Krooninen sairaus

tiivistelmä

syöpään liittyvä kakeksia on monimutkainen aineenvaihdunnan sairaus ominaista progressiivinen rasvakudoksen ja heikkeneminen lihasmassaa. Vaikka solu- ja molekyylitason mekanismeja kuihtuminen ovat puutteellisesti, aiemmat tutkimukset ovat ehdottaneet mitokondriohäiriöitä hiirimalleissa syöpäkakeksialle. Jotta ymmärtää paremmin metabolinen muutos syövän aiheuttama kakeksia, tutkimme vaikutuksia tehostetun oksidatiivisen kapasiteetin lihassurkastumatilaan käyttäen siirtogeenisiä hiiriä yli-ilmentävät Peroksisomien proliferaattoriaktivoidut Receptor gamma Co-aktivaattori-1α (PGC-1α) in luuston lihaksen Lewisin keuhkokarsinooma-istutettu malli. Lisääntynyt mitokondrioiden biogeneesin havaittiin kasvain, luurankolihaksessa-implantoitu hiiriin. Nämä korotukset eivät estä tai kääntää lihasten kuihtumista hiirillä kätkeminen kasvaimia. Lisäksi kasvaimen kokoa nostettiin lihas PGC-1α yliekspressoivissa hiirillä. Löysimme samanlainen Veren tulehduksellisten sytokiinien kasvaimia implantoitu eläimiin, jotka eivät vaikuttaneet lihasten ilmentymistä PGC-1α. Tuloksemme osoittivat, että lisääntynyt mitokondrioiden biogeneesin luustolihasten ei riitä pelastaa kasvaimeen liittyvien, akuutti lihaksen menetys, ja voisi edistää kasvaimen kasvua, mahdollisesti vapauttamaan myokines.

Citation: Wang X, Pickrell AM, Zimmers TA, Moraes CT (2012) kohonneita lihaksen mitokondrioiden biogeneesin ei estä lihaksen menetys, mutta lisääntynyt kasvaimen kokoon hiirimallissa Akuutti Cancer aiheutetun Kuihtuminen. PLoS ONE 7 (3): e33426. doi: 10,1371 /journal.pone.0033426

Editor: Antoni L. Andreu, sairaala Vall d’Hebron, Espanja

vastaanotettu: 28 marraskuu 2011; Hyväksytty: 12 helmikuu 2012; Julkaistu: 12 maaliskuu 2012

Copyright: © 2012 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: National Institute terveys- ja lihasdystrofia Association. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kliinisesti kakeksia on määritelty ”monimutkainen metabolinen oireyhtymä, johon liittyy taustalla sairaus ja ominaista tappio lihaksen tai ilman rasvakudoksen massan” [1]. On havaittu monissa krooninen tai loppuvaiheen kuten AIDS, tuberkuloosi ja syöpä [2]. Jopa 50% käsittelemätöntä syöpäpotilaat kokevat etenevää rasvakudoksen ja vähärasvaisen painoindeksi ilman nälkään, monimutkainen oireyhtymä kutsutaan syövän aiheuttama kakeksia [3]. Läsnäolo kuihtuminen liittyy yleensä siedä hoitoa, huono elämänlaatu ja korkea kuolleisuus potilailla [4].

Vaikka laajoja tutkimuksia on tehty viimeisen kymmenen vuoden aikana, taustalla olevien mekanismien aiheuttavan syöpää kuihtuminen ovat ei vielä täysin ymmärretä. Yksi johtavista teorioita on se, että tuumorista peräisin tekijät ovat vastuussa hajoamista painoindeksi, mukaan lukien lihas [2]. On yleisesti hyväksytty, että proinflammatoristen sytokiinien keskeisessä asemassa kaikki keinot, jotka johtavat hyper kataboliaa ja laihtuminen liittyy syöpäkakeksialle [5]. Läsnäolo systeeminen tulehdus liittyy yleensä huonompi ennusteen potilailla [6].

