Krooninen sairaus

tiivistelmä

eturauhassyövän antigeenin geenin 3 (

pCA3

) on upotettu intronin toisen geenin

BMCC1

(Bcl2- /adenovirus E1B yhdeksäntoista kDa- vuorovaikutuksessa proteiini 2 (BNIP-2) ja Cdc42GAP homologia BCH-motiivin sisältävän molekyylin karboksyylipään alue 1), joka on myös ylösajettu eturauhassyövässä. BMCC1 alunperin olevaksi, kaksi geeniä (

C9orf65 /PRUNE

ja

BNIPXL

) molemmin puolin pCA3 mutta tiedot viittaavat siihen, että se on yksittäinen geeni, joka koodaa korkean molekyylipainon proteiinia. Tässä me osoitamme ensimmäistä kertaa ilmaus 300 kDa: n BMCC1 proteiinin (BMCC1-1) eturauhassyövässä ja melanoomasolulinjoissa. Tämä proteiini havaittiin yksinomaan mikrosomaalisessa murto ja sytoplasmisissa rakkulat. Havaitsimme myös ilmentymistä BMCC1 proteiinin eturauhassyövässä osissa käyttäen immunohistologialla. GST vetää alas, immunosaostus ja massaspektrometria proteiini vuorovaikutuksen tutkimuksissa tunnistettu useita jäseniä adapteri liittyvää kompleksia 2 (AP-2) kuin BMCC1 interactors. Sopusoinnussa rooli BMCC1 kuin AP-2 vuorovaikutuksessa endosomaalisen proteiinia, BMCC1 co-paikallistaa β-adaptiiniproteiinin on perinuclear alueen solun. BMCC1 osoitti myös osittainen kolokalisaation kanssa varhain endosomista pienten GTP-ase Rab-5 sekä vahvaa kolokalisaation kanssa sisäistetty Pulsechase leimattua transferriiniä (Tf), jotka osoittavat, että BMCC1 on lokalisoitu toiminnallinen endosyyttisiin rakkulat. BMCC1 Knockdown ei vaikuttanut Tf otto ja AP-2 Knockdown ei levitä BMCC1 vesicular jakelu ilman keskeinen rooli BMCC1 in kanoninen AP-2: n välittämien endosyyttistä ottoa. Sen sijaan meidän posit uusi rooli BMCC1 jälkeisessä endosyyttistä ihmiskauppaa. Tutkimus tarjoaa perustavanlaatuinen luonnehdinta BMCC1 monimutkainen syöpäsolujen ja ensimmäisen kerran syytöksiä sen rakkulan ihmiskauppaa.

Citation: Harris JL, Richards RS, Chow CWK, Lee S, Kim M, Buck M, et ai. (2013) BMCC1 Onko AP-2 Associated endosomaalista Proteiini eturauhassyöpäsoluissa. PLoS ONE 8 (9): e73880. doi: 10,1371 /journal.pone.0073880

Editor: Gnanasekar Munirathinam, University of Illinois, Yhdysvallat

vastaanotettu: 05 helmikuu 2013; Hyväksytty: 23 heinäkuu 2013; Julkaistu: 06 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Harris et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Hanke rahoittivat Eturauhassyöpä säätiön Australia. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on yleisesti diagnosoitu maligniteetti sekä johtava syy syöpäkuolemista maailmanlaajuisesti. Tämä ehto on laajakirjoinen ja histologisia muutoksia ja käyttäytymistä, jotka vaihtelevat premalignien vaurioiden paikallisille eturauhasen syöpiä, jotka seurata veltto tietenkin prosentteina syöpiä että etäispesäkkeitä varhaisessa vaiheessa ja edistymistä nopeasti [1]. Siksi lisäksi parannettujen ja ennustavia välineitä, yksityiskohtainen käsitys solubiologian eturauhassyövän kehittymistä ja etenemistä tarvitaan. Yksi lupaavimmista biomarkkereita eturauhasen syöpä on ei-koodaavat RNA pCA3 [2,3]. Tätä RNA: ta tunnistettiin eturauhassyövän biomarkkerit differentiaalisella display-analyysi RNA: iden histologisesti normaalin ja pahanlaatuisen kudoksen samoista potilaista, ja alun perin kuvattu Differential Display klooni 3 (DD3) [2]. Korkea pCA3 ilmaisun vahvasti pahanlaatuista transformaatiota eturauhasen epiteelin kuitenkin biologinen perusta korrelaatiota ei ole selvitetty [2-4].

aiemmin osoitettu, että

pCA3

on upotettu intronin toisella geenillä,

BMCC1

[5].

BMCC1

alunperin olevaksi, kaksi erillistä geenien

c9orf65 /PRUNE

(joka koodaa N-terminaalista aluetta) ja

BNIPXL

(jotka koodaavat C-terminaalisen alueen).

