Krooninen sairaus

tiivistelmä

Johdanto

Kemoterapia -aiheiset endoteelin vaurioita edistää varhaista kehitystä sairastua sydän- ja verisuonisairauksiin kivessyöpä potilailla. Meidän tavoitteena oli tunnistaa asiaankuuluvat mekanismit ja etsi ehdokas biomarkkereita tämän endoteelin vaurioita.

Methods

Human mikro-verisuonten endoteelisolujen (HMEC-1) altistettiin bleomysiinin tai sisplatiinin kanssa käsittelemättömiä näytteitä kontrollina. 18k cDNA mikrosiruja käytettiin. Geenien ilmentyminen eroja analysoitiin yhden geenin tasolla ja geenien sarjaa ryhmittyneet biologisten reittien ja vahvistanut qRT-PCR. Proteiini tasojen ehdokkaan biomarkkereiden mitattiin kivessyöpä potilaan plasma ennen, aikana ja jälkeen bleomysiini-etoposidi-sisplatiini-kemoterapian ja liittyvät endoteelisolujen vaurioita biomarkkerit (von Willebrand -tekijän (vWF), erittäin herkkä C-reaktiivinen proteiini (hsCRP)) .

tulokset

Microarray data tunnistettu useita geenejä erittäin differentiaalikaavojen; esim. Kasvuerilaistumistekijä 15 (

GDF-15

), aktivoiva transkriptiotekijä 3 (

ATF3

) ja amfireguliini (

AREG

). Pathway analyysi paljasti voimakkaan assosiaatioita ”p53” ja ”diabetes” geenin sarjaa. Huomioon tunnetut toiminto, mittasimme GDF-15-proteiinin tasot 41 kiveksen potilailla aikana kliinistä seurantaa. Pre-kemoterapian GDF-15 tasoa vastasi valvontaa. Läpi kemoterapiaa GDF-15, vWF ja hsCRP nousivat, ja korreloivat eri ajankohtina.

Johtopäätös

Puolueeton lähestymistapaa prekliinisessä mallissa paljasti liittyvistä geeneistä kemoterapian aiheuttama endoteelisolujen vaurio , kuten

GDF-15

. Kohonneet plasman GDF-15 tasoa kivessyöpä potilailla kemoterapian aikana ja sen yhdessä vWF ja hsCRP viittaavat siihen, että GDF-15 on mahdollisesti hyödyllinen biomerkkiaine liittyvät endoteelin vaurioita.

Citation: Altena R, Fehrmann RSN, Boer H, de Vries työryhmältä Meijer C, Gietema jA (2015) kasvuerilaistumistekijä 15 (GDF-15) plasmassa suurenevat aikana Bleomycin- ja sisplatiini-Based hoito kivessyöpä Potilaat ja liittyvät endoteelivaurion. PLoS ONE 10 (1): e0115372. doi: 10,1371 /journal.pone.0115372

Academic Editor: Ramon Andrade de Mello, Algarven yliopisto, PORTUGALI

vastaanotettu: toukokuu 27, 2014; Hyväksytty: 21 marraskuu 2014; Julkaistu: 15 tammikuu 2015

Copyright: © 2015 Altena et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tuki tarjosi RUG 2009-4365 Alankomaiden Cancer Society. Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

käyttöönotto platinapohjaisen kemoterapian luvun lopulla Seitsemänkymmentäluvun on johtanut korkeisiin paranemisaste metastasoituneen kivessyöpä. Tämä kuitenkin kemoterapia aiheuttaa sivuvaikutuksia, jolloin sairastuvuuden onnistuneesti hoidettu perhe [1]. Tarpeelliset asiat ovat lisääntynyt riski toisen maligniteettien ja sydän- ja verisuonitautien (CVD) [2-5]. CVD voi syntyä aikana tai pian hoidon jälkeen [6, 7], sekä vuosia vuosikymmeniä myöhemmin [3-5, 8-11].