syöpäkakeksialle aiheuttaa systeemisiä muutoksia potilaan metabolinen profiili tukemiseksi kasvainten kehittymiseen. On raportoitu, että mitokondrioiden luustolihakseen lukien vähentynyt oksidatiivisen fosforylaation (OXPHOS) kapasiteetti ja häirinnyt mitokondrion dynamiikkaa, on mukana systeeminen tulehdus ja luustolihasten tuhlaa [7]. Peroksisomiproliferaattori-aktivoitu reseptorit (PPAR: t) transkriptiotekijöitä perheen ja niiden modulaattori PPAR-gamma koaktivaattoria-1α (PGC-1α) ovat päällikön sääntelyviranomaisten mitokondrioiden biogeneesiä ja energia-aineenvaihdunnan [8]. Mitokondrioiden irtoamisen proteiineja (UCPs) 1, 2, ja 3 yläreguloituja atrophying lihas; ja aineenvaihdunnan poikkeavuus lisääntynyt proteolyysin lihas on hiljaista kakektisilla potilailla [9], [10]. Aktivointi pro-inflammatoristen sytokiinien TNFa-indusoidun NF-KB: n on osoitettu vähentävän promoottorin transaktivaatiota ja transkriptionaalista aktiivisuutta säätelijöitä mitokondrioiden biogeneesin (PGC-1α, PPARa ja TFAM) ja vaikuttaa alavirran oksidatiivisen markkereita (sitraatti-syntaasi, ja sytokromi

c

oksidaasi) [11].

kliinisiä interventioita varten on kehitetty yleinen oire hallinta tuhoisan kunnossa; Nämä toimenpiteet ovat vain lievittävä ilman erityistä kohdistaminen aiheuttaa tekijä kuihtuminen ja tulokset eivät ole tyydyttäviä [12].

Tässä tutkimuksessa tutkimme mahdollinen terapeuttinen vaikutus kasvaa mitokondrioiden biogeneesin yliekspressiolla PGC-1α luustolihaksessa siirtogeenisessä hiirimallissa syöpäkakeksialle. Tuloksemme osoittavat, että lisääntynyt mitokondrioiden biogeneesin lihas ei riitä muuttamaan tasoja proinflammatoristen sytokiinien ja estää lihaksen menetys liittyy kasvaimen istutuksen. Lisäksi kasvu lihasten PGC-1α voi myös olla sivuvaikutus edistää kasvaimen kasvua.

Tulokset

Kasvain-ympätty siirtogeenisiä MCK-PGC-1α hiiret ylläpitävät tehostettua mitokondrioiden biogeneesin gastrocne- ja quadriceps

Siirtogeeniset MCK-PGC-1α hiirillä-express PGC-1α luustolihaksessa vetämänä lihaksen kreatiinikinaasi (MCK) promoottori [13]. Havaitsimme kasvua

Ppargc1a

mRNA-tasoja 13-kertaiseksi gastrocnemiuksessa, lihas koostuu samantasoista tyypin I (hapettava) ja tyypin II (glykolyyttisiä) kuituja ja 19-kertaisesti quadriceps, joka on lihas koostuu pääasiassa tyypin II kuitujen, 4 kuukauden ikäinen kasvaimettomina siirtogeenisiä MCK-PGC-1α hiirissä (kuvio 1A). Samanlainen kasvu havaittiin kasvaimen kantavien hiirten (kuvio 1A). Kun määritetty vakaan tilan tasot PGC-1α proteiinin gastrocnemiuksen ja quadriceps homogenaateissa, havaitsimme selvästi lisääntynyt siirtogeenisiä hiiriä kontrolleihin verrattuna, tai ilman kasvaimia. Tulokset gastrocnemious ja quadriceps olivat olennaisesti sama sekä genotyyppien (kuvio 1 B, C ja ei ole esitetty).

. mRNA-tasot (ΔΔCt) on

Ppargc1a

gastrocne- ja quadriceps normalisoidaan

GAPDH

4 kuukausia of-iän MCK-PGC-1α ja valvontaa sekä ilman kasvaimen istutuksen (n = 4 /ryhmä).

B, C

. Vasen paneeli: edustaja Western blotting-analyysi vakaan tilan tasojen PGC-1α ja mitokondrioiden proteiineista (kompleksi II alayksikköä SDHA, kompleksi III alayksikkö UQCRC1, ja monimutkainen I alayksikkö NDUFB8) 4 kuukausia of-ikä lihashomogenaateissa of MCK-PGC- 1α ja valvontaa. Oikea paneeli: Optinen tiheys (O.D.) määrällinen kiinnostavia proteiineja normalisoitu toα tubuliinia (n = 3 /ryhmä

B

, n = 4 /ryhmä

C

). Virhe palkit ovat keskiarvo ± SEM.