BNIPXL

(

BMCC1-4

) avoin lukukehys tunnistettiin tietokannasta etsimällä homologeja Bcl-2 vuorovaikutuksessa proteiini BNIP-2 [6]. Kirjoittajat tunnistettu

BNIPXL /BMCC1-4

kuin geenin alueen kanssa korkea

BNIP-2

homologian, ja nimetty homologisen alueen BCH (BNIP-2 /Cdc42GAP Homologia) domain [ ,,,0],6]. Käyttämällä eksogeenisesti ilmaistuna merkinnällä BNIPXL proteiineja, he osoittivat, että se on vuorovaikutuksessa RhoA ja sen aktivaattori proto-Lbc [6]. -parin Ja vuorovaikutus tutkimukset osoittivat, että BNIPXL sitoo RhoA ja proto-Lbc kautta eri alueiden ja että BNIPXL ilmaisun lohkot RhoA signalointi, ainakin osittain estämällä stimuloiva RhoA-Lbc vuorovaikutus [6]. Machida et ai. [7] tunnistettiin pidempi isoformin BMCC1 ihmisen neuroblastooma (BMCC1-3), joka kesti koodaavat eksonit 7-19 ja tunnistettiin myöhemmin BMCC1-1. Korkea ilmaus tästä transkriptin korreloivat edullisemman ennusteeseen tämä syöpä. Todisteet ilmentyminen täyspitkän BMCC1-1 transkriptin ulottuu

c9orf65

ja

BNIPXL

geenit saatiin Iwama et al. [8], joka kloonattiin täyspitkä cDNA: Hela-solut. Tässä tutkimuksessa ja sen jälkeen, BMCC1 transkriptit on havaittu rajoitettu alueille hiiren aivoissa [8,9]. Clarke et ai. [5] osoitti, että BMCC1 RNA ilmentyminen on kohonnut eturauhassyövän ja etäpesäkkeitä verrattuna hyvänlaatuinen kudosta, mikä osoittaa, että BMCC1 voidaan toimivan eri tavoin eri syöpien ja kudosten tyyppejä. Katsaus BMCC1 isomuodon ilmaisun ja erilaisia ​​toimintoja BCH verkkotunnuksen sisältävien proteiinien annetaan viime julkaisuissa [10,11].

ensitunnistaminen vastaava proteiini BMCC1-1 osoitettiin Iwama et al. [8]. Tämä ryhmä esille spesifisen vasta-aineen äärimmäisen N-terminaalinen alue BMCC1-1, ja vaikka useita vyöhykkeet havaittiin Western blot Hela MR, HEK293T ja KNS81 glioomasolut vain taajuusalueilla 250 kDa olivat herkkiä tietyille siRNA ehtyminen. Massaspektrometriaa käytettiin tunnistamaan nämä korkean molekyylipainon bändejä BMCC1-1. Samassa tutkimuksessa, ilmaisu eksogeenisen proteiinin cDNA-kloonin, tuotetaan myös useita bändejä SDS-PAGE, todennäköisesti osoittaa huomattavia proteolyysin, mikä tulkintaa. Viime aikoina, Li et al. [12] tunnistettiin olfaxin vastaavien proteiinien vaihtoehtoisia BMCC1 transkription aloituspaikkoja ilmaistaan ​​hajukäämissä, jossa hallitseva vyöhyke 52 kDa. Arama et ai. [11] havaittu bändi samankokoisia koko aivot lysaateissa ja viljeltiin neuronien ja astrosyyttien, jota he kutsuivat BMCC1s. Esillä olevassa tutkimuksessa, ilmaisun ja ominaispiirteiden yhden 340 kDa BMCC1 proteiinin eturauhassyövän LNCaP on kuvattu. Identiteetti tämän proteiinin voimakkaasti perustettiin havaitsemiseen useita vasta-C- ja N-pään alueisiin proteiinin, ehtyminen erityisiä siRNA ja tukee MALDI TOF /TOF-analyysit. Ensimmäistä kertaa tunnistimme endogeeninen proteiini yhteisvaikutukset alueen ulkopuolella BCH verkkotunnus. Olemme havainneet, että BMCC1 alue ilman laskennallisesti tunnistettavissa toimintakykyyn vuorovaikutuksessa adapteri proteiinikompleksi 2 (AP-2). Olemme myös osoittaneet kolokalisaation BMCC1 kanssa β-adaptiiniproteiinin ja eri endosomaalista markkereita, mukaan lukien Rab5 ja sisäistetty transferriiniä (Tf). Alustavat funktionaaliset analyysit viittaavat BMCC1 on ei-kanoninen AP-2 vuorovaikutuksessa proteiini osallistuu jälkeisessä endosyyttisissä ihmiskauppaa.

Materiaalit ja menetelmät

Kudokset ja solulinjoissa

Human eturauhaskudoksiin lahjoitti potilaiden Royal Brisbane Hospital kirjallinen suostumus alle eettinen hyväksyntä Queensland Institute for Medical Research ihmisen eettinen komitea. Potilaan suostumuslomakkeet on säilytetty. Hiiren kudokset saatiin a5 kuukauden ikäisen villin tyypin uros BalbC hiiri, alle eettinen hyväksyntä Queensland Institute for Medical Research (QIMR) eläinten eettinen komitea. LNCaP, 22Rv1, DU145, RWPE1, ALVA, PC3 ja MCF-7 saatiin ATCC: ltä. A11, D11, D28, D33 ja D38 olivat lahjoja Chris Schmidts laboratorio (QIMR). Nämä saatiin osallistuvilla potilailla kliinisissä tutkimuksissa QIMR, jossa kirjallinen suostumus päässä QIMR Tutkijavoimavarojen eettinen komitea. Mikrosiru tutkimuksen solulinjoissa A11 ja D11 on julkaistu [13], koska on kliininen tutkimus D-sarjan potilaista [14]. Kaikkia solulinjoja pidettiin yllä DMEM: ssä (Gibco), penisilliiniä ja streptomysiiniä, jota oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia (Gibco).

