Krooninen sairaus

tiivistelmä

MikroRNA (Mirs) ovat pieniä, endogeeninen, ei-koodaavat RNA: t, jotka säätelevät vakautta ja /tai kääntäminen täydentävien mRNA tavoitteita. Mirs ovat nousseet paitsi kriittinen modulaattoreina normaali fysiologinen prosesseja, mutta niiden vapauttaminen voi vaikuttaa merkittävästi eturauhasen ja muita syöpiä. Ekspression miR-23b ja miR-27b, joka on koodattu samalla miR klusterin (miR-23b /-27b), on vaimentua metastaaseja, kastraatio-resistenttejä kasvaimia verrattuna ensisijaisen eturauhassyövän ja hyvänlaatuisen kudoksen; kuitenkin, niiden mahdollinen rooli eturauhassyövän etenemiseen ei tunneta. Huomasimme, että ektooppinen ilmentyminen miR-23b /-27b kahdessa itsenäisessä kastraatio kestävä eturauhassyövän solulinjoissa johti tukahduttaminen hyökkäyksen ja muuttoliike, sekä vähennetään eloonjäämisen pehmeässä agarissa (mitta anoikis). Kuitenkin, ei ollut vaikutusta miR-23b /-27b soluproliferaatioon viittaa siihen, että nämä MIRS toimivat etäpesäkkeiden (mutta ei kasvua) vaimentimia eturauhassyövässä. Kääntäen, esto miR-23b /-27b vähemmän aggressiivinen androgeeniriippuvaisen LNCaP eturauhassyöpäsolulinja johti tehostetun hyökkäyksen ja muuttoliike myös vaikuttamatta lisääntymistä. Mekanistisesti, huomasimme, että käyttöönotto miR-23b /-27b metastaattisessa, kastraatio kestävä eturauhassyövän solulinjoissa johti merkittävään vaimennus Rac1 toiminnan vaikuttamatta koko Rac1 tasoa ja aiheutti kohonneeseen tuumorisuppressorigeenin E-kadheriinin. Esto nämä Mirs oli päinvastainen vaikutus androgeeniriippuvaisissa LNCaP. Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-23b /-27b ovat etäpesäkkeitä vaimentimet, jota voisi käyttää uusien biomarkkereiden ja terapeuttisia aineita kastraatio-resistenttejä.

Citation: Ishteiwy RA, Ward TM, Dykxhoorn DM, Burnstein KL (2012) microRNA -23b /-27b Cluster estää Metastasoitunut fenotyyppi kastraatio hylkivät syöpäsolujen. PLoS ONE 7 (12): e52106. doi: 10,1371 /journal.pone.0052106

Editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 31 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 09 marraskuu 2012; Julkaistu: 26 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Ishteiwy et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health Grant CA132200 (jotta KLB) ja DOD Pre-tohtorikoulutuksessa apurahan w81xwh-11-1-0314 (RAI). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Jo yli puolen vuosisadan androgeenideprivaatio on tavallinen hoito kehittynyt ja metastaattisen eturauhassyövän, koska kasvaimet ovat aluksi riippuvaisia ​​androgeenien selviytymisen ja kasvun. Valitettavasti useimmilla potilailla, kasvaimet lopulta edetä parantumaton, kastraatio kestävä ja metastasoitunut muodossa. Näin ollen tehokas uusien hoitomuotojen ja tarkka prognostiset indikaattoreita parantamiseksi tarvitaan kliinistä hoitoa miesten eturauhassyövän.

etäpesäke, tunnusmerkki maligniteetti, on kasvainsolujen vaeltamista kautta verenkiertoon tai imusolmukkeiden järjestelmän alkuperäisestä kasvaimesta sivuston kaukaisiin elimiin. Metastaattinen kehitys etenee monivaiheinen prosessi, joka sisältää paikallisia invaasio, kulkeutumista verenkiertoon (intravasation), selviytyminen liikkeessä, irtautuminen verisuonet (ekstravasaatio), aloitus ja ylläpito micrometastases kaukaisiin sivustoja ja lopuksi, verisuonten muodostumista uuden kasvaimia [ ,,,0],1]. Jotta edetä alas tämän metastaattisen kaskadin, primäärikasvain solut kerääntyä geneettisiä ja epigeneettiset muutokset, mukaan lukien vapauttaminen miRNA ekspressiokuvioiden. Valaisemaan mekanismeja, joilla helpotetaan syöpäsolujen muuttoliikettä ja invaasio on tärkeä tavoite syöpätutkimuksessa, koska etäpesäkkeitä jää syynä 90% kuolemista kiinteiden kasvainten [1]. Mediaani potilaiden elinaikaa paikallinen eturauhassyöpä on yli 5 vuotta, kun taas miehet etäpesäkkeitä ovat merkittävästi vähentyneet eloonjäämisluvut [1].

