerättiin 11 potilaalla diagnosoitiin dysplastic OPML ja 11 potilasta, joilla OSCC yliopiston Minnesotan Otolaryngology klinikalla. Kunkin potilaan sylki näytteet ensin talteen, sen jälkeen kokoelma harjan koepaloja leesionäytteistä ja terve limakalvo vastaavien contralateral alue käyttäen Rovers Orcellex harjat (Rovers Medical Devices B.V., Alankomaat). Harjaa koepalat suun limakalvoilla ja koko sylki kerättiin myös 10 terveillä vapaaehtoisilla. Terve vapaaehtoisilla ei ollut merkittäviä riskitekijöitä OSCC (tupakoimattomien, kohtalainen tai alhainen alkoholin käyttö) ja olivat vapaat suun haavaumia. Välittömästi keräyksen jälkeen näytteitä säilytettiin -20 ° C: ssa, ja siirrettiin sitten -70 ° C: ssa käyttöön asti. Lisäksi tietoa tupakan ja alkoholin käyttöä potilaiden kerättiin. Ominaisuudet tutkimusväestöstä on koottu taulukkoon S1.

Solulinjat

MSK Leuk1 soluihin [16], kasvanut suun limakalvolta vieressä suullinen leukoplakia vaurioita, oli lahja Dr. Peter säkit, New York University. MSK Leuk1 soluja kasvatettiin KGM-2 Medium (Lonza Walkersville, MD), johon oli lisätty naudan aivolisäkeuutetta, rekombinantti ihmisen epidermaalinen kasvutekijä, ihmisen rekombinantti insuliini, hydrokortisoni, epinefriini, ja transferriini 37 ° C: ssa, 5% CO

2 .

Muuttunut ihmisen orvaskeden keratinosyyttejä (Rhek) kuolemattomiksi Ad 12-SV40-viruksen [17] saatiin tri Jhong S. Rhim National Cancer Institute, (Frederick, MD). OSCC solulinja CA-9-22 [18], oli lahja Toshio Kuroki, MD. Soluja ylläpidettiin Eaglen minimal essential väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia, L-glutamiinia (5,8 mg /ml), ja penisilliiniä /streptomysiiniä (50 ug /ml) 37 ° C: ssa, 5% CO

2 adherentteina yksikerrosviljelmissä.

harjattu biopsia näytteiden esikäsittely

MS-pohjainen proteomic löytö tutkimuksiin ja western blot validointitutkimukset, harja otetuissa aiheita laskussa kaksi hydroksipropyylitärkkelysasetaatteja identtisesti. Jotta voidaan maksimoida elpymistä peptidien ja minimoida näytteen käsittelyn vaiheita, käytimme ”on-harja” digestiomenetelmä tuottamiseksi peptidin ratkaisu MS-pohjainen proteomiikka-analyysi (katso kuvio 1A Results osiossa). Harjaspää upotettiin ja lyysattiin 50 mM tris, pH 8,0, 2% SDS, 95 ° C: ssa 10 minuutin ajan ajoittain vorteksoimalla. Solujäänteet poistettiin sentrifugoimalla 16 100 x g ja supernatantti otetaan talteen puhtaaseen mikrofugiputkeen. Proteiini elpyminen mitattiin käyttäen BCA-määrityksellä (Thermo Scientific). Talteen proteiinit pilkottiin sitten ja käsitellään myöhemmin massaspektrometriaa analyysi tai käyttää western blot validointi.