RNA uuttaminen ja cDNA-synteesi

Kokonais-RNA solulinjoissa ja kudokset puhdistettiin käyttäen Trizol (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tätä RNA: ta käänteiskopioitiin cDNA käyttäen Superscript III (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

PCR ja sukupolven cDNA-kloonien

cDNA-kloonit BMCC1 ja muiden geenien tuotettiin monistuksella kohde alkaen LNCaP cDNA. Oligonukleotidit hankittiin Sigma Aldrich, standardi PCR-monistukset suoritettiin WTH

Pfu

Turbo (Roche). Tyypilliset syklin olosuhteet olivat 92 ° C 2 minuuttia sen jälkeen; 92 ° C 30 sekuntia, 60 ° C 30 sekuntia, 72 ° C: ssa 90 s /kb (2 sykliä); 92 ° C 30 sekuntia, 57 ° C 30 sekuntia, 72 ° C: ssa 90 s /kb (2 sykliä); 92 ° C 30 sekuntia, 53 ° C 30 sekuntia, 72 ° C: ssa 90 s /kb (30 sykliä). Kaikki Q-PCR suoritettiin käyttäen Corbett Rotorgene-6000 (Qiagen, Australia), Rotorgene-6000-sarjan Software (Qiagen, Australia) ja Quantitect® SYBR® Green PCR Kit (Cat. No. 204143, Qiagen, Australia). Reaktiot valmistettiin kolminkertaisina ja jokainen sisälsi 7.5μl of qPCR Master Mix, 0,5 pl kutakin 10pM eteen- ja taaksepäin aluketta ja 5 ui laimennettua cDNA (1:10 laimennus). Pyöräily edellytys BMCC1 ja β

2M alukkeet olivat seuraavat: 95 ° C: ssa 15 min, jota seurasi 45 sykliä 95 ° C 20 sekuntia, 58 ° C: ssa 20 sekuntia ja 72 ° C: ssa 20 sekunnin ajan. Pyöräily olosuhteet AP2M1 alukkeet olivat seuraavat: 95 ° C: ssa 15 min, jota seurasi 45 sykliä 95 ° C 20 sekuntia, 60 ° C: ssa 20 sekuntia ja 72 ° C: ssa 20 sekunnin ajan. Aineisto generoidaan Rotorgene-6000 sarjan ohjelmiston ja suhteellisen geeni-ilmentymisen tasot laskettiin käyttäen kuvattua menetelmää Pfaffl [15]. Alukesekvensseissä ja restriktiokohdat on esitetty oheismateriaali (taulukko S1). Kaikki restriktioentsyymit ostettiin NEB.

rekombinanttiproteiini ilmentäminen, puhdistaminen ja silloittamalla

rekombinanttiproteiini ilmentyminen ja puhdistus ja silloittumista suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [16].

Vasta-aineet

Rekombinantti BMCC1-GST-fuusioproteiineja ilmennettiin ja puhdistettiin, kuten edellä on kuvattu. Kanin vasta-Ab-1 ja Ab-3 tuotettiin injektoimalla kaneja eluoitujen denaturoimattomana GST-fuusioproteiinit (käyttäen Institute for Medical ja Veterinary Science, Adelaide standardi annosnopeus, aikataulu ja apuaineita). BMCC1 Ab-2 antiseerumia synnytettiin rokotus kanin denaturoidulla GST-fuusioproteiinin upottaa tallentamattomiin polyakryyliamidigeelissä viipaleet (IMVS). BMCC1 lampaan antiseerumi tuotettiin ymppäämällä lampaan kanssa eluoitu denaturoimattomana BMCC1-GST-fuusioproteiini (IMVS) (Ab-4). Kaikki proteiinit oli N-terminaalin GST tunnisteita ympätty ja erityiset BMCC1 sekvenssit kullekin vasta-aineelle esitetään taulukossa S1. Spesifisten vasta-aineiden ja ei-spesifisiä ohjaus vasta-aineet puhdistettiin seerumista kuvatulla [16].

Kaupalliset vasta käytettiin tässä projektissa olivat hiiren anti-DNA PKcs (Santa Cruz tuote 18-2), hiiren anti-RNA-polymeraasia II (Abcam, ab5408), kanin anti-β-adaptiiniproteiinin (joka havaitsee AP-1B1 ja AP-2B1) (Santa Cruz A-5), hiiren anti-EEA1 (BD Transduction Laboratories, 610457), hiiren anti-α-tubuliinin (Sigma T9026) ja hiiren anti-GAPDH (Millipore MAB374). Asianmukaiset Alexafluor konjugoidulla aasin toissijainen vasta saatiin Invitrogen ja HRP konjugoitua sekundaarista vasta-aineet olivat Sigma.

