Krooninen sairaus

tiivistelmä

konversio androgeenireseptorin (AR) signaloinnin mekanismina kasvun tukahduttaminen normaalin eturauhasen epiteelisolujen, että kasvun stimulaatio eturauhassyöpäsoluissa liittyy usein AR mutaatio, monistuminen ja yli-ilmentyminen. Siten alas-säätely AR signalointi on yleisesti terapeuttinen eturauhassyöpään. E006AA solulinja perustettiin peräisin hormoni naiivi, paikallinen eturauhassyöpä. E006AA solut ovat geneettisesti aneuploidi ja kasvaa yhtä hyvin ksenosiirrettyjä kumpaankaan ehjä tai kuohittu uros NOG mutta ei nude-hiirissä. Nämä solut näyttely: 1) X-kromosomin päällekkäisyyttä ja

AR

geenimonistuksen, vaikka paradoksaalisesti ei yhdistettynä lisääntyneeseen AR ilme, ja 2) somaattisten, dominanttinegatiivivaikutus Serine-599-glysiini menettämisestä toiminnon mutaatio dimerisaatio pinta DNA: ta sitovan domeenin

AR

geenin. Ei vaikutusta kasvuun E006AA solujen havaitaan kohdistamalla knockdown endogeenisen mutantti AR, ektooppinen ilmentyminen villin tyypin AR, tai hoito androgeenien tai antiandrogeenit. E006AA solut edustavat prototyyppi äskettäin tunnistettu alatyyppi eturauhassyövän solut, jotka ilmentävät vallitsevaa-negatiivinen AR menettämisestä toiminnon hormonaalisesti naiivi potilaalle. Tällainen menettämisestä toiminto eliminoi AR-välitteistä kasvun hidastuminen normaalisti aiheuttama normaalia fysiologista androgeenien, tuottaen siten valikoivaa kasvua etu näille pahanlaatuisten solujen hormonaalisesti aiemmin hoitamattomilla potilailla. Nämä tiedot korostavat, että menetys AR-välitteistä kasvun hidastuminen on itsenäinen prosessi, ja että ilman ylimääräisiä muutoksia, ei riitä hankkia onkogeenin riippuvuus AR signalointi. Siten potilaat eturauhasen syöpäsolujen sataman tällaisille AR menettämisestä toiminto mutaatiot eivät hyödy aggressiivisia hormoni tai anti-AR hoitojen vaikka he ilmaisevat AR proteiinia.

Citation: D’Antonio JM, Vander Griendin DJ Antony L, Ndikuyeze G, Dalrymple SL, Koochekpour S, et ai. (2010) menetys androgeenireseptorin riippuva kasvu Suppression Eturauhassyövän Cells voi tapahtua riippumatta hankkimasta onkogeeninen Addiction androgeenireseptorin Signaling. PLoS ONE 5 (7): e11475. doi: 10,1371 /journal.pone.0011475

Editor: Janine Santos, University of Medicine ja hammaslääketieteen New Jersey, Yhdysvallat

vastaanotettu 23. huhtikuuta 2010 Hyväksytty: 14 Kesäkuu 2010; Julkaistu: 08 heinäkuu 2010

Copyright: © 2010 D’Antonio ym. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: NIH Grant R01DK52645 ja Marylandin Stem Cell Research Fund MSCRF-II-0428 runsaasti tukenut tätä tutkimusta. Donald Vander Griendin tukivat Urology Training Grant (NIH T32DK07552), ja jonka DOD Post-Doctoral Training Award (PC060843). Jason DAntonio tukee Urology Training Grant (NIH T32DK07552-21A1). Dr. Koochekpour tukivat avustusta NIH /NCRR-Center of Biomedical Research Excellence (COBRE; 1P20 RR021970) ja myöntävät R21CA149137. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

viimeisen vuosikymmenen aikana on ollut uutta kiinnostusta androgeenireseptorin (AR) signalointia, koska se liittyy normaaliin eturauhasen funktio, eturauhasen syövän synnyn, ja metastasointiin. Normaalissa eturauhasessa, AR toimintoja voidaan ohjata vastavuoroisesti parakriininen vuorovaikutusta epiteelin ja strooman solut [1]. Androgeenien sitoutumalla AR eturauhasen stroomasoluissa aktivoi transkription Cascade johtaa tuotannon ja erityksen parakriinisiä kasvutekijöitä, jotka tunnetaan andromedins, joka diffundoituvat epiteelin osastoon, sitoutuvat solun pinnan sukulais-reseptoreihin, ja aktivoi signaalipolkuja stimuloida ja selviytyminen epiteelisolujen [1]. Kun läsnä on fysiologisia androgeenivaikutuksen, ja siten andromedins, ligandisitoutuneena AR sijaitsee onteloerityssolut epiteelisolujen estää liikakasvua epiteelin osaston tukahduttamalla solujen proliferaatiota ja edistää solujen erilaistumista [1], [2], [3] [4]. Tämän tärkeys solusta kontekstisidonnaisia ​​AR kasvua heikentävän kykyä dokumentoitu tutkimuksia, jotka osoittavat, että ehdollinen menetys AR ilmaisun epiteelin osastossa, mutta ei stroomasolujen lisäksi lisääntynyt luminal epiteelisolujen lisääntymistä [5], [6]. Kun fysiologinen taso androgen ei säily, kuten seuraavat androgeeniablaatio, taso andromedins laskee tasolle, jossa ne voivat ei stimuloida tai estää apoptoosin aktivaatiosta epiteelisoluissa ja siten eturauhasen taantuu [1].