PGC-1α on transkription koaktivaattorikompleksien että ylössäätelee transkriptio ydinvoiman koodattu mitokondrion proteiinit, edistää mitokondrioiden biogeneesin [14], [15], [16]. Kvantitoimme tasot mitokondrioiden proteiinien 4 kuukauden ikäiselle MCK-PGC-1αmice ja todettu huomattavasti korkeampi useiden mitokondrioiden merkkiaineiden hiirissä ilman tai kasvaimia (kuvio 1 B ja 1 C). Tasot mtdna sekä gastrocnemiuksen ja quadriceps kohosivat PGC-1α ilmentävät hiiret (kuvio 2A). Yhdenmukaiset merkkejä lisääntynyt mitokondrioiden biogeneesin, havaitsimme merkittävää nousua sitraattisyntaasin (CS) ja sytokromi

c

oksidaasi (COX) toiminta sekä gastrocne- ja quadriceps (kuvio 2B, C).

a.

mtDNA kopiomäärä gastrocnemiuksen ja quadriceps 4-kuukauden ikäiset MCK-PGC-1α ja villityypin hiirissä, ilman ja kasvaimen istutuksen (n = 5 /ryhmä).

B-C.

COX ja CS entsymaattinen aktiivisuus gastrocnemiuksen (

B

) ja quadriceps (

C

) lihashomogenaateissa normalisoitu proteiinia kasvain MCK-PGC-1α ja ikä-verrokeilla (n = 5 /ryhmä).

D-E.

MRNA (ΔΔCt) on

PPARa

,

PPARg

,

Ppard

, ja

Ppargc1b ​​

gastrocne- (

D

) ja quadriceps (

E

) normalisoitu

GAPDH

4-kuukautta vanha kasvain MCK-PGC1-α ja vuotiaiden verrokit (n = 4 /ryhmä). Virhe palkit ovat keskiarvo ± SEM.

Mielenkiintoista, huomasimme ero asetus toisen jäsenen PGC-1 perhe, PGC-1β gastrocne- ja quadriceps kasvaimen ympätty eläimillä. Vaikka se pysyi ennallaan gastrocnemiuksessa kudoksessa,

Ppargc1b ​​

mRNA tasot olivat merkitsevästi väheni nelipäiseen kudosta kasvaimen kantavien MCK-PGC-1αmice (kuvio 2D, E). Näin ollen ekspressiotasot transkriptiotekijöiden

PPARa

ja

PPARg

lisääntyivät merkitsevästi gastrocnemius mutta ei nelipäiseen lihakseen (kuvio 2D, E).

yli-ilmentymistä MCK-PGC-1αdoes ei suojaa syöpää aiheuttamaa lihaksen menetys

Aiemmin laboratoriossamme osoitti, että yli-ilmentyminen PGC-1αin luurankolihasten suojattu ja hidasti etenemistä mitokondriomyopatioiden ja iän aiheuttaman sarcopenia [17 ], [18]. Oletimme, että lisääntynyt mitokondrioiden toimintaan, meidän MCK-PGC-1α hiiret olisivat vastustuskykyisiä lihasten kuihtumista kääntämällä aineenvaihdunnan muutokset vaikuttavat kuihtuminen.

Kun olet vahvistanut tätä vahvaa parannusta mitokondrioiden biogeneesin, me tutki yli -ilmaisu of PGC-1α voisi tarjota suojan lihaksen menetys meidän tuumorigeenisiä mallissa. Seurasimme paino MCK-PGC-1α ja villityypin hiirien kanssa tai ilman kasvain, indikaattorina yleinen terveydentila jälkeen ymppäämällä syöpäsoluja. Havaitsimme ole merkittävää eroa ryhmien välillä, kunnes injektion päivän 12 ja -13, missä MCK-PGC-1α kasvain hiirillä oli merkittävä kasvu prosentteina kehon painoa verrattuna kaikkiin 3 muuta ryhmää hiiriä (kuvio 3A).

a.

prosentuaalinen kehon painoa yli kahden viikon kuluttua kasvainsolujen tai suolaliuosta injektiota varten MCK-PGC-1α tai valvontaa 4 kuukautta-of-ikä, eläinmäärien kuin leimatun.