. Harjaa biopsia keräys ja näytteen valmistelu protokollaa. B. Kokeellinen suunnittelu kvantitatiivinen MS-pohjainen proteomiikan kokeita. Eräässä kokeessa käytettiin sovitettu kudosta OPML potilaista, kun taas toinen koe käytetty sovitettu kudosta OSCC potilaista.

isobaaristen peptidi lähdemerkintäratkaisut ja näytteiden valmistus

Proteiinit harjattu solut vähennetty DTT 1 h 55 ° C: ssa ja trypsiinillä pilkottu käyttäen modifioitua FASP protokollaa [19]. Jodiasetamidi käytettiin kysteiini alkylointireagenssin. Tuloksena peptidit poistettiin suola käyttäen kiinteän faasin uutolla patruunat (TC18 Sep-pak, Waters). Peptidit liuotettiin sitten valmistajan toimittamia puskuria ja merkitty iTRAQ reagenssilla (Applied Biosystems) huoneenlämmössä 1 h ja poistettiin suola Sep-Pak patruunoita.

Näytteet olivat ensi fraktioitiin off-line semipreparatiivisella HPLC. Yhdistetyt, iTRAQ-leimattuja peptidejä suspendoitiin uudelleen puskuriin A (10 mM ammoniumformaattia, pH 10 98:2 vesi: asetonitriili) ja fraktioitiin offline korkean pH C18 käänteisfaasi (RP) kromatografia [20]. Magic 2002 HPLC (Michrom Bioresources, Inc., Auburn, CA) käytettiin C18 Gemini-NX pylväs, 150 mm x 2 mm: n sisähalkaisija, 5 um hiukkasten, 110 Ä: n huokoskoko (Phenomenex, Torrence, CA). Puskuri A oli 10 mM ammoniumformiaattia, pH 10. 98:2 vesi: asetonitriili ja puskuri B oli 10 mM ammoniumformiaattia, pH 10. 10:90 vesi: asetonitriili. Virtausnopeus oli 150 ul /min. gradientilla 0-35% puskuri B 60 minuutin aikana., minkä jälkeen 35-60% 5 minuutin aikana. Fraktiot kerättiin 2 minuutin välein, ja UV-absorbanssin seurattiin 215 nm: ssä ja 280 nm: ssä. Peptidi sisältävät fraktiot jaettiin kahteen yhtä suureen numeroitu ryhmää, ”varhainen” ja ”myöhäinen”. Ensimmäinen ”aikaisin” fraktio ketjutetaan ensimmäinen ”myöhään” osa, ja niin edelleen. Ketjutettuja näytteet kuivattiin vakuumissa, suspendoitiin uudelleen kuorman liuottimessa (98:2:0.01, vesi: asetonitriili: muurahaishappoa) ennen massaspektrometristä analyysiä.

massaspektrometrianalyysissä

lineaarinen ioniloukku -Orbitrap (LTQ-Orbitrap) Velos väline (Thermo Fisher Scientific) [21] käytettiin massaspektrometriaa. Instrumentti oli toiminut ylhäältä kymmenen data riippuvainen tilassa käyttämällä kyselyn skannaa 30000 resoluutio 300-1800 m /z. Tandem MS (MS /MS) skannaukset hankittiin eristämiseen leveys on 2 m /z ja korkeamman energian collisional dissosiaatio (HCD) pirstoutuminen -tilassa. 40% normalisoitu törmäysenergia käytettiin 20 millisekunnin ajan. Automaattinen vahvistuksen säätö asetukset olivat 3 x 10