aikana eturauhasen karsinogeneesin, sekä AR-riippumaton ja AR-riippuvaisia ​​signalointi- mekanismeja, edistää pahanlaatuisiin epiteelisolujen [7]. AR-riippumattoman reitin, AR proteiini ei ilmenny ja siksi AR-säänneltyjen tukahduttaminen pahanlaatuisten solujen kasvua menetetään. Tärkeää on, että kun AR sitten ektooppisesti ilmaistaan ​​kuten AR-riippumattoman eturauhassyövän soluissa, androgeenin aktivoitu AR signalointi estää solujen kasvua [8]. AR-riippuvaisen reitin, AR-toiminto on usein muunnetaan kasvun vaimennin onkogeeniin stimuloi eturauhasen syövän solujen eloonjäämistä ja proliferaatiota [1], [9], [10]. Vaikka joko AR-riippumaton tai -riippuvaisella reitit ovat mahdollisia, suurin osa eturauhasen syöpien hankkia kasvaimia synnyttävän AR signalointi, mikä antaa perustelut miksi androgeeniablaatio on standardi hoito metastasoituneen eturauhassyövän koska se estää proliferaatiota ja aktivoi apoptoosia näissä metastasoituneen syöpäsoluja [ ,,,0],11]. Lisäksi AR signalointi edelleen keskeinen tavoite jopa kastraatiotason vastustuskykyisten metastaattinen eturauhas- syöpien [7]. Tämä perustuu tulokseen tutkimukset osoittavat, että vaikka harvinaista hormonaalisesti aiemmin hoitamattomilla potilailla, AR-geenin mutaatio ja vahvistus, jolloin kohonnut AR proteiinin ilmentyminen, havaitaan useimmissa metastaattisen eturauhassyövän kudokset saatiin potilailta, joilla kastraatiotason kestävä etäpesäkkeitä [12], [13]. Yhdenmukaisesti näiden kliinisten havaintojen, AR-geenin mutaatio, vahvistusta ja proteiinin yliekspressio havaitaan yleisesti useimmissa eturauhassyövän johdetut solulinjat kastraatiotason kestävästä isäntien [14], [15]. Nämä kastraattitaso kestävä eturauhassyövän solulinjoissa ei apoptoosiin, kun androgeenien loppuun tai androgeenien antagonisteja käytetään; kuitenkin, he lopettavat lisääntyvien ja aktivoi solukuoleman jos AR proteiinin taso alenee alle kriittisen tason sekä

in vitro

[14], [16], [17] ja

in vivo

[ ,,,0],18]. Nämä havainnot ovat yhdenmukaisia ​​käsitteen ”onkogeenin riippuvuus” [19] AR proteiinin ilmentymistä ja toimintaa, ja dokumentti että tällaiset kastraatiotason kestävä syöpäsolujen edelleen riippuvaisia ​​AR signalointi niiden pahanlaatuinen kasvain [1], [9].

läsnäolo AR ilmaisun, somaattiset AR mutaatioiden tai vahvistusta ei välttämättä tarkoita kuitenkaan että eturauhasen syöpäsolun on riippuvainen AR signalointi. Tämä lausunto perustuu tässä tutkimuksessa, joka dokumentoi ylimääräinen alatyypin ihmisen eturauhasen syöpäsolujen. Tässä alatyyppi, AR on tehty hallitseva-negatiivinen, keskeytys- toiminto mutaation vaikka AR geneettisesti monistetaan ilman, että potilas koskaan vastaanottaa androgeeniablaatio hoitoa. Tällaisen määräävän-negatiivinen menetys AR funktion pahanlaatuisten solujen tuottaa selektiivisen kasvuedun poistamalla normaalia androgeeniriippuvaisen AR signaloinnin aiheuttama kasvun hidastuminen; kuitenkin, vaikka se onkin välttämätöntä, se ei riitä näiden pahanlaatuisten solujen hankkiminen onkogeenisessä riippuvuus AR-signalointi.

Methods

Ethics lausunto

Kaikki eläinkokeet suoritettiin mukaan eläinten protokolla MO09M434 hyväksymä Johns Hopkins Animal Care ja Käytä komitean nimenomaan tätä tutkimusta.