B.

Prosenttiosuus kasvaimettomina kehon paino 2 viikon kuluttua kasvaimen inokulaation MCK-PGC-1α ja ikään verrokeilla, eläinten määrää kuin paneelissa

.

C.

Paino kasvain (g) uutettu pistokohdassa 2 viikon kuluttua tuumorin istuttamisen (n = 5 villityypin, n = 7 MCK-PGC-1α).

D.

Lineaarinen regressio mallintaminen suhde muutokset prosentteina painon ja paino kasvain MCK-PGC-1α ja ikä-haun kasvain valvontaa, eläinten määrää kuin paneelissa

C

.

E.

Paino gastrocnemiuksen ja quadriceps (g) suolaliuosta ruiskutetaan ja kasvaimen ympättiin ryhmien MCK-PGC-1α tai samanikäisiin villityypin hiirillä, eläinten määrää kuin paneelissa

.

F.

Pitoisuudet seerumissa IL-6-ohjaus ja kasvain villin tyypin ja MCK-PGC-1α hiiriä (n = 5 /ryhmä). Virhe palkit ovat keskiarvo ± SEM.

Ymmärtääksemme jos tämä kasvu kehon painoa MCK-PGC-1α kasvain hiirillä tuli, tarkastelimme painon ja uutetaan kasvaimen painoa. Olemme havainneet, että kasvain-free kehon paino väheni merkitsevästi kasvaimen kantavien hiirten sekä genotyyppien, eikä suuria eroja siirtogeenisten ja villityypin hiiriä (kuvio 3B). Kuitenkin kasvainten uutetaan MCK- PGC-1α hiiret olivat noin 50% suurempi kuin kontrolleilla (kuvio 3C). Kun piirtämällä muutoksia kehon painon vastaan ​​kasvaimen kokoa, olemme huomanneet positiivinen korrelaatio villin tyypin hiiriä, joka hajotettiin MCK-PGC-1α kasvain hiirillä (kuvio 3D). Tämän todisteita, päättelimme, että koko kehon painonlisäys kasvain MCK-PGC-1α hiirten johtui kasvaimen massan eikä voitto lihaksen paino. Kuitenkin huolimatta suurempia kasvaimia, MCK-PGC-1α hiiret eivät menettäneet enemmän painoa kuin kasvain laakeri valvontaa.

painot Sekä gastrocnemiuksen ja quadriceps olivat lievästi, mutta laskivat merkittävästi villityypin kasvain hiirillä, mikä osoittaa, mallimme aiheuttama lihaksen menetys (kuvio 3E). Kuitenkin, ei ollut eroa kummassakaan lihasryhmän verrattuna välillä kasvaimeen ympätty siirtogeenisten ja villityypin hiirillä (kuvio 3E). Olemme myös määrällisesti pitoisuus pro-inflammatoristen sytokiinien IL-6 seerumissa. Kuten odotettua, IL-6 tasot lisääntyivät dramaattisesti tuumoria kantavissa hiirissä molempien genotyyppien verrattuna kasvaimen hiiriä, mutta emme löytäneet merkittäviä eroja kahden genotyyppien (kuvio 3F). Siten MCK-PGC-1α ei näytä suojautua lihaksen menetys tai alentaa systeemisiä IL-6 tasoa tällä päätepistettä.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa käytimme MCK-PGC- 1α hiirimallissa tutkimaan vaikutusta lisääntyneen mitokondrioiden biogeneesin syövän aiheuttamaa lihaksen menetys. Löysimme lisääntynyt mitokondrioiden biogeneesin lihaskudoksessa MCK-PGC-1α kasvain hiirillä verrattuna WT kasvain hiirillä. Yllättäen huomasimme, että lisääntynyt ilmentyminen PGC-1α lihaksessa ei estänyt lihaksen menetys. Tämä oli odottamaton tulos, koska lihas PGC-1α osoitettiin ryhmämme ja muiden antaa laajan suojan erilaisiin olosuhteisiin liittyy lihasten rappeutuminen [17], [19].