5 ionit ioni ansa, ja 1 x 10

6. Orbitrap. Dynaaminen syrjäytyminen käytettiin kestää 15 sekuntia ja toista lasken 1.

Proteiinin tunnistaminen ja kvantifiointi

Raw tiedostot muunnettiin mzXml käyttäen msconvert (jaettu osana ProteoWizard 01.6.1260) . MS /MS-spektrit etsittiin vastaan ​​UniProt ihmisen tietokantaan lukien salattu sekvenssit ja yhteiset kontaminanttiproteiinit (yhteensä 136002 merkinnät) käyttäen Sequest v27.0. Hakuparametrit sisältyi 1,6 amu (atomimassayksikköä) edeltäjä ja 0,8 amu fragmentti massa toleranssi, 2 jäi katkeamiset, osittainen trypsiini spesifisyys, kiinteät modifikaatiot carbamidomethylated kysteiinin iTRAQ reagenssi muunnos lysiiniä ja N-päät, ja vaihteleva muuttaminen metioniinin hapetuksen. Hakutulokset suodatettiin 99% proteiinia todennäköisyydellä ja 95% peptidi todennäköisyys Scaffold (v3.3.1, Proteome Software), joka tuottaa vääriä löytö nopeudella 1%. Proteiinit kvantifioitiin käyttäen räätälöityjä ohjelmistoja kehitetään talon [22]. Vain proteiinit tunnistettiin kahdesta tai useammasta MS /MS-spektri sovitetaan peptidit harkitaan kvantitatiivista analyysiä. P-arvot kullekin proteiinin määrä määritettiin kolme tai useampia MS /MS-spektrit, kuten on kuvattu [22]. Taulukko S2 näyttää kaikki tiedot proteiineja tunnistettu ja määrällisesti näissä kokeissa.

Western-blottaus Kokeet

western blotting kokeita, riippumaton joukko näytteitä käytettiin puutteessa näytemateriaalin alkuperäisestä näytesarja käytetään MS-pohjainen proteomic kokeita. Kolmekymmentä mikrogrammaa (ug) harjan koepalan proteiinin kunkin yksittäisen aihe analysoitiin validointi kokeita, tai viisikymmentä ug proteiinia solulysaateista solulinjoja, yhdessä kolmekymmentä ug positiivisen kontrollin proteiinia, erotettiin 12% SDS-PAGE. Proteiinit siirrettiin sitten PVDF-membraanille (Millipore), ja tutkittiin kanin polyklonaalista anti-SLPI-vasta-aine (1:250; Abcam ab46763). Täplät leimattiin piparjuuriperoksidaasikonjugoiduilla toissijainen vasta (1:10,000) ja näkyväksi ECL-detektiojärjestelmässä (Thermo Scientific).

Kun on kyse koko syljen, stimuloimattomasta näytteet kerättiin riippumaton sarja aiheista (4 tervettä vapaaehtoista, 5 potilaalla on OPML ja 5 primaarisessa OSCC). Koko sylkeä sentrifugoitiin 3000 x g 4 ° C: ssa, supernatantti, joka sisältää liukoisen fraktion syljen proteiinit kerättiin, ja solupelletit pestiin PBS: llä ja hajotettiin saada solun proteiineihin. Yhteensä proteiini kvantitoitiin käyttäen BCA-määritystä (Thermo Pierce).

Reporter Gene määritykset

solulinjat maljattiin 50000 solua /kuoppa 12-kuoppalevyille ja lyhytaikaisesti ko-transfektoitiin kautta TransIT Express reagenssia (MirusBio, Madison, WI), jossa on pIgκB-Luc reportterigeenin plasmidi 24 tuntia myöhemmin yhdessä pCMV Lac-Z reportteri, joka sisältää CMV-promoottorin ja Lac-Z-geenin pcDNA3 säätää transfektiotehokkuuden. PIgκB-Luc toimittaja rakenne sisältää kolme immunoglobuliini G-κ ketjun NF-KB: n sitoutumiskohtia ajo lusiferaasigeeniä ja luovutti ystävällisesti meille Dr. K. Brown (NIAID, NIH). Yön yli transfektion jälkeen solut käsiteltiin yhdistelmä-humaani-SLPI (R 2-kertainen) tutkimuksessamme. Mielenkiintoista, vain kolme näistä proteiineista osoitti runsaasti muutoksia sekä kudostyypeissä (OPML- ja OSCC) verrattuna terveisiin normaaliin (lihavoitu teksti taulukko 1).