Solut ja materiaalit

E006AA [20], S006AA [20], LNCaP ja PC-3 (saatu ATCC, Manassas, VA), ja LNCaP C4-2B (saatu UroCor, Oklahoma City, OK) soluja pidettiin RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA), ja LAPC-4-soluja IMDM: ssä (Invitrogen) plus 1 nM R1881 , jotka molemmat sisältävät 10% FBS: ää (Hyclone, Logan, UT), 1 x Pen /Strep, ja L-glutamiinia. CWR22 -ksenografti kasvain kudos oli ystävällinen lahjoitus Thomas Pretlow (Case Western Reserve University, Cleveland, OH). Hiili /dekstraani FBS (csFBS) saatiin Hyclone ja käyttää täydentämään fenolipunaista RPMI (Invitrogen) ja lusiferaasi ja kromatiinin immunosaostusmäärityksissä. Synteettinen androgeeni R1881 hankittiin Perkin-Elmer (Boston, MA). PSA-analyysi toteutti JHMI kliinisen kemian laboratoriossa. Solukasvu mitattiin 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT) (CellTiter Non-Radioactive Cell Proliferation Assay Promega Corp. (Madison, WI)). Lyhyesti, solut maljattiin 96-kuoppainen formaatti ja annettiin kiinnittyä yön yli. Soluja käsiteltiin apuainetta tai lääkettä. Tietyissä päivää, 15 ui MTT-väriaine-reagenssia lisättiin kuhunkin kuoppaan, levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa 4 tunnin ajan, 100 ui Stop-reagenssia lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja levyt luetaan Molecular Devices SpectraMAX plus levynlukijalla 570 ja 650 nm. Absorbanssilukemia piirrettiin sitten standardikäyrää vastaan ​​määrittää solujen lukumäärän. Tulokset on esitetty päivästä 4. klonogeeninen eloonjäänti määritettiin seuraavasti: 500-solut (vanhempien E006AA, E006AA LV-non-hiljentäminen-shRNA, ja E006AA LV-AR-shRNA) maljattiin kuoppaa kohti 6-kuoppaisille levyille, annettiin kiinnittyä ja asuttaa kuusi päivää, sitten samanaikaisesti kiinteitä ja värjättiin 0,5% kristallivioletilla /25% metanolia liuoksen ja pesäkkeet laskettiin manuaalisesti.

Karyotyyppi Analyysit ja fluoresenssi in situ -hybridisaatio

sytogeneettinen analyysi oli suoritettiin käyttäen standardimenetelmiä. Kromosomipoikkeavuuksien kuvattiin mukaan iSCN ohjeiden [21]. FISH suoritettiin solulinjoissa ja normaalin miehen ohjaus käyttämällä koettimia hankittiin Vysis (Abbott Molecular), joka on spesifinen AR Gene (Xq12) ja X-sentromeerin. Hybridisaatio tehtiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kutakin solulinjaa, 100 interphase tumat teki maalin ja suhde punaista (AR) vihreäksi (Xcen) signaalit laskettiin. Kaikkiaan 9-20 metafaasien analysoitiin myös. Kuvat otettiin käyttäen tavallista epifluoresenssimikroskooppia ja FISH View ohjelmisto (Applied Spectral Imaging).

In vivo

Kasvaimen Analyysit

In vivo

kasvun määritykset suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [22], [23]. Ihonalaista injektiota, miljoona E006AA solua 200 ul: ssa 80% Matrigel (BD Biosciences, laimennettiin kylmällä HBSS) injektoitiin kyljet mies Nude tai NOG-SCID-hiirissä. Sillä CWR22 ksenografti rokotukset, 20 mg kudosta ruiskutettiin hiirtä kohden. Kirurgisen kastraation tehtiin kuten aiemmin on kuvattu [22], [23]. Kulkua kasvainkudoksen suoritettiin pilkkominen kasvainkudosta, joka kulkee sen läpi steriilin kudoksen siivilä, pesemällä PBS: llä ja uudelleen injektoimalla 50 mg kasvaimen 200 ui: aan 80% Matrigel.

Immunohistologiset Detection

immuunivärjäytyminen AR (N-20; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), PSA (Dako Cytomation, Carpinteria, CA), ΔNp63 (LabVison /Neomarkers, Freemont, CA), Nkx3.1 (UMBC) ja CK5 (Babco, Richmond CA) tehtiin ksenografti aikaisemmin selostetulla tavalla [24], seuraavin muutoksin: Kudosleikkeet deparrafinized, vedettömät ja lyhyesti tasapainotettu vedellä. AR ja Nkx3.1 immunohistokemia, antigeeni paljastumista suoritettiin keittämällä liukuu 1 mmol /l EDTA: a (pH 8,0) 15 minuutin ajan. For p63 värjäys, diat höyrytettiin 20 min Antigeeni paljastamaan Solution (Vector Laboratories, Burlingame CA) 20 minuutin ajan. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus pysäytettiin inkuboimalla peroksidaasin lohko 5 min huoneen lämpötilassa. AR ja Nkx3.1 värjäys, epäspesifinen sitoutuminen estettiin inkuboimalla 1% naudan seerumin albumiinia Tris-HCI, pH 7,5 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Laseja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla, kuten kanin polyklonaalista AR-vasta-ainetta (1:25 laimennus), 45 minuutin ajan huoneenlämpötilassa; hiiren monoklonaalista PSA-vasta-aine (1:50 laimennos) 45 minuuttia huoneen lämpötilassa; hiiren monoklonaalista p63-vasta-ainetta (1:50 laimennos) 45 minuutin ajan huoneenlämpötilassa; kanin polyklonaalinen Nkx3.1 vasta-ainetta (1:1000 laimennos) 45 minuutin ajan huoneenlämpötilassa; ja kanin polyklonaalista CK5 vasta-ainetta (1:2500 laimennos) 45 min ajan huoneenlämpötilassa. Jälkeen primaarisessa vasta-aineessa sovellus, laseja inkuboitiin poly-HRP konjugoidun sekundaarisen (EnVision (AR, p63) tai PowerVision (PSA, Nkx3.1, CK5)) on 1:3000 laimennoksella 30 min ajan huoneenlämpötilassa. Signaalin havaitseminen suoritettiin käyttäen 3,3′-diaminobentsidiinitetrahydrokloridilla (DAB), koska kromogeenina 20 min. Objektilasit vastavärjättiin hematoksyliinillä, kuivattu, ja asennettu.