MikroRNA (Mirs), pienet ei-koodaavaa 18- 24-nukleotidin RNA: t, ennustetaan ekspression säätelemiseksi, joka on suurempi kuin 90% proteiinia koodaavan geenien, mikä vaikuttaa erilaisia ​​solu- ja molekyylitason prosesseista [2]. Mirs moduloida mRNA-tasojen ja kääntämisen kautta kanonisen emäspariutumisen välillä siemenen sekvenssin miRNA (nukleotidit 2-8 5’päästä) ja täydentävät siemen ottelun sekvenssit kohde-mRNA: iden, jotka tyypillisesti sijaitsevat 3’alue (UTR ) [3]. MikroRNA vaientaa sukulaisamideillaan tavoitteensa mRNA pilkkominen, translaation tukahduttaminen, mRNA epävakauden tai näiden mekanismien yhdistelmän [4]. Enemmän kuin 50% selityksin ihmisen miR geenit sijaitsevat kromosomaalisen alueilla, jotka ovat alttiita vahvistus, poistamista tai translokaatio aikana kasvaimen kehityksen [5]. Mirs on ratkaiseva rooli etäpesäkkeitä, mikä johtuu todennäköisesti niiden kyky transkription jälkeen säädellä geenin verkkojen tärkeä solujen invaasiota, liikkuvuuteen ja muuttoliike [6].

biogeneesin Mirs on säädeltyä, monivaiheinen prosessi [ ,,,0],7]. Yli 40% ihmisten Mirs järjestetään evolutionarily säilytetty klustereita, jotka cotranscribed erillisinä polykistronista pri-miRNA. Suuri määrä Mirs ja miR klusterit vapautettu kasvaimen synnyssä ja metastaattisen kehittämiseen [8].

MiR-23b ja miR-27b, jotka käsittävät klusteri ihmisen kromosomissa 9, ovat nimenomaan alassäädetty ihmisen kastraatio -kestävistä eturauhassyöpä (CRPC) kliiniset näytteet [9] – [12], sekä solujen malleja CRPC [10], [13]. Mielenkiintoista, Sun et al. [12] mukaan miR-23b /-27b ilmentymistä merkittävästi vähentynyt (2,8-kertainen) in primaarikasvainten (verrattuna viereiseen normaaliin kudokseen) ja on edelleen laski 3,2-kertaisesti metastasoitunut CRPC näytteissä. Tässä tutkimuksessa 15 ulos 17 CRPC kasvain näytteet omasivat downregulation miR-23b /-27b verrattuna primaarikasvaimen näytteitä [12]. Huolimatta korrelaatio laski miR-23b /-27b lisääntynyt taudin synnyssä, rooli miR-23b /-27b sisään CRPC etäpesäkkeitä ei ole hyvin tunnettu. Täällä voimme tarjota todisteita siitä, että miR-23b /-27b estää avaimen metastaattinen prosessit kuten solun invaasiota, muuttoliike ja kiinnittymisestä riippumaton eloonjäämisen vaikuttamatta solujen lisääntymistä. Nämä vaikutukset on liitetty lisääntynyt E-kadheriinin tasoilla ja vaimennus Rac1 toimintaa.

E-kadheriinin, joka on adheesiomolekyyli, vaimentaa invasiivisia ja muuttavien fenotyypin syöpäsolujen [14] – [17]. Menetys E-kadheriinin liittyy tyypillisesti kasvaimen invasiivisuus, metastaattisen levittäminen ja huono potilaan ennusteeseen erilaisia ​​syöpiä, mukaan lukien eturauhasen. Esimerkiksi menetys E-kadheriinin antaa metastaattinen kyky suhteellisesti ei aggressiivinen, transformoidut rintojen epiteelisolujen [16]. Lisäksi E-kadheriinin negatiivinen soluilla parannetun hyökkäyksen ja metastaattisen potentiaalin verrattuna E-kadheriinin positiivisten solujen Dunning rotan eturauhassyövän malli [14], [15], [18]. Rho GTPaasi Rac1, joka säätelee solun tukirangan uudelleenjärjestelyjä välttämättömiä solujen vaeltamiseen, liittyy voimakkaasti aggressiivinen eturauhassyöpä [19] – [22]. Kohonnut Rac1 tarvitaan invasiivisia käyttäytymistä ihmisen eturauhassyövän solulinjassa PC3 [23]. Siten Tässä esitetyt tiedot ovat sopusoinnussa rooli miR-23b /-27b klusteri etäpesäkkeitä tukahduttaminen kautta vaikutuksia E-kadheriinin ja Rac1.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa ALVA31 (saatu tohtorit. Stephen Loop ja Richard Østensen, Department of Veteran asioiden Medical Center, Tacoma, WA) [24], LNCaP (American Type Culture Collection, Manassas, VA), PC3 -ML (saatu Dr. Alessandro Fatatis, Drexel University College of Medicine) [25], siirrostettiin ja ylläpidettiin RPMI 1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 100 IU /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä, ja 100 g /ml L-glutamiinia. Kaikki viljelmät pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2.