Vaikka syyt kuihtuminen ovat edelleen huonosti, lisääntynyt hajoaminen ja vähentynyt synteesi lihaksen proteiinien proteasomista järjestelmä näyttää olevan tärkeä rooli [20]. Systeeminen tulehdus se näyttää välittävän mekanismin syövän aiheuttama kakeksia [5]. Rosenberg ja työtovereiden ehdotti, että korkea seerumin TNFa ja IL-1β olivat syyt laihtuminen nivelreuman kuihtuminen [21]. Systeeminen sytokiini-ajettu tulehdusreaktio AIDS-potilaiden samanaikaisen aktiivinen infektio on myös liitetty kakeksian [22]. Malli ihonalaisen kasvaimen istutuksen osoittaa myös kasvu kiertävän IL-6 tasoa liittyy lihasten ja koko kehon painon. Kuitenkin meidän kokeissa IL-6 tasoa ei ollut eroa villityypin ja MCK-PGC-1α hiirissä (kuvio 3F). Siksi me spekuloida, että vaikka PGC-1α voi suojautua lihaksen menetys liittyy luontainen metabolisen toimintahäiriöt [17], [19], se on vähemmän tehokas esteenä lihaksen menetys ole ulkoisten tulehduksellinen signaaleja.

MCK- PGC-1α hiirimallissa on tutkittu laajasti ryhmämme ja muiden eri myopatioissa. Lisäksi siirtogeenisiä strategiaa, PGC-1α voidaan saada aikaan myös kestävyysliikuntaa [23], [24]. Molemmat lihasten PGC-1α ilmaisun ja liikunta on osoitettu lievittävän systeeminen tulehdus [9], [19], [25]. Osana kombinatoorista hoidon käyttää yhtäpitävä potilaan fyysiset olosuhteet yleensä ehdotettu kliinisissä intervention [26]. Mallissa syövän aiheuttama kakeksia koe-eläimet kuolevat 2 viikkoa tuumorin istuttamisen jälkeen. Hiiret kehittyi lievä lihaksen menetys sisällä 13 päivän aikataulua on kasvain esiintyy jo 5. päivänä istutuksen jälkeen. Vaikka PGC-1α yliekspressio ei lievittävät lievä lihaksen menetys meidän akuutti tuumorigeenisia mallia, uskomme tulevia kokeita tulisi tutkia terapeuttisen vaikutuksen lisääntynyt mitokondrioiden biogeneesin vaikeammissa tai krooniset mallit syövän aiheuttama lihasten kuihtumista.

Vaikka syy tähän negatiivinen tulos ei ole tiedossa, huomasimme myös, että kasvaimet olivat noin 50% suurempi hiirillä yli-ilmentävät lihas PGC-1α. Yksi mahdollinen selitys tälle havainnolle on se, että luustolihas voidaan erittää myokines, kuten IL-6, joka voi olla kasvua edistävää aktiivisuutta [27]. Tämä oli odotettu havainto, joka oikeuttaa lisätutkimusta eri kasvain ja mallit.

Yhteenvetona työmme osoitti, että stimuloiva mitokondrioiden biogeneesin ei ollut riittävä ehkäisemään tai korjaamaan lihaksen menetys aikana akuutin syövän aiheuttamaa lihasten kuihtumista. Lisäksi olemme löytäneet todisteita siitä, että PGC-1α ilmaisua lihas voi johtaa kehitystä suurempien kasvaimia.

Methods

Eläimet

sukupolvi MCK-PGC-1α siirtogeenisiä hiirissä on aiemmin kuvattu [13]. Nainen eläimet analysoitavaksi olivat puhtaita C57BL /6J MCK-PGC-1α hiirten samanikäisillä pesuetoverissa valvontaa. Kaikki hiiret menettelyt suoritettiin protokollan mukaisesti hyväksymän Miamin yliopiston: Institutional Animal Care ja Käytä komitea (# 10-071). Hiiriä pidettiin virus-antigeenin vapaa laitokseen yliopistossa Miamin: Division of Veterinary Resources alla 12 tunnin valo /pimeä sykli huoneenlämmössä ja syötetään

halun

standardin jyrsijöiden ruokavaliota. Päätepisteen Tutkimuksen asetettiin, kun fyysinen kunto yli 50% jäljellä kasvain kantavien hiirten arvioitiin kriittisesti ja lopetettiin 24 tunnin kuluessa.