proteiinit on esitetty taulukossa 1, erittävien leukosyyttien proteaasinestäjä (SLPI), erottui perustuu sen voimakkaaseen vähenemiseen sekä OPML ja OSCC kudoksissa verrattuna terveisiin normaalien (19,5 ja 12,4 keskimääräinen runsaus vähennys OPML- ja OSCC kudokset, vastaavasti). Näiden havaintojen perusteella, ja tunnetut rooli SLPI kuin proteaasinestäjän kanssa yhteydet suusyövän [26], päätimme edelleen vahvistaa ja tutkia tätä proteiinia. Tätä varten ensin edelleen kuulusteltiin määrällisten proteomiikan tietojen SLPI. On huomioitava tulokset toisesta iTRAQ kokeessa, johon sisältyi sovitetun OSCC terveillä verrokeilla kudosta. Tulokset osoittivat, että ei ollut ainoastaan ​​SLPI laski OSCC leesion kudosta verrattuna terveisiin normaalit, mutta myös se väheni sovitetussa tervettä kudosta verrattuna terveiden normaaleissa kudoksissa (kuvio 2). Suhteellisen pieni väheneminen havaittiin myös ensimmäisessä iTRAQ kokeen välillä sovitettu kudosta OPML- potilailla ja terveillä normaaleissa kudoksissa (taulukko S2).

Validating syövän etenemisessä riippuva SLPI yltäkylläisyyden Dynamics Independent Näytteitä

jotta vahvistaa havaittuun runsaasti lasku SLPI sekä OPML ja OSCC kudoksissa, ensin pyrittävä puolikvantitatiivinen western blotting kokeiluja ylimääräistä harjalla biopsianäytteissä. Kuten on esitetty kuviossa 3A, Western-blotit vahvisti MS-pohjainen tulokset, SLPI runsaasti väheni asteittain terveiden normaaliin kudokseen ja OPML- kudos, jossa on enemmän dramaattinen lasku OSCC kudoksissa. Kuvassa S1 esittää latauskontrollina tulosten kautta yhteensä proteiinivärjäys kalvojen käyttää tuloksia esitetään kuviossa 3. Lisäksi keräsimme un-stimuloidun koko sylki näytteet samoilta potilaille, jotka suostuivat harjata koepaloja. Olemme eristäneet kuorinnan solut näistä näytteistä sentrifugoimalla ja tutkittiin eristetyn proteiineja SLPI solujen hajoamisen jälkeen. Tulokset osoittivat samansuuntaisesti runsaasti lasku SLPI terveiden normaaleista kudoksista ja sekä OPML ja OSCC kudoksissa (kuvio 3B). Analyysi liukoiset proteiinit sisältyvät syljen supernatanteista osoitti vähemmän yhdenmukainen suuntaus (tuloksia ei ole esitetty).

. Tarkastaminen väheni SLPI kudoksissa keräämät siveltimellä koepala. B. SLPI runsaus mitatut tasot paisutettu solujen koko syljestä. C. SLPI runsaus mitatut tasot mallissa solulinjoissa. Positiivinen kontrolli on normaali terve ihmisen sylkinäyte; Rhek solut ovat peräisin normaalin epiteelin solulinja, MSK on malli OPML- solulinja (MSK-Leuk1) ja CA9-22 on malli OSCC solulinjassa.

Testasimme myös runsaasti SLPI proteiinin malli OPML ja OSCC solulinjoissa (kuvio 3C). Täällä, päätimme vertailla liukoisia proteiineja eristettiin kokosolulysaateista kontrollista RHEK soluista, MSK-leuk1 soluja (malli solulinja OPML [27]) ja Ca9-22 soluja (malli solulinja OSCC [28]). Samanlaisia ​​tuloksia potilaan harjan koepaloja, havaitsimme dramaattiseen laskuun SLPI MSK-leuk1 ja Ca9-22 solulinjoissa verrattuna terveisiin soluihin.