Yksi mekanismien mukana kehittämässä tämän hoitoon liittyvä CVD on suora endoteelin vaurioita. Sen lisäksi, että induktio endoteelisolujen kuolemaan [12-14], sekä Bleomysiini [14-16] ja sisplatiinin [14, 17-19], vaikuttaa välillisesti endoteelisolujen toiminnon, esim. häiritsemällä tulehduksellinen ja fibrinolyyttisen tekijöistä. Lopulta tämä kemoterapiaindusoitu soluaktivaation voi edetä endoteelin toimintahäiriötä, kiihtyneen ateroskleroosin ja selvä CVD.

varhainen tunnistaminen ja mahdollisesti ehkäisy näiden hoitoon liittyviä komplikaatioita ovat kriittisiä säilyttää optimaalisen terveyden edellytys kivessyöpä eloonjääneitä. Kehittäminen CVD on asteittainen prosessi, ja varhaisvaiheen toimenpiteet tai tehostetun seulonta voi hidastaa tai pysäyttää etenemisen kohti taudin kliinisiä sairastuvuutta. Biomarkkereita hoitoon liittyviä endoteelin vaurioita voi tunnistaa ne potilaat, joilla on lisääntynyt riski CVD.

Tässä tutkimuksessa back-käännetään kliininen havainto, että bleomysiini ja sisplatiini indusoivat endoteelisolujen vaurioita. Käytimme puolueeton lähestymistapa analysoimalla cDNA microarray tulokset tunnistaa uusia geenejä, jotka liittyvät kemoterapiaan liittyvää endoteelisolujen vaurioita. Geeniekspressioprofiilit muodostettiin ihmisen mikrovaskulaaristen endoteelisolujen line (HMEC-1) ennen ja jälkeen hoidon bleomysiinin ja sisplatiinin eri ajankohtina ja pitoisuudet. Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR) suoritettiin vahvistamaan geenejä merkittäviä ilme eroja useissa koeasetelmia. Seuraavaksi huomioon tunnetut tehtävä näiden geenien kirjallisuudessa, valitsimme yhden näistä kandidaattigeenit lisävalidointia todisteena periaatteen proteiinin tason kivessyöpä potilaan kohortissa. Tämän translaationäkökulmasta pyrittiin tunnistamaan mekanismeja ja mahdollisia biomarkkereita kemoterapiaa liittyviä endoteelin vaurioita.

Materiaalit ja menetelmät

Solun viiva malli

HMEC-1 on ikuistettu ihmisen ihon mikro-verisuonen endoteelisolujen linja, joka säilyttää morfologisia ja toiminnallisia endoteelisolujen ominaisuuksia aikana useita kohtia [20]. Soluja kasvatettiin, kuten yksikerroksinen MCDB-131-alustassa (Invitrogen, Merelbeke, Belgia), jota oli täydennetty 10% vasikan sikiön seerumia (Bodinco, Alkmaar, Alankomaat), 10 mM L-glutamiinia (Invitrogen, Merelbeke, Belgia), 1 ug /ml hydrokortisonia (Sigma-Aldrich, Amsterdam, Alankomaat) ja 10 ng /ml ihmisen orvaskeden kasvutekijän (R bleomysiini 0,06 ug /ml tai sisplatiinia 0,52 uM) kaksi kertaa viikossa; solut kerättiin analyysiä varten 30. päivänä (S1B Fig.). Sisplatiinin antamisen täytyi keskeyttää, jos 7

th annon takia huomattavan solukuolemaa, mutta jatkettiin koko annosta sen jälkeen. Bleomycin voidaan antaa keskeytyksettä.

cDNA microarray kokeiluja

Yhteensä-RNA eristettiin HMEC-1, jonka RNeasy (Qiagen, Venlo, Alankomaat) ja yhdistettiin kerta-pisteen ja huumeiden 2 itsenäisestä kokeesta. Puhdistuksen jälkeen (Qiaquick PCR-puhdistuskittiä, Qiagen, Venlo, Alankomaat), monistettiin RNA: ta (cRNA) näytteet muunnettiin cDNA käänteistranskriptaasin, itsenäisesti leimattu Cy3 (vihreä) ja Cy5 (punainen), ja satunnaisesti hybridisoitiin asiak- valmistettu 18K cDNA mikrosiruja. Fluoresenssikuvia mikrosirun diat saatiin Affymetrix GMS428 skanneri (Affymetrix, Santa Clara, CA) molemmille fluoroforit, signaali intensiteetit kunkin täplän kvantifioitiin omistettu IMAGENE 5,6 ohjelmisto (Biodiscovery, Marina del Rey, CA).

rikvantiilin normalisointi levitettiin log2 muuttaneet Cy3 ja Cy5 intensiteettiä. Operon v2.0 (Human Genome Oligo Set V2) koetin tunnisteet muunnettiin viralliset HUGO geenin symboleja. Expression arvot useiden koettimien kohdistaminen yhden geenin otettiin keskiarvo, jolloin yhteensä 15950 ainutlaatuisia geenejä. Myöhemmin ilme saadut tiedot useista hybridisaatiot (

n

= 4) saman HMEC-1 näyte otettiin keskiarvo.