Plasmidi ja siRNA transfektio

LNCaP maljattiin 6 kuopan astioihin antibioottivapaalle kasvualustaan ​​ainakin 48 h ennen transfektiota. Transfektoitiin LNCaP käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden (2 ug plasmidia ja 5 ui Lipofectamine 2000 per 9,5 cm

2 hyvin). siRNA-dupleksit ostettiin Invitrogen (sekvenssit taulukossa S1) ja transfektoitiin käyttäen Lipofectamine RNAiMAX tai Lipofectamine 2000 (100 pmol siRNA duplex ja 5 ui Lipofectamine per 9,5 cm

2 hyvin).

Generation solun ja kudoksen lysaatit

Solut irrotetaan kasvualustan trypsinoimalla seerumivapaassa DMEM 0,025% trypsiiniä (Gibco), ja trypsiini inaktivoitiin lisäämällä DMEM, joka sisälsi 10% seerumia. Solut pelletoitiin sentrifugoimalla (500 x g, 5 min) ja pestiin kahdesti PBS: ssä. Pestiin solupelletit hajotettiin sitten jääkylmään Mammalian Cell Lysis Buffer (MCLB, 50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40). Kaikki lysaatit sisältävät 2 x pitoisuus Roche Complete EDTA-vapaa proteaasinestäjä. Perusteellinen pesu poistaa soluviljelmässä trypsiiniä ja lisäksi korkean pitoisuuden proteaasi-inhibiittorit ovat

kriittinen

havaita vahingoittumattomia BMCC1, joka on muutoin edellyttää nopeaa proteolyysiä. Tissue lysaatit syntyy homogenisoimalla MCLB, jauhamalla joka Kontes kooltaan 22 hioksellisella Dounce. Solujen ja kudosten lysaatit kirkastettiin sentrifugoimalla (17000 x g 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa). Aivokudoksen lysaatit altistettiin lisäkäsittely poistaa kerros kelluva lipidejä. Aivokudoksessa lysaatit erotettiin ja Biorad Micro Biospin suolanpoisto kromatografiapylväät, joka oli tasapainotettu ennalta MCLB, joka poisti tahmea liukenematonta materiaalia. Proteiinikonsentraatiot määritettiin käyttämällä Biorad, Lowry-proteiinimäärityksellä BSA standardeja.

Western blotting

Näytteet Laemelli SDS-PAGE latauspuskuria tehtiin standardi SDS-PAGE. Proteiinit siirrettiin Amersham nitroselluloosalle siirtopuskurissa (6 g /l Tris-emästä, 3 g /l glysiiniä, 0,36 g /l SDS, 20% metanoli) 100 W.H. Kalvot blokattiin estoliuoksessa (PBS-0,05% Triton-X100: 5% BSA tai PBS /0,07% Tween 20 kanssa 4% rasvatonta maitojauhetta). Membraanit tutkittiin käyttämällä 0,2 ja 5 ng /ul, että mainituilla vasta-aineilla estämään ympäristön lämpötilassa 2 tuntia tai 4 ° C: ssa yön yli, ja havaitaan käyttämällä HRP konjugoituja sekundäärisiä vasta-aineita ja Western Salama luminolin reagenssia (Pierce).

immunosaostus ja GST pulldowns

Solulysaatit edellä kuvatulla tavalla. Immunosaostukseen, lysaatit inkuboitiin puhdistetulla nolla tai BMCC1 vasta-aineita (0,5-2 ug vasta-ainetta per mg lysaattia) 4 ° C: ssa yön yli. BMCC1-vasta-aine-kompleksit saostettiin lisäämällä proteiini G agaroosia hartsia 2 h 4 ° C: ssa. GST pulldowns, lysaatit inkuboitiin BMCC1-GST-fuusioproteiinia silloitettua hartsia 4 ° C: ssa yön yli. Molemmissa tapauksissa, sitoutumattomien proteiinien pestiin hartsista 3 x 20 petitilavuus pesee kylmää lyysipuskuria. Saostuneet proteiinit eluoitiin lisäämällä 2 hartsin petitilavuutta SDS-PAGE-latauspuskuria. Sitten eluoidut proteiinit analysoitiin SDS-PAGE: lla ja Western blotting.

spektrometria

Hopeavärjätty geelipalat väri poistettiin 15 mM kaliumferrisyanidia ja 50 mM natriumtiosulfaattia ja pestään vedellä. Pieces poistettiin vesi 25 mM ammoniumbikarbonaattia /50% asetonitriiliä ja tyhjökuivatetaan. Ne peräkkäin alennettu ja alkyloitiin 25 mM DTT ja 55mm jodiasetamidi, sekä 25 mM ammoniumbikarbonaattia. Gel palaset poistettiin vesi 25 mM ammoniumbikarbonaattia /50% asetonitriilillä ja kuivattiin uudelleen. Sitten ne nesteytyksestä on 20 ng /ul sekvenssointilaatua trypsiiniä (Promega) 40 mM ammoniumbikarbonaattia /10% asetonitriili, täydennettiin kuivumisen estämiseksi ja hajotettiin yön yli 37