Testing Mahdolliset Tulehdusta vaikutukset SLPI Hoito on OPMLs

rooli NF-KB: n aktivaation ja sääntelyn proinflammatoristen tekijöiden mekanismiin taustalla siirtyminen OPML ja OSCC on tunnettu [29], [30], [31]. On olemassa todisteita siitä, jotka osoittavat SLPI estää NF-KB [32], [33], vaikka tämä ei ole osoitettu malleissa suusyövän. Tämän todistusaineiston nojalla pyrimme tutkimaan, onko SLPI vähentää NF-KB aktiivisuuden MSK-Leuk1 soluissa, käyttäen lusiferaasi-pohjainen reportterianalyysi [34]. Käsittelimme transfektoidut MSK Leuk1 solujen kahdella eri pitoisuuksia puhdasta SLPI peptidin (20 ug /ml ja 40 ug /ml), ja mitataan NF-KB: n eri aikoina käsittelyn jälkeen (kuvio 4). Tulokset molemmat hoidot olivat vertailukelpoisia, sekä osoittaa noin 40% lasku NF-KB 24 tunnin kuluttua SLPI hoidon. Hoito alhaisempi määrä SLPI (10 ug /ml) oli pienempi ja vähemmän luotettavia lasku NF-KB: n aktiivisuuden (tuloksia ei ole esitetty).

Taitto-muutos NF-KB: n reportterigeenimäärityksessä suhteessa ajoneuvon hallinnan on piirretty eri ajankohtina hoidon jälkeen.

keskustelu

Olemme tehneet ensimmäisen of-its-laji, syvällinen kvantitatiivinen haulikko proteomiikka-analyysi ei-invasiivisesti kerätyt suullinen harjalla biopsianäytteissä, etsien tunnistamaan proteiiniin runsaasti muutoksia, jotka liittyvät suun kautta syövän etenemisessä. Harjaa koepaloja ovat hyvin tunnettuja niiden arvoa ei-invasiivisesti kerätään solu näyte suussa syövän diagnostiikkaan sovelluksiin [11], [12]. Kuitenkin MS-pohjainen proteomic tutkimukset hyödyntää näitä mahdollisesti tietoa runsaasti näytteitä ovat olleet vähäisiä. Erityisesti Driemel et al [13] käytetään pinta-avusteinen laser desorptio /ionisaatio (SELDI) MS kvantitatiivisesti profiilin harjalla biopsianäytteissä ja tunnistaa mahdolliset biomarkkerit etenemistä. Remmerbach ym [14] käytetään enemmän vakio MALDI-MS analysoida eristettyjä proteiineja harjan koepaloja samoin. Vaikka nämä tutkimukset oli jonkin verran menestystä, käyttämällä SELDI tai MALDI-menetelmiä on monimutkainen seos on rajoitettu osajoukko suhteellisen pieniä proteiineja ja /tai peptidejä näytteissä kohteisiin.

MS-pohjainen haulikko proteomiikan toisaalta tarjoaa laajennettu näkymä harjalla koepala proteomeja, koska sen kyky tunnistaa ja määrällisesti proteiinien kaikkien molekyylipaino luokat [15]. Tutkimuksemme on ensimmäinen osoitus haulikon proteomiikka soveltaa suullinen harjalla koepalojen. Yksi kysymys alussa oli selvittää, onko solut kerätään harja koepala tarjoaisi runsaasti kokonaisproteiinipitoisuus suuren mittakaavan proteomiikka-analyysi. Olemme havainneet, että on-harja solujen hajoamista menetelmä oli parempi saanto (vähintään kymmeniä mikrogrammaa kokonais-proteiinia) kuin yrittää pestä solut vapaa harjalla ennen lyysiä (tietoja ei esitetty). Meidän tulosten tulisi avata tietä ylimääräisiä haulikko Proteomiikan analyyseihin harja koepaloja luonnehtimiseksi suun vaurioihin eri yhteyksissä.