Tiedot on talletettu NCBI: n Gene Expression Omnibus (GEO) ja ovat pääsee GEO sarjan Liittymisnumero GSE62523 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE62523).

Class vertailu

”akuutti” valotusasetuksin, ilmentyvät eri geenien välillä HMEC-1 käsittelemättömiä näytteitä ja näytteet altistettiin eri lääkeannoksina (eli IC

50 ja IC

90) testattiin epäparametrinen Cuzick testi lineaarisen trendin , tuloksena on

Z

pisteet ja

P

arvo. Tämä koe tehtiin solujen jälkeen kerättyjen 6 (

t

= 6), 24 (

t

= 24) ja 48 (

t

= 48) tuntia. Kaikkien kolmen ajankohtina

Z

saaduilla tuloksilla Cuzick testit lineaarinen trendi oli tiivistää (eli

ΣZ

=

Z

t = 6

+

Z

t = 24

+

Z

t = 48

); jolloin valitaan geenien sillä rajoituksella, että muutokset ilmentyminen johdonmukaisella suuntaan kasvavien pitoisuuksien kanssa ajan myötä. Geenejä paremmuusjärjestykseen

ΣZ

pisteet.

”krooninen” valotusasetuksen, T-testi suoritettiin geeniekspressiotasot näytteistä saatujen altistuvat huumeiden (IC

10 sisplatiini tai IC

10 bleomysiini) verrattuna käsittelemättömään kontrolliin näytteistä, jotka oli kerätty 30 päivän jälkeen inkubaation. Tulokset näistä geeneistä oli luokiteltu

P-

arvo.

Gene Set rikastus Analysis

Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) [23] toteutettiin kanssa GSEA 2.0 -ohjelmisto paketti (Broad Institute, Cambridge, MA). Expression tiedot kaikista 15950 geenit verrattiin toiminnallinen geeni asettaa onko jokin näistä sarjaa rikastuneet HMEC-1 käsitelty bleomysiinin tai sisplatiinin ”akuutti” sekä ”krooninen” valotusasetuksesta. Vertailu suoritettiin käyttäen 169 geeniä settejä Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomit tietokanta (Kegg; https://www.genome.jp/kegg/). Tilastollinen merkitys rikastaminen määritettiin käyttäen empiiristä geenipohjaisten permutaatio -testi 1000 permutaatiot. Väärä löytö määrä (FDR) laskettiin kullekin toiminnallinen geeniperimä, jotka edustavat arviolta todennäköisyys, että tietty rikastamiseen pistemäärä väärä positiivinen löydös. Raportoimme geeni sarjaa, jossa on FDR ≤ 0,10 ja

P

≤ 0,025.

kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR

Differential ilmentymistä kolme geeniä oli vahvistanut qRT-PCR. Tätä varten RNA-näytteet sisältyvät cDNA microarray-analyysi käytettiin. Lisäksi kaksi erillistä koetta suoritettiin, joissa HMEC-1 altistettiin sisplatiiniin ja bleomysiini mukaan ”akuutti” -exposure ympäristössä. RNA-näytteet eristettiin sen jälkeen, kun 6, 24 ja 48 tunnin altistuksen lääkkeet (S1A kuvio.). Kaikki RNA-näytteet olivat DNaasi käsitelty poistamaan genominen DNA-kontaminaation, ja sen jälkeen, RNA käänteiskopioitiin cDNA: ksi. qRT-PCR suoritettiin käyttäen Applied Biosystems Taqman mukaan valmistajan protokollan. Master Mix, alukkeita ja Taqman ostettiin Applied Biosystems (Nieuwerkerk a /d IJssel, Alankomaat). Kolme geeniä, erittäin differentiaalikaavojen kolmessa neljästä koeasetelmia, katsottiin uskottavalta ehdokkaita qRT-PCR validointi. Geenit ja niiden Taqman geeniekspression määritystä luvut olivat kasvuerilaistumistekijä 15 (

GDF-15;

Hs00171132_m1), aktivoiva transkriptiotekijä 3 (

ATF3;

Hs00231069_m1), amfireguliini (

AREG;

Hs00155832_m1); Lisäksi ilmentyminen housekeeping-geenin Glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi (

GAPDH

; Hs02758991_g1) määritettiin. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena käyttäen ABI PRISM 7900 HT Sequence Detection System, seuraavat sykliolosuhteita: 2 min 50 ° C: ssa, 10 min 95 ° C: ssa, mitä seurasi 40 sykliä, joissa 15 sekuntia 95 ° C: ssa ja 1 min 60 ° C. Suhteellinen määrä kohdegeenien laskettiin jakamalla syklin keskimääräisen kynnyksen (CT) ja kiinnostavan geenin keskiarvolla CT-arvo taloudenhoito geeni

GAPDH

. Suhteelliset ilmaisu-erot laskettiin vertaamalla ilmentymisen perustason aikapisteessä (t = 6, S1A Fig.). Kaksipuolinen t-testiä käytettiin vertaamaan ilmentymis- eroja. P-arvot 0,05 katsottiin osoittavan merkittävä ero.

GDF-15-proteiinin tasot kivessyöpä potilaiden plasman aikana ja sen jälkeen bleomycin- ja sisplatiini-kemoterapian

kliinisesti vahvistaa havainnot solulinjasta mallia, käytimme kohortin 41 kivessyöpä potilaat, jotka osallistuivat ennakoiva tutkimus varhaisen kemoterapiaa liittyviä sydänverisuonimuutoksia aikana bleomycin- ja sisplatiini-. Potilaat voivat saada tutkimukseen, oli metastasoitunut kivessyöpä, olivat 18-50 vuotta vanhoja ja saivat ensimmäisen rivin sisplatiini-kemoterapian yliopiston Medical Centre Groningen, Alankomaat. Hylkäämisperusteet olivat edellisen kemoterapiaa tai sädehoitoa, läsnäolo CVD, käytön erytropoietiinin ja glomerulusfiltraatio 60 ml /min. Paikallinen eettinen komitea hyväksyi tutkimuksen ja kirjallinen suostumus saatiin kaikilta osapuolilta. Riippuen niiden kansainvälistä sukusolujen Cancer Collaborative Group (IGCCCG) ennusteen ryhmä, potilaat saivat joko kolme tai neljä BEP mittaisia ​​3 viikkoa kunkin (bleomysiini-30 USP, päivää 2, 8 ja 15, etoposidi-100 mg /m

2 , päivinä 1-5) ja sisplatiini-20 mg /m

2, päivinä 1-5). Ensimmäisen 6 päivää potilasta sammutettua 4 L NaCl 0,9% /vrk ja saivat päivittäin antiemeettihoidolla (deksametasoni, ondansetroni). Otettiin verinäytteitä päivänä 1, 8 ja 15 ensimmäisen kemoterapiaa tietenkin päivä 1 ja 8 toisen ja kolmannen tietenkin (c1d1 (= lähtötilanteessa), c1d8, c1d15, c2d1 jne), yhden kuukauden kuluttua valmistumisen ja vuoden kuluttua kemoterapian aloittamista. EDTA plasma sarjaan kerätty ja tallennettu -20 ° C: ssa analyysiin asti. Viite tiedot saatiin terveen miehen sisarukset aikuisten lapsuusiän syövän sairastaneet, jotka olivat osallistuneet kuin verrokeilla in poikkileikkaus tutkimus myöhässä sydän- jälkiseurausten hoitoon lapsuusajan syöpä [24]. Näistä terve mies sisarukset, kontrolliryhmään, joiden kummankin mediaani-ikä kuin kivessyöpä potilaat valittiin. Mittaukset kontrollit tehtiin kuten edellä on kuvattu.

Plasma GDF-15-proteiinin tasot määritettiin sandwich entsyymi-immunosorbenttimääritys (ELISA), jossa on kaupallisesti saatavaa reagenssipakkausta (R Wilcoxonin n allekirjoittama rank testiä käytettiin pariksi muutoksia. Kaksipuoliset P-arvot ≤ 0,05 katsottiin osoittavan merkitystä, SPSS ohjelmistopaketti versio 22 (SPSS Inc., Chicago, IL) käytettiin.

Tulokset

cDNA microarray

Class vertailua. Top 50 Useimpien ilmentyvät eri geenien ”akuutti” ja ”krooninen” valotusasetuksen bleomysiini ja sisplatiini on koottu taulukkoon 1. Kuva. 1 esittää Venn kaavio päällekkäisten geenien top 50: n neljästä eri valotusasetuksilla. Tämän analyysin kolme geeniä, esim.