RNA: n eristäminen ja Kvantitatiivinen RT-PCR

Kokonais-RNA eristettiin käyttäen Mirvana miRNA eristäminen kit (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia). Taqman kantasilmukan RT-PCR-menetelmällä käyttäen TaqMan® miRNA käänteistranskriptio kit ja TaqMan® miRNA määritykset (Applied Biosystems) käytettiin arvioimaan ilmentymisen miR-27b.U6 pieni ydin- RNA toimi sisäisenä kontrollina kaikissa kokeissa .

immunoblottauksella

Cellular proteiinit uutettiin ja erotettiin SDS-PAGE-geeleillä ja western blot-analyysit suoritettiin standardimenetelmien mukaisesti. Western blottaus β-aktiinin samalla membraanin käytettiin latauskontrollina. Käytetyt vasta-aineet olivat anti-E-kadheriini (BD 610181), anti-Rac1 (Millipore 23A8), ja anti-aktiini (Santa Cruz 1616).

Plasmidit ja Lentivirusvektorikonstruktit Production

Ihmisen miR-23b /-27b esiaste (pMIRNA-23b /-27b-GFP) ja salattu ohjaus (pMIRNA-salatut-GFP) kloonattiin lentivirusvektoreita (Systems Biosciences (SBI) Mountain View CA, USA) transfektoitiin LentiX HEK-soluihin ( Clontech, Mountain View CA, USA) valmistajan protokollan. GFP: n ilmentymisen transdusoiduissa ALVA31 ja PC3-ML-soluissa määritettiin virtausta cytometery.

virtaussytometria

trypsinisoitiin solut läpäiseviksi käyttämällä 0,05% trypsiiniä 0,53 mM EDTA (Cellgro). Virtaussytometria tehtiin koskevasta Accuri C6 sytometrialla käyttämällä CFlow ohjelmiston mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Solutransfektiot

Kemiallisesti muunnetut antisensenukleotidit (antagomiRs) vastaan ​​miR-23b ja miR-27b tai valvontaa antagomiRs hankittiin Applied Biosystems ja transfektoitiin 50 nM käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollaa. Kaikki kokeelliset testit suoritettiin 72 tuntia transfektion jälkeen.

Migration määritykset

Scratch määritykset suoritettiin ALVA31 soluissa 72 tuntia transduktion jälkeen miR-23b /-27b tai sekoitettua kontrollipeptidiä tai LNCaP-solujen 72 tunnin kuluttua transfektion antagomiR-23b /-27b tai valvoa antagomiR. Steriili pipetin kärki oli raahata konfluentteja yksisolukerrokset luoda tyhjästä. Yksittäiskerroksia pestiin sen jälkeen kahdesti solujätteen poistamiseksi ja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa 4 tuntia. Valokuvat otettiin heti naarmuuntumista ja uudelleen 4 tunnin kuluttua. Kuva J käytettiin mittaamaan tyhjästä leveys kuin ajan funktiona. Prosentuaalinen ero (scratch) sulkeminen laskettiin prosentteina jäljellä solun vapaa alue verrattuna alueen alkuperäisen haavan. Kaksi itsenäistä koetta suoritettiin yhteensä vähintään 6 naarmuja kunkin solulinjan.

soluproliferaatiomäärityksissä

ALVA31, PC3-ML (ilmentävät miR-23b /-27b tai salattu ohjaus) ja LNCaP-soluja (transfektoitu antagomiR-23b /-27b tai ohjata antagomiR) maljattiin alkutiheydellä 10000 solua /kuoppa kuuden kuoppalevylle. Osoitetuissa aikapisteissä solut trypsinoitiin ja elinkelpoisten solujen (ne, jotka eivät sisällä trypaanisinistä) laskettiin hemosytometrillä.

Matrigel Invasion määritykset

Matrigel Invasion Assay (BD Biosciences) suoritettiin käyttämällä ALVA31 ja PC3-ML-soluissa 72 tuntia transduktion jälkeen miR-23b /-27b tai sekoitetun ohjaus ja LNCaP 72 tunnin kuluttua transfektion antagomiR-23b /-27b tai valvoa antagomiR. 50000 soluja seerumia 16 tuntia, sitten ympättiin yläosaan kammioon siirtokuoppaan laite on matrigeelin päällystetty kalvo (24 no insert, 8mm huokoskoko). Väliaineessa, jota täydensi 10% FBS: ää käytettiin kemoattraktantti. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa 48 tunnin ajan, alkuun kammiot pyyhittiin vanulla poistamiseksi ei-muuttavien tai ei-invasiivisia soluja. Solujen alapinnalle kalvon kiinnitettiin sitten kylmällä metanolilla, värjättiin 0,01% kristalliviolettia ja laskettiin mikroskoopilla.