rinnakkaisia ​​analyysejä verrataan terveen normaalin kudoksen OPML- ja OSCC kudosten sekä verrokeilla, paljasti useita mielenkiintoisia proteiinien joka osoittaa muutoksia runsaasti. Vaikka muut ehdokkaat arvoisia lisävalidointia tunnistettiin, päätimme keskittyä SLPI, jonka taustalla on huomattava ja toistettavissa lasku runsautta sekä OPML ja OSCC kudoksissa verrattuna terveisiin normaalia kudosta. Tutkijat ovat perinteisesti tunnustettu rooli SLPI estämisessä seriiniproteaasien; kuitenkin, tieto sen toiminnot ovat edelleen laajentaa sisältämään mikrobilääkkeiden, immuniteetti ja anti-tulehdus roolit [35]. SLPI rooli suullinen syövän etenemisessä on vähemmän tunnettu, mutta viimeaikaiset tulokset koepalana otetulle kudosleikkeiden osoitti laskua SLPI in OSCC kudoksissa verrattuna terveisiin, sekä mahdollisen roolin estämällä invasiivisuus [26].

tutkimus on paljastanut useita uusia havaintoja SLPI n mahdollista roolia suun syöpä. Yhden, tuloksemme ovat ensimmäinen osoittaa merkittävä lasku SLPI ei-invasiivisesti kerätyt suun harja biopsianäytteissä sekä matkapuhelinverkon osa koko sylkeä. Nämä havainnot ovat yhdenmukaisia ​​viimeaikaiset tulokset osoittavat SLPI runsaasti lasku OSCC kudosleikkeiden kerätään perinteisen leikkausveitsellä koepala [26]. Tärkeää on meidän tutkimus on ensimmäinen tutkittava sekä OPML ja OSCC kudoksiin, mikä osoittaa progressiivinen menetys SLPI pre-pahanlaatuinen tila, jota seuraa dramaattinen lasku OSCC. Tuloksemme viittaavat mahdollinen rooli SLPI ei-invasiivisesti kerätty diagnostisia tai prognostista biomarkkereiden joko OPML tai OSCC kudosten – merkittävä havainto annettava kiireesti yksinkertaisempaa ja halvempaa testit suullinen syöpä, joka kiertää haitat leikkausveitsellä koepala [8] [9].

Tuloksemme osoittavat myös mekanistinen rooli SLPI suun syövän etenemisessä. Viimeaikaiset havainnot käyttämällä

in vitro

soluviljelmässä ovat ehdottaneet, että SLPI estää invasiivisuus suun syöpäsolujen [26]. Laajentaminen Näiden havaintojen tulokset viittaavat siihen, systeeminen lasku SLPI, ainakin suun epiteelisolut potilailla alttiita suusyövän kehitystä. Tätä väitettä tukivat noin 5-kertainen pieneneminen SLPI in Hyväksytty tervettä kudosta verrattuna terveisiin normaaleihin kontrolleihin, joiden yhtäpitäviä laskun sen runsaasti paisutettu solujen koko sylkeä. Määritetään perusteella (esimerkiksi geneettisten, epigeneettiset jne) tätä kokonaislasku vuonna SLPI runsaasti potilaalle kehittyy OSCC vie enemmän tutkimus.

Tuloksemme osoittavat, että SLPI estää NF-KB transkriptionaalista aktiivisuutta in vitro in OPML soluissa edelleen tukee mekanistinen rooli suullinen syövän etenemisessä. Lisääntynyt NF-KB: n transkriptionaalisen aktiivisuuden, aktivoimalla ilmentymisen pro-inflammatoristen sytokiinien, on tunnettu tekijä OSCC kehittämiseen [29], [30], [31]. Väheneminen SLPI runsaus voi, ainakin osittain, olla osasyynä tulehdusreaktioita tila johtaa OSCC. Toiset ovat osoittaneet rooli SLPI estäjänä NF-KB: n aktiivisuuden, mikä osoittaa, että se voi häiritä signalointireitin johtava NF-KB: n aktivaation [36] ja /tai mahdollisesti kilpailevat sitoutumisesta DNA: NF-KB: n säätelykohtia [32 ]. Tutkimuksemme on ensimmäinen näyttää SLPI estäjänä NF-KB: n yhteydessä suusyövän, erityisesti malli OPML solulinjassa. Ymmärtäminen tarkka mekanismi esto vie enemmän tutkimus. Havaintomme avaa kiehtova mahdollisuus SLPI kuin hoitovaihtoehto riskiryhmään OPML vaurioita, sillä tällaiset hoidot tarvitaan kiireellisesti estää kehitystä invasiivisen OSCC. SLPI tarjoaa mahdollisia etuja tällainen sovellus, koska se on pieni proteiini (noin 11 kDa), tiedetään olevan vapaa translaation jälkeiset modifikaatiot, ja osoitettiin olevan siirtyy solujen helposti [32].