° C. Peptidit uutettiin pesemällä kappaletta 0,1% TFA. Eluoidut peptidit ovat poistettiin suola käyttäen C-18-ZipTips (Millipore) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Peptidit sekoitettiin sitten MALDI matriisi (Bruker) ja analysoitiin käyttäen Bruker Ultraflex positiivisionisella heijastin tilassa MS /MS toleranssi 100 ppm. Analyysi suoritettiin talon käyttäen Mascot, etsimällä vastaan ​​2012 nisäkkään kuin tarpeeton tietokanta, joka mahdollistaa default translaation jälkeisiä modifikaatioita ja jopa jäi trypsiinipilkkomiskohdan [17].

puhdistus mikrosomeja

LNCaP-solut erotettiin ydin- ja sytoplasman fraktiot douncing hypotoniseen liuokseen, kuten aikaisemmin on kuvattu [16]. Mikrosomeja puhdistettiin sytoplasminen uute ultrasentrifugoinnilla (100000 x g 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa käyttäen Beckman SW55Ti roottori). Mikrosomeja suspendoitiin uudelleen SDS-hajotuspuskuriin (2% SDS, 1 mM DTT: tä, 125 mM Tris, pH 6,8) ja selvitetty 17000 x g 20 min. Sytosoliin konsentroitiin 1/10 alkuperäisestä tilavuudesta käyttäen 10K cut-off keskipako- suodatinyksikön (Millipore) ennen SDS-PAGE.

Immunohistologiset värjäystä

Tavallinen immunohistokemia värjäys menettelyä noudatettiin. Parafinoidut leikattiin 4 um ja asennettiin 5-aminopropyylitrietoksisilaania (AAS) päällystetty dioja, jotka sen annetaan kuivua yön yli. Parafiini upotettujen leikkeiden poistettiin vaha ksyleenillä ja käsiteltiin mikroaaltolämmitykselle 60 ° C: ssa 20 minuutin ajan sitraattipuskurissa (2,1 g /1000 ml, pH 6,0) antigeenin haku. Jälkeen estää endogeenisen peroksidaasin, pesu fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) ja esto ei-spesifisen sitoutumisen sekundaarisen vasta-aineen kanssa normaalin sian seerumissa, rutiini streptavidiini-biotiini-peroksidaasi-immunovärjäyksellä diaminobentsidiinillä on sovellettu. Leikkeitä inkuboitiin yön yli BMCC1 Ab-3. Ensisijainen vasta-aine, joka on substituoitu PBS kohdissa, käytettiin negatiivisina kontrolleina. Leikkeet vastavärjättiin Harris hema-. Koska BMCC1 tiedetään olevan positiivinen eturauhasen hyvänlaatuisen kudoksissa, ydin eturauhasen kudoksen hyvänlaatuisesta liikakasvusta sisällytettiin positiivisena kontrollina kuhunkin array.

pisteytys on BMCC1 proteiinin ilmentymisen soluissa kudosten 74 potilaasta perustuu solujen osuus värjättiin BMCC1 polyklonaalisella vasta-aineella ja intensiteetti tahra solujen sisällä. Värjäys intensiteetti pisteytettiin asteikolla: Ei värjäystä, lievä, kohtalainen ja vahva. Kaikki näytteet analysoitiin mukaisesti mikroskooppinen tutkimus käyttäen Olympus mikroskooppia (malli: BX40), suurennuksella x200.

Immunofluorescence ja mikroskopia

Solut ympättiin steriili peitelasit vähintään 24 tuntia ennen kiinnitys. Imettiin ja solut pestiin kerran PBS: ssä ennen silloittumista (PBS: ssä, jossa oli 10% foramlin 10 min huoneenlämmössä). Fiksatiivi poistettiin ja solut pestiin PBS: ssä ennen läpäiseväksi ja esto PBS 0,05% Triton-X100 ja 5% FBS. Sitten solut värjättiin 0,4 ja 2 ng /ul ilmoitettu primaaristen vasta-aineiden ympäristön lämpötilassa 2 tuntia tai 4 ° C: ssa yön yli. Laji Hyväksytty puhdistettu IgG käytettiin sopivana kontrollina vasta-ris- /adsorptio. Kaikki vasta-aineet havaittiin käyttämällä asianmukaisia ​​Alexafluor488 tai Alexafluor 594 aasi-vasta-aineita. Konfokaalimikroskopia suoritettiin Zeiss LSM710. Co-lokalisointi kvantifioitiin käyttäen Zen 2011 ohjelmistoa. Päällekkäisyys kerroin /päällekkäisyys kerroin jälkeen Mandersia menetelmä tunteeton eroja signaalin intensiteettiä, käytettiin määrällisesti kolokalisaation kuvan pareittain.