Soft Agar määritykset

Soft agar määritykset suoritettiin ALVA31 tai PC3-ML-soluissa 72 tuntia transduktion jälkeen miR-23b /-27b tai salattu ohjaus. Ankkurista riippumaton kasvu arvioitiin kuten aiemmin on kuvattu [26].

Rac1 Activity määritykset

Rac1 aktiivisuuden määritykset suoritettiin ALVA31 tai PC3-ML-solujen 72 tunnin transduktion jälkeen miR-23b /- 27b tai salattu ohjaus. GTP-sitoutunut Rac1 erotettiin GDP-Rac1 käyttämällä avattavan lähestymistapa aikaisemmin kuvatulla [19]. Lyhyesti, solulysaatteja inkuboitiin 200 mg /ml PBD-GST [p21-sitova domeeni, PBD, että Rac1 /Cdc42 efektori PAK (p21-aktivoitu kinaasi)]. GTP-Rac1 otettiin talteen inkuboinnin jälkeen glutationi-agaroosi-helmiä. Kompleksit kerättiin, denaturoitiin ja erotettiin SDS-PAGE: lla. Aktiivinen Rac1 havaittiin Western-blottauksella anti-Rac1 vasta-aineita (Millipore). Kaikkiaan 5% alkuperäisestä lysaattia analysoitiin myös immunoblottauksella kokonaismäärän määrittämiseksi tasot Rac1 (GDP-ja GTP-sitoutunut).

Tulokset

MiR-23b /-27b vaimentaa Motility , Invasion ja Anchorage riippumaton kasvu kastraatio vastustuskykyisten syöpäsolujen

Koska käänteinen korrelaatio miR-23b /-27b ilmaisun ja pahanlaatuisen fenotyypin ihmisen eturauhassyövän, pyrimme arvioimaan, antineoplastisia rooli (t) tälle miRNA klusterin. Tätä varten miR-23b /-27b klusteri on ektooppisesti ilmaistiin käyttäen lentivirusvektorilla (myös koodaa GFP) kaksi erillistä erittäin aggressiivinen kastraation kestävä eturauhassyövän solulinjoissa, ALVA31 ja PC3-ML. 72 tuntia sen jälkeen, transduktion, solut analysoitiin GFP: n ilmentymisen käyttäen virtaussytometriaa, jotta voidaan määrittää transduktioteho kunkin kokeen (S1). Kokeet suoritettiin ainoastaan ​​silloin, kun yli 95% soluista ilmaistuna GFP. Koska miR-27b sijaitsee 3 ’miR-23b, tarkkailtiin miR-27b tasot käänteistranskriptaasin qPCR seuraavat transduktion lentivirukset, joka koodaa tämän miRNA klusterin tai kontrollina ei-spesifisen miRNA (tuloksia ei ole esitetty). Transduktio kanssa miR-23b /-27b lentivirusvektorilla johti mir-27b tasolle verrattavissa luontaisesti löytyy MCF7-soluissa, joka toimi positiivisena kontrollina miR-27b [27]. Vaihtoehtoisesti, miR-23b /-27b estyi androgeeni- riippuvaista LNCaP line käyttäen antagomiRs, jotka ovat synteettisiä oligonukleotidejä, jotka ovat komplementaarisia kohde-miRNA jotka johtavat pilkkomalla vastaava miRNA (S2).

Sen määrittämiseksi, miR-23b /-27b säätelee solujen metastaattista prosesseja, olemme analysoineet vaikutuksia muuttamalla miR-23b /-27b ilme kastraatio kestävä solun liikkuvuus ja muuttoliike. Käyttämällä tyhjästä määrityksiä, huomasimme, että ektooppinen ilmentyminen miR-23b /-27b vuonna CRPC linja, ALVA31 vähentynyt soluliikkuvuus noin 2-kertaiseksi, kun vain 4 tuntia (kuvio 1A). Toisaalta, inhibitio endogeenisen miR-23b /-27b ilmentymisen LNCaP-soluissa, mikä on suhteellisen korkea endogeenisten tasojen näiden miRNA ja niillä on pieni liikkuvuus, johti yli 2-kertainen liikkuvuutta verrattuna kontrollieläimiin antagomiR-transfektoiduissa soluissa (kuvio 1 B ).