meidän havainnot tuottavat useita mielenkiintoisia hypoteesin testaus tulevaisuudessa. Yhden, mahdollisuus SLPI ei-invasiivisesti kerätty diagnostisia tai prognostisia biomarkkereiden voitaisiin testata suuremmissa kohorttia OPML ja OSCC potilaita. Sen tehtävä estäjänä NF-KB: OPML, joilla on mahdollisuuksia ennaltaehkäisevään hoitoon voitaisiin testata ja tutkitaan monin tavoin. Kokeet tutkii luonne esto, kuten suora sitova NF-KB sivustoja, ja vaikutukset geenin ja proteiinin ilmentyminen olisi valaiseva. Testaus typistettyjä versioita SLPI voi myös osoittavat lisääntynyt estäviä vaikutuksia NF-KB: n ansiosta paremmin solun sisäänoton ja /tai DNA: ta sitova. Sitten lopuksi kiinnostava, viimeaikaiset todisteet ehdottaa myös rooli SLPI estämään ihmisen papilloomavirus (HPV) infektio ja sen jälkeen pään ja kaulan alueen syövän kehityksen [37]. Tutkimuksen vaikutuksista SLPI hoidon HPV + syöpäsoluja olisivat kiinnostuneita. Havainnot esitämme täällä tarjota lähtökohdan tällaisten tulevien tutkimusten, mikä voi jähmettyä SLPI niin arvokkaan proteiinin diagnoosissa, ennusteen ja hoidon suun syöpä.

massaspektrometriaa proteomiikka tiedot on talletettu ProteomeXchange Consortium (https://proteomecentral.proteomexchange.org) kautta PRIDE kumppani arkiston [38] kanssa aineisto tunnisteen PXD000807 ja DOI 10,6019 /PXD000807.

tukeminen Information

Kuva S1.

Coommassie värjätään kuvia kokonaisproteiinia kuormitus (A) harjattu suullinen cellsfrom potilaita; (B) paisutettu cellsfrom koko salivafrom potilaita; (C) Ensiöparit linjat, kuten RhEK keratinosyyttejä, MSK suun leukoplakia soluja, ja CA-9-22 suun syöpäsoluja. Nämä membraanit käytettiin western blotting tulokset on esitetty kuviossa 3 tekstiä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0095389.s001

(DOC)

Taulukko S1.

Potilaiden ominaisuudet.

doi: 10,1371 /journal.pone.0095389.s002

(DOC) B Taulukko S2.

Kaikki proteiinit tunnistettu ja määrällisesti proteomic analyyseissä. Tulokset kahden erillisen iTRAQ reagenssi-emäkset proteomiikan analyysit esitetään erilliset taulukot.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0095389.s003

(XLSX) B

Kiitokset

kirjoittajat ovat kiitollisia Center for massaspekrometria yliopistossa Minnesota, erityisesti Leeann Higgins ja Todd Markowski, apua näytteen valmisteluun ja instrumentaali analyysi. Kirjoittajat myöntävät myös Minnesotan Supercomputing instituutin niiden ylläpidosta käytettyjen laitteistojen ja ohjelmistojen tietojen analysointia.