Transferrin oton

LNCaP ympättiin steriili peitelaseja 24h ennen merkinnöissä. Pulse-chase oton konjugoidun transferriini-reseptori-kompleksin (Tf-R) suoritettiin oleellisesti, kuten on kuvattu Aschenbrennerin et al. [18]. Lyhyesti, soluja seerumia seerumittomassa media (fenolipunattomalla DMEM-F12, Life Technologies), 2 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Pintaan tarra solut konjugoiduilla transferriinin solut pantiin jäihin 30 min sitten inkuboitiin 20 ug /ml Alexafluor-594 konjugoitua transferriini (Molecular Probes) laimennettu jääkylmään seerumivapaassa 30 min. Solut pestiin kahdesti jääkylmällä seerumivapaassa poistamaan sitoutumaton transferriini ja t = 0 peitelasit kerättiin BMCC1 immunofluoresenssilla, kuten on kuvattu. Loput peitelaseja jahtasi vuonna esilämmitettyä seerumivapaassa varten osoitetun ajanjaksojen ennen sadonkorjuuta. Ottoa konjugoitu transferriini-reseptori-kompleksin suoritettiin myös käyttäen samanlaista menetelmää kuin Boucrot et ai. [19]. Soluja huuhdeltiin kerran DMEM-F12 /5% FCS sitten inkuboitiin 10 minuuttia 10 uM Alexafluor-594 konjugoitu transferriini DMEM-F12 /5% FCS: ää. Sitten solut pestiin jääkylmällä PBS: llä ennen korjataan immunofluoresenssimenetelmällä.

Tulokset

BMCC1-1 ilmennetään tietyissä syövissä

hBMCC1

on suuri ja monimutkainen transkription yksikkö, jossa käytetään rutiininomaisesti eturauhassyövän biomarkkereiden

hPCA3

upotettu

BMCC1

introni 6.

BMCC1

on aiemmin selityksin erillisinä

PRUNE2

ja

BNIP

geenejä reunustavat

pCA3

, jossa eksogeeninen ilme perustuu tutkimuksiin heijastaa tätä. Viimeaikaiset tulokset ovat osoittaneet, että

BMCC1

tuottaa transkripti (merkitty BMCC1-1), joka ulottuu upotetun antisense

pCA3

geeni [5,8]. Tässä osoitamme, että BMCC1-1 RNA ilmentyy 10/10 pCA3 positiivinen eturauhassyövän kudosnäytteistä (kuvio S1).

Olemme aiemmin osoittaneet, että eturauhasen syöpä LNCaP ilmentää suuria tasoja sekä BMCC1- 1 ja pCA3 RNA: t [5]. Laajentaa näitä tutkimuksia endogeenisen BMCC1 proteiinia, me syntyi useita polyklonaalisten vasta käyttäen rekombinanttisesti ilmaistu fragmentteja BMCC1 antigeeneinä (kaavamainen kuvassa S2, kloonaus alukkeet taulukossa S1). Nämä vasta-aineet käytettiin osoittamaan, että

BMCC1

tuottaa 300 kDa: n proteiinin LNCaP (kuvio 1). Koko tämän proteiinin vastaa kyseistä ennustaa BMCC1-1 cds ja käännetty peptidisekvenssi (

eli

3088 aminohappoa, ~ 340 kDa). 340 kDa: n BMCC1 proteiini havaittiin sekä C-terminaalisen Ab-1 (esitetty aminohapposekvenssejä vastaan ​​2345-2705) ja N-terminaalinen Ab-3 (esitetty aminohapposekvenssejä vastaan ​​1-369) LNCaP-soluissa. Tämän proteiinin ilmentyminen ei ole havaittu pCA3 negatiivinen eturauhassyöpäsolulinjoissa PC3, DU145, ALVA, RWPE-I (kuvio 1A). BMCC1 ekspressio oli myös poissa pCA3 rintasyöpä MCF7. BMCC1 ei havaittu normaalien solujen, kuten olemme aiemmin raportoitu [5]. Identiteetin 340 kDa: n vyöhykkeen vahvistettiin immunopresipitoimalla BMCC1 peräisin LNCaP uutteet käyttäen Ab-3, jonka jälkeen Western blot tunnistus Ab-2 (nostatettu aminohappo 222-276) (kuvio 1 B). Spesifisyys BMCC1 tunnistus varmistettiin lisäksi ohimenevä ehtyminen BMCC1 ilmaisun siRNA ja havaitseminen useita vasta-aineita. BMCC1 siRNA transfektio aiheutti dramaattinen väheneminen intensiteetti 340 kDa: n proteiinijuovana havaita sekä C- ja N- terminaalinen vasta-Ab-1 ja Ab-3 (kuvio 1C). Tämä tukee immunosaostus tiedot uskottavasti osoittaa, että

BMCC1

on proteiinia koodaavan geenin, joka tuottaa 340 kDa proteiinia pCA3 ilmentävät LNCaP. Emme havainneet ilmentymisen siRNA herkkiä anti-BMCC1 reaktiivinen bändejä alemmilla molekyylipainot, mikä osoittaa, että BMCC1-1 proteiini on hallitseva geenituote eturauhassyöpäsoluissa (tuloksia ei ole esitetty). BMCC1-proteiinin ekspressiota ei havaittu useissa solulinjoissa, jotka ovat peräisin neuroblastooma, rinta- ja munasarjasyövän (tuloksia ei ole esitetty). BMCC1 proteiini havaittiin 3/5 ensisijaisen melanoomasolulinjoja, ja joissakin tapauksissa dubletti havaittiin (kuva S3). Identiteetin nauhojen melanoomasolulinjoja osoitettiin voimakkaasti havaitsemalla BMCC1 vasta-aineiden kanssa eri alueiden proteiinin, Ab-1 ja Ab-3. Tämä osoittaa, että BMCC1 voisi olla rooli muissa elimissä.