Lentivirusvektorikonstruktit Infektio

Stable ihmisen villityypin AR cDNA ilmaisun ja FACS-lajittelu GFP-positiiviset solut tehtiin kuten aiemmin on kuvattu [8], [25]. Stabiili mutantti LV-AR S599G luotiin ensin PCR-monistus E006AA cDNA, joka sisälsi S599G mutaation. Sekä PCR-fragmentin ja villityypin lenti-virus AR plasmidi restriktiodigestoitiin Eco81I ja Tth111I. Mädätetyn PCR-tuote ja LV-AR plasmidi eristettiin, puhdistettu, ligoitiin käyttäen nopeaa T4-ligaasia Kit (Fermentas), ja sekvensoitiin vahvistamaan S599G paikoilleen. Short-hiusneula knockdovvn AR suoritettiin käyttäen MISSION

TM lentiviraalinen shRNA transduktiopartikkeleilla kohdistaminen joko AR yksin tai ei-äänenvaimennusjärjestelmiä shRNA ohjaus (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). 1 x 10

4 E006AA tai LNCaP-soluja maljattiin kuoppaa kohti, ja annettiin tarttua 4 tai 24 tuntia, vastaavasti. Solut transdusoitiin MOI 2 (2 x 10

4 hiukkasia /kuoppa) ilman polybreenin. Antibiootti valinta [1,5 ug /ml puromysiiniä (Sigma)] aloitettiin 48 tuntia myöhemmin.

AR Sequencing

RNA otettiin talteen käyttäen Qiagen miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) ja kontaminoivat DNA poistettiin käyttäen Ambion DNA-sarjaa (Ambion, Austin, TX). Superscript käänteistranskriptaasia III (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja 1 ug kokonais-RNA: ta käytetään tuottamaan cDNA, jossa Oligo-dT-alukkeita. Genomi-DNA uutettiin käyttäen Qiagen DNA Mini Kit ja inkuboitiin RNaasi (Roche, Mannheim, Saksa) 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan kontaminoivien RNA. PCR-monistus cDNA, ja genominen DNA suoritettiin käyttäen Platinum

Pfx

DNA-polymeraasia (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden kanssa seuraavien päällekkäisten alukesarjat: (1) 5′-AGAGAGGTAACTCCCTTTGGCT-3 ’ja 5’-ACGCTCTGGAACAGATTCTGG -3 ’(740bp), (2) 5′-TCCCGCAAGTTTCCTTCTCT-3′ ja 5’-GATACTGCTTCCTGCTGCTGTT-3 ’(756bp), (3) 5′-TGAGGAACAGCAACCTTCACAG-3′ ja 5’-ACAGGGTAGACGGCAGTTCAA-3 ’(704bp) (4) 5’-GCCGAATGCAAAGGTTCTCT-3 ’ja 5′-TTGACACAAGTGGGACTGGGA-3′ (700bp), (5) 5’-CAGTTGTATGGACCGTGTGGT-3 ’ja 5′-CTACACCTGGCTCAATGGCT-3’ (723bp), (6) 5 ’ -CGGAAGCTGAAGAAACTTGG-3 ’ja 5′-AGAAGCGTCTTGAGCAGGAT-3′ (685bp), (7) 5’-ATTCCAGTGGATGGGCTGAA-3 ’ja 5′-TAGCTCTCTAAACTTCCCGTGG-3′ (714bp), (8) 5’-CTTCCCATTGTGGCTCCTAT-3 ’ja 5’-ACCTTCTCGTCACTATTGGC-3 ’(361bp); ja genomisen DNA: n monistaminen: n eksonin 3 AR-geenin (9) 5’-TGTTTGGTGCCATACTCTGTCCAC-3 ’ja 5′-GCATCCTCACTCACCTTCTGTTGG-3’ (530bp). PCR-tuotteet olivat sarakkeessa puhdistettiin käyttämällä Qiagen QIAquick (Qiagen) ja sekvensoitiin Johns Hopkins University DNA-analyysi Facility käyttäen sekä eteen- että taaksepäin-alukkeita.