-27b ilmentyminen vähenee kastraation kestävä eturauhassyövän solumigraation, kun taas inhibitiota miR-23b /-27b lisää migraation androgeeniriippuvaisen eturauhasen syöpäsoluja. Scratch määritykset suoritettiin ALVA31 soluja, jotka ilmentävät miR-23b /-27b tai sekoitettua kontrollipeptidiä (A) ja LNCaP-soluja transfektoitiin 50 nM antagomiR-23b-27b tai ohjata antagomiR (B). Kuvia selvitetty vyöhykkeiden (edustaja kuvissa oikealla) otettiin ennen ja jälkeen 4 tunnin inkuboinnin ja tyhjennetään alueet mitataan Image J ohjelmisto. Keskimääräinen prosenttiosuus kaventaminen (± SD) (johtuen solujen vaeltamiseen) on esitetty kaksi erillistä koetta, 7 naarmuja (A) ja 6 naarmuja (B) (*** P 0,001).

Seuraavaksi määritetään, onko miR-23b /-27b ilmaus vaikuttaa invasiivisuus kastraation-resistenttien solujen käyttäen Matrigeliä hyökkäystä kammioita. Seerumia solua lisättiin ylempään kammioihin siirtokuoppaan ja määrä soluja valtaavat kautta matrigeelin este vastauksena kemoatrak- (seerumi) aikana 48 tunnin ajanjakson arvioitiin. Esittely miR-23b /-27b osaksi ALVA31 ja PC3-ML soluissa merkittävästi vähensi hyökkäävän solujen yli 2-kertainen (kuvio 2A ja B). Sen sijaan ehtyminen miR-23b /-27b toimintaa vähemmän aggressiivisia androgeeniriippuvaisen LNCaP-solulinjasta merkittävästi parannettu soluinvaasiota (kuvio 2C).

-27b ilmaisu vähentää invasiivisuus kastraation vastustuskykyisten eturauhasen syöpäsolujen kun taas esto miR-23b /-27b in androgeeniriippuvaisissa syöpäsolujen kasvaa invasiivisuus. A, Matrigel invaasio määritykset suoritettiin ALVA31 soluissa (A) ja PC3-ML-solut (B), joka ilmaisee miR-23b /-27b tai sekoitetun ohjaus-transdusoidut solut. Ylempi paneeli osoittaa edustavat alueet kammion suodattimet kristallivioletilla-värjäytyneiden solujen. Taitteen muutos (± SEM) edustaa määrä hyökkäsi solua per kammio jaettuna valvonnan kolmesta itsenäisestä kokeesta suoritettiin kolmena kappaleena A ja välineet (± SD) yhden riippumattoman kokeen tehty kolmena kappaleena B (*** P 0,001 ). C, LNCaP-solut transfektoitiin 50 nM ohjaus antagomiR tai antagomiR-23b /-27b. Matrigel invaasio määritykset suoritettiin 72 tuntia transfektion kuten edellä todettiin. Väline (± SD) on kaksi erillistä koetta suoritettiin kolmena kappaleena näkyvät (*** P 0,001).

Lisäksi maahanmuuttoa ja invaasio, metastasoitunut solut usein hankkia kyky kasvaa kiinnityskohdassa riippumattomalla tavalla, vastustavat anoikis. Näin ollen meidän määritettiin vaikutukset miR-23b /-27b eturauhassyöpäksenografteilla solujen eloonjäämistä pehmeässä agarissa. ALVA31 ja PC3-ML-solut (miR-23b /-27b ilmentävät ja muokkaamalla ohjaus transdusoidut) maljattiin matalan kiinnitys media (pehmeä agar) ja yhdyskunnan eloonjäämiseen arvioitiin 2-4 viikon kuluessa pinnoitus. Pesäkkeenmuodostus oli merkittävästi heikentynyt ALVA31 ja P3-ML solulinjat ilmentävät miR-23b /-27b verrattuna salattu kontrolleihin (kuva 3). Nämä tiedot viittaavat vahvasti siihen, että miR-23b /-27b ilmaisu antaa anoikis herkkyys aggressiivinen kastraation-resistenttien syöpäsolujen.

-27b pienenee ankkurointi riippumaton kasvu kastraation kestävä eturauhassyövän solulinjoissa. Pehmeä agar määritykset suoritettiin ALVA31 ja PC3-ML soluja, jotka ilmentävät miR-23b /-27b tai transdusoitu sekoitetun ohjaus (** P 0,01). Mean pesäkkeitä numero (± SEM) maljaa kohti kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta suoritettiin kolminkertaisesti kullekin solulinjan on osoitettu (** P 0,01).

Mielenkiintoista, yli-ilmentyminen miR-23b /- 27b kastraation-resistenttejä solulinjoja, ALVA31 ja P3-ML, ei merkittävästi vaikuttanut solujen lisääntymistä (kuvio 4A ja B). Lisäksi esto nämä Mirs in androgeeniriippuvaisissa LNCaP eturauhassyövän solut myös ei vaikuttanut leviämisen hinnat (kuvio 4C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-23b /-27b klusteri voi olla keskeinen rooli metastaattisen prosessin osoittamalla tavalla havaittu fenotyyppien invaasio, muuttoliike ja anoikis määrityksissä. Kuitenkin muutoksia tason miR-23b /-27b cluster ollut vaikutusta proliferaatioon eturauhassyövän solulinjoissa.