GDF-15

,

ATF3

ja

AREG

, havaittiin top 50 kolmessa neljästä valotusasetuksilla. Tämän vuoksi päällekkäisyys eri valotusasetuksilla katsoimme näiden kolmen geenin uskottavalta ehdokasta, ja nämä rajaukset tehtävän hyväksynnän qRT-PCR.

cDNA microarray-GSEA. Väylät on rikastettu vähintään FDR ≤ 0,10 ja

P

≤ 0,025 vuonna GSEA on yhteenveto taulukossa 2. ”akuutti” -exposure -asetus bleomysiini, kuusi väyliä rikastettiin (kaikki säädelty), kun taas mitään reittejä oli rikastettu ”krooninen” -asetuksen kanssa asetettu kriteerit FDR. Sisplatiini altistus johti 12 rikastettua pääsyväylistä ”akuutti” -exposure asetus (säädelty n = 3, alassäädetty n = 9), kun taas kuusi reittejä oli rikastettu ”krooninen” -exposure asetus (kaikki alassäädetty). The ’p53’ ja ’tyypin I diabetes ”geeni sarjaa rikastuneet kolmessa neljästä valotusasetukset; geenejä sisälly tähän geeniperimä on yhteenveto S1 taulukossa.

qRT-PCR

Validoida ilmentymisen muutosten

GDF-15

,

ATF3

ja

AREG

qRT-PCR suoritettiin. Kun ”akuutti” -exposure asetus, mRNA-ilmentyminen kaikki kolme geeniä lisääntyi ajan altistuksen jälkeen bleomysiini ja sisplatiini, yhdenmukaiset kanssa microarray data. 48 tunnin jälkeen altistuksen sekä lääkkeiden, mRNA: n ilmentymistä kaikissa kolmessa geenit oli merkittävästi suurempi verrattuna käsittelemättömiin kontrollisoluihin. Ei muutosta mRNA ilmentyminen näiden kolmen geenin esiintyi käsittelemättömän verrokin soluissa ajan (Fig. 2).

Plasma GDF-15-proteiinin tasot kivessyöpä saaneilla potilailla BEP-kemoterapian

Perustuu tietoihin kirjallisuudesta valitsimme GDF-15 edelleen validointi proteiinin taso plasmassa kivessyöpä potilaasta ja hoidon jälkeen, ja niihin liittyvät GDF-15 tasoa tunnettuihin plasma endoteelin vaurioita biomarkkerit (vWF, hsCRP) [25 , 26]. Lähtötilanteen ominaisuudet potilaista on yhteenveto taulukossa 3. Vaikka lyhyen välille merkitystä (p = 0,06), perustason (eli ennen kemoterapian aloittamista) GDF-15-proteiinin tasot kivessyöpä potilaat eivät eronneet terveistä samanikäisiin miehiin (Fig. 3A). Potilaat IGCCCG hyvää ennustetta ryhmä oli hieman alhaisempi lähtötilanteessa GDF-15-proteiinin tasot kuin potilasta väli- tai huonoon ennusteeseen ryhmät (hyvä ennuste: mediaani 362,9 pg /ml (alue +197,6-+1059,5; n = 33), väli- /huono ennuste: mediaani 689,1 pg /ml (alue +186,8-1935,0; n = 8);

P

= 0,04). Lähtötason GDF-15 taso ei ollut riippuvainen kasvain (vaihe 2 tautia: mediaani 373,0 pg /ml (alue +197,6-1935,0; n = 30), vaiheen 3 4 tauti: mediaani 486,4 pg /ml (alue +186,8-1875,9; n = 11);

P

= 0,40). Pre-kemoterapian GDF-15-proteiinin tasot eivät liittyneet (r

s = 0,08;

P

= 0,61).