Western blot -analyysi

kokosolulysaateille valmistettu kohti solun perusteella lyysipuskuriin (20 mM Tris-HCI, pH 7,8, 140 nM NaCl: a, 1 mM EDTA, 0,5% natriumdeoksikolaatti, 0,5% Nonidet P-40), johon on PhosSTOP fosfataasinestäjällä tabletin ja proteaasi-inhibiittorin tabletti (Roche ), ja 1 mM ditiotreitolia. Kokosolulysaateille altistettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin PVDF-membraaneille. Membraanit blokattiin 5% maitoa (TBS + 0,1% Tween-20) 1 tunnin ajan. Kani polyklonaalinen AR-aineella (SC-816), ja hiiren monoklonaalinen CK8 (SC-53266) ja hiiren monoklonaalinen CK18 (SC-32722) vasta-aineet hankittiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), ja hiiren monoklonaalinen ß-Actin vasta-aine hankittiin Sigma (A5441), ja niitä käytetään yhdessä anti-kani-HRP-vasta-ainetta (7074, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), tai anti-hiiri-HRP: tä (NA931V, GE Healthcare, UK).

Nuclear ja sytoplasman solufraktioista valmistettiin käyttäen Nuclear Complex Co-IP kit (Active motiivi, Carlsbad, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, solut pestiin, ja sen jälkeen kaavittiin kylmässä PBS: ssä, jota oli täydennetty fosfataasi-inhibiittorit. Solupelletit suspendoitiin uudelleen ja hajotettiin 1 × hypotonista liuosta sekä pesuainetta, sentrifugoitiin 6000 x g: ssä 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja sytoplasminen jakeet poistettiin. Nuclear pelletit suspendoitiin digestointipuskuriin plus entsymaattisen leikkaus cocktail ja inkuboitiin 4 ° C: ssa 90 min. 0,5 M EDTA lisättiin lopettaa entsymaattisten leikkaus reaktioita ja ydinvoiman lysaatit sentrifugoitiin 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Kaikki fraktiot yhdistettiin yhtä suuren tilavuuden kanssa 2 x SDS-näytepuskuriin ja denaturoidaan 95 ° C: ssa 5 min. Näytteet eroteltiin 4-15% PAGE ja blotattiin joko anti-AR (N-20, Santa Cruz), sytoplasman merkki vinkuliini (Sigma), tai ydin- merkki HDAC (Santa Cruz Biotechnologies).

mittaaminen AR transkriptioaktiviteettia

Solut (per kuoppa) valkoisena polystyreeniä, kirkas pohja, steriili 96-kuoppaisille kudosviljelylevyille vastaavasti: LNCaP C4-2B (9000); PC-3 (7000); E006AA, E006AA LV-AR, E006AA LV-non-hiljentäminen-shRNA, E006AA LV-AR-shRNA (5000). Solut, kanssa tai ilman androgeenien (1,0 nM R1881) maljattiin kuudelle rinnakkaisnäytteelle RPMI (Invitrogen), jota oli täydennetty 10%: csFBS (Hyclone), mutta ilman fenolipunaista tai pen /strep, ja annettiin kiinnittyä yön yli. Solut transfektoitiin käyttämällä Fugene 6 (Roche), 50 ng probasiini-PSA-tulikärpäsen ja 5 ng PRL-TK-renilla (Promega, Madison, WI) lusiferaasireporttiterilla rakentaa kuoppaa kohti suhteessa 03:01 (ui Fugene: ug kokonais- DNA: ta) seerumittomassa alustassa [26]. Päivänä kolme, kuusi hoito kuopat stimuloitiin androgeenin ja kuusi kontrollikuoppiin laitettiin 0,1% ajoneuvoon. Päivänä 4, media oli huolellisesti pois ja solut prosessoitiin Dual Luciferase Assay Kit ohjeet (Promega # E1910). Lyhyesti, 30 ui passiivisen lyysipuskuria lisättiin jokaiseen kuoppaan ja levyä ravisteltiin ravistelijassa 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Firefly ja Renillaa entsymaattinen aktiivisuus mitattiin käyttäen Wallac Jet 1450 Microbeta levy suutin. Kolmen transfektoiduissa LNCaP-C4-2B solujen sai 50 ng probasiini-PSA-tulikärpäsen, 5 ng PRL-TK-renilla, ja 50 ng LV-AR-S599G rakentaa kuoppaa kohti suhteessa 03:01 (ui Fugene: ug kokonais-DNA) seerumittomassa media.

kromatiini immunosaostus

LNCaP C4-2B ja E006AA soluja kasvatettiin fenolipunaista RPMI, täydennetty 10%: csFBS, kerättiin trypsinoi- ja kromatiinin mukaan valmistettua MagnaChipille pakki Upstate, Temecula, CA. ~ 1 x 10