-27b ei säännellä eturauhassyöpää solujen lisääntymistä. A ja B, leviämisen ilmentävien solujen miR-23b /-27b verrattiin salattujen valvonta-transdusoidut solut. Keskimääräinen solujen lukumäärä (± SEM) yhteensä kolmen erillisen kokeen suoritettiin kolmena rinnakkaisena on esitetty ALVA31 solujen ja keskimääräinen solujen lukumäärä (± SD) edustavan kokeessa, joka suoritettiin kolmena rinnakkaisena on esitetty PC3-ML-soluja. C, proliferaatio LNCaP-solujen, jotka oli transfektoitu antagomiR-23b /-27b tai ohjata antagomiR arvioitiin. Keskimääräinen solujen lukumäärä (± SD) kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta suoritettiin kolmena rinnakkaisena on esitetty.

ektooppinen ilmentyminen miR-23b /-27b lisää merkittävästi E-kadheriinin Protein tasot ja vähentää Rac1 Activity

Ymmärtääksemme molekyylimekanismeihin miR-23b /-27b estoa metastaattisen fenotyyppien, tutkimme ilmaus avaintekijöitä syöpäsolujen muuttoliikettä ja invaasiota. Tyypillisesti muuttoliike ja invaasio kasvainsolujen edistetään menetys vuorovaikutuksen vyöliitos solun tukirangan ja myöhemmät muutokset toimintaan Rho perheen pienten GTPaasit kuten Rac1 ja Cdc42 [28]. Olemme havainneet, että ektooppinen ekspressio miR-23b /-27b johti huomattavaan kasvuun E-kadheriinin proteiinin tasot sekä ALVA31 ja PC3-ML-soluja. Toisaalta, inhibitio miR-23b /-27b LNCaP-soluissa johti vähentyneeseen E-kadheriinin tasoilla (kuvio 5).

-27b lisää merkittävästi E-kadheriinin ilmentymisen kastraatio kestävät solulinjat. ALVA31 tai PC3-ML soluja, jotka ilmentävät miR-23b /-27b tai transdusoitu sekoitetun ohjaus ja LNCaP-soluja transfektoitiin antagomiR-23b /-27b tai ohjata antagomiR alistettiin western blotting E-kadheriinin ja aktiini. Edustaja blotit on esitetty yhteensä 2-6 kokeissa.

Rac1 aktiivisuus liittyy, ja näyttää olevan välttämätön metastaattisen fenotyypin eturauhassyövän, samoin kuin muut epiteelisyöpien [19] , [29]. Endogeenisen Rac1 toiminta edistää ankkurointi riippumatonta kasvua, jota tarvitaan invasiivisia käyttäytymistä CRPC solulinjan PC3 [29]. Näistä syistä päätimme onko ektooppinen ilmentyminen miR-23b /-27b aggressiiviseen eturauhassyöpään vahingoittuneiden solujen Rac1 aktiivisuutta. Esittely miR-23b /-27b sisään ALVA31 ja PC3-ML, jotka molemmat on suuri endogeeninen Rac1 aktiivisuus [19], merkittävästi vaimentunut Rac1 aktiivisuutta vaikuttamatta yhteensä Rac1 tasoilla (kuvio 6). Yhdessä nämä tiedot tarjoavat mekanistinen käsitys rooli miR-23b /-27b tukahduttamiseen metastaattisen fenotyyppien.

-27b merkittävästi vähentää Rac1 aktiivisuutta mutta eivät koko Rac1 tasoja kastraation kestävä eturauhassyövän solulinjoissa. Rac1 toiminnan määritykset suoritettiin ALVA31 (A) ja PC3-ML (B) soluja, jotka ilmentävät miR-23b /-27b tai transdusoitu sekoitetun ohjaus. GTP-sitoutunut Rac1 erotettiin GDP-Rac1 käyttämällä avattavan määritys kuten kuvattu materiaalit ja menetelmät. Komplekseja, jotka sisältävät GTP-Rac1 (aktiivinen Rac1) kerättiin, denaturoitiin ja erotettiin SDS-PAGE ja sen jälkeen Western blottauksella anti-Rac1 vasta-aineita. Yhteensä Rac1 (GDP-ja GTP: hen sitoutuneen) osuus on 5% alkuperäisestä solu- lysaattia. Aktiini käytettiin latauskontrollina. Kvantifiointi kolmen itsenäisen kokeen esitetään virhejanojen kanssa, jotka edustavat SEM (* P 0,05), (** P 0,01).