. Plasma GDF-15-proteiinin tasot metastasoituneen kivessyöpä (n = 41) ennen alkua bleomycin- ja sisplatiini-kemoterapian verrattuna terveisiin samanikäisiin miehiin (n = 10); B. Plasma GDF-15-proteiinin tasot ennen, aikana ja jälkeen valmistumisen bleomcyin- ja sisplatiini-pohjainen kemoterapiaa kivessyöpä. Näytteen c1d1 piirretään ennen aloittamista kemoterapiaa. (*) P 0,05 verrattuna lähtötasoon tai ilmoitettu aika-pisteen.

aikana BEP-kemoterapiaa, GDF-15-proteiinin tasot nousivat lähtötilanteeseen verrattuna, huomattavasti korkeampi 1 kuukausi ja 1 vuosi post-kemoterapian ( Fig. 3B, taulukko 4). Verrattuna pre-kemoterapian plasmassa vWF ja hsCRP muuttuneet merkittävästi hoidon aikana (taulukko 4). Lähtien kemoterapian päättymisen jälkeen, vWF-tasot pysyivät jatkuvasti koholla, kun taas hsCRP palasi ennen kemoterapiaa arvoja. Lähtötilanteessa tasoja GDF-15 liittyi tasoja vWF (r

s = 0,35;

P

= 0,03) ja hsCRP (r

s = 0,39;

P

= 0,014). Kemoterapian aikana, tasot GDF-15 korreloi hsCRP at c1d8 (r

s = 0,44;

P

= 0,01) ja vWF: ään c3d8 (r

s = 0,40;

P

= 0,017). Tällä Seurantakäynti kuukauden kuluttua kemoterapian päättymisen, tasoja GDF-15 ja vWF olivat vahvasti korreloivat (r

s = 0,56;

P

= 0,001), kun taas tämä suhde ei löytynyt GDF-15 ja hsCRP (r

s = 0,18;

P

= 0,28). Vuoden kuluttua kemoterapian aloittamista, ei suhdetta GDF-15 tasoa ja vWF tai hsCRP (r

s = 0,28;

P

= 0,12; r

s = 0,10;

P

= 0,57) havaittiin.

keskustelu

tässä tutkimuksessa käytimme puolueeton translaationäkökulmasta kanssa cDNA microarray välineenä löytää uusia mekanismeja, jotka liittyvät ja valitse ehdokas biomarkkerit mukana in kemoterapiaindusoitu endoteelin vaurioita. Tämän

in vitro

strategiassa, löysimme useita yksittäisiä geenejä merkittäviä muutoksia ilmaisun altistuessaan bleomysiini ja sisplatiini. Kolme geeniä, joilla on vahva ilmaus erot kolmessa neljästä koeasetelmia,

GDF-15

,

ATF3

ja

AREG

, todensi qRT-PCR. Lisäksi GSEA paljasti klustereita geenien mukana useissa reittejä, kuten ”p53” ja ”tyypin I diabetes” geenin sarjaa, joka vaikutti tässä mallissa. Lisäksi osoitimme, että BEP-kemoterapian (bleomysiini, etoposidi, sisplatiini) todellakin vaikuttavat plasma GDF-15-proteiinin tasot kivessyöpä potilaat ja että nämä tasot liittyvät tunnettuihin endoteelin vaurioita biomarkkerit kuten vWF ja hsCRP.

Kun yhden geenin analyysi useiden geenien merkittävästi ilmentyvät differentiaalisesti erilaisia ​​kokeellisia asetuksia HMEC-1

in vitro

malli. Geenit

GDF-15

,

ATF3

ja

AREG

olivat 50 parhaan n useimpien differentiaalisesti ilmentyvien geenien kolmen neljän valotusasetuksilla.

sytokiini GDF-15 (tunnetaan myös nimellä Macrophage inhiboiva sytokiini-1 (MIC-1) tai NSAID aktivoitu geenin (NAG-1)) on jäsen Transforming Growth Factor β (TGF) perhe. GDF15 aiheutetaan kaikenlaisia ​​ärsykkeitä kuten sytokiinien, kemo- ja /tai sädehoidon ja vahingon kaikenlaisia ​​eri solujen ja kudosten [27-30]. Vapauttamista GDF-15 voi indusoida anti-inflammatorisia, anti-apoptoottiset ja antiproliferatiivisia vaikutuksia, joten se vaikuttaa vasculoprotective mekanismeja. Siksi korotukset GDF-15 plasmatasot meidän potilaan kohortissa voivat hyvinkin johtua tuotannon kasvun endoteelisolujen ja /tai makrofageissa, kompensoimaan kemoterapiaindusoitu vaurioita. Eräässä tutkimuksessa arvioidaan geeniekspression muutoksia eturauhassyöpänäytteissä edeltävistä ja dosetakseli /mitoksantroni hoito,

GDF-15

oli yksi eniten up geenien jälkikäsittely [31], mikä osoittaa, että sytostaatit voivat vaikuttaa

GDF-15

ilmentymistä sekä pahanlaatuisten ja ei-pahanlaatuisten solujen.