7 solut suspendoitiin uudelleen 10 ml: sta elatusainetta, määritetään lisäämällä 275 ui 37%: ista formaldehydiä ja ravisteltiin varovasti 22 ° C: ssa 12 min. Silloittumisen jälkeen, 1 ml glysiiniä, lisättiin ja soluja ravisteltiin varovasti 5 minuutin ajan 22 ° C: ssa, pestiin kahdesti kylmällä PBS: llä, suspendoitiin uudelleen 500 ul: aan solujen hajotuspuskuria plus 2,5 ui proteaasi-inhibiittoreita (5 mM PIPES, pH 8, 85 mM KCI, 0,5% NP-40), ja sentrifugoitiin 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Solupelletit suspendoitiin uudelleen 500 ul: aan solujen hajotuspuskuria plus 2,5 ui proteaasi-inhibiittorit, inkuboitiin 15 min jäillä lyhyt vortex 5 minuutin välein, ja sentrifugoitiin 800 x g: ssä 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Tumapelletit suspensoitiin uudelleen ydin- lyysipuskuria 2,5 ui proteaasi-inhibiittoreita (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCI, pH 8,1). Kromatiinin sonikoitiin keskimäärin DNA pituus 500-1200 emäsparia käyttäen Fisher Scientific Sonic Dismembrator Malli 100 (4 x 15 sekunnin pulsseja asetus 3). Viisi ui säästettiin ohjaustulo ja 50 ui alikvootit laimennettiin 450 ul: laimennuspuskuriin (0,01% SDS, 1,1% Triton, 1,2 mM EDTA, 16,7 mM Tris-HCI, pH 8,1, 167 mM NaCl). Neljä ug vasta-ainetta lisättiin vastaaviin putkiin: 4 ui 1 mg /ml kanin IgG- tai 40 ui 100 ug /ml kanin anti-AR (SC-816, Santa Cruz), ja sitä pyöritetään O /N 4 ° C: ssa. Immuuni- komplekseja sentrifugoitiin 10 minuutin ajan 10000 x g 4 ° C: ssa pelletoimiseksi kaikki aggregaatit, tai ei-spesifinen komplekseja. Supernatantti (Haluttu immuunikompleksien) kerättiin ja yhdistettiin 20 ui proteiini A Dynabeads (Invitrogen, CA) ja sekoitettiin varovasti 2 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Putket laitettiin Millipore magneettinen telineeseen ja immuunikompleksien pestiin peräkkäin 1 kerran alhainen puskuria (0,1% SDS, 1% Triton, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCI, pH 8,1, 150 mM NaCl), korkean suolapitoisuuden puskurilla (0,1 % SDS, 1% Triton, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCI, pH 8,1, 500 mM NaCl), LiCI: n puskuri, ja TE, 3 min sekoittaen kunkin pesuvaihe. Kääntää siltoja, helmet suspendoitiin uudelleen 100 ul: aan Chelex ja keitettiin 10 minuuttia 95 ° C: ssa, sentrifugoitiin 1 min 12000 x g 4 ° C: ssa, ja supernatantit kerättiin. Helmet suspendoitiin uudelleen 120 ui vedessä, sentrifugoitiin uudelleen, ja supernatantit yhdistettiin aikaisempien supernatanttia. Kaapattu DNA puhdistettiin Qiagen PCR-puhdistuskittiä (# 28104) valmistajan ohjeiden ja analysoitiin PCR: llä ja q-PCR: llä.

PCR analyysi immunosaostettiin DNA

käyttäminen 5 Prime HotMasterMix ( Eppendorf), PCR-reaktiot suoritettiin seuraavalla tavalla: 94 ° C 2 min, sitten 32 sykliä 30 sekunnin denaturaatio 94 ° C: ssa, 30 s hehkutus (kuten jäljempänä esitetään kunkin alukeparia) ja 30 sekuntia ja pidentyminen 65 ° C, sitten 2 min loppupidennys 65 ° C: ssa. PCR-tuotteet erotettiin 2% agaroosigeeleillä ja värjättiin etidiumbromidilla. Amplifikaatioalukkeet DNA-fragmenttien ovat seuraavat: PSA-promoottorin ARE (52 ° C) fwd 5′-GCCAAGACATCTATTTCAGGAGC-3 ’, rev 5′-CCCACACCCAGAGCTGTGGAAGG-3′; KLK2-promoottorin (52 ° C) FWD 5’-CTCCAGACTGATCTAGTATG-3 ’, rev 5′-TTGGCACCTAGATGCTGACC-3’; SP1 päällä P45

Skp2 promoottorin (53 ° C) fwd 5′-GATCCACGCTCAGAGACGAC-3 ’, rev 5′-TTCGAGATACCCACAACCCC-3′; TCF4 sitova elementti c-Myc-promoottorin (55 ° C) fwd 5’-GCTCTCCACTTGCCCCTTTTA-3 ’, rev 5′-GTTCCCAATTTCTCAGCC-3’.

Kvantitatiivinen PCR-analyysi Immunopresipitoidun DNA

käyttäminen BioRad IQ SYBER Green Supermix (Hercules, CA), PCR-reaktiot suoritettiin BioRad ICycler seuraavasti: 95 ° C 3 min, sitten 40 sykliä 30 s denaturaatio 95 ° C: ssa, 30 s ja pariutuminen 55 ° C: ssa, ja 45 sekuntia ja pidentyminen 72 ° C: ssa (kerättiin aikana laajennus), jota seurasi 110cycle sulamislämpötilat 45-100 ° C: ssa sen varmistamiseksi, alukkeen tehokkuutta. Aikaisemmin on suunniteltu alukkeita kvantitatiivinen monistamiseksi DNA-fragmenttien, jotka sisältävät oletetun ovat PSA-geenin promoottorin ja ARE III PSA tehostaja-alue ovat: ARE fwd 5’CCTAGATGAAGTCTCCATGAGCTACA-3 ’, rev 5′-GGGAGGGAGAGCTAGCACTTG-3′; ARE III FWD 5’-TGGGACAACTTGCAAACCTG-3 ’, rev 5′-CCAGAGTAGGTCTGTTTTCAATCCA-3’ [27]. Prosenttia tulo laskelmat tehtiin seuraavasti:% input = 2 (Ct

AR Chip – Ct

input) x100. Studentin t-testiä käytettiin määrittämään p-arvo.