Keskustelu

MIRS moduloivat erilaisia ​​biologisia ja patologisten prosessien lukien metastaattisen cascade. Yli tuhat MIRS on koodattu ihmisen genomin ja selvittäminen niiden toiminnot on tärkeä tutkimusalue [6]. Koska monet Mirs on rooleja apoptoosin ja mitogeneesiä [30] potentiaalinen panos etäpesäke voi olla vaikea erottaa. Osoitamme tässä, että miR-23b /-27b tukahdutetaan muuttoliike ja hyökkäys aggressiivinen eturauhassyöpä solut ilman omaa sekoittavien tekijöiden vaikutuksesta solujen lisääntymistä. MIRS nämä tyypit ominaisuuksia kuvataan ehdokas ”etäpesäkkeiden vaimentimia” [6], [31].

kapasiteetti kasvainsolujen torjumiseksi anoikis, siirtää ja tunkeutua edellyttää hankinta useiden molekyyli- piirteitä [32] . Tuloksemme osoittavat, että ektooppinen ilmentyminen miR-23b /-27b metastaattisessa CRPC solulinjoissa, ALVA31 ja PC3-ML, johti vähentyneeseen kasvuun pehmeässä agarissa vähenemisestä sekä solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Kääntäen, esto miR-23b /-27b vuonna androgeeniriippuvaisissa eturauhassyövän solulinjaa, LNCaP, johti tehostettuun solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Jotta kasvain epiteelisolujen hyökätä ja siirtyä, eheys epiteelin ja tyvikalvon on häirinnyt antamalla solujen päästä osaksi taustalla strooman. Tämä prosessi vaatii häiriöitä epiteelisolujen solukontaktien, joka voi tapahtua alentuneet Soluadheesiomolekyylien kuten E-kadheriinin. Expression of miR-23b /-27b lisääntynyt E-kadheriinin proteiinin tasot kaksi riippumatonta CRPC solulinjoissa; kääntäen esto miR-23b /-27b vähemmän aggressiivinen androgeeniriippuvaisissa eturauhassyövän solulinjaa, LNCaP, pienensi E-kadheriinin tasoilla.

Menetys adheesiomolekyyli E-kadheriinin eturauhasessa syöpäpotilaan yksilöt liittyy vahvasti metastaattinen käytös ja huono kliiniseen tulokseen [14], [15], [18]. Nämä tutkimukset tukevat E-kadheriinin sääntelyn purkamisesta kriittinen tapahtuma eturauhassyövässä etenemistä ja ovat yhdenmukaisia ​​havaintomme että miR-23b /-27b-ilmentymisen lisännyt E-kadheriinin tasoilla ja lasku metastaattinen ominaisuuksia. Molekyylitason perustan säätely ylöspäin E-kadheriinin in miR-23b /27b ilmentävien syöpäsolujen on tuntematon. Vaikka me arveltu, että tämä vaikutus johtuu miR-23b /-27b estoa (joko suora tai epäsuora) yhden tai useamman tunnetun E-kadheriinin transkriptiorepresso- [33] – [35], emme tarkkailla yhtäpitäviä todisteita repressioasteen E-kadheriinin repressors Twist, Slug, Snail, Zeb1 tai Zeb2 in CRPC solulinjoissa yliekspressoivia miR-23b /-27b (tuloksia ei ole esitetty). Nämä havainnot viittaavat siihen mahdollista osallistumista muiden repressors ja /tai että miR-23b /-27b välittämää säätelyn E-kadheriinin tapahtuu läpi monimutkaisempi mekanismi (t).

metastaattinen prosessi ei koske vain menetys solu-solu-kiinnikkeistä vaan kasvainsolut on myös hankkia kyky siirtyä, jotta asuttaa kaukaisiin kohtiin. Rho GTPaasina Rac1 säätelee uudelleenjärjestely aktiinisytoskeletonin tarvitaan solujen vaeltamiseen. Yliekspressio Rac1 liittyy parannettu metastaattista potentiaalia eturauhasen ja muiden epiteelin syövän tyypit [36] – [38]. Kohonnut Rac1 aktiivisuus esiintyy CRPC, edistää kastraatio kestävä, sekä, ankkurointi riippumattomaan kasvuun ja tarvitaan invasiivisia käyttäytymistä CRPC solulinjan PC3 [19], [21]. Erilaisia ​​aktivaattoreita Rac1 on osoitettu olevan tärkeitä eturauhassyövän etenemisen tai hankinnan invasiivisen fenotyypin. Esimerkiksi me ja muut osoittivat, että on tärkeää Rho guaniininukleotidiä vaihto tekijät (GEFs) etenemisen CRPC [21], [22], [26], [39]. Lisäksi lisääntynyt ilmentyminen tiettyjen Rac1 GEFs korreloi lisääntyneeseen biokemiallisten uusiutuminen [22] ja laski taudista vapaan eloonjäämisen eturauhassyöpäpotilailla [40]. Proteiinit, jotka vähentävät Rac1 aktiivisuutta hydrolyysillä GTP, GTPaasi aktivoivat proteiinit (GAP), toimivat tuumorisuppressorit [41]. Vaikka miR-23b /-27b ei vaikuttanut veren kokonaiskolesterolia Rac1, käyttöönoton nämä Mirs osaksi ALVA31 ja PC3-ML-solujen määrän väheneminen aktiivinen (GTP-sitoutunut) Rac1. Siksi on oletettava, että miR-23-b /27-b on inhiboivat yhtä tai useampaa monista ylävirtaan sijaitsevien aktivaattorien Rac1 tai epäsuorasti lisäämään Rac1 inhiboivia proteiineja.