kohonneita tasoja GDF-15 on liittynyt lisääntynyt riski sairauksien arveltu johtuvan krooninen tulehdus [29, 32] ja lukuisat tutkimukset osoittivat, että GDF-15 on arvokas biomarkkeri sydän- ja verisuonisairauksien [29, 30, 32-34]. GDF-15 arvellaan olevan merkittävä rooli sydän- vaurioita vastausten [35], mahdollisesti kautta angiogeneesiä vastauksen osoitettiin prekliinisen malli HUVEC [36]. GDF-15 on kuvattu myös biomarkkereiden /ennustaja albuminuria, tunnettu pohtimaan perustettu mikro-verisuonitukoksia [37]. Lisäksi useat tutkimukset syytöstä GDF-15 näkökohtia aineenvaihdunnan häiriöt esim. insuliiniresistenssi ja lihavuus [30, 38, 39]. Äskettäin korkeampi verenkierrossa MIC-1 /GDF-15 oli myös liittyy lisääntynyt paksusuolisyövän riskin tukeva rooli kroonisen tulehduksen kehittämisessä paksusuolen syövän [40].

ATF3

on alavirtaan jäsen MAP-kinaasi signalointireitin joka koodaa ydin- tekijä, joka stimuloi transkriptiota kun solustressiä. Fast säätely ylöspäin

ATF3

on keskeinen stressin vasteen eri endoteelisolujen malleja, indusoima erilaisten haitallisten ärsykkeiden [41-46]. Puuttuminen

ATF3

-levels suojattu soluja apoptoosin induktion, esim. aiheuttama TNFa HUVEC [47], annetaan sisplatiinia ihmisen glioblastoomasolulinjan [42], tai liittyvät doksorubisiiniin sydänlihassolujen [48]. Mielenkiintoista on, että immunohistokemiallisesti mitattuna

ATF3

-ilmaisu on lisääntynyt ateroskleroottisten alueilla ihmisen lonkkavaltimoista [43]. Harvat tutkimukset osoitettu

AREG

, jäsen kasvutekijän reseptoreita, jolla on tärkeä rooli solujen lisääntymistä ja selviytymistä. Rintasyöpä solujen altistuvat sisplatiinin erittävät AREG-proteiinin yli pitkiä aikoja, eli enintään 72 tuntia sen jälkeen käsikirjassa [49].

Käytettävissä olevien tietojen päätimme tutkia plasman proteiineihin tasoja GDF-15 kivesten syöpäpotilailla ennen, aikana ja jälkeen hoidon BEP-kemoterapian ja liittyvät muutokset tasot tunnettujen endoteelin vaurioita biomarkkereiden [25, 26]. Kohonneet GDF-15 koko hoidon sekä jälkeinen kemoterapia voi osittain perustua syöpään liittyvien mekanismien, kuten GDF-15-proteiinin tason wasslightly suurempi potilailla, joilla kehittyneempää tautien vaiheessa mitattuna IGCCCG pisteet, jotka voivat koskea vapauttaa GDF-15 apoptoottiselta kasvainsoluja. Kuitenkin, sen rooli endoteelisolujen vaurio tukee se, että GDF-15 tasot korreloivat proteiinien tiedetään vastaamaan kemoterapian liittyvien endoteelisolujen vaurio kivessyöpä potilailla, vWF ja hsCRP [25, 26]. Näin ollen, on mahdollista, että havaittu nousu plasman GDF15 on mukana kemoterapia liittyvien endoteelisolujen vaurioita, mutta se ei todennäköisesti ole, koska endoteelisolujen loukkaantumisen. Koska tämä proteiini on mekanistisesti liittyvät kemoterapiaan liittyvää endoteelisolujen vaurio voi olla mahdollisesti herkkä biomarkkereiden havaitsemiseksi tämä vahinko. Edelleen laajennettu analyysi GDF15 tasoilla yhdistettynä fenotyypitykseen kardiovaskulaarisia riskitekijöitä suuremmassa kohortin potilaista on perusteltua. Vaikka tässä tutkimuksessa ei ole suhteessa välillä havaittiin esikäsittely tasojen GDF15 ja ikä, on tunnettua, että tässä tapauksessa normaalissa väestön ja on otettava huomioon, kun analysoidaan GDF15 tasoa ajoissa. Lisäksi se, että TGFp-reitin on mukana tässä vahingot voivat olla vihjeen interventioita vähentävät endoteelisolujen aiheutuvia vahinkoja hoidon bleomysiini ja sisplatiini.