Tulokset

E006AA Solut ovat tuumorigeenisiä Ehjä ja kastroitu NOG-SCID-hiiret

Koochekpour et al. raportoitu perustamalla uuden ihmisen eturauhassyövän solulinjaa, E006AA, joka oli peräisin Gleason 6 lokalisoitu eturauhassyöpää hormoni-naiivi eturauhassyöpä potilas on Afrikkalainen Amerikan laskeutuminen [20]. Yhteensopiva normaalin eturauhasen stroomasolut, kutsutaan S006AA, olivat myös viljeltiin samasta eturauhasen näytteestä [20]. Epiteelin alkuperä E006AA solujen vahvistettiin positiivinen lauseke sytokeratiineja 8 (CK8) ja 18 (CK18), kun taas strooman alkuperä S006AA solujen tukee myönteinen ilmaus mesenkymaalisten merkkiaineiden desmiinille ja alfa-sileän lihaksen aktiini ja Koska CK8 ja CK18 [20]. Alkuperäisessä tutkimuksessa, E006AA solut eivät olleet tuumorigeenisiä kun ksenosiirrettyjä osaksi koskemattomana nude-hiirten [20]. Koska nude-hiirillä on poikkeuksellisen runsaasti aktivoitua (NK) T-soluja, mikä johtaa lisääntyneeseen isäntä Immuunireaktiivisuuden kohti kasvava kasvain [28], tämä herätti kysymyksen siitä, onko E006AA solut ikuistettu mutta vain osittain muunnettu tai ovatko ne täysin pahanlaatuisia mutta herkkiä NK-solujen tappaminen. Voit ratkaista tämän ongelman, E006AA solu ihonalainen rokotukset molempiin ehjänä nude ja NOG /SCID /γ

c

null triple hiirillä [eli NOG-SCID puutteellinen NK, B, ja T-solujen] olivat vireille [29]. Ymppäyksen E006AA-soluja nude-hiiriin (n = 15), osoittivat, että E006AA solut muodostavat palpoitavissa kasvaimia, saavuttaa ~100-200 mm

3 kuudella viikon 100% hiiristä. Kuuden viikon kuluttua kuitenkin, kaikki E006AA kasvaimia ehjä nude-hiirissä, lakkasivat kasvamasta, ja taantunut yli sekunnin ajan 5-10 viikkoa (kuvio 1A). Toisin kuin tilanne nude-hiirissä, E006AA kasvaimet kasvoivat kiihtyvällä vauhdilla in NOG-SCID-hiirissä ja ei taantumista (kuvio 1A). Mielenkiintoista on, että vaikka tuumorigeeninen, ei seerumin PSA voitu havaita E006AA kasvaimen kantavien hiirten (n = 10).

(A) Siirrostus E006AA soluja nude-hiirissä verrattuna uros NOG-SCID-hiirissä. (B) siirto kasvainkudoksen peräisin vakiintunut E006AA ksenografti kasvaimen uros NOG-SCID hiiren ehjä uros Nude ja NOG-SCID-hiirissä. (C) kasvu E006AA ja CWR22 ihmisen eturauhassyövän ksenograftikasvaimina kastroitu vs. ehjä uroshiirillä kahdeksaksi viikoksi. (D) Histologinen analyysi (H & E) ja immunovärjäyksen E006AA ksenograftikudoksesta osiot AR, PSA, p63, ja CK5 (kuvat otettu 20 × ja 40 ×). (E) Western blot-analyysi CK8 ja CK18 ilmaisun LNCaP, PC-3, E006AA ja S006AA soluja. ß-Actin toimi latauskontrollina.

varmistamiseksi edelleen, että havaittu spontaani regressio E006AA ksenograftikasvaimina nude isännät, mutta ei NOG-SCID-hiirissä, johtuu immuunitunnistusta ja hävittämistä NK solut, poistimme vakiintunut ja kasvava E006AA kasvain peräisin NOG-SCID isäntä ja siirretty kudos tästä kasvain takaisin joko koskemattomia uros- NOG-SCID (n = 5) tai nude-hiiriin (n = 5). Samanlaisia ​​aiemmat havainnot, istutetut E006AA kasvaimet koki viivästynyt regressio koskemattomassa nude-hiirten muodostaen samalla kasvaa jatkuvasti kasvaimia NOG-SCID isännät (kuvio 1 B). Nämä yhdistetyt tulokset asiakirja, E006AA solut ovat todellakin tuumorigeenisia mutta alttiita NK-solujen tappaminen.