kasvaimensiirrostuspäivänä

nainen villityypin hiirillä ja MCK-PGC-1α siirtogeenittömien poikasten (n = 8 /ryhmä) 4 kuukauden iässä injektoitiin subkutaanisesti 10

6 Lewisin keuhkokarsinooma solua 100 ul steriiliin vehikkeliin, fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS), välillä Lapaluut. Kontrollit injektoitiin samalla tavalla ja sijainti PBS (n = 7 villityypin hiirissä, n = 5 MCK-PGC-1α hiiret). Painot eläimet kirjataan ja niiden yleinen terveydentila oli seurattiin päivittäin kasvaimen inokulaation jälkeen. Yksilöt katsotaan huonossa kunnossa pysty selvitä vasta päätepiste tutkimuksen lopetettiin ja jätetty tarkempaa analyysiä.

Spektrofotometri Analyysit

OXPHOS määritykset suoritettiin aikaisemmin kuvatulla [28]. Lyhyesti, homogenaateissa quadriceps ja gastrocnemius valmistettiin käyttäen kudoshomogenisaattorilla (Omni) PBS: ssä plus proteaasiestäjäseostabletit (Roche) jäällä. Näytteet sentrifugoitiin 800 g 5 minuuttia ja supernatantti homogenaattia lisättiin puskuriin, joka sisälsi 10 mM KH

2PO4, 1 mg /ml BSA: ta, 120 mM lauryyli maltosidi, ja 2 mM sytokromi

c

pelkistetään natriumhydrosulfiitin. seoksia seurasi 550 nm: ssä imeytymistä lukema otetaan joka 11. sekunti 2 minuutin ajan 37 ° C: ssa. 240 uM kaliumsyanidia käytetään estämään reaktion varmistamiseksi kaltevuus oli spesifinen sytokromi

c

oksidaasi (COX). Rinteillä normalisoitiin proteiinipitoisuus määritettiin Bradford-määrityksellä.

sitraattisyntaasin (CS) aktiivisuus määritys, supernatantit lisättiin puskuriin, joka sisälsi 50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 20 mM asetyyli-CoA: a, 10 mM 5, 5′-ditiobis (2-nitrobentsoehappo), ja 0,1% triton X-100. Määritys suoritettiin 30 ° C: ssa 50 mM oksaloasetaatti (oksa) reaktion käynnistämiseksi. Lukemat otettiin joka 11. sekunti 3 minuutin ajan. Rinteet otettu ennen lisäämistä oksa poimittiin rinne oksa. Normalisointi oli kuten edellä.

mRNA eristäminen ja käänteistranskriptaasia PCR

Leikellyt quadriceps ja kaksoiskantalihas kudokset upotettiin TRIzol® (Sigma /Invitrogen). Kudokset homogenisoitiin käsin roottorin homogenisaattorilla (VWR), ja RNA uutettiin kloroformifaasin erottaminen. Käytimme 1 ug RNA Käänteiskopiointia reaktio käyttäen iScript cDNA synteesikitti mukaan valmistajan protokollan (BioRad).

Reaaliaikainen PCR

Maxima SYBR Green /ROX qPCR Master Mix (Fermentas) käytettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden suorittamiseksi real-time PCR. Alukkeet, joita käytetään cDNA: n määrän olivat:

Ppargc1a

(5’CTGCGGGATGATGGAGACA, 5’AGCAGCGAAAGCGTCACA),

Ppargc1b ​​

(5’TGGCCCAGATACACTGACTATG, 5’TGGGCCTCTTTCAGTAAGCT),

PPARa

(5’TTCCCTGTTTGTGGCTGCTAT, 5’CCCTCCTGCAACTTCTCAATGTAG),

PPARg

(5’CGGAAGCCCTTTGGTGACTTTA, 5’GCGGTCTCCACTGAGAATAATGAC),

Ppard

(5’ACCGCAACAAGTGTCAGTAC, 5′- CTCCGGCATCCGTCCAAAG), ja

GAPDH

(5’TGCACCACCAACTGCTTAG, 5’GGATGCAGGGATGATGTTC).

seuraavat alukepareja käytettiin kvantifiointia varten mtdna kopioida numeron kokonais-DNA (uutettiin fenoli: Kloroformifaasi erotus):

ND1

(5’CAGCCTGACCCATAGCCATA, 5’ATTCTCCTTCTGTCAGGTCGAA),

Actb

(5’TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA, 5’CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG). Vertaileva Ct menetelmää käytettiin määrittämään suhteellinen runsaus mielenkiinnon kohteena olevien geenien tai mtdna [29].