. BMCC1 immunoblottaus koko solu-uutteiden. 30 ug lysaattia solulinjan alistettiin 5% SDS-PAGE. BMCC1 ekspressio havaittiin käyttäen kanin vasta-aineita vastaan ​​aa 2345-2705 (C-terminaali, kanin anti BMCC1, Ab-1), ja toinen vasta-aine, Ab-3, joka tunnistaa N-pään BMCC1. DNA PKcs käytettiin latauskontrollina.

B. Immunosaostus BMCC1 peräisin LNCaP yhteensä lysaatin. BMCC1 immunosaostettiin inkuboimalla 1 mg LNCaP lysaattia 1 ug Ab-3: ssa 8 tuntia 4 ° C: ssa ja sen jälkeen saostamalla proteiini G agaroosilla. Epäspesifinen (NS) IgG käytettiin sijasta Ab-3 kontrollina IP. Pesty hartsi eluoitiin SDS-PAGE täyteväriä ja Länsi blotatun. IgG raskaan ketjun (lastaus) osoittaa yhtä suuri vasta-tulo.

C. Ehtyminen BMCC1 ilmentymisen siRNA. LNCaP-solut transfektoitiin BMCC1 siRNA 1730 (siBMCC1) tai kontrolli-siRNA: (siControl). Yhteensä lysaattia kerättiin 3 päivää transfektion jälkeen ja BMCC1 ilmentyminen analysoitiin Western-blottauksella BMCC1 Ab-1 (C-terminaali) ja Ab-3 (N-terminaalinen). Täplää oli täysin riisuttu toisiaan seuraavien antureista. RNA-polymeraasi II on latauskontrollina.

Machida et al. [7] ja Li et al. [12] käytetään

in situ

-hybridisaatio hiiren alkioiden osoittaa, että BMCC1 RNA ilmentyy pääasiassa hermokudoksessa, ja Zhou et al. [20] käytetään PCR hiiren kudoksen RNA osoittaa, että ainakin BCH domeeni on ilmaistu useita kudostyyppejä. Iwama et ai. [8] käytetään PCR-alukkeet kattavat koko geeni osoittaa vahvaa ilmaisua takajuuren hermosolu välituotteen ilme koko aivojen, selkäytimen, eturauhanen ja kohtu ja heikkoa ilmentymistä muissa kudoksissa. Puuttumaan tähän epäkohtaan konstitutiivisen vs. rajoitettu RNA ilmaisun, ja saada lisätietoja proteiinin ilmentymisen ja otaksuttu saumattu geenituotteita, me immunoblotattiin proteiinilysaattien paneelista aikuisen hiiren kudoksissa käyttäen BMCC1 Ab-4. Tässä ei-kasvaimia asetus havaitsimme vahva ~ 80 kDa aivoissa kudoksissa, pienemmillä ilmaus pienemmän 72 kDa: n vyöhykkeen (kuva S4). 52 kDa BMCC1s tunnistetaan Arama et al. [11] ei havaittu tässä, koska antigeenin Ab-4 ulottuu aminohappoa 2192-2433 on BMCC1-1 ja ei sisällä mitään osaa BMCC1s (katso kuva S2). Vahvista ilmentymisen BMCC1 Eturauhassyöpätutkimuksessa kasvain ympäristössä, immunohistologinen värjäys eturauhassyöpäkudoksille suoritettiin käyttämällä Ab-3. Vähäinen BMCC1 värjäytyminen havaittiin eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun rauhasepiteeliin ja strooman, jossa vahvempi värjäytyminen havaittiin rauhasepiteeliin eturauhasen kasvaimia (kuva S5).