GSEA osoitti merkittävästi rikastettu useita reittejä, mukaan lukien ”p53” ja ”tyypin I diabetes” in ”akuutti” altistuminen bleomysiini ja sisplatiini, ja ”krooninen” saaneet sisplatiinia. Havainto, että p53 liittyvät geenit vaikutti bleomysiinin sekä sisplatiini havainnollistaa pätevyyttä lähestymistapamme, sillä molemmat lääkkeet kohdistavat niiden keskeisten terapeuttinen vaikutus solujen apoptoosin. Rikastettu ”Tyyppi I diabetes ’geeni setti sisältää useita geenejä mukana tulehduksellinen prosesseissa, esim. HLA-molekyylejä, interleukiinit ja TNF, mikä osoittaa, että bleomysiini ja sisplatiini indusoivat tulehdusreaktion endoteelisoluissa. Tämä havainto on täysin linjassa tutkimusten kanssa kivessyöpä hoidetuilla potilailla sisplatiini-, jotka osoittivat korkeampia systeemisen tulehduksen ja endoteelin toimintahäiriötä [25, 26, 50]. Koska kiertävä platina on havaittavissa verenkierrossa vuosina vuosikymmenien kuluttua sisplatiinihoitoon [51-52], pitkäaikainen kivessyöpä perhe voi hyvinkin olla käynnissä verisuonitukoksia ja krooninen matala-asteista endoteelin tulehdusta. Kun krooninen tulehduksellinen vastauksia osoittautua tärkeä patogeeninen tekijä kehittämiseen kemoterapian aiheuttama endoteelisolujen vaurioita, interventioon tulehduskipulääkkeiden on perusteita lähestymistapa vähentää näitä vaikutuksia.

Yhteenvetona käytimme cDNA microarray kohteeseen havaita puolueeton geenien ja reitit liittyvät kemoterapiaan liittyvää endoteelisolujen vaurioita, löytää biomarkkereita ja mekanismeista tämä vahinko. In HMEC-1 alttiina bleomysiini ja sisplatiini, useita geenejä voimakkaasti ilmentyvät differentiaalisesti, esim.

GDF-15

,

ATF3

ja

AREG

. Vuonna GSEA, klustereita liittyvien geenien solukuolemaan ja tulehduksen vaikutti. Havaitut muutokset plasman GDF-15-proteiinin tasot kivessyöpä potilaat aiheuttama sisplatiinipohjaisen ja bleomycin sisältäviä kemoterapia mukaan tämä informatiivinen prekliiniset lähestymistapaa voidaan kääntää hoitopaikassa, ja että GDF-15, voi olla mahdollinen biomerkkiaine korkoa, joka on mekaanisesti mukana kemoterapia liittyvien tervettä kudosvaurioita kuten endoteelin vaurioita. Edelleen

in vitro

ja

in vivo

etsintä on perusteltua. Tämä helpottaa logiikka kohti valitsi kohteensa interventioon, aikaisin korvike biomarkkereita kemoterapiaan liittyvien endoteelin vaurioita.

tukeminen Information

S1 Kuva. Kokeellinen suunnittelu.

A. ”Akuutti” valotusasetusta: ikuisti HMEC-1 altistettiin bleomysiini (0,3 ug /ml (IC 50), 1,5 ug /ml (IC90)) tai sisplatiinia (2,6 uM (IC 50), 12,9 uM (IC 90)) 6, 24 ja 48 tuntia; B. ”krooninen” valotusasetuksen: aikana 30 päivän HMEC-1 altistui 0,06 ug /ml bleomysiini (IC10) tai 0,52 uM sisplatiinin (IC10) kahdesti viikossa). Molemmissa kokeissa käsittelemätöntä näytteet toimivat vertailuryhmänä. (*) RNA-eristys ja cDNA microarray kokeiluja; (†) RNA: n eristys ja qRT-PCR.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0115372.s001

(TIF) B S1 Taulukko. Geenit sisältyvät ”p53” ja ”tyypin I diabetes” geeni setit Kegg tietokantaan, sijoittui aakkosjärjestyksessä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0115372.s002

(DOC) B

Kiitokset

Kiitämme Kevin Bouma, Gert Jan Meersma, Haukeline Volders ja Nynke Zwart niiden teknistä apua ja keräämiseksi potilaan näytteitä.