Western-blottaus-analyysi

Proteiiniuutteet valmistettiin reisilihakseen ja gastrocnemius lihaksia, jotka homogenisoitiin kädessä pidettävät roottori (VWR) PBS: ssä, joka sisälsi proteaasiestäjäseostabletit (Roche). Sitten näytteet jäädytettiin nopeasti nestetypessä ja varastoidaan -80 ° C: ssa, kunnes ne käytettiin. Käytön yhteydessä, homogenaatit laimennettiin 1:10 RIPA-puskuria (62,5 mM Tris-HCI, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,25% SDS, 1 mM EDTA, proteaasi-inhibiittorit, ja fosfataasi-inhibiittorit lisättiin juuri) ja sonikoitiin lyhyesti. Homogenaatteja sentrifugoitiin sitten 15000 x g: ssä ja supernatantti kerättiin. Proteiinit kvantifioitiin käyttäen Bradfordin menetelmällä. Sama määrä proteiinia, ladattiin 4-20% SDS-polyakryyliamidigradienttigeellä (BioRad). Geeli blotattiin polyvinylideenifluoridia (PVDF) kalvo (BioRad).

Kalvot blokattiin Odyssey estoliuoksessa (LI-COR Biosciences) laimennettiin 1:01 PBS: llä 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Primaaristen vasta-aineiden käytettiin OXPHOS jyrsijän cocktail (Mitosciences), α-tubuliinin (Sigma), PGC1-α (Santa Cruz), SDHA (Mitosciences), β-aktiini (Sigma), sytokromi

c

(Mitosciences), Porin (Mitosciences), ja UQCRC1 (Mitosciences). Primaarista vasta-ainetta inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa. Toissijaiset vasta käytettiin joko infrapuna-konjugoituja vasta-aineita anti-kani-700 tai anti-hiiri-800 (Rockland) at valmistajan ehdotti pitoisuuksia. Sekundäärisiä vasta-aineita inkuboitiin 1 tunti huoneen lämpötilassa. Blots infrapuna sekundaariset vasta-aineet visualisoitiin Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Biosciences). Optisen tiheyden mittaukset tehtiin käyttäen Gel-Pro Analyzer ohjelmisto.

juoksumatto

Endurance arvioitiin käyttämällä kuutta kaistaa juoksumatto motivaatio verkkoon suunniteltu jyrsijöitä (Columbus Instruments). Eläimet saivat yhden koulutuspäivä sopeutua laitteet ja motivaatio verkkoon. Testipäivänä hiiret suorittamiseen vaaditaan nopeudella 8 m /min 5 minuutin ajan ja määrä putoaa motivaatio verkkoon tallennettiin jokaista hiirtä.

Serum IL-6 määrällisiä

Verta otettiin vasemmasta kammiosta syvä anestesia hiirien ennen lopetettiin. Veren annettiin hyytyä jäällä, ja seerumia eristettiin 1000 x g pöytäsentrifugilla (Eppendorf 5424) 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Lisäksi sentrifugointivaihe seerumin 10000 x g 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa suoritettiin täydellinen verihiutaleiden poistamiseksi. Seerumin käytettiin BD Sytometrisen helmi array hiiren tulehdus sytokiinien kit mukaan valmistajan ohjeiden (BD Biosciences). Näytteet analysoitiin BD LSRFortessa solu analysaattori (BD Biosciences).

Tilastollinen analyysi

Kaikki tulokset ilmaistiin keskiarvoina ± STDEV. Merkitys erot arvioitiin 2-tie ANOVA seurasi Bonferronin testin jälkeen kokeisiin, joissa on enemmän kuin 2 ryhmää tai parittomia Studentin t-testi välissä 2 ryhmien. Eroja pidettiin merkittävinä, kun p 0,05 (*), 0,001 p 0,01 (**), p 0,001 (***).

Kiitokset

Kiitämme tohtori Bruce M. Spiegelman tarjota siirtogeeninen MCK-PGC-1α-hiiriä käytettiin tässä tutkimuksessa.