BMCC1 vuorovaikutuksessa AP-2 eturauhassyöpäsoluissa

jotta saadaan käsitys solun funktio BMCC1, vuorovaikutuksessa proteiinien tunnistettiin puhdistus BMCC1-GST affiniteettihartsien. Olemme syntyy limittyneitä BMCC1-GST kloonien pGEX jotka kattavat täyspitkän cDNA: n (taulukko S1). Yhdistelmä-DNA-proteiinit ilmennettiin ja silloitettu glutationi-agaroosi tuottaa sarjan affiniteetti matricies vuorovaikutuksessa proteiineja. Silloitettu GST-BMCC1 fuusiota hartsit inkuboitiin yhteensä LNCaP lysaatin puhdistamaan BMCC1 interactors. Hartsi liittyvät proteiinit eluoitiin, ratkaistaan ​​ja visualisoidaan hopeavärjätyssä SDS-PAGE. BMCC1 GST fragmentit 1-2 ja 4-10 veti alas erilaisia ​​proteiineja usein todettu epäspesifisiä tai toimimattomia interactors. Näitä ovat eEF1γ, 40S ribosomaalinen proteiini, GRP75 ja GRP78 (tietoja ei ole esitetty). BMCC1 GST F3 (aminohapot 575-904) saostetaan tietyillä taajuusalueilla 50 kDa: n ja 110 kDa: n (kuvio 2A). 50 kDa ja 110 kDa vuorovaikutuksessa bändejä leikattiin irti ja tunnistettiin massaspektrometrillä (MALDI MS /MS: llä Bruker Ultraflex III). Yhteenveto Mascot hakutietoja on esitetty taulukossa S2. Tämä osoitti, että BMCC1-F3 on vuorovaikutuksessa useiden jäsenten Adapter Liittyvät proteiini Complex 2 (AP-2). AP-2 kompleksi on endosomissa liittyvä heterotetrameeri joka koostuu kolmesta eri konstitutiivisen komponentteja (AP-2S1, AP-2M1 ja AP-2B1 /β-adaptiiniproteiinin) ja toinen kahdesta toisensa poissulkevia osia (AP-2A1 tai AP-2A2) [ ,,,0],21]. 50 kDa: n BMCC1-F3 vuorovaikutuksessa proteiini tunnistettiin AP-2M1, joka perustuu kahden erillisen tunnisteita, joissa on yhteensä 8 ei-päällekkäisten peptidien (taulukko S2). 110 kDa BMCC1 vuorovaikutuksessa bändi sisälsi sekoitus kolmen suuren molekyylipainon AP-2 kompleksin jäsentä: AP-2A1, AP-2A2, ja AP-2B1 (taulukko S2). AP-2B1 tunnistettiin kaksi näytettä, joissa on yhteensä 5 ainutlaatuinen peptidejä. Homologia AP-2A1 ja AP-2A2 tekee yksilöllinen tunnistukset kompleksi (kuvio S6). AP-2A1 tunnistettiin 3 näytettä, joissa on yhteensä 6 peptidit, jotka eivät vastaa AP-2A2. AP-2A2 tunnistettiin yhdessä näytteessä yksi peptidi ei johdu AP-2A1. Näiden näytteiden kolme yksittäisten peptidien voinut vastasi joko AP-2A1 tai AP-2A2 ja ei voida katsoa johtuvan varmuudella jompikumpi vuoksi identtisyys (taulukko S3). Ei laskennallisesti tunnistettavissa verkkotunnuksia voisi johtua tällä alueella, joten toiminnallinen vuorovaikutus kartoitus BMCC1 on tunnistanut uuden proteiinin-proteiini-vuorovaikutuksen motiivi. Vuorovaikutusta BMCC1 ja AP-2 kompleksin vahvisti samanaikainen immunosaostus. BMCC1 immunosaostettiin LNCaP lysaateista ja tuloksena vuorovaikutuksessa proteiinit eluoitiin ja analysoitiin Western blottauksella (kuvio 2B) paljastaa, että endogeeninen BMCC1 vuorovaikutuksessa β-adaptiiniproteiinin ja AP-2A1 /2 (kuvio 2B). Endogeeninen vuorovaikutus BMCC1 ja AP-2 kompleksi esitetty todennettua BMCC1 immunosaostuksella solulysaateista soluista, jotka olivat olleet BMCC1 köyhtynyt siRNA. 340 kDa: n vyöhyke havaittiin korkean molekyylipainon ratkaisemiseksi Coomassie värjätyn geelin (kuvio 2C). Tämä kaista on pienennetty intensiteetin immunosaostumalla BMCC1 köyhdytettyä solujen kontrolliin verrattuna siRNA soluja. Vaikka immunosaostus ei määrällistä lähestymistapaa, tämä alennettu intensiteetti ohjataan kaistan valinta myöhempää MS-analyysiä. Tunnistaminen Tämän bändin BMCC1 varmistettiin MALDI-TOF /TOF of trypsiinipeptidit leikatusta geelileikkeessä. Tärkeää on, että äärimmäisen BMCC1 N-terminaalinen peptidi TEFNYFTETR, ei ole läsnä katkaistun isomuodon (BMCC1-3) raportoineet Machida et ai. [7] tunnistettiin näiden joukossa (taulukko S4). Tämä edellyttäen

de novo

näyttöä BMCC1-1 proteiinin ilmentymisen LNCaP. Interaktioprofiileihin BMCC1 tutkittiin Western blotting nämä immunopresipitaateista AP-2A1 /2 ja β-adaptiiniproteiinin. Yhdenmukainen alentuneeseen BMCC1 proteiinin siBMCC1 immunoprecipate, vähentää signaalit AP-2A1 /2 ja β-adaptiiniproteiinin havaittiin sakka siBMCC1 lysaatista kuin kontrolli lysaattia. Tämä lisätodisteita, että nämä proteiinit spesifisesti vuorovaikutuksessa BMCC1 (kuvio 2C).