Kun osoitti tuumorigeenisyyden E006AA soluja, me seuraavaksi arvioineet androgen reagointikykyä,

in vivo

, siirrostamalla näiden solut sekä ehjänä (n = 10) ja kastroitiin (n = 8) uros NOG-SCID hosts. Kasvaimet kehittyi yhtä hyvin sekä isännät ja ei ollut eroa kasvuvauhti tai kasvaimen tilavuuden kastroitu vs. ehjä NOG-SCID eläimillä (kuvio 1 C). Varmistaa kastraattimäärät kiertävän androgeenien, kasvua androgeenin reagoiva CWR22 ihmisen eturauhassyövän ksenograftin kastroiduilla (n = 5) vs. ehjä (n = 5) uroshiirillä analysoitiin myös. Toisin kuin ehjä hiirillä, kasvu CWR22 ksenograftikasvaimina kastroitu isännät oli syvästi estetty (kuvio 1 C). Nämä tulokset asiakirja, E006AA soluilla kastraatiotason kestävä kasvu,

in vivo,

vaikka ne alunperin perustetaan hormonaalisesti naiivi ensisijainen eturauhassyöpää. Luonnehtia fenotyyppi näiden E006AA solujen, NOG-SCID ksenograftikasvaimissa poistettiin ja käsiteltiin histologista ja immunohistokemiallista analysointia varten. Kuvio 1D havainnollistaa, että E006AA solut ovat paikallisesti invasiivisia, tunkeutuva luustolihasten kuituja paikallisella inokulaatiopaikalla kanssa hyökkääviä solujen näytteille tunnusmerkki piirteitä laajentuneessa ja polymorfisten syöpäsolun ytimiä, joissa AR proteiinin ilmentyminen on havaittavissa. Kanssa edellisen seerumin analyysiin, E006AA ksenografti solut eivät tahraa positiivinen PSA (kuvio 1 D), tai AR-säädellään Nkx 3,1 proteiineja (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi syöpäsolut puuttui ilmentymisen tyvisolusyöpä markkeri, p63, mutta oli positiivisia epiteelisolujen markkereita sytokeratiini 5 (CK5) (kuvio 1D), CK8 ja CK18 (kuvio 1 E), joka edelleen varmistaa epiteelin alkuperä E006AA solujen [30], [31], [32].

poissulkemiseksi vaihtoehtoinen selitys sille, miksi E006AA solut osoitettu olevan kasvaimia synnyttäviä tässä tutkimuksessa, mutta ei aiheuttanut tuumoreita alkuperäisessä tutkimuksessa E006AA solut rutiininomaisesti ylläpidetään

in vitro

ei karyotyypitetty suoraan soluviljelmästä (kuvio 2A) ja havaittiin olevan samanlainen, epänormaali karyotyyppi alunperin raportoitu E006AA solulinjan [20]. Tällaiset solut inokuloitiin NOG-SCID isännät ja jatkuvasti kasvava kasvain sittemmin korjattu palauttaa

in vitro

E006AA kulttuureissa. Karyotyyppi analyysi näistä kasvain- E006AA solujen dokumentoitu sama epänormaali karyotyyppi, kuten nähdään

in vitro

-maintained solulinja (kuvio 2B), joka poistaa mahdollisuus, että E006AA solut tuli geneettisesti epästabiili sen jälkeen, kun inokulointi NOG- SCID-hiiriin ja kehitetään uusia sytogeneettinen muutoksia, jotka ovat suorittaneet pahanlaatuisiksi osaksi kasvaimia variantti.

(A) Karyotyyppi analyysi E006AA solujen ennen injektiota ja

in vivo

kasvaimen kasvua. (B) analyysi E006AA solujen peräisin NOG-SCID kasvain hiiri, dokumentointi mitään merkittävää karyotyyppitutkiraus muutoksia kasvaimen kasvun aikana.

Amplification, mutaatio, ja Expression AR nipistämässä hylkivät E006AA Cells

Fluoresenssi

in situ

Hybridization (FISH) suoritettiin koettimien spesifisiä

AR

geeni [Xq12] (punainen signaali) ja X centromere (vihreä signaali) ( Kuva 3A). Interphase analyysi osoitti, että 91% soluista tutkittiin, oli kaksi punaista signaalia, joka liittyy kuhunkin vihreä signaali. Koska on päällekkäistä X-kromosomi, tämä tarkoittaa, että keskimäärin

AR

geeni monistetaan ainakin nelinkertaiseksi vuonna E006AA solulinjassa.

(A) Sytogeneettiset analyysi AR tila normaalissa miehen ohjaus ja E006AA solujen määritettynä in situ fluoresenssihybridisaatiolla (FISH) käyttäen koettimia spesifisiä AR Gene (Xq12, punaisia) ja X centromere (vihreä värillinen). (B) sekven- päällekkäin alukkeen PCR-monistus E006AA mRNA ja cDNA tunnistettiin missensemutaatio (Ser599Gly), joka vastaa ”X” kanta säilytetty AXRND motiivi DBD D-box (kuten merkitty mustalla nuolenpäällä asemassa