Vaikka ekspressio miR-23b /-27b välitteinen väheneminen of Rac1 toimintaa ja lisännyt E-kadheriinin proteiinin tasot, nämä vaikutukset epäillään olevan epäsuora. Koska yksittäiset Mirs usein säätelemään lukuisia kohdegeenien, miR-23b /-27b voi tukahduttaa useita tavoitteita ja verkostoja, jotka lopulta johtaa suuria fenotyypin muutoksia, havaitsimme. Useita miR-23b ja miR-27b kohdegeenien on havaittu muissa syöpäsolutyyppien, jossa nämä MIRS ilmentyvät differentiaalisesti verrattuna normaaliin kudokseen, mukaan lukien rinta-, maksa- ja keuhkojen [42] – [50]. Kuitenkin, koska monet koodaamien proteiinien näiden geenikohteet osallistuvat säätelyyn solujen lisääntymistä, odotamme, että nämä geenit eivät edusta asiaa tavoitteet eturauhassyövän soluissa. Lisäksi tunnistimme useita laskennallisesti ennustaa Ehdokaskohteiden Mir-23b /-27b, jotka liittyvät Rac1 signalointi ja E-kadheriinin sääntely myös PI3-kinaasi, MAPK, TGF-beeta, Wnt, mTOR, Jak-STAT, toll-like reseptorin ja Notch mm. Näiden monimutkaisten integroiva verkkojen tavoitteet miR-23b /-27b voi lähentyä säädellä Rac1 aktiivisuus ja E-kadheriinin. Olemme aktiivisesti näitä mahdollisia kohteita. Lisäksi on tärkeää rajata yksittäisiä rooleja kaksi Mirs tässä klusteri invaasion ja migraatio syöpäsolujen.

Koska etäpesäkkeet ovat vastuussa potilaiden kuolleisuuden lähes kaikissa ihmisen karsinoomien, kyky miR-23b /-27b estää metastaattinen prosessit olla kliinistä arvoa. Menetys miR-23b /-27b voi toimia ennustetyövälineenä markkerina aggressiivinen eturauhassyöpä. Biomarkkerit, jotka erottavat veltto aggressiivinen eturauhassyöpä kriittisesti tarvitaan, ja menetys miR-23b /-27b voi ennustaa etäpesäkkeitä. Koska Mirs myös mahdollinen käyttö hoitomuodot [51], miR-23b /-27b ”matkii” olisi arvioitava kokeellisissa malleissa eturauhassyövän etäpesäkkeiden.

tukeminen Information

Slide S1.

arviointi transduktioteho ALVA31 ja PC3-ML-soluja. GFP ALVA31 (A) tai PC3-ML (B-solut) 72 tuntia sen jälkeen, kun kahden peräkkäisen transductions GFP-koodattu lentivirusvektoreita pMIRNA-miR-23b /-27b tai pMIRNA-salattu lentivirusvektoreita (Systems Biosciences (SBI) Mountain View CA, USA). GFP: n ilmentymisen in trandusoidun ja transdusoidut solut arvioitiin FACS-analyysillä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0052106.s001

(TIF)

Slide S2.

MiR-27b tasojen lasku LNCaP-soluissa, jotka on transfektoitu antagomiR-23b /-27b. LNCaP-solut transfektoitiin 50 nM antagomiR-23b /-27b tai ohjata antagomiR. MiR-27b tasot määritettiin käyttäen reaaliaikaista PCR 72 tuntia transfektion jälkeen. Arvot ovat miR-27b tason normalisoitu U6 snRNA vuonna LNCaP ohjaus antagomiR.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0052106.s002

(TIF) B

Kiitokset

Kiitämme Drs. Balakrishna ja Vinata Lokeshwar, Pedro Salas (University of Miami Miller School of Medicine), Jennifer Richer (University of Colorado Health Sciences keskus) joka ystävällisesti tarjoaa reagenssien ja neuvoja. Kiitämme myös tohtori Seth Wander, Dekaung Zhao, Carol Maiorino, tohtori Leah Lyons, tohtori Fayi Wu, Stephanie Peacock ja Cale Fahrenholtz (University of Miami Miller School of Medicine) neuvoa